（分析化学专业论文）以四唑为配体的新型色谱固定相的合成及色谱性能研究.pdf

摘要 生物大分子分离与纯化的液相色谱方法有多种，离子交换色谱( c ) 和固定金属离子亲合色谱( i m a c ) 是其中广为应用的两种方法。本论文设 计合成了两种以四唑为配体的新型c 和i m a c 固定相，并对生物大分子 进行了分离与纯化，所取得的主要成果如下： 1 采用丫缩甘油醚基丙基三甲氧基硅烷活化的大孔硅胶与3 羟基丙腈 反应，在氯化铵的催化下再与叠氮钠通过3 + 2 环加成反应制得了一种以四 唑为配体的硅胶基弱阳离子交换色谱固定相。系统的考察了生物大分子在 固定相上的分离能力、保留行为、负载容量及柱效稳定性等色谱性能。结 果表明，5 种标准蛋白可以被很好的分离，保留行为符合离子交换色谱模式； 该固定相具有负载量高，稳定性好，不可逆吸附小等优点。将四唑配体固 定相色谱柱用于鸡蛋清中溶菌酶的一步纯化，纯化的溶菌酶纯度为8 9 6 ， 活性可达6 6 8 2 3 砌恤g 。 2 采用y 氨基丙基三乙氧基硅烷活化的大孔硅胶与3 氯丙腈反应得 到腈基硅胶，再在氯化铵的催化下与叠氮钠通过3 + 2 环加成反应首次制备 了一种四唑配体金属离子亲合色谱固定相。研究了蛋白质在螯合c u 2 + 、n i 2 + 、 c 0 2 + 固定相上的分离和保留行为。结果表明，固定相螯合上金属离子后，4 种蛋白可以达到更好的分离效果，保留行为符合粼保留机理。 关键词：四唑配体固定相；离子交换色谱；固定金属离子亲合色谱；生物 大分子分离 西北大学硕士学位论文 p r 印a r a t i o no ft e t r a z o l e - f u n c t i o n a l i z e ds t a t i o n a 巧p h a s e a n dt h e i rc ：h r o m a t o g r a p h i c p r o p e r t i e s a b s t r a c t u i q u i dc h r o m a t o 伊a p h y ( i qh 嬲b e e nw i d e l ya p p l i e di nt h es e p a r a t i o n 觚d p u r i f i c a t i o n o f b i o p o l y m e li o n e x c h 觚g cc h r o m a t o 孕a p h y( m c )觚d i n l m o b i l i z e dm e t a l - i o n a f f i n i t yc h r o m a t o 伊a p h y ( i m a i c ) a r e 铆oi m p o r t a n t k i n d s 锄o n g i 上：m e t h o d s ht h i s d i s s e n a t i o n ， t o wk i n d so f t e t r a z o l e - f u n c t i o n a l i z e ds t a t i o n a r yp h 弱ew e r cp r 印硼甜蛐c c c s s f u l l y ，柚dw e r c e m p l o y e di ns e p a r a t i o n 孤dp u r i f i c a t i o no f b i o p o l y m e f b ym c 柚di m a c n e 0 b t a i n e dr c s u l t s 缸es u m m e r 娩e d 硒i nt h ef 0 u o w i n g ： 1 an o v e lt e t r 杞o l e - f i l n c t i o n a l i z e ds i l i c a s t a t i o n a r yp h a s ew 弱p r 印a r c d s u c c e s s f u l l yf 研u s ei nw e a kc a t i o nc x c h 卸g ec h r o m a t o 伊a p h y i tw 弱p r e p a r c d c o n v e n i e n u yb ym o d i 毋i l l g s i l i c a g e li 】i t i a l l y w i t h 丫一酉y c i d o x y p r o p y l t r i m e t h o x y s i l 锄e ，t h e nw i t h3 - h y d r o x y p r o p i o n i t r i l e 柚df i n a l l y w i t h 锄m o i l i u m - c a t a l y z e d ( 3 + 2 ) a z i d 啪i t r i l ec y d o a d d i t i o n t h ep r e p a r e d s t a t i o n a 巧p h 蕊ew 弱c h a r a c t e r 娩e d 如dc v a l u a t e df 研i t ss e p a r a t i o np e r f b 皿锄c e ， p r o t e i nr e t e n t i o nb e h a v i o r l o a d i n gc a p a c i t y 锄dc h e m i c a ls t a b i l i t y t h er e s u l t s s h o wt h a tf i v ep r o t e i n sc o u l da c h i e v ea 誉妁ds e p a r a t i o n0 nt h i sc o l u m n ，锄d t h e i rr e t e n t i o nb e h a v i o rw 硒c o n s i s t e n tw i t h 正c n o t a b l y t h ec o l u m nw i t h t e t r a z o l e f u n c t i o n a l i z e ds t a t i o n a r yp h a s es h o w e dg o o dl o a d i n gp r o p e n y 卸d l o n g t e 珊s t a b i l i t y ，卸d n os i 鲥f i c 柚ti e v e r s i b l ea d s o r p t j o n 弛a l l y ，t h e c 0 1 u mw 雒u s e dt oc 哪ro u tas i n 酉e - s t e pp u r i f i c a t i o no fl y s o z y m e 丘o me g g w h i t e 7 n l ep u r i t yo ft h ep u r i f i e dl y s o z y m ew 弱8 9 6 ，柚ds p e c i f i ca c t i v i t yw a s 6 6 8 2 3 i i j m g 2 a n o t h e rn o v e lt e t r a z o l e f u n c t i o n a l i z e ds i l i c a s t a t i o n a r ) rp h a s ew 勰 d e v e l o p e df o fu s ei ni m a co fp r o t e i i l s i tw a sp r e p a r e db ym o d i f y i n gs i l i c ag e l i i l i t i a u yw i t h 丫。a m i n o p r o p y l t r i e t h o x y s i l a n e ，t h e nw i t h3 - c h l o r o y p r o p i o n i t r i l ea n d f i n a l i yw i t h 锄m o n i u m c a t a l y z e d ( 3 + 2 ) a z i d e _ n i t r i l ec y d o a d d i t i o n a f t e rt h e c h e l a t i o no fm e t a li o n( e g c u “，n i 2 +a n dc 0 2 + ) ，t h ec h r o m a t o 铲a p h i c 西北大学硕士学位论文 c h a r a c t e r i s t i co ft h ec o l u m nw 弱e v a l u a t e di nt e m so fs e p a r a t i o na b i l i t yw i t h d i 虢r e n tm e t a li o n sa td i 骶r e n tp hi nt h em o b i l ep h a s e t 1 l er e s u l ti i l d i c a t e dt h a t f o u rp r o t e i n sc o u l da c h i e v eb e t t e rs e p a r a t i o n ，姐dp r o t e i nr e t e n t i o nb e h a v i o rw 舔 c o n s i s t e n tw i t hn 厦a c k e y w o r d s ： t e t r a z o l e - f u n c t i o n l i z e d s i l i c a ；i o n e x c h 觚g ec h f o m a t o 伊a p h y ； i m m o b i l i z e dm e t a l i o na f i 】d t yc h r o m a t o 孕a p h y ；b i o s e p a r a t i o n l n 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解西北大学关于收集、保存、使用学位论文的规定。 学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。 本人允许论文被查阅和借阅。本人授权西北大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研 究所等机构将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库或其它 相关数据库。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名：二啦指导教师签名： 少口夕年，月1 日歹嘲年乡月刁日 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究：【作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，本论文不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西北大学或其它教育机构的学位或证二b 而 使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示谢意 学位做作者阮缈 少9 产年厂月1 日 西北大学硕士学位论文 第一章文献综述 1 1 生物大分子的分离纯化与高效液相色谱技术 生物大分子指的是作为生物体内主要活性成分的各种分子量达到上万 或更多的有机分子，它是生物体的重要组成成份，其结构复杂，具有重要 的生物功能。常见的生物大分子除蛋白质与核酸外，另外还有糖类、脂类 和它们相互结合的产物，如糖蛋白、脂蛋白、核蛋白等。近年来，出于蛋 白组学研究、基因药物和蛋白药物开发等的需要，越来越多的生物大分子 在体外通过各种工程的途径被人工制造出来，而且对其纯度和活性的要求 越来越高。由于生物技术制品往往组分比较复杂，大多需要经过分离纯化， 而生物大分子自身又容易变性，因此对生物大分子的分离与纯化手段也提 出了更高的要求。 高效液相色谱( h i g hp e r f 0 皿柚c el i q u i dc h 舳a t o 伊a p h y ，瑚p i c ) 作为分 析化学中发展最快、应用最广范的分析方法之一，在许多领域成为必不可 少的手段。它具有分辨率高、重复性好、操作模式灵活( 可以根据分离对 象选择不同的固定相和流动相) 等优点。另一方面，生物大分子物理化学 性质的多样性( 电荷、等电点、疏水性、体积) 使得它们非常适合使用液 相色谱进行分离。两者特点的互补性使得高效液相色谱成为了生物大分子 分离与纯化中的一个通用和基本的重要工具。 1 2 生物大分子的h p l c 分离模式【1 ，2 】 目前用于生物大分子的分离纯化的h p l c 分离模式主要有反相色谱( r e v e r s e d p h 弱ea o m a t o 聊h y ，r p c ) ，疏水作用色谱( h y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o n c l 聃m a t 0 伊印h y h i c ) ，体积排阻色谱( s i z e e x c l u s i o nc h r o m a t o 伊a p h y ，s e c ) ， 离子交换色谱( i o n - e x c h a n g ec h r o m a t o 黟a p h y ，i e c ) ，亲和色谱( a 衄i l i t yc h r o m a - t o 伊叩h y ，a c ) 等。 1 2 1 高效反相液相色谱( h p r p c ) h p r p c 是h p l c 在生物大分子分离纯化中应用最为广泛的一种模式， 主要由于其拥有分辨率高和与质谱( m s ) 具有兼容性两大优点。其分离过 西北大学硕士学位论文 程可以描述为，生物大分子在通过色谱柱的过程中在固定相和流动相之间 进行分配，大分子的体积太大不能进入到疏水固定相内，只能以其疏水部 分吸附在固定相表面，当流动相中的有机溶剂达到某个特定的浓度时，大 分子解吸附，被洗脱下来。生物大分子因表面疏水区的面积和分布不同， 与固定相吸附作用大小的差异而得到分离。 h p i 冲c 的缺点在于固定相疏水性太强极易造成蛋白质构象变化以致失 活；流动相采用的有机溶剂有毒，易对环境造成污染，不易除去，也会降低 蛋白质的活性，污染蛋白质；此外m r p c 分离蛋白时所采用的低p h 也有可 能对蛋白的活性造成影响。 尽管如此，h p r p c 依然广泛用于多肽和蛋白质的分离纯化。hj 等【3 】 将h ：p r p c 应用于从蛇毒中分离纯化丝氨酸蛋白酶抑制剂。z h y h 等【4 】则 将h p r p c 运用到从海参明胶水解产物中纯化a c e 抑制肽。o l i v e nj e 等人 【5 】在c 4 半制备反相柱上建立了实验室级的纯化重组人促甲状腺素的方法。 磁mj y 等人【6 】用c 1 8 反相柱从人羊水中纯化一种抗菌肽。 1 2 2 高效疏水作用色谱( h p c ) 用适度疏水性的固定相，以含盐的水溶液作为流动相分离生物大分子的 液相色谱叫疏水相互作用色谱或简称疏水色谱。h p h i c 具有以下几个优点： 分离蛋白质时，活性回收率高；采用盐的水溶液作为流动相，可以保持蛋白 质的生物活性；流动相成本低，相对于h p r p c 大大减少了使用有机溶剂对环 境造成的污染；在分离方法上可作为h p r p c 的一个补充。 h p h i c 利用蛋白质的疏水性进行分离，是一种通用型的液相色谱技术， 已经被用于很多种蛋白质或多肽的分离与纯化。b a l a g i l n l n a t h 锄b 等【7 】使用 h p h i c 一步纯化细胞内表达的重组溶栓酶。s o n ib 等【8 】则将h p h i c 运用到从 新西兰麻中一步纯化藻青蛋白。k o s t a r e v ai 等【9 】在他们最新发表的研究论文 中介绍了使用h p h i c 纯化抗体杂聚物的方法。p a s s 撕n h al a 【1 0 】则运用 h p h i c 从大肠杆菌提取物中分离纯化重组人可溶儿茶酚邻甲基转移酶。 1 2 3 高效体积排阻色谱( h p s e c ) h p s e c 与前面几类色谱的分离机理不同，它的分离主要依据溶液分子体 积大小的差别，而不依赖于溶质在流动相和固定相间的相互作用力。由于 2 西北大学硕士学位论文 h p s e c 独特的分离机理，其具有如下优点：保留时间短，峰形窄，易于检测； 保留时间反映分子体积，有利于未知物鉴定；分离条件温和；溶质回收率高。 但由于其分离体积有限，峰容量较小及不能分离大小非常相似的分子是它的 缺点。 虽然相对于其他的h p l c 方法，h p s e c 的负载量较低，但由于其分离原 理的特殊性，可以与其他方法互补，也被广泛地应用在蛋白质和多肽的分离 上。s c h l a t t e r c rj c 等【1 1 】将h p s e c 用于纯化前列腺素d 合酶。h o m e m 锄d a 等人【1 2 1 报道了应用h p s e c 纯化单克隆免疫球蛋白g 。h p s e c 的另一个特殊 用途是估测大分子的分子量范围，此外还经常用于蛋白质分离纯化链末端的 除盐过程。 1 2 4 高效离子交换色谱( h p i e c ) h p c 同阳p r p c 一样被广泛的用于多肽、蛋白质和其他生物大分子的分 离。它具有如下优点：高容量；高分辨率；温和的分离条件；通用性；在分 离时对样品有一定浓缩作用；相对低的耗费。h p c 的保留机理有静电作用 模型和溶质计量置换保留模型( s d t r ) 。带电生物大分子或生物大分子的 带电区域( 中性生物大分子由于表面电荷分布不均匀性，也有静电荷不为零 的区域) 通过静电作用与固定相上带相反电荷的区域作用而得到保留，保留 的强弱与静电作用的大小有关，作用力大保留强，反之保留弱。 通常离子交换色谱固定相是通过基质表面化学改性得到不同性质的离 子交换官能团。根据固定相表面所带官能团的不同，离子交换柱可被分为阴 离子交换柱和阳离子交换柱，这两种离子交换柱根据所带官能团电离能力的 不同又可分为强阴离子( s a x ) 、弱阴离子( 眦) 、强阳离子( s c x ) 、 弱阳离子( w c x ) 4 种。常见的s a x 有季胺离子，w a x 有伯、仲、叔胺， s c x 有磺酸基、磷酸基，w c x 有羧基。 常见的用于蛋白质分离的离子交换剂基质材料有硅胶基质和有机聚合 物两大类。硅胶基质的主要特点是刚性好、耐压，没有树脂那种固有的溶胀 和收缩现象，且孔径和形状容易控制。此外，由于溶质易于通过相对较大的 大孔与固定相上的活性位点接触，因此传质速率快，柱效高。有机聚合物是 作为离子交换用的传统的填料，与硅胶基质填料相比，其具有耐受p h 范围广 3 西北大学硕士学位论文 泛、化学稳定性高以及易于衍生化等优点。 目前，有机高聚物固定相是应用最为广泛的离子交换填料，近年关于新 型有机聚合物离子交换固定相的研究较多。w a n gm y 等【1 3 】制备了聚乙烯 亚氨修饰的甲基丙烯酸酯乙烯基二甲基丙烯酸酯共聚整体柱，研究了牛血 清白蛋白的保留。陈刚等人【1 4 】合成了缩水甘油醚基甲基丙烯酸甲酯乙烯基 二甲基丙烯酸酯共聚微球疏水介质阳离子交换固定相，并对其色谱性能进行 了系统的研究。u n s a le 等人【1 5 】合成了用于蛋白分离的单分散多孔缩水甘油 醚基甲基丙烯酸甲酯乙烯基二甲基丙烯酸酯共聚物和2 ，3 二羟基丙基甲基 丙烯酸甲酯乙烯基二甲基丙烯酸酯共聚物两种离子交换固定相。关于高分 子聚合物离子交换树脂的研究，国内龚波林实验室也做了大量工作【1 6 1 8 】。 肿c 被广泛用于蛋白质分离的主要原因之一是流动相的选择比较灵 活方便。它既可以通过改变离子强度也可以通过改变p h 来获得好的分离效 果，改变离子强度最为常用，但改变p h 的方式也逐渐得到了重视【1 9 】。p h 的变化会改变蛋白质的静电荷，还会影响配体的电离程度，造成蛋白质在 h p c 上的保留产生不同的改变，从而得到分离。h p 正c 通常采用盐浓度增 加的梯度洗脱方式分离蛋白质。除p h 、盐的种类和浓度外，影响h p c 分离 的因素还有柱长、温度和添加剂等。 蛋白质在h p 正c 上是依据蛋白质与配体间的静电作用力不同进行分离 的，它采用盐水体系作流动相，使得许多蛋白质在分离之后仍可保持高的生 物学活性，因此被广泛用于蛋白质的分离。j a c 0 bn 等【2 0 】在分离纯化由利迪 链霉菌产生的多聚半乳糖醛酸酶时采用了h p c 。a i z a w ap 等【2 1 】将加? c 用于大规模的从人血浆中制备凝血酶。p a t i lg 等【2 2 】建立了利用瑚? 正c 获得 高纯度c 藻青蛋白的方法。s h ib x 等【2 3 】使用两次h p c 纯化重组水蛭素 - i i 。 1 2 5 高效亲合色谱( h p a c ) 亲合色谱是基于分离物与配体间特异性亲合作用来达到对生物大分子 的分离的，已被广泛的用于蛋白质的分离纯化。h p a c 与其他h p l c 技术相 比有以下特点：作用机理不同，分离选择性强，纯化倍数高；专用于生物大 分子的分离；h p a c 色谱柱专用性强，只能分离一种或一类物质。h p a c 也 西北大学硕士学位论文 有自身的缺点，如：柱子专用性强，成本高；易产生不可逆吸附；分离的动 力学过程慢；柱子寿命较短；制备填料时技术要求高。蛋白质在h p a c 上的 分离主要依赖于配体与分离物间的识别，这种识别作用符合所谓的钥匙作用 模型和诱导作用模型，具有高度的生物选择性。 目前常用的亲合色谱有外援凝集素亲合色谱( k c t i na f ! f i i l i t yc h r o m a t o - 掣a p h y ) ，免疫亲合色谱( h i l m u n o a f f i n i t yc h r o m a t o 卿h y ) ，d n a 亲合色谱 ( d n a a f i n i t yc h r o m a t o 伊a p h y ) ，蛋白配体亲合色谱( p r o t e i nl i g 锄d a f i i n i t yc l 啪m a t o 鲫h y ) ，染料配体亲合色谱( d y e - l i g 卸da f ! f i i l i t yc h r o m a t o 一莎l p h y ) ，固定金属离子亲合色谱( h m o b i l i z e dm e t a l - i o na f ：f i n i t yc i h 舳a t o - 伊a p h y ，i m a c ) 等。 i m a c 是基于蛋白质对固定在基质上金属离子亲合能力的不同进行分离， 较其它亲合色谱法有许多优点：在低离子强度下可分离亲合金属的蛋白质， 在高离子强度下又显示疏水特性，可作为疏水柱分离不同疏水性的蛋白质； 同一基质可吸附不同金属离子，制备性能不同的金属螯合柱，且金属离子的 再生和更换非常容易，柱寿命长；在多数情况下蛋白质通过柱子仍保持生物 活性；与其它亲合柱相比，蛋白质负载量高，容易放大和工业化。 蛋白质在i m a c 中的保留一般认为是静电、疏水和配位作用的总和。所 谓配位作用是蛋白质表面氨基酸残基，如h i s 、c y s 、唧上的n 、o 、s 等富 电子原子将其孤对电子插入固定金属离子d 层空价电子轨道形成配位键；静 电作用是带电金属螯合配体与带电蛋白质分子间以及近距离范围带电配位 原子与固定金属离子电荷间的相互作用；疏水作用是固定相疏水碳链与蛋白 质表面疏水区域的作用，这种作用随溶液盐浓度的增加而增大。这三种作用 力在不同条件下对蛋白质的保留贡献大小不一，常随流动相、固定相和蛋白 质的性质发生变化。 i m a c 填料由基质、间隔臂和配体三部分组成。常用于i m a c 填料的基 质材料有交联琼脂糖、硅胶、纤维素和有机高分子聚合物等。i m a c 的配体 由两部分组成：络合剂和金属离子，金属离子在分离中起主要作用。i m a c 中常用的络合剂有亚氨基二乙酸( i d a ) 、，一三( 羧甲基) 乙烯二胺 ( t e d ) 、氨基三乙酸( 删、羧甲基天门冬氨酸( c m a s p ) 、四乙烯戊 5 西北大学硕士学位论文 胺( 1 e p a ) 、羧甲基口，卢一二胺丁二酸( c m d a s 砧和乙二胺，二乙酸 ( e d d a ) 等【2 4 2 6 】。常用的金属离子为具有d 层空价电子轨道的过渡金属如 c u 2 + 、n i “、c 0 2 + 、z n 2 + 、f e 3 + 等，它们与络合剂形成可与蛋白质结合的金属 螯合配体。 眦用于蛋白质分离时，常用的洗脱方式为增加离子强度和降低p h 的 梯度洗脱，有必要时也可采用分段洗脱。如果蛋白与配位金属作用强，则需 要采用添加竞争剂的竞争洗脱方式。影响i m a c 分离纯化的因素有金属离子、 蛋白质表面氨基酸残基配体、溶液p h 值、离子强度、竞争洗脱剂等。 近年来，i m a c 的基质材料、螯合剂、金属离子等都有新的发展。基质 方面来说，出现了以交联的b - 环糊精【2 7 】和羟基磷灰石【2 8 】为m n c 基屡的报 道；有机物无机物复合基质材料也有学者进行了研究，如交联壳聚糖硅胶 【2 9 ，3 0 】和琼脂糖氧化铝【3 1 】；d e n 讫l ia 等在原有聚合物基质中引入磁性材 料( 如f e 3 0 4 ) ，合成了磁性聚合物i m a c 基质【3 2 ，3 3 】；此外，一些新技术 也被引入到i m a c 基质的合成中，如原子转移自由基聚合( a t o mt r 柚s f e rr a d i c a l p o l y m e r i z a t i o n ，a 瓜p ) 【3 4 】和表面印记覆盖技术( s u 血c ei m p 血恤gc o a t i n g t e c h n i q u e ) 【3 5 】。m a 是使用最为广泛的螯合剂，但新的螯合剂咪唑【3 6 】、染 料【3 1 】、8 - 羟基喹啉【3 7 】、组氨酸【3 2 ，3 8 】和壳聚糖也陆续被研究者引入。在 金属离子方面，b a s s e tc 等首次建立了螯合u 0 2 2 + 亲合色谱方法【3 9 】。 在商品化的龇c 固定相( 如m i a s e p h a d e xg 2 5 ，可以根据实际需要固 定不同金属离子) 产生后，i m a c 在蛋白质分离和纯化中得到了广泛的应用， 成为了生物大分子分离与纯化中的一个重要工具。t 0 d o r o v a b a l v a yd 等【4 0 】 研究了i m a c 纯化人类抗体及其水解片段。g u p t av 等【4 1 】使用c u 2 + i d a 和 n i “d a 柱纯化了大肠杆菌表达的羊生长激素。g l y n o uk 【4 2 】使用n i 2 + n r a 柱一步纯化发光蛋白。v a n 鲫s 等【4 3 】研究了螯合不同金属离子的i d a 柱对 人免疫球蛋白g ( i g g ) 纯化效果。基于h i s 与i m a c 的强烈作用，先将h i s 连 接到被纯化蛋白的c 一或n 一末端( h i s t a g ) ，制成对固定金属离子有亲合力的 融合蛋白，经i m a c 分离后，再用化学或酶法断裂技术除去融合蛋白中的螯合 肽，即得高纯度目标产品，这种技术已得到广泛应用【4 4 ，4 5 】。 6 西北大学硕士学位论文 1 3 四唑简介 四唑( t e t r a z o l e ) 是含有一个碳原子和四个氮原子的五元杂环化合物， 由于它具有很多特殊性质，近年来在药物化学方面得到广泛的应用【4 6 4 8 】。 四唑是羧酸的电子等排体，可以用于替代具有生物活性的化合物的羧基部 分，而且四唑具有更好的生物代谢稳定性【4 6 ，4 7 ，4 9 】。四唑环中氮原子上的氢 可以电离，形成四唑阴离子，其洳随碳原子上支链的改变而变化很大，大 约是0 8 到6 【5 0 】。四唑阴离子与羧酸阴离子一样是平面结构，但四唑阴离 子的电荷是分散在整个四唑环上的。在p h7 4 生理环境下，四唑与羧酸一样 以阴离子形式存在，但其亲脂性约是羧酸阴离子的十倍，可以更好的透过细 胞膜。四唑阴离子还可以与肽链上的氨基酸残基形成两个氢键，因而对生物 大分子具有很好的亲合性【4 7 】。除了在药物方面的应用外，四唑因其高的含 氮量也被应用到高能材料领域【5 1 】。 随着人们对四唑重视程度的逐渐增加，四唑的合成方法也得到了不断 的发展。早期采用删3 与有机腈环加成反应的方法，但如有毒且很容易 泄漏。l 0 f q u i s tr 等【5 2 】采用n h 4 a 和n 龇高温下原位产生卸和腈反应， 克服了早期方法中卸的毒性问题，该反应常使用耐受高温的d m f 做反应 溶剂。这种合成四唑的方法现在也依然被广泛的采用【5 3 5 5 】。后续的研究 者对合成方法的探索主要集中在与n a n 3 产生叱的物质上，文献报道的 n h 4 a 的替代物有盐酸三乙胺【5 6 】、氯化铝【5 7 】、三氟化硼- 乙醚【5 8 】、硝酸 银【5 9 】等。一个较为引人瞩目的进展是d e m k o 和s h a 印l e s s 等使用z n b r 、 n a n 3 和腈在异丙醇和水的溶液中反应制备四唑【6 0 】。此外，一些研究者也 将可溶于有机溶剂的三烷基锡叠氮化物和三甲基硅烷叠氮化物引入到了四 唑的合成中【4 9 】。微波辅助合成的方法兴起后，s h i ej j 等【6 1 】也将其运用 到了四唑的合成中。 1 4 本文的研究工作 根据四唑环特有的性质，本实验室首次将其引入到色谱固定相中。在 前期工作中，已经对含有四唑环的色谱固定相的合成及色谱性能进行了初 步探索【6 2 ，6 3 】。本论文在此基础上，采用改进的制备方法合成了一种以四 7 西北大学硕士学位论文 唑为配体的弱阳离子交换色谱固定相，并首次合成了一种四唑配体金属亲 合色谱固定相，并对这两种四唑配体固定相的色谱性能进行了系统研究。 参考文献 1 r j 辛普森主编，蛋白质纯化实验指南一用于蛋白质组学的研究( p u r i 匆i n gp r o t e i n s 董d r p r o t m i c s al 蛆o 脚r ym a m i a i ，) ，影印版，北京，科学出版社，2 0 0 4 。 2 郭立安，高效液相色谱法纯化蛋白质理论与技术，陕西，陕西科学技术出版社，1 9 9 3 。 3 l n j ，y a n g h l y u h n e ta 1 ，脚f 洳，2 0 0 8 ，2 9 ( 3 ) ，3 6 9 - 3 7 4 。 4 z h a o y h ，u b f ，l i u z y e ta 1 ，a c 跚b 眈 硎，2 0 0 7 ，4 2 ( 1 2 ) ，1 5 8 6 - 1 5 9 1 。 5 o l i v e 妇j e ，d 锄l i a n ir e ta 1 ， zc 矗m m 口纰4 ，2 0 0 7 ，1 1 6 4 ，2 0 6 - 2 1 1 。 6 k i mj y ，l 胱s y ，p a r ks c e ta 1 ，删西儿b 却 y s 彳c 纽一胁玩，m f b d m 岱， 2 0 0 7 ，1 7 7 4 ( 9 ) ，1 2 2 1 1 2 2 6 。 7 b a l a g l m m a t l l a nb ，r 锄c h a n d nn s ，j a y 缸锄a ng e ta 1 ，占幻d i 明1 脚z ，2 0 0 8 ， 3 9 ( 1 ) ，8 4 9 0 。 8 s o n i b ，t r i v e d iu ，m a d 觚1 w 盯d e ta 1 ，肋陀如l l 厂死咖加正，2 0 0 8 ，9 9 ( 1 ) ，1 鹞1 9 4 。 9 k o s t a 佗v ai ，h u n ge ，c 锄p b e c ，：凸删撇蜘弘彳，2 0 0 8 ，1 1 7 7 ( 2 ) ，2 5 4 2 “。 1 0 p 舔s 础n h al a ，b o n i 位i 0m j ，s 0 玳鲥a - s i l v ap e ta 1 ，上劬翮口幻移彳，2 0 0 8 ， 1 1 7 7 ( 2 ) ，2 8 7 2 9 6 。 1 1 s c h l a n e 陀rj c ，b k e rr ，s c h l a t t e r 盯b c ta 1 ， 胁纽g 肠抽岱o 统e ，工勿留 1 2 h o m e m 觚d a ，o n e 璐m ，k u 础1 t j e s j t ee ta 1 ， 上凸删加f d 2 弘4 ，2 0 0 7 ，1 1 5 7 ， 2 3 7 2 4 5 。 1 3 w 抽gm y ，x uj ，z h o ux e ta 1 ，z 凸聊l 口五d 移彳，2 0 0 7 ，1 1 4 7 ，2 4 2 9 。 1 4 陈刚，龚波林，白泉，耿信笃，锄加z 劬绷，2 0 0 7 ，2 5 ，7 7 8 2 。 1 5 u n s a le ，h l a k t ，d u m s 0 ye e ta 1 ，勘口己劬妇彳c 缸，2 0 0 6 ，5 7 0 ，2 4 0 - 2 4 8 。 1 6 常漩，李龙，龚波林，2 0 0 7 ，1 9 ( 4 ) ，3 7 4 3 7 7 。 1 7 龚波林，任丽，阎超等，高等学校化学学报，2 0 0 7 ，2 8 ( 5 ) ，8 3 1 8 3 6 。 1 8 强克娟，朱金霞，卜春苗等，分析测试学报，2 0 0 7 ，2 6 ( 1 ) ，8 1 1 。 1 9 a h a m e dt ，c h i l a m k u r t h is ，n f o rb k e ta 1 ， z ( 冼r o m 口f 叼：彳，a n i c l ei np r e s s 。 8 西北大学硕士学位论文 2 0 j a c o bn ，c p 0 0 m 八，p r e m ae ，占幻删h ，：瑟砌以d 正，a n i c l ei np r e s s 。 2 1 a 血a w ae ，w i n g es ，勋d s ng ，刀l 嗍妇妇舰比h ，a n i c l ei np r e s s 。 2 2 p a t i lg ，c h e t h 蛆as ，s r i d e v i a s e ta 1 ， 上c 免m m 口f p 黟彳，2 0 0 6 ，1 1 2 7 ，7 d 名1 2 3 s h ib x ，uj c ，只m c e 船b 幻曲绷，2 0 0 6 ，4 1 ，2 4 4 6 - 2 4 5 1 。 2 4 李蓉，陈国亮，赵文明，化学通报，2 0 0 5 ，( 5 ) ，3 5 2 3 5 9 。 2 5 u e d ae k m ，g o u tp w ，m o 玛蛆t i l ，上劬，i 册口坼4 ，2 0 0 3 ，9 8 8 ，1 彩。 2 6 c h a g ags ，z 曰幻如绷历哪胁班d 出，2 0 0 1 ，4 9 ( 1 - 3 ) ，3 1 3 - 3 3 4 。 2 7 u y c ，s y u m j ，躺绷西嗨z ，2 0 0 5 ，2 3 ( 1 ) ，1 7 - 2 4 。 2 8 s u r b ，l i ns c ，h s uw h ，za r d ，撇f p 杉彳，2 0 0 4 ，1 0 4 8 ，3 1 3 9 。 2 9 w hj m ，l n 柚m m ，z h j y ，如z 肋己肘a c m m 以，2 0 0 6 ，3 9 ( 4 - 5 ) ，1 8 5 1 9 1 。 3 0 ) 【ien ，w u j m ，z 凸r d ，竹口f 啊4 ，2 0 0 4 ，1 0 5 7 ，4 1 4 7 。 3 1 h i d a y a tc ，n a 蚓i m am ，毗蟛m e ta 1 ，z 姗历d 删多，2 0 0 3 ，9 5 ( 2 ) ，1 3 3 - 1 3 8 。 3 2 啦6 ls ，t d r l nd ，d e n i z l i 八，z 卸己p d 枷蹦，2 0 0 4 ，9 3 ( 6 ) ，2 6 6 9 - 2 6 7 7 。 3 3 t i m 锄e nd ，i v l l zh ，d e n i ：z l i a ，如f 上历以 缸c m m d 己，2 0 0 6 ，3 8 ( 2 ) ，1 2 6 - 1 3 3 。 3 4 m c c a n h yp ，c h a t t o p a 曲y a ym ，m 讪h a u s 盯g lc ta 1 ，彳加厶黝删，2 0 0 7 ，3 6 6 ( 1 ) ，1 - 8 。 3 5 i jf ，i j ) 【m ，z h a n gs s z 凸删加螂，：彳，2 0 0 6 ，1 1 2 9 ，2 2 3 - 2 3 0 。 3 6 a r v i d s s o ne ，l v a n o va e ，g a l a e vi 1 m e ta 1 ，上c 而，0 忉口l d 移召：b i 伽a l 缸口，& 妇以仪磐 口以铆眈口f 豇栅，2 0 0 1 ，7 5 3 ，2 7 9 2 8 5 3 7 面s h c h e n k 0q ，d y b a lj ，m 6 s z 吞r o s o v 矗k e ta 1 ，zc 矗m 口f d g ，：彳，2 0 0 2 ，9 5 4 ，1 1 5 1 2 6 3 8 o d a b 弱im ，g a r i p c 蛆b ，d e n i z l ia ，z 却踞p d 枷l ，2 0 0 3 ，9 0 ( 1 0 ) ，2 8 似2 8 4 7 。 3 9 b a 蹴tc ，d e d i 印八，g u 6 血p e ta 1 ，上劬，d ，撇f p 跖彳，2 0 0 8 ，1 1 5 8 ，2 3 3 - 2 4 0 。 4 0 t 0 d o r 0 v a - b a l v a yd ，p i t i o to ，b o l l r h i mm ，z 吼，i 姗口f p 弘曰，2 0 0 4 ，8 0 8 ( 1 ) ， 5 7 6 2 。 4 1 g u p t a v ，e s h w 撕an s ，p 如d a a ke ta 1 ，上劬，i 溯口f 1 9 弘彳，2 0 0 3 ，9 9 8 ，9 3 - 1 0 1 。 4 2 g 1 ) r n o uk ，i o a 皿o up c ，c 缸s t o p o u l o st k ，m 纪胁点印r e s s 三c 柳口耐 ，_ c 口砌订， 2 0 0 3 ，2 7 ( 2 ) ，3 8 4 - 3 9 0 。 4 3 v a n c a ns ，m 妇n d ae a ，b u e n os m a ，肋c 巴站b 幻曲绷，2 0 0 2 ，3 7 ( 6 ) ， ， 5 7 3 5 7 9 。 q 西北大学硕士学位论文 4 4 w e s t r ad f ，w e u i n gg w ，1 0 d e d 驰d g a m e ta 1 ，上劬，伽口f d i 旷刀? 曰砌批z & 泐c 嚣口耐铆比口f 溉，2 0 0 1 ，7 6 0 ( 1 ) ，1 2 9 1 3 6 。 4 5 l d u g h r 姐s t ，l d u g h 砌n b ，r y 姐b j c ta 1 ，么以口肋西删，2 0 0 6 ，3 5 5 ( 1 ) ， 1 4 8 1 5 0 。 4 6 h e r tr j ， b 如d r g 肘a 反c h e 柳，2 0 0 2 ，1 0 ，3 3 7 乒- 3 3 9 3 。 4 7 m ) r z n i 】【o vl v ，h r a b a l e ka ，k d l d o b s l 【i ig i ，c 抛肌胁幼1 d 缈lq 哪磁，2 0 0 7 ， 4 3 ( 1 ) ，1 9 。 鸫h e m a n d c z 八s ，c h e n g et w ，m u s i a l c m c ta 1 ，b 加，g 朋硪劬绷工绒，2 0 0 7 ， 4 9 k o l d o b s k i ig1 ，o s 仃o v s l d iva ，j 札鼹c a 绷r e 让，1 9 9 4 ，6 3 ( 1 0 ) ，7 9 7 - 8 1 4 。 5 0 b 0 m e i aa 八，zc a 删助g 加纽，2 0 0 1 ，4 6 ( 4 ) ，9 3 9 - 9 4 3 。 5 1 阳世清，徐松林，雷永鹏，含能材料，2 0 0 6 ，1 4 ( 6 ) ，4 7 5 - 4 8 4 。 5 2 胁g 卸wq ，h e n 巧r 八，l 0 f q u i s tr ， 上曲，1 c 抛肌s 阢，1 9 5 8 ，舳( 1 5 ) ， 3 9 0 8 - 3 9 1 1 。 5 3 s h 诎a t ，s h i m a d a k ，m a t s u i s e ta 1 ，b 加侈胍凸绷，2 0 0 6 ，1 4 ，6 7 8 删。 5 4 r a m l am m ，o m 盯m 八，e l - k h a m r y 八m e t c ，曰d d 侈肘毛正c a 绷，2 0 0 6 ，1 4