单倍体育种技术ppt课件

,玉米诱导单倍体育种技术与应用,陈绍江中国农业大学,1,内容提纲,单倍体育种（DH）背景介绍单倍体育种基本程序国内单倍体育种研究进展系统化与工程化问题,2,无融合生殖类型,一、无性幼胚起源细胞发生的部位和幼胚的发育方式，可以进一步把无融合结实或无融合生殖再分为4种不同的类型:1.无孢子形成（apospory）2.二倍性孢子形成（diplospory）3.不定胚生殖（adventitiousembryny）4.单性生殖（parthenogenesis）,3,有性生殖与各种无融合生殖方式的比较,4,单性生殖孤雌生殖：在正常的有性胚囊中，卵细胞未经受精而直接发育成胚的现象称为单性生殖或雌核发育（gynogenesis）。由单性生殖产生的胚或植株，都是单倍体。孤雄生殖：与雌核发育相对应的另一种单性生殖的形式是雄核发育（androgenesis）。这是一种更为稀有的遗传现象，正常有性胚囊中的卵细胞，因某种原因丧失功能，未能和精子结合，进入胚囊的一个精子占据卵细胞的位置，发育为单倍体的胚。,5,产生玉米单倍体的途径,品种间杂交自发产生的孤雌生殖单倍体不定配子体基因ig诱导的孤雄生殖单倍体化学和物理方法诱导的单倍体花药组织和花粉培养产生的单倍体雌穗、子房或胚珠的离体培养孤雌生殖诱导系杂交诱导产生单倍体,一、背景介绍,6,基本应用：1)育种平台：快速获得纯系，缩短育种年限亲本与高代系纯化种质改良,7,8,育种程序比较,9,2)遗传研究：突变鉴定，淘汰有害的隐性基因基因定位（DH群体）生殖遗传-双胚苗等,10,11,12,特点,多-易于规模化快-选系速度快好-纯度高省-,13,3）单倍体育种应用状况国内：2013250万个单倍体以上,规模化单倍体育种,14,国外应用,先锋、孟山都、先正达、利马格兰、KWS等均有大规模应用,DH系占新选系可以达到90%，已经替代传统选系成为主要的选系方法现代育种技术的新体系三大核心技术单倍体育种+分子育种+转基因,15,国外大规模单倍体育种,16,二、单倍体育种基本程序,17,基础材料2n=20,单倍体n=10,单倍体的鉴定,加倍,DH系2n=20,单倍体育种程序,单倍体产生,单倍体加倍,DH系评价与应用,18,（一）、单倍体诱导,诱导母本材料诱导系与杂交种诱导机理,19,基础材料孤雌生殖诱导系无色糊粉层紫色糊粉层无色胚芽紫色胚芽绿色植株正常杂交籽粒准单倍体籽粒紫色糊粉层紫色糊粉层紫色胚芽无色胚芽假单倍体单倍体紫色植株绿色植株加倍,DH系,20,1、基础材料选择,群体遗传构成：杂合群体：单交种，群体等分离群体：F2,F3,F4等近纯合群体：自交系等种质类型：硬粒80以上马齿90以上,21,2、玉米孤雌生殖诱导系,Coe(1959)Stock6是第一个孤雌生殖诱导系,诱导率1%-2%。Lashermes(1988)孤雌生殖诱导系WS14,诱导率3.5%。Tyrnov等(1994)孤雌生殖诱导系ZMS,单倍体诱导频率达到2%左右。4）张铭堂、德国所用诱导系RWS,UH400等诱导率8左右5）吉林农科院吉诱3号6）其它研究单位也开展了研究7）中国农业大学在BH0Stock6后代选育出高油型孤雌生殖单倍体诱导系农大高诱1号等。最近新的诱导系农大高诱2-5号，诱导率8-18%，诱导杂交种农大杂诱1号，2号诱导率在5-10%。,22,诱导系,23,农大高诱2-5号与杂交种,新系25号基本稳定诱导率在5-18%,24,25,2011年7月北京上庄,26,2011年10月至2012年2月28日海南南滨,27,2012年12月15日海南南滨,28,2013年02月25日海南南滨,29,2013年02月25日海南南滨,30,2013年02月20日海南南滨,31,农大高诱5号(CAUHI5)果穗与植株,生产上应用的诱导系类型,32,关联群体自交系与诱导系CAUHI5杂交后表现,33,籽粒标记R-nj遗传-花粉直感,34,果穗中的单倍体,35,单倍体产生的生物学机理：,36,雄配子体发育,37,双受精示意图,(引自FredericBerger等，2008),38,（二）、单倍体鉴定,田间鉴定（早期）细胞遗传学方法形态学方法放射性方法除草剂方法分子标记法遗传标记法油份鉴定法,39,孤雌单倍体的标记R-nj,40,根色鉴别,41,植株颜色鉴别,42,（三）、单倍体加倍,自然加倍与小麦、水稻等不同，玉米单倍体自然加倍率一般低于10，有些材料不发生自然加倍（Zabirova,1993;Shatskaya,1994）气体N2O加倍（A.Kato，2002）组培加倍药剂化学加倍除草剂(APM,Pronamide,Oryzalin,Trifluralin等)秋水仙素,配方的优化,加倍环节的优化（时间、温度等）,43,药剂加倍,除草剂：APM(amiprophosmethy1)、拿草特(pronamide）、安磺灵(oryzalin)、氟乐灵(trifluralin)等；秋水仙素多种因素影响（药剂浓度、处理时间、处理温度等）。,44,田间加倍,45,（四）、DH系,46,47,48,三、中国农业大学单倍体研究1995开始-,诱导技术,鉴别与加倍,DH系高效应用,单倍体育种技术体系,生物学机理,应用研究,理论研究,遗传学学机理,花粉直感与竞争,系统与工程化,技术优化,49,理论研究,生物学机理：染色体排除-B染色体诱导系遗传机理：遗传方式、诱导基因精细定位花粉直感：油份直感效应和当代杂种优势,50,诱导生物学机理：染色体干扰与排除,特殊籽粒类型的发现,51,特殊籽粒的频率及倍性鉴定,52,SSR分子标记检测,53,DGAT1-2测序结果,54,玉米小孢子第二次分裂中B染色体的不分离现象,B染色体传递,55,玉米染色体荧光免疫染色结果（金危危教授提供）黄绿色信号为CENH3抗体，箭头所指为玉米B染色体（信号相对较弱）如果有B染色体说明不是单受精，诱导系A染色体消失为排除所致,56,单倍体诱导机理模式图,57,A1:B73UH400;A2:UH400;B不同子粒类型,诱导性状生殖遗传机制,58,诱导性状与败育性状同为雄配子表达性状,A:诱导系常规系,B:诱导系自交,C:常规系诱导系,59,单倍体诱导基因作用模型,?（A）诱导基因在雄配子中表达，并可能受到表观修饰（用灰色表示）。其产物对于花粉的竞争性会有影响?（B）父本染色体的高度修饰可能会造成子粒中染色体消除或败育的发生。对于其余的轻度修饰的花粉将不会影响双受精过程，并最终形成正常子粒。,60,诱导基因分子标记可以用于辅助选育诱导系,在第1和第9染色体上发现诱导基因,61,1号染色体诱导基因精细定位单倍体油份玉米85%左右的油份存在于玉米胚之中，而油份具有一定的花粉直感效应，如以高油型诱导系进行诱导，双受精的杂交籽粒具有较高油份，而孤雌生殖单倍体则油份较低。,72,HO115,NMB73,73,油份鉴定值的确定,74,人工测油-速度慢1000粒左右/天,天平,75,油份自动核磁共振测定仪鉴定单倍体,以农大高油高诱一号为父本与普通玉米杂交，杂交当代籽粒含油量显著提高，花粉直感的增油率在30以上。利用此法进行单倍体鉴定，准确率可以超过90，速度可以达到每天2万粒.也可以用于其他作物的选择与鉴别。,76,YFP荧光基因诱导系,根尖与籽粒中YFP标记的表现情况,红色箭头所指为携带有YFP基因的子粒，其余不含YFP,77,YFP荧光标记鉴定单倍体,在OLYMPUSDP72体式荧光显微镜下，通过测定杂交幼胚的荧光强度鉴别其中的单倍体。,杂合体,单倍体,78,3、单倍体加倍技术,化学加倍技术-芽苗化学加倍自然加倍技术-自然加倍基地,79,海南单倍体育种,80,化学加倍（加倍可以达到散粉率30-80%）,81,不同基础材料单倍体处理与对照的散粉情况比较（2009）,加倍效果,处理后单倍体的平均散粉率高于对照近10倍，一般5-6倍,82,大规模自然加倍基地（西北）,83,自然加倍,自然加倍重点：条件好：保证单倍体正常生长发育环境稳：可控性强-设施加倍-温室、组培基地加倍-西北、西南、海南,84,4、单倍体与DH应用和管理,单倍体管理DH系管理-规模化DH系管理方法遗传研究抗青枯病DH群体1145Y331（2001-03年）选择方法研究亲本纯化与种子生产-,85,86,资源的优化配置,87,5、系统化与工程化育种,单倍体技术发展阶段：点：关键环节突破-重点技术线：操作程序规范-流程化管理面：技术体系形成-选系主导技术体：系统工程构建-包括与其他技术结合借鉴航天科技创新经验,88,系统工程化内容,系统工程理论（钱学森系统科学理论与创新思想）发展软件和硬件系统构建-专业化、自动化、信息化系统优化-,89,90,系统优化,与转基因、分子育种结合乃至融合全DH化：现有亲本纯化应用于种子生产*全单倍体育种（TH）-TotalHaploidBreedingAH,BH,CH,DHEH（早期加倍单倍体/Earlydoubledhaploid)*-,91,单倍体胚诱导产生的单倍体胚性愈伤组织,单倍体幼胚组织培养,有可能作为纯化转基因后代或转基因受体材料？,92,不同材料EH,昌7-2EH,87-1EH,垦自167-7EH,郑58EH,EH再诱导,87-1EH,郑单958F1EH,孤雌生殖二倍体？,93,EH群体,94,中国农业大学通过项目发放诱导系，技术培训等途径使全国主要育种企事业单位掌握了单倍体育种技术中国