（环境工程专业论文）烯唑醇在土壤、小麦中的残留消解动态及其微生物降解研究.pdf

中文摘要 本文首先建立 - j , 麦和土壤中烯唑醇残留的检测方法，添加回收试验结果表明， 在添j n 0 0 2 , - 一1 0 0m g k g 的4 个水平，烯唑醇的平均回收率为7 9 2 8 - - 一1 0 0 6 4 ，变异系 数为2 9 9 - - - 6 3 7 ，最低检出量为0 0 2 n g ，最低检出浓度为0 0 2 m g k g 。所建立的分析 方法简便快速，灵敏度高，并有良好的精确度，符合农药残留检测要求。在此基础上， 研究了1 2 5 烯唑醇可湿性粉剂在天津和合肥试验点小麦田中的残留消解动态。从农 药厂污泥中驯化、分离出烯唑醇高效降解菌，并对其降解特性进行了研究。研究结果 如下： 消解动态试验结果表明，1 2 5 烯唑醇可湿性粉剂在小麦上的消解规律符合一级 动力学模型。以1 2 5 烯唑醇可湿性粉剂0 2 4 9 m 2 喷施后：2 0 0 6 和2 0 0 7 两年天津试 验点小麦中原始沉积量分别为1 9 6 0 m g k g 、1 2 3 9 m g k g ，其消解半衰期分别为9 6 9 天、8 5 5 天；土壤中原始沉积量分别为1 3 6 4 m g k g 、1 7 6 m g k g ，其消解半衰期分别 为1 2 9 5 天、1 4 7 1 天。2 0 0 6 和2 0 0 7 两年合肥试验点小麦中原始沉积量分别为 1 1 5 3 m g k g 、0 7 0 9 m g k g ，其消解半衰期分别为7 1 0 天、6 7 7 天；土壤中原始沉积量 分别为1 8 4 7 m g k g 、1 3 5 5 m g k g ，其消解半衰期分别为1 3 0 3 天、1 1 9 7 天。 从生产烯唑醇的农药厂废水处理池的活性污泥中驯化、分离得到6 株能以烯唑醇 为唯一碳源生长的细菌，分别命名为l 群、2 撑、3 群、4 撑、5 拌、6 群。实验结果表明，这六种 菌都是好氧菌种，对烯唑醇降解率大于3 0 的有1 撑、3 捍、矿、矿，其中1 群为优势菌种。 该优势菌降解烯唑醇的最适温度为3 0 - - - 3 5 ，最适p h 值为7 0 ，投加o 4 0 4 m g l 的菌株 母液量为1 0 ，烯唑醇的最佳初始浓度为3 0 m g l 。该菌在上述最适条件下，1 5 0r m i n 摇床培养6 天，对烯唑醇的降解率可达7 8 1 4 ；优势菌1 群单菌对烯唑醇的降解要比复 合菌对其降解的效果好。在培养液中添加5 0 m l 的烯唑醇，在上述最适条件下，分 别对0 、6 、1 0 天的降解产物进行提取，经g c m s 检测可知，无中间产物形成，推测 其降解产物为c 0 2 和h 2 0 ，研究结果可为含该农药的废水处理中的应用提供基础数据 和参考。 关键词：烯唑醇；小麦；土壤；残留消解；微生物降解 a b s t r a c t a tf i r s t ，r e s i d u e s a n a l y t ：i c a lm e t h o d so fd i n i c o n a z o l ei nw h e a ta n ds o i lw e r e e s t a b l i s h e d t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h ea v e r a g er e c o v e r i e sw e r e7 9 2 8 一10 0 6 4 w h e n t h ea d d e dl e v e l sw e r ef r o m0 0 2 m g k gt o1 0 0m g k g t h ec vv a r i e df r o m2 9 9 t o6 3 7 ， t h el i m i to fd e t e c t i o nw a so 0 2n g ，a n dt h el i m i to fd e t e c t i o nw a s0 0 2m g k g t h ea n a l y s i s w a se a s y , q u i c k s e n s i t i v ea n da c c u r a t e t h em e t h o da c c o r d sw i t ht h ed e m a n do fp e s t i c i d e s r e s i d u ea n a l y s i s a n dd i s s i p a t i o nd y n a m i c so fd i n i c o n a z o l ei nw h e a tw e r el e a r n e di n t i a n j i n ga n dh e f e i a no p t i m a ld e g r a d a t i o n a lb a c t e r i aw a si s o l a t e df r o ma c t i v a t e ds l u d g e w h i c hw a sc o l l e c t e df r o m p e s t i c i d ef a c t o r y ，a s w e l la s b i o d e g r a d a t i o n o f d i n i e o n a z o l e ，w e r es t u d i e di nt h i sp a p e r t h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w s r e s i d u a ld i s s i p a t i o nd y n a m i c se x p e r i m e n ts h o w e dt h a tt h eo r i g i n a ld e p o s i t i o n sw e r e 1 9 6 0 m g k g , 1 2 3 9 m g k g ，r e s p e c t i v e l y ；t h ed i s s i p a t i o nh a l f - l i v e so fd i n i c o n a z o l ei nw h e a t w e r e9 6 9d a y sa n d8 5 5d a y s ，r e s p e c t i v e l y t 1 1 eo r i g i n a ld e p o s i t i o n sw e r e1 3 6 4 m g k g ， 1 7 6 0 m g k g ，r e s p e c t i v e l y , a n dt h ed i s s i p a t i o nh a l f - l i v e so fd i n i c o n a z o l ei ns o i lw e r e l 2 9 5 d a y sa n d14 17d a y sr e s p e c t i v e l y , i nt i a n j i n gd u r i n g2 0 0 6a n d2 0 0 7 r e s i d u a ld i s s i p a t i o nd y n a m i c so fd i n i c o n a z o l ei nw h e a tf o l l o w e dk i n e t i cm o d e l t h e o r i g i n a ld e p o s i t i o n so fd i n i c o n a z o l ei nw h e a ti nh e f e ii n2 0 0 6w a s1 15 3 m g k g ；t h e o r i g i n a ld e p o s i t i o n si n2 0 0 7w a s0 7 0 9 m g k g ；t h ed i s s i p a t i o nh a l f l i v e so fd i n i c o n a z o l ei n w h e a ti nh e f e ii n2 0 0 6a n d2 0 0 7w e r e7 10d a y sa n d6 7 7d a y s ，r e s p e c t i v e l y t h eo r i g i n a l d e p o s i t i o n so fd i n i c o n a z o l ei n s o i lw e r e1 8 4 7 m g k g ，1 3 5 5 m g k g ，r e s p e c t i v e l y , a n dt h e d i s s i p a t i o nh a l f - l i v e sw e r e13 0 3d a y sa n d1 1 9 7d a y sr e s p e c t i v e l y ，i nh e f e id u r i n g2 0 0 6 a n d2 0 0 7 s i xb a c t e r i an a m e d1 群、2 群、3 存、矿、5 撑、矿w h i c hc a nu t i l i z ed i n i c o n a z 0 1 ea ss o l ec a r b o n s o u r c ew e r ei s o l a t e df r o ma c t i v a t e ds l u d g ec o l l e c t e df r o ms e w a g e t r e a t i n gs y s t e mo f p e s t i c i d ef a c t o r y ，t h e n ，t h eo p t i m a ld e g r a d a t i o nc o n d i t i o n so nd i n i c o n a z o l eo ft h e s e b a c t e r i u m sw e r es t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a ts i xb a c t e r i aa l lw e r ea e r o b i o s i s t h e d e g r a d a t i o ne f f i c i e n c yt od i n i c o n a z o l eo fl 群、3 群、4 、矿c o u l dr e a c ha b o v e3 0 a n d1 舟w a s p r e d o m i n a n tb a c t e r i u m t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r e ，p h ， b a c t e r i a m u t t e r l a u g e a n d d i n i c o n a z o l ei n i t i a lc o n c e n t r a t i o nf o rd e g r a d a t i o no fd i n i c o n a z o l eb yt h e1 秤w e r e3 0 3 5 ， 7 0 ，10 o f0 4 0 4 m g la n d3 0 m g l ，r e s p e c t i v e l y 7 8 14 o ft h ed i n i c o n a z o l ew a s d e g r a d e di n6d a y ss h a k i n ga ts p e e do f15 0r m i na n da ta b o v e - m e n t i o n e do p t i m a l c o n d i t i o n s t h ed e g r a d a t i o ne f f e c to ft h i ss u p e r i o rb a c t e r i u mn a m e d1 群w a sb e t t e rt h a n m i x e db a c t e r i a i nt h ea b o v eo p t i m u m c o n d i t i o n s ，d i n i c o n a z o l e ( 5 0m g l ) w a sa d d e dt ot h e i l c u l t u r ef l u i da n df e r m e n t e df o r0d a y s ，6d a y s ，10d a y sr e s p e c t i v e l y t h eb i o d e g r a d a t i o n p r o d u c t sw e r ee x t r a c t e dr e s p e c t i v e l y ，a n dw e r em e a s u r e db yg c m s t h er e s u l t ss h o w e d t h a tt h eb i o d e g r a d a t i o np r o d u c t sw e r ei n n o c u o u sm a t t e r s ，s u c ha sc 0 2a n dh 2 0 t h e s e r e s u l tm a yo f f e rb a s i cd a t aa n dr e f e r e n c et od i s p o s i n gd i n i c o n a z o l ei nw a s t ew a t e r k e yw o r d s ：d i n i c o n a z o l e ，w h e a t ，s o i l ，r e s i d u e ，b i o d e g r a d a t i o n i l l 插图和附表清单 公式l 残留量的计算公式9 公式2 降解率的计算公式1 0 表11 2 5 烯唑醇可湿性粉剂田间试验6 表2 烯唑醇在小麦植株和土壤中的添加回收结果1 3 表32 0 0 6 年1 2 。5 烯唑醇可湿性粉剂在天津、合肥小麦上的消解动态1 4 表42 0 0 6 年1 2 5 烯唑醇可湿性粉剂在天津、合肥土壤中的消解动态1 5 表52 0 0 7 年1 2 5 烯唑醇可湿性粉剂在天津、合肥小麦上的消解动态1 6 表62 0 0 7 年1 2 5 烯唑醇可湿性粉剂在天津、合肥土壤中的消解动态1 7 表7 培养基中的烯唑醇经不同提取剂提取的添加回收试验1 8 图l 烯唑醇标准曲线1 1 图2 烯唑醇标样气相色谱图11 图3 小麦植株空白气相色谱图1 2 图4 小麦植株添加气相色谱图1 2 图5 土壤空白气相色谱图12 图6 土壤添加气相色谱图1 2 图72 0 0 6 年烯唑醇在小麦中的消解动态曲线1 4 图82 0 0 6 年烯唑醇在土壤中的消解动态曲线1 4 图92 0 0 7 年烯唑醇在小麦中的消解动态曲线1 6 图1 02 0 0 7 年烯唑醇在土壤中的消解动态曲线1 6 图1 1 不同的菌种降解烯唑醇的曲线1 9 图1 2 菌株l # 的生长曲线1 9 图1 3 温度对烯唑醇降解的影响1 9 图1 4p h 对烯唑醇降解的影响1 9 图1 5 投菌量对烯唑醇降解的影响一2 0 图1 6 烯唑醇初始浓度对降解率的影响2 0 图1 7 投菌量对烯唑醇降解的影响2 l 图1 8 单菌、复合菌对烯唑醇降解能力的比较2 1 术语与略语表 术语及略语英文全称 m i c r o g r a m n a n o 粤卸m m i l i g r a m g r a m k i l o g r a m m i c r o n m e t r e m i l l i m e t r e c e n t i m e t r e m e t e r s q u a r em e t e r m i c r o l i t r e m i l i l i t r e l i t r e m i n u t e h o u r d a y m e g a p a s c a l r o t a t e g a sc h r o m a t o g r a p h y i v 中文全称 微克 纳克 毫克 克 千克 微米 毫米 厘米 米 平方米 微升 毫升 升 分钟 小时 天 兆帕 转 气相色谱 呈2岵唱g蚝阻一吼m o此札l口h d r 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过 的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的 材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何责献均已在论文中作了明确的说明并 表示了谢意。 研姓躲毯睦 帆一年6 月佃 关于论文使用授权的说明 本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：兰墨笪匕霞研究生签名：2 丝! 竺磁 第一导师签名 时间：1 机彳年舌月厶日 v 帆叩年6 月啪 1 引言 1 1 烯唑醇简介 烯唑醇( d i n i c o n a z o l e ) 又名特谱醇，是日本住友化学工业公司于19 8 4 年研制成功 的新型、高效、广谱、内吸性、低毒并兼作植物生长调节剂的杀菌剂品种1 1 ，化学名 称：( e ) - ( r s ) - 1 一( 2 4 二氯苯基) 一4 ，4 二甲基2 ( 1 , 2 ，4 三唑1 基) 1 戊烯3 醇；分子式： c 1 5 h 1 7 c 1 2 n 3 0 ，分子量：3 2 6 0 9 2 训。 化学结构式： 99 联 ly “ a 奇c 耩等譬一缸c 姗j 蠹 | l 捌一狴 1 1 1 理化性质 原药为无色结晶固体，熔点1 3 4 - 1 5 6 。c 。在2 0 下，密度为1 3 2 ，蒸气压2 9 3 m p a ； 在2 5 ( 2 下，蒸气压4 9 m p a ，水中溶解度4 0 r n g l ，甲醇9 5 9 k g ，丙酮9 5 9 k g ，二甲牟 1 4 9 k g ，己烷0 7 9 k g 。对光、热和潮湿稳定，常温下贮存稳定性可达两年【2 捌。 1 1 2 毒性 属低毒农药。雄大白鼠急性 1 3 l d 5 0 为6 3 9 m g k g ，雌大鼠为4 7 4 m g k g ；大鼠急性 经皮l d s o 5 9 k g 。对皮肤无刺激作用，对眼睛有轻微刺激。大鼠急性吸a l c 5 0 ( 4 小时： 2 7 7 0 m g k g 。a m e s ( 污染物致突变性检测) 试验结果为阴性。北美鹌鹑l d s o ) 自 1 4 9 0 2 m g k g ，野鸭l d s o 2 9 k g ，野鸭l c s o ( 8 天) 为5 0 7 5 m g k g 饲料。鱼毒l d s o ( 9 6 d x 时) ： 鲤鱼4 0 m g l ，日本k i l l f i s h 鱼6 8 m g l ，虹鳟1 5 8 m g l ，蜜蜂急性接触l d 5 0 2 0 u g 蜜蜱 2 - 3 ，5 】 o 1 1 3 剂型 国内外的主要剂型有可湿性粉剂、乳油、拌种剂、悬浮剂和微乳剂等 6 。1 4 1 。 1 1 4 作用方式及机理 杀菌剂是属于麦角甾醇生物合成抑制剂，它具有广谱的抗菌活性，特别对子囊菌 和担子菌有较高活性。它对孢子萌芽的抑制作用小，而明显抑制萌芽后芽管的伸长、 吸器的形成及菌体在植株体内的生长发育、新孢子的形成等。植物种子、根、叶片均 能内吸，并具有较强的向顶传导性能。主要作用机制是抑制c 1 4 位的脱甲基反应，使 甾醇合成受阻，破坏菌体的功能，导致真菌细胞膜不正常，最终真菌死亡。d m i ( 甾 醇c 一1 4 a 脱甲基酶抑制剂) 类杀菌剂的抗药性机理主要表现在以下3 个方面：药剂在 菌体内积累减少，以致达到作用靶点的药量不足而表现出杀菌剂的活性下降。d m 】 抗药菌株内1 4q d m ( 1 4 a 脱甲基酶) 的光谱和酶功能均发生变化。有毒害作用的甲 基甾醇的快速更新( 脱毒) 【1 5 】。 烯唑醇不仅具有杀菌作用，同时对植物有一定的生长调节功能。该类化合物能够 调节植物生长发育的机理在于：它们参与植物体内异戊二烯的代谢过程，抑制赤霉素 的生物合成，诱导和促进脱落酸及细胞分裂素的合成，改变植物体内的激素平衡，从 而有效地调节和控制植物的生长发育【l 6 。 1 1 5 防治对象 主要用于防治葡萄、苹果、梨等果树的白腐病、黑星病、黑斑病【1 7 捌和水稻等禾 谷类作物的稻曲病、玉米丝黑穗病掣2 卜2 2 1 。对花生、甜菜等经济作物的叶斑病、锈病 及芦笋的茎枯病、荸荠的秆枯病、白菜的黑斑病等也有很好的防治效果 2 3 乏8 1 ，是 “九五”期间我国农药工业重点推广产品【2 9 1 。据报道，烯唑醇对小麦条锈病和白粉 剧9 1 ，对大麦条纹病、根腐病、散黑穗病 3 0 】等具有优异的保护作用和治疗作用，田 间防治效果和保产效果优于目前生产上大面积使用的三唑酮【3 l - 3 2 1 。烯唑醇作为广谱 性杀虫剂，已广泛应用于农业生产中【3 3 1 。 1 1 6 注意事项 ( 1 ) 本品不可与碱性农药混用。( 2 ) 药品应在通风、干燥、阴凉处贮存。( 3 ) 喷药时 要穿工作服、戴好口罩、手套，要避免药液吸入或沾染皮肤，药后要及时冲洗。( 4 ) 当稀释液倍数偏小时，对黄瓜、西葫芦生长有抑制作用。( 5 ) 拌种时要先用少量水喷 洒种子，将种子润湿，然后按推荐的用药剂量拌种，应充分混拌均匀，然后再播种。 ( 6 ) 长时间并单一使用该药，容易使病菌对其产生抗药性，建议与作用机制不同的其 他杀菌剂轮换使用。( 7 ) 该药对藻状菌纲病菌引起的病害无效【5 j 。 1 1 7 使用现状 据对烯唑醇杀菌剂产品登记动态概要可知，1 9 9 2 年至2 0 0 6 年全国2 0 个省、区、市 7 3 家企业登记产品9 3 个厂次( 包括原药、单剂和复配制剂) 。其中2 0 0 1 年登记产品1 9 个 厂次，占全程产品登记总量的2 0 4 ，成为全程产品登记最高年度。江苏省1 9 9 3 年至 2 0 0 6 年有2 2 家企业登记产品3 4 个厂次。山东省2 0 0 1 年至2 0 0 6 年有8 家企业登记复配制 剂8 个厂次。河北省2 0 0 0 年至2 0 0 5 年有5 家企业登记产品7 个厂次。山西省运城奇星农 药有限公司2 0 0 5 年登记3 2 5 锰锌烯唑可湿性粉剂，用来防治苹果树斑点落叶病、 梨树黑星病 3 4 】。 1 1 8 烯唑醇发展趋势与展望 ( 1 ) 由于一些农药品种的抗病性不强、病菌致病力的变异、抗药性方面的缺点， 以及连续重茬栽培等原因，使得农2 对农作物病虫害防治效果降低，为解决这个问题， 混合农药的开发已成必然。充分发挥混合药剂的长处，达到“一次施药、病虫兼治 的目的。目前，单拿烯唑醇来说，含有2 种成分的2 0 烯唑醇高效氯氰菊酯水乳剂、 6 0 福美双烯唑醇干粉种衣剂、井冈霉素烯唑醇混剂、1 5 啶虫脒烯唑醇可湿 性粉剂、烯唑醇与多菌灵复配剂和3 种成分的1 5 福美双吡虫啉烯唑醇悬浮种衣 剂等已经推向市场【3 5 4 1 2 1 j 。 ( 2 ) 要想减少药剂对环境的污染就只有减少农药用量，在药剂毒力不变的情况下， 减少用药量与提高防效存在着一定的矛盾，而导向农药有可能解决这个矛盾m 】。所谓 导向农药【4 2 1 ，就是农药有效成分在导向载体的介导下能在植物体内向特定部位传导的 农药。导向农药的关键是找出适宜的导向载体【4 3 】。许多维管束病害的病原菌主要寄居 在植物的茎基部，大多数内吸性杀菌剂因不能向下传导，通过喷雾不能到达作用部位 而无法防治1 。因此解决内吸性杀菌剂向下传导的问题成为杀菌剂领域的当务之急。 a 萘乙酸等植物生长激素具有在韧皮部容易传导的特性【45 | 。如果以这些物质为导向载 体，与杀菌剂如烯唑醇拼接，可获得向根部传导的新杀菌剂m 】。 ( 3 ) 在大力倡导绿色农业化学的今天，为适应现代农业对农药毒性、安全性、残 效性日益严格的要求，功能高分子材料与农药控制释放技术结合的研究，已越来越引 起人们的青睐 4 7 5 2 】；与此同时，手性新农药的研究和开发，目前也已成为国际上非常 活跃的又一研究领域5 0 - 5 1 , 5 3 - 5 4 。以及聚合物农药的研究也越来越引起人们的广泛兴趣 4 9 - 5 1 , 5 5 - 5 9 】。有关功能高分子材料与农药控制释放技术结合的研究，国外的研究主要集 中在除草剂方面 5 5 , 6 0 - 6 3 】，而国内台立民等【“】研究了以烯唑醇为底物，通过化学反应使 其与苯乙烯马来酸酐交替共聚物结合，得到的聚合物杀菌剂在模拟应用环境中经水 解和微生物降解等过程能够以有效剂量持续释放出活性组分，其杀菌活性与烯唑醇基 本一致，持效期至少3 0 天。这种聚合物杀菌剂能充分利用聚合物稳定性和粘附性，克 服常规农药易受环境因素影响而大量流失的缺点，从而达到有效利用农药，减少环境 污染之目的。在手性新农药的研究和开发方面，以烯唑醇为底物，以( ) 孟氧基乙酸 为拆分试剂进行手性拆分，得到具有高度杀菌活性的r - 型光学异构体烯唑醇，再通过 酯化、聚合等化学反应得到悬垂侧链上具有r 型烯唑醇活性片断的杀菌聚合物。该聚 合物本身不表现生物活性，可以通过化学键的水解断裂持续释放出具有高度杀菌活性 的r - 型烯唑醇，充分发挥手性农药的突出特点，符合农用杀菌剂的速效性和持效性的 要求，有实用意义扣引。 1 2 烯唑醇对环境的污染 农药在为人类创造巨大财富的同时，对环境安全和人身健康也带来了一定威胁。 其中有效利用率低，大量农药进入环境，是其负面影响的主要原因 6 6 - 6 7 。 1 2 1 烯唑醇生产过程中对环境的污染 烯唑醇在合成生产过程中有机物占绝大多数而无机物较少，在合成过程中，需要 大量使用丙酮，因此可能会产生一些丙酮有机废气。在合成生产过程中也会产生氯化 氢气体等有机气体，对环境造成一定的危害。因此减少和处理有机废气是关键【6 8 1 。 3 1 2 2 烯唑醇的使用对环境的污染 农药在防治农作物病虫草害中是发挥了重要作用，同时也对环境造成了污染。在 使用过程中发挥作用的同时，部分被残留在农作物、土壤中，部分挥发到大气中，还 有部分均会不可避免地通过多种途径进入水体，造成地面、大气及水体的污染。破坏 了生态平衡、危及人畜安全。因此，加强对其研究，采取有效措施消除污染，净化环 境具有重要的现实意义。 1 3 研究意义和内容 1 3 1 研究意义 农药在水环境中的降解主要有生物降解、水解和光化学降解等，其中，生物降解 是农药在水环境中降解的重要途径之一，是近年来的研究热点，如王兆守等【6 9 】研究了 拟除虫菊酯类农药微生物降解；李兆坤等【_ 7 0 】研究了甲胺磷农药的微生物降解；明惠青 等 7 1 1 研究了有机磷农药微生物降解；李玉清【7 2 1 研究了丙烯菊酯农药的微生物生物修 复作用等等。因此在生态系统中，微生物对烯唑醇的降解起着重要作用。目前，国内 外对烯唑醇生物降解的研究尚无报道。 通过两年两地的烯唑醇残留动态及微生物降解烯唑醇的试验，建立消解动态模型 得出半衰期、初步了解到烯唑醇在麦田生态系统中的残留情况；并从活性污泥中，分 离筛选得到能高效降解烯唑醇的细菌。希望通过本次研究，不仅可以为该农药的登记 提供残留、降解和检测方法的资料，而且为实际烯唑醇废水生物处理提供高效的微生 物菌种、为将来的生物处理烯唑醇污染提供一些参考。以便取得更好的环境效益和经 济效益。 1 3 2 研究内容 ( 1 ) 通过添加回收率试验，建立烯唑醇在小麦和土壤中的残留分析方法；对各前 处理条件的筛选及对气相色谱操作条件的摸索。 ( 2 ) 于2 0 0 6 年和2 0 0 7 年，在天津、合肥两地对1 2 5 烯唑醇可湿性粉剂在小麦和土 壤中的田间消解动态进行初步研究。进而确定该农药在小麦和土壤中的消解动态模型 及半衰期，并得出消解速率结论，为其正式登记提供残留评价资料。 ( 3 ) 本研究还从活性污泥中，分离筛选出能以烯唑醇为唯一碳源生长的高效降解 菌，并对优势菌种降解特性进行研究，即对该优势菌种生长的最适温度、最适p h 值、 投加菌种母液量、烯唑醇的最佳初始浓度、培养时间的初步研究、优势菌种与复合菌 种对烯唑醇降解的效果进行比较以及对降解产物的测定。为其在含该农药的废水处理 中的应用提供基础数据和参考。 ， 4 2 材料与方法 2 1 药品、试剂和菌源 农药标样：烯唑醇( 纯度9 7 3 ，农业部农药检定所) 。 甲醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、正己烷、无水硫酸钠、氯化 钠均为分析纯；超纯水；弗罗里硅土( 6 5 0 c 烘4 6 d , 时，用前1 3 0 烘5 6 d , 时，再加 不同百分比的水减活) 。 菌源：来自安徽华星化工股份有限公司废水处理池的活性污泥。 2 2 仪器与设备 s p 2 0 0 0 a 型气相色谱仪( e c d 检测器、n - 2 0 0 0 色谱工作站) 、恒温振荡器 ( s h a c ) 、旋转蒸发仪( r e 5 2 a a ) 、离心机( t d z 5 w s ) 、电子天平( f a - 1 1 0 4 ) 、电 热恒温鼓风干燥箱( d h g 9 0 7 0 a ) 、粉碎机( l g 0 4 ) 、7 2 2 s 分光光度计( 上海精密科 技仪器有限公司) 、高压灭菌锅( 上海医用核子仪器厂) 、恒温摇床培养箱( q h z 9 8 a ) 、 恒温培养箱( d h p 9 0 8 2 ) 、无菌超净工作台( s w - c j 2 f ) 、g c m s 仪( a g i l e n t6 8 9 0 n g c 5 9 7 3m s ) 等。 2 3 培养基 富集培养基1 ( l b 培养基) ： 胰蛋白胨 1 0 9 l ， 酵母提取物 5 9 l ， 氯化钠 5 9 l ， p h 7 0 富集培养基2 ( 牛肉膏蛋白胨液体培养基) 7 3 】： 牛肉膏 蛋白胨 氯化钠 水 p h 7 0 - 7 2 驯化培养基( 无机盐培养基) 7 4 】： n a c l n 地c 1 m g c l 2 6 h 2 0 c a c l 2 2 h 2 0 5 5 o g ， 1 0 9 ， 5 o g ， 1 0 0 0 m l ， 1 0 9 0 5 9 0 2 9 0 0 2 9 k 2 i - i p 0 4 o 5 9 k h 2 p 0 4 0 5 9 h 2 0 1 0 0 0 m l p h 7 0 - 7 2 分离筛选培养基： 驯化培养基+ 琼脂( 1 5 2 0 9 ) + 烯唑醇农药( 3 0m g l ) 斜面保存培养基( 牛肉膏蛋白胨固体培养基) ： 牛肉膏蛋白胨液体培养基+ 琼脂( 1 5 2 0 9 ) 2 4 实验方法 2 4 1 残留部分的实验方法 2 4 1 1 试验时间和地点 2 0 0 6 、2 0 0 7 年；天津市和安徽省合肥市。 2 4 1 2 气候条件和土壤类型 天津属于暖温带半湿润大陆性气候，其土壤类型为潮土；安徽为亚热带湿润季风 气候区，其土壤类型为黄褐土。 2 4 1 3 田间试验设计 分小麦和土壤处理区：小麦每小区面积3 0m 2 ，土壤每小区面积6m 2 ，每处理3 次重复，同时设置不施药为对照。田间试验设计见表1 。 表1 1 2 5 烯唑醇可湿性粉剂田问试验 亿l b l e1 t e s to f12 5 d i n i c o n a z o l ei nw h e a t f i e l d 小麦残留消解动态田间试验设计：在小麦白粉病发病初期，按照0 2 4 9 m 2 的剂 量，换算成1 2 5 的制剂为o 1 9 2g m 2 ，即5 7 6 9 3 0 m 2 , 兑水4 l 均匀喷雾在小麦试验 田( 1 次) 。施药区每小区面积3 0m 2 ，每个处理三次重复，同时设置不施药对照。施 药后0 、l 、3 、5 、7 、1 0 、1 4 、2 1 、2 8 、4 5 天以随机多点采样法采集小麦植株，测定 其中烯唑醇的残留量。 土壤残留消解动态田间试验设计：为了保证数据的规律性拟采取模拟实验法：在 小麦地旁选一块空地，按照0 2 4 9 m 2 的剂量，换算成1 2 5 的制剂为0 1 9 2g m 2 ，即 1 1 5 2 9 6 m 2 , 兑水0 8 l 均匀喷于地表上。每小区面积为6 m 2 ，设三个重复。施药后0 、 6 1 、3 、5 、7 、1 0 、1 4 、2 1 、2 8 、4 5 天取0 , - 一1 0 c r n 深度的土壤，测定烯唑醇的残留量。 2 4 2 微生物部分的实验方法 2 4 2 1 菌株的驯化 称取1 0 9 污泥于装有9 0 m l 无菌水的2 5 0 m l 三角瓶中，振荡数小时后，取1 0 m l 悬浮液于9 0 m l 富集培养基1 中，3 0 、1 5 0 r m i n 摇床培养，2 天后取此混合菌悬液 1 0 m l 到含2 0 0 m g l 烯唑醇、9 0 m l 驯化培养基的三角瓶中，同样条件下摇床培养， 7 天为1 个周期。每周期结束后，取驯化菌液1 0 m l 渐次移至含烯唑醇分别为3 0 0 、 4 0 0 、4 5 0 、5 0 0m g l 的驯化培养基9 0 m l 中培养。 2 4 2 2 菌株的分离筛选 取最后一个周期的驯化菌液，并进行梯度稀释( 1 0 以1 0 。6 ) ，将1 0 一、1 0 r 6 分别 涂布于分离筛选培养基平板上，3 0 。c 培养3 天。挑取在形态上有差异且菌落比较大的 菌株，在分离筛选培养基平板上进一步划线分离，3 0 下，连续传代5 次，得到纯种 菌株，分别进行斜面保存。 2 4 2 3 菌种的生长曲线 从斜面上挑取一环茵体接入富集培养基2 中，3 0 ，1 5 0r m i n 摇床培养2 4 小时， 作为菌悬液。制备1 1 瓶牛肉膏蛋白胨液体培养基，其中l o 瓶加菌悬液1 0 ，1 瓶不加 菌作对照，每瓶液体总量为1 0 0 m l 。同样条件下培养5 天，每天定时按顺序从不同的瓶 子中取出5 m l ，每次取两个瓶子的样，以不加菌为对照，测定不同培养时间的培养基 的o d 6 0 0 。然后绘制菌株培养时间与o d 6 0 0 的关系曲线，从而确定菌株稳定生长期阶 段。 2 4 2 4 菌株母液制各 从斜面上分别挑取一环菌体接入到几瓶含富集培养基2 的三角瓶中，3 0 ，1 5 0 r m i n 摇床培养到菌株稳定生长期阶段，离心( 4 0 0 0 r m i n ，5 m i n ) ，弃去上清液，并 以0 9 n a c l 反复洗涤2 次，再次离心，测其湿重，得0 4 0 4 9 l 的0 9 n a c l 菌株母液， 冷藏备用。 2 4 2 5 烯唑醇高效降解菌株的筛选 向驯化培养基中加入o 4 0 4 9 l 菌株母液1 0 ，3 0 c ，1 5 0r m i n 摇床培养，每2 天取 1 次样，进行提取离心，测烯唑醇含量，直至烯唑醇含量不再有明显变化。选出对烯 唑醇降解率大于3 0 的菌株，并将降解率最大的作为优势菌种。 2 4 2 6 产物测定 向驯化培养基中加入2 4 2 4 中的菌株母液5 m l ，5 0m g l 的烯唑醇，1 5 0r m i n ，3 0 。c 培养1 0 天。在0 天、6 天、l o 天分别取样，进行提取离心，提取剂分别为正己烷和二氯 甲烷，测定其降解产物。 2 4 2 7 菌株l 撑对烯唑醇降解的影响因素 以烯唑醇为唯一碳源，1 5 0 r m i n 摇床培养6 天，研究温度、p h 、投菌量、烯唑醇 7 初始浓度、通气量对烯唑醇降解的影响每个处理2 次重复，并作c 时照，取其平均 值确定其最适生长条件。 ( 1 ) 温度对菌株l 样降解烯唑醇的影响试验 在2 5 0 m l = 角瓶中加入4 5 m l 无机盐培养基( p h 为7 o ) 、3 0m g l 烯唑醇和5 m l 上述菌株母液，分别置于2 0 、2 5 、3 0 、3 5 、4 0 、4 5 。c 条件下摇床培养，并在1 小时( 作 为c k ) 和6 天定时取样测定培养基中烯唑醇的残留浓度。 ( 2 ) p h 对菌株1 撑降解烯唑醇的影响试验 将无机盐培养基f 约p i - i 值分别调至5 5 、6 0 、6 5 、7 0 、7 5 、8 0 、8 5 ，溶液中烯唑 醇的浓度为3 0 m g l ，接入5 m l 匕述菌株母液，3 0 。c 振荡培养6 天后测定烯唑醇的含量。 ( 3 ) 投菌量对菌株1 撑降解烯唑醇的影响试验 分别向2 5 0 m l 三角瓶中加入p h 为7 0 的无机盐培养基、3 0m g l 烯唑醇和0 4 0 4 9 l 的菌株母液0 ( c k ) 、2 、5 、8 、1 0 、1 2 、1 5 、1 8 m l ，使其混合液总量为5 0 m l 。3 0 摇床培养，6 天后定时取样进行烯唑醇含量的测定。 ( 4 ) 烯唑醇初始浓度对菌株1 抖降解烯唑醇的影响试验 向装有4 5 m l p h 为7 0 的无机盐培养基、5 m l 菌株母液的2 5 0 m l 三角瓶中分别添加 烯唑醇量为2 0 、3 0 、4 0 、5 0 、6 0 、7 0 m g l 。3 0 摇床培养，6 天后定时取样分析降解 液中烯唑醇浓度。 ( 5 ) 通气量对菌株1 徉降解烯唑醇的影响试验 分别在2 5 0 m l 三角瓶中加3 0 、5 0 、8 0 、1 0 0 、1 2 0 、1 5 0 r a l p h 为7 0 的无机盐培养 基，按1 0 投菌量接种，3 0m g l 烯唑醇，并作c k 对照。其中一组用多层保鲜膜密封 即不让外界空气通入，另一组可通入空气( 用棉塞塞瓶口) ，3 0 ( 2 摇床培养，6 天后 定时取样测定烯唑醇含量。 2 4 3 样品分析 2 4 3 1 样品制备 小麦样品：先将小麦植株剪碎，再粉碎处理。 土壤样品：因考虑到土壤阴干后可能造成农药损失，所以土壤样未经阴干处理而 采取压细混匀处理后直接测定，同时测定土壤含水量。 2 4 3 2 样品提取 小麦植株样品中烯唑醇的提取：称取5 o g 经处理过的植株样品于2 5 0 m l 具塞三 角瓶中，加入4 0 m l 丙酮，在恒温振荡器上振荡提取3 0 m i n 后抽滤，并将滤渣倒回三 角瓶中。再向该三角瓶中加入3 0 m l 丙酮，振荡3 0 m i n 后抽滤，将两次的滤液合并倒 入分液漏斗中。向分液漏斗中加入5 0 m l3 的氯化钠溶液，用4 0 m l x 3 二氯甲烷， 萃取三次，待静置分层后，将下层液过无水硫酸钠于浓缩瓶中，4 2 。c 下浓缩至约l m l ， 待净化。 土壤样品中烯唑醇的提取：称取5 o g 制备后的土壤样品于5 0 m l 塑料离心管中， 加入5 m l 蒸馏水，摇匀后加入2 0 m l 乙腈，振荡提取3 0 m i n 。再向离心管中加入5 0 9 氯化钠，剧烈振荡5 m i n 后，以3 5 0 0 r m i n 离心5m i n ，从上层溶液中准确移取15 m l ， 过无水硫酸钠后收集于浓缩瓶中，4 5 c 下浓缩至约l m l ，待净化。 2 4 3 3 样品净化 小麦植株样品：玻璃层析柱中装入6 o g 弗罗里硅土( 8 水脱活) ，上下各加入约 2 c m 高的无水硫酸钠，轻轻敲打使填充致密。用1 0 m l 石油醚预淋层析柱，将待净化 的小麦植株提取液用2 0 m l 石油醚- 乙酸乙酯( 体积比为4 ：1 ) 混合液分四次( 每次5 m l ) 洗浓缩瓶，上柱，弃去淋出液。用3 0 m l 石油醚乙酸乙酯( 体积比为4 ：1 ) 的混合液 淋洗，收集淋出液于浓缩瓶中，浓缩至近干，用正己烷定容，待测。 土壤样品：玻璃层析柱中装入3 0 9 弗罗里硅土( 5 水脱活) ，上下各加入约2 c m 高的无水硫酸钠，轻轻敲打使填充致密。用1 0 m l 石