（分析化学专业论文）氯霉素分子印迹聚合物的制备及其在食品残留分析中的应用.pdf

华中科技大学硕士学位论文华中科技大学硕士学位论文 i 摘 要 分子印迹技术是近几年迅速发展起来的一项新技术。分子印迹聚合物 （molecularly imprinted polymer，mip）具有选择性高、化学稳定性好等优点，是一 种有发展潜力的固相萃取材料。mip 与固相萃取结合形成的分子印迹固相萃取技术 （molecularly imprinted solid-phase extraction，mispe） ，在药物、食品及生物样品中 物质的分离检测方面具有很好的应用前景。 氯霉素是（chloramphenicol，cap）一种广谱抗生素，常作为动物饲料添加剂使 用。由于使用不当及代谢不完全，造成动物源性食品中的氯霉素残留，对人体存在严 重的毒副作用，对人类健康造成威胁。食品中氯霉素残留的分析是食品安全检测的重 要内容。由于食品中氯霉素含量较低，样品基体复杂，因此提高分析方法的选择性和 灵敏度具有实际意义。固相萃取是一种常用提高选择性的方法，其关键是性能优良的 固相萃取材料的制备。 本文以 cap 为对象， 制备对 cap 具有特异识别性且高度稳定的 cap 印迹聚合物 （chloramphenicol based molecularly imprinted polymer，capmip） 。通过优化制备条 件以及分子印迹固相萃取条件，实现了对饲料中 cap 的检测。 本文主要工作结论包括： 1. 以 cap 为模板分子，maa 为功能单体，通过对模板分子与单体比例、聚合温度以 及模板分子与交联剂比例等因素的优化，制备性能优良的 capmip。结果表明：模板 分子、功能单体与交联剂比例为 1：4：24，聚合温度为 60 ，所制备的 capmip 微 粒的吸附效果最佳。 2. 以制备的 capmip 微粒作为固相萃取剂，优化活化、上样、淋洗和洗脱条件，得 到优化的固相萃取条件为：5 ml 甲醇，5 ml 乙腈和 5 ml 水活化 mip 柱；2 ml 10 % 的乙醇水溶液为上样液；3 ml 20 %乙腈水溶液为淋洗液；2 ml 乙腈为洗脱液。在此 条件下对 115 mol/lcap 的回收率在 74.396.7 %之间。 mispe 能选择性地识别和 定量回收样品中的 cap。 华中科技大学硕士学位论文华中科技大学硕士学位论文 ii 3. 亚临界水萃取与 capmip 固相萃取联用，检测饲料中的 cap。cap 浓度为 0.02、 0.05、0.1 mol/g 加标饲料的回收率分别为 76.6%，80.6%和 84.8%。相对于单纯的亚 临界水萃取，亚临界水萃取和 mispe 萃取联用后 hplc 检测时有更优的分离效果。 关键词：关键词：分子印迹聚合物；固相萃取；氯霉素；亚临界水萃取 华中科技大学硕士学位论文华中科技大学硕士学位论文 iii abstract as a new technology, molecular imprinting technology is developed rapidly in recent years. molecular imprinted polymer (mip) has shown advantages, such as high selectivity and chemical stability and has become a potentinal stationary phase extraction material in the solid-phase extraction. the combination of mip and solid-phase extraction (namely molecularly imprintde solid-phase estraction, mispe) has a good prospect in determining trace analytes in drug, food and biological samples. chloramphenicol as a broad-spectrum antibiotics，is widely used in various infectious diseases and animal feed additives. because of the improper use and incomplete metabolism, chloramphenicol residues remain in animal-derived food. however, the hazard effect of chloramphenicol residues results a threat to human health. chloramphenicol residues is an important part in food analysis.because the content of chloramphenicol in food is low and the matrix of food sample are always complex, it is significance to improve the selectivity and sensitivity of the analytical method. solid-phase extraction is a common method of improving selectivity and sensitivity, and the key is the performance of solid-phase extraction material. in this research, a chloramphenicol molecular imprinted polymer (capmip) was prepared, and the preparation conditions of capmip and the operation parameters of mispe were optimized. the major conclusions are as follows: 1. molecular imprinted polymer (mip) was prepared with chloramphenicol as the template molecule and methacrylate as monomer. the prepared capmip has excellent performance, through the optimization of the proportion of monomer, crosslinker and polymerization temperature factors. it was shown that the property of capmip were satisfactory when the ratio of template molecule, monomer and crosslinker was 1:4:24, polymerization temperature was 60. 2. capmip was used solid-phase extraction matercial, and the extraction condition were optimized as: 5 ml methanol, 5 ml acetonitrile and 5 ml water were used to activate the mip column respectively, loading with 2 ml 10% the ethanol solution, washing with 3ml 华中科技大学硕士学位论文华中科技大学硕士学位论文 iv 20% acetonitrile solution and eluting with 2 ml acetonitrile. under these conditions different concentrations (115 mol/l) of chloramphenicol could be recovered. the recoveries were between 74.3 to 96.7%. mispe can selectively and quantitatively recover the chloramphenicol of the samples. 3. the combination of subcritical water extraction and mispe were used in determination of chloramphenicol in feed. the standard addition recoveries of 0.02, 0.05, 0.1 mol/g were 76.6%, 80.6% and 84.8% respectively. in contrast to subcritical water extraction alone, the combination of subcritical water extraction and mispe showed better separation performance. keywords: molecular imprinted polymer; solid-phase extraction; chloramphenicol; subcritical water extraction 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。 对本文的研究做 出贡献的个人和集体， 均已在文中以明确方式标明。 本人完全意识到本声 明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即： 学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许 论文被查阅和借阅。 本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部 分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段 保存和汇编本学位论文。 保 密，在_年解密后适用本授权书。 不保密。 （请在以上方框内打“” ） 学位论文作者签名： 指导教师签名： 年 月 日 年 月 日 本论文属于 华中科技大学硕士学位论文华中科技大学硕士学位论文 1 1 绪 论 1.1 引言 随着社会经济的快速发展和人民生活水平的提高，动物源性食品在人们生活中所 占比例越来越大，部分不法养殖户为追求经济效益最大化，不同程度的在饲料中添喂 人用抗生素，使畜禽肉品中抗生素残留严重，成为的食品安全的重要问题之一。各国 政府严格限制食品中各种有害成分，特别是抗生素、农药残留等。 食品安全检测是保障食品安全的基础，是监督管理的重要手段。为了有效地保障 食品安全，就必须对食品安全中的各类样品进行准确地分析测定。目前食品安全检验 部门通常采用气相色谱、液相色谱等分析仪器。然而使用这些仪器进行分析测定前， 必须把样品制成溶液。 由于食品样品具有被测物浓度低、组分复杂、干扰物质多、易受环境影响而变化 等特点，因此要获得数据准确、重现性好的分析结果，样品预处理是重要环节。样品 预处理已成为分析化学领域中一个重要的分支，传统的样品预处理方法有液-液萃取、 索氏提取、层析、蒸馏、吸附、离心、过滤等几十种。这些方法一般要使用大量的有 机溶剂，而且处理时间长、操作步骤复杂，容易导致样品损失和玷污，产生较大误差。 因此，迫切需要探索高准确度、快速、简单、不使用或少使用有机溶剂的样品预处理 方法，发展较快的有固相萃取、固相微萃取等。 固相萃取技术以其高效性、高选择性、高自动化程度以及低耗性等特点被广泛地 应用在生物医学、食品分析、环境分析等领域1，其关键是优良的固相萃取材料的制 备。因此制备选择性高的固相萃取材料已为研究的热点。 1.2 氯霉素样品预处理及检测方法 1.2.1 氯霉素类抗生素来源及危害 我国是一个养殖大国，近年来养殖业飞速发展。由于集约化的高密度养殖、珍贵 华中科技大学硕士学位论文华中科技大学硕士学位论文 2 品种引进、 使用催生长激素、 环境污染等因素导致了养殖环境的恶化和畜禽疾病增加， 又由于畜禽疾病防治体系的不健全和欠缺用药指导和规范管理，在养殖业中滥用抗生 素现象严重。比如不遵守休药期、超剂量使用、超范围使用违反国家法规规定等等， 从而造成动物源食品中的抗生素的残留。这部分残留抗生素就转移到了人们体内，这 会使人产生对抗生素的抗性，从而影响以后用药的效果。 cap广泛用于各种传染性疾病的治疗，通过抑制细菌蛋白质合成而发挥抑菌作 用，对大多数革兰氏阳性和阴性菌有效，对革兰氏阳性菌作用性较强，特别是对伤寒 副伤寒杆菌作用最强。 但cap对人体存在严重的毒副作用， 主要是抑制骨髓造血功能， 引起粒细胞和血小板减少以及再生障碍性贫血；除此以外对消化系统神经系统也有严 重的毒性反应，可引起视神经炎、急性中毒性表皮松懈症、角膜瘫痕、皮疹等不良反 应，对新生儿、早产儿、老年人以及肝肾功能不全的病人影响更大2。近年有儿童服 用cap和老年人使用cap眼膏导致死亡事件的报道。cap的应用已有近50年的历史， 但由于上述毒副作用使cap成为第一个被禁止用于可食用动物的抗生素。 cap在动物性食品中的残留严重威胁着人类健康，因此cap残留问题已引起国际 组织和许多国家及地区有关部门的高度重视。欧盟均在法规中规定cap 残留限量标 准为“零容许量” 3，即不得检出。美国仅允许cap用于非食用动物，fda规定的cap 检出限为0.3 ng/ml， 而且目前正在研究应用更灵敏的检测方法4。 我国农业部已将cap 从2000年版的中国兽药典中删除，作为禁用药品。在2002年底的农业部第235号 公告 动物源性食品中兽药最高残留限量 中明确规定cap在动物性食品中不得检出， 对于用酶联免疫（elisa）和高效液相色谱分析法（hplc）检测时要求其检测限量 为1 ng/ml。 1.2.2 样品预处理方法 1.2.2.1 固体样品预处理方法 固体样品的预处理方法通常有索氏提取、超声萃取、微波辅助萃取等，近几年发 展了一种新的绿色预处理技术亚临界水萃取。 1）索氏提取 华中科技大学硕士学位论文华中科技大学硕士学位论文 3 索氏提取（soxhlet extraction，sox）利用虹吸原理，保持提取溶剂与提取样品 充分反应，因而消除了振荡提取中的传质不平衡，其设备花费低、提取样品范围广、 且易于操作，迄今仍被广泛应用。但索氏提取技术需要较长提取时间( 18h)，受提 取物干扰影响较大，提取过程需要消耗大量溶剂，大量的提取溶剂不仅花费高而且对 环境造成新的污染，因而此技术不宜于批量处理样品。 2）超声萃取 超声波是一种弹性机械振动波，它的强烈振动产生高速度、强烈的空化效应，从 而引起的剧烈机械振动、乳化、扩散、击碎、化学效应和热效应等，加速被萃取成分 的扩散释放并充分与溶剂混合，从而缩短了萃取时间，提高了萃取效率。超声萃取 （ultrasonic extraction）设备简单，技术成熟，对被萃取物基本上没有选择性差 异，可作为一种通用型的萃取方法。 aleixo等5将超声萃取技术用于食品中铅和镉的萃取。他们将待测样品粉碎后加 入适量硝酸，超声处理510min后离心，并用原子吸收进行了分析。实验结果表明条 件优化后的超声萃取对蔬菜和动物组织中铅、镉的回收率可达89%105%。超声萃取 具有快速、价廉、高效的特点，与传统的索氏萃取相比，耗时短，溶剂用量少，设备 简单，操作容易。但是超声萃取过程中超声波有可能破坏某些分析物，且仪器保养要 求高。 3）微波辅助萃取 微波辅助萃取（microwave-assisted extraction，mae）是80年代才发展起来的一 项新型分离技术，微波是一种频率范围在300-300,000兆赫的电磁波，常用范围为2450 兆赫，即微波产生的电场正负讯号每秒钟可以变换24.5亿次。极性分子在微波电场的 作用下，以每秒24.5亿次的速率不断改变其正负方向，使分子产生高速的碰撞和摩擦 而产生高热，从而加速了两相间的传质过程，升温快速而均匀，使溶剂萃取时间大大 缩短。 t.h.hoang等6采用mae技术从各种固体剂中提取有效药物成分， 以甲醇-水 （75： 25，v/v）为萃取溶剂，50 的条件下萃取5 min，得到有效成分的回收率为 97.4101.9%。 4）亚临界水萃取 华中科技大学硕士学位论文华中科技大学硕士学位论文 4 亚临界水萃取（subcritical water extraction，scwe）是一种新的绿色样品预处理 技术，其设备简单、萃取时间短，通过改变亚临界水温度和压力来改变水的极性、表 面张力和粘度，从而可以选择性地萃取样品基体中的不同极性的有机化合物，甚至金 属离子。由于采用纯水作萃取剂，不用或很少用有机溶剂，因此它对环境没有污染或 污染很少。 yu yang等7研究了用亚临界水萃取工业污染土壤样品和美国河流沉积物样 品中的pcbs的条件，回收率能达到90%以上。omid tavakol等8用scwe技术从鱿鱼排 泄物内分别萃取cd （） ， cu （） ， zn （） ， 萃取温度分别为380 ， 300 ， 240300 ，萃取压力分别为1.55 mpa，3.35 mpa，6.42 mpa，萃取时间分别为20 min，20 min， 10 min。 1.2.2.2 液体样品预处理方法 液体样品的预处理方法主要液-液萃取、固相萃取法、固相微萃取等。 1）液-液萃取 液液萃取（liquid-liquid extraction，lle）是利用溶质在两种不相溶或部分互溶的 液相之间的分配不同来实现溶质之间的分离或提纯。由于它具有选择性高，分离效果 好，易于实现大规模连续化生产的优点，在有色金属湿法冶金、化学分析等领域中得 到应用9,10。但此技术在实际应用中存在溶剂损失、处理时间长、二次污染、易燃、 有气味等缺点。 2）固相萃取、固相微萃取 固相萃取技术（spe）是一种液固分离萃取的试样预处理技术，其装置图如图1.1 所示。它是根据被萃取组分与样品基质及其他成分在固定相填料上作用力强弱的不同 而使它们彼此分离。通过颗粒细小的多孔固相吸附剂选择性的吸附溶液中的被测物 质，被测物质被定量吸附后，用体积较小的另一种溶剂洗脱或用热解析的方法解析被 测物质，从而达到分离富集被测物质的目的。固相微萃取（spme）是在固相萃取技术 的进一步发展，装置图如1.1所示。该技术克服了固相萃取技术的缺点，如固体或油 性物质对填料空隙的堵塞等，大大降低了空白值，同时又缩短了分析时间。该技术操 作简单，可以节省样品预处理70%的时间，无需使用有机溶剂，极大的改善了操作人 员的工作环境，使有毒溶剂降到最低。 华中科技大学硕士学位论文华中科技大学硕士学位论文 5 固相萃取技术的关键是固相萃取柱的填料。spe柱使用最多的填料c18相。该种 填料疏水性强，在水相中对大多数有机物显示保留。也使用其他具有不同选择性和保 留性质的填料，如活性炭纤维、氧化铝、硅酸镁、c8、离子交换剂等11。近年来，发 展了许多专属性spe固定相，是针对特定的环境、生物试样而设计的，例如用分子印 迹聚合物（mip）作为固相萃取材料12-14。 图1.1 装置示意图. a. 固相萃取 b. 固相微萃取 1.2.2.3 氯霉素样品预处理方法 cap 样品的预处理方法目前主要有液-液萃取、振荡萃取、超声萃取以及亚临界水 萃取等。 蜂蜜等液体样品主要采用液-液萃取。 液-液萃取15是将取适量的蜂蜜等液体试样 放入烧杯中， 45 水浴加热 5 min， 加入乙腈进行离心 5 min， 再加入氯仿离心 3 min， 取上清液，蒸干有机剂，用乙腈溶解。 小虾、饲料等固体样品可以采用超声萃取、振荡萃取及亚临界水萃取等方法。振 荡萃取16是将固体试样绞碎后，加入适量的乙酸乙酯和水放在振荡器上振荡 3 min 静 置，过滤，将残渣再次振荡、静置、过滤，反复提取 3 次，滤液合并放入分液漏斗中， 去除下层保留酯相，浓缩蒸干，用乙醇溶解。超声萃取17是将试样中加入乙酸乙酯， 超声萃取一段时间后，水浴蒸干乙酸乙酯，用氯化钠甲醇溶液溶解。亚临界水萃取 18是取适量样品放入小硬质管中，萃取温度 105 ，萃取时间 10 min，溶剂酸度为 中性，溶剂体积为去离子水 5 ml。 近几年来随着分子印迹技术的发展，cap 分子印迹聚合物在食品残留检测中的应 ab 华中科技大学硕士学位论文华中科技大学硕士学位论文 6 用也成为研究热点。 1.2.3 氯霉素的检测方法 氯霉素残留的分析检测方法多用微生物学方法、放射免疫法、色谱法和酶免疫分 析法等。 （1） 微生物学方法 微生物学方法是cap测定的最常用的方法19。该方法易操作，费用低，可用于大 量样品的筛选。该方法是用拭子采集动物体内的组织液，然后将其放置于涂满枯草杆 菌的培养基中，保温过夜。观察在拭子周围是否出现抑菌环，若有即表明组织液中有 大量抗生素存在， 如果该动物用过cap进行治疗， 则可以认为该组织中存在cap残留。 微生物法的优点是操作简便、样品用量少、预处理简单，在基层大规模筛选中有 一定的应用价值；缺点是微生物法检测周期较长，易受组织中其他抗菌素影响，特异 性低，灵敏度也不高。 （2） 放射免疫法 放射免疫分析是建立在免疫反应基础上的核技术，最基本的原理是放射性核素标 记的抗原和被测抗原 （或标准品） 对有限量的抗体进行可逆性的竞争结合反应。 amold 等20报道了在蛋、肉、奶中cap的放射免疫痕量分析。对于用cap治疗的动物组织和 其它可食用产品，此方法检出限量约为0.2 ng/ml，1 ng/ml以上的cap残留能被准确定 量，在蛋、肉中平均回收率为85%，在奶中回收率高于95%。 放射免疫法的检测灵敏度较高，但是具有同位素半衰期短、存在放射性污染及需 要复杂的仪器设备等缺点，使应用受到限制。 （3） 酶联免疫分析法 酶联免疫测定法是以酶学和免疫化学为基础发展起来的一种新技术。其原理是试 样中残留的cap与试剂盒中的cap酶标记物共同竞争cap抗体，形成有酶标记或无酶 标记的抗原抗体复合物而被吸附于微孔板底，用酶标仪在450 nm处测定吸光度，根据 吸光度值得出样品中cap的残留量。由于该技术灵敏度高、特异性强、快速经济，已 在许多领域中得到广泛应用。现已有试剂盒供应市场，可以直接用于样品检测，是目 前最理想的残留筛选性分析方法之一。 华中科技大学硕士学位论文华中科技大学硕士学位论文 7 van de water 等21采用单克隆抗体竞争酶联免疫法测定猪肌肉组织中cap残留， 最低检测限量可达25 ng/ml。keukens 等22用la carte test试剂盒检测肉中的cap残 留，最低检测限为2 ng/ml。 但是elisa的缺点在于影响因素较多，易出现大量假阳性结果。抗体批次不同， 测定结果也会出现差异。 （4） 色谱法 气相色谱法具有分离效能高、选择性高和灵敏度高的特定，加上检测快速，因此 应用广泛。cap的分子结构中含有氯，故可以选用高灵敏度的电子捕获检测器。2004 年林秋萍等23建立了鸡肌肉中cap残留量的气相色谱测定方法， 结果表明其方法的线 性范围在10-200 ng/ml之间最小检出限是1.1 ng/ml。 cap含有苯环、羟基基团等可以使cap在紫外光下有很强的吸收，可以应用高效 液相色谱法紫外检测器对其进行定性定量检测。高效液相色谱法检测cap是一种灵敏 度较高、可靠性较强的一种方法，此法重复性好、假阳性少，但检测限较高，为5.0-10 g/kg。由于动物源性产品成分复杂，一些杂质干扰测定，应用该法检测时，对于样 品预处理必须仔细谨慎，以提高测定准确性和灵敏度。1992年nagata 等24报道了用 液相色谱法同时测定动物肌肉中的甲砜霉素和cap的残留方法。 目前，我国国家标准方法有气相色谱法测定饲料中cap17，和水产品中cap残留 25。色谱法具有灵敏度高、结果可靠、重复性好等优点，是目前国际公认的测定方法。 但是，它也存在一些明显的不足，如：仪器化程度高且价格昂贵，要求具有较高专业 素质的熟练人员操作等。因此不能用于现场监控分析，也不适用于大量筛选。 1.3 分子印迹技术及应用 分子印迹技术是模拟自然界所存在的分子识别作用， 如酶与底物、 抗体与抗原等， 以目标分子为模板合成具有特殊分子识别功能的印迹高分子聚合物的一种技术26。 它 的起源可以追溯到20世纪40年代， 著名的诺贝尔奖获得者pauling提出的以抗原为模板 来合成抗体理论。为分子印迹发展奠定了一定的理论基础。1949年，dickey27首先实 现了染料在硅胶中的印迹并提出“分子印迹”的概念。1972年，wulff等28, 29首次成 华中科技大学硕士学位论文华中科技大学硕士学位论文 8 功制备出对糖类化合物有较高选择的共价型分子印迹聚合物(mip)； mosbach等创立了 非共价型mip制备方法30，引起了许多研究者的关注。随着wulff和mosbach的开拓性 工作，分子印迹得到迅速发展。 分子印迹技术是将要分离的目标分子与交联剂在聚合物单体溶液中进行共聚制 备得到颗粒介质，然后洗脱除去包埋在介质中的目标分子，便得到分子印迹聚合物 (mip) 介质，如图1.2所示，此时的介质可以将目标分子的空间结构保持“印迹”或留 下“记忆” 。分子印迹技术具有特异识别性、高效性、稳定性好等突出优点31, 32。最 近十几年已广泛应用于色谱分析与色谱分离、模拟酶、催化剂、仿生传感器等研究领 域，且应用研究新领域正在不断扩大33。 图 1.2 分子印迹聚合物聚合示意图 1.3.1 分子印迹材料制备和方法 mip制备方法根据单体与模板分子结合方式的不同，分为预组装法和自组装法两 种基本方法。 预组装法（preorganization）又称共价法，由德国 wulff 及同事在 20 世纪 70 年代 初期创立28。是指模板分子先与功能单体通过共价键结合，在进行交联聚合以后，模 板分子通过化学过程从聚合物的骨架中脱离，从而形成对模板分子具有特异吸附性和 选择性识别位点的聚合物。其常用的功能单体为硼酸酯、西夫碱、亚胺、缩醛等。通 过形成衍生物，用交联剂聚合产生高分子聚合物，用水解等方法除去模板分子。共价 键作用的优点是单体和印迹分子间的作用力一般较强，形成的复合物也很稳定，聚合 中能获得在空间精确固定排列的结合基团，所得的印迹聚合物的识别位点密度也高。 因此，此类聚合物对模板分子具有较高的专一性识别。缺点就是共价键的能量大，印 华中科技大学硕士学位论文华中科技大学硕士学位论文 9 迹分子的除去比较困难，在印迹分子预组装或识别过程中结合和解离速度一般很慢， 难以达到热力学平衡，所以不适合于快速识别，并且识别作用机理与生物识别相差甚 远，因此共价聚合这种方法发展非常缓慢。 自组装法（self-assembling）又称非共价法，由瑞典的 mosbach 及同事在 20 世纪 80 年代后期创立34。是指模板分子与功能单体通过非共价键作用力相结合，包括氢 键，离子键(静电作用)，金属配位，p-p 作用，偶极作用，疏水作用以及范德华力等 形成单体/模板超分子复合物。 模板分子通过抽提除去以后， 得到具有识别位点的聚合 物骨架，而这种骨架同样具有识别作用。由于此方法可应用多种作用力，在印迹过程 中可以使用多种功能单体以及其用简单的萃取办法便可把模板分子除去等优点而受 到广泛关注，近年来非共价型 mip 己经成为分子印迹的主要方向。 由于 mip 的制备过程是分子印迹技术的关键。 目前国内外的研究主要从分子印迹 的基本原理来选择不同的功能单体、交联剂、引发剂、溶剂。 1.3.1.1 制备材料的选择 （1）功能单体的选择 根据单体与印迹分子作用力的大小预测，设计合成带有能与印迹分子发生作用的 功能基的单体。共价型单体包括 4-乙烯苯硼酸、4-乙烯苯甲醛、4-乙烯苯胺、4-乙烯 苯酚等。非共价型单体包括丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、对乙烯苯甲酸、 对乙基苯乙烯、亚甲基丁二酸、二丙烯酞胺-2-甲基-1-丙磺酸、1-乙烯基咪哇、4-乙烯 基吡啶、2-乙烯基吡啶等。 （2）交联剂的选择 交联剂是使印迹分子和功能单体形成高度交联、刚性的 mip， “固化”功能单体 的功能基团在模板分子周围的特定位置上，或在提取模板分子后，形成与模板分子在 形状和功能基团定位完全吻合的“空穴” 。mip 要求很高的交联度( 70 - 90% )。最初 用二乙烯基苯为交联剂， 后来发现使用丙烯酸酯类交联剂制备的 mip 识别性更高。 乙 二醇二甲基丙烯酸酯(egdma)是分子印迹中常用的交联剂， 最近含有三或四个乙烯基 基团的交联剂也被使用。 （3）引发剂的选择 华中科技大学硕士学位论文华中科技大学硕士学位论文 10 mips 的聚合方式通常为自由基引发聚合，引发剂为偶氮二异丁腈(aibn)或偶氮 二异庚腈(abhn)。引发方式常有高温热引发和低温光引发两种。低温光引发由于具 有下述优点： (1)可稳定印迹分子和单体所形成的复合物； (2)可印迹热不稳定的化合物； (3)可以改变聚合物的物理性能以获得更好的选择性，因而获得了更广泛的应用。热引 发也较为常见，但此法对热不稳定的化合物不适用。 （4）溶剂的选择 溶剂既是溶解用于聚合的所有试剂，也是制备 mips 的致孔剂，还会影响功能单 体和印迹分子间的结合强度、动力学性质和聚合物的形态结构，特别是在非共价键的 结合体系中显得尤为重要35，因为非共价作用的强弱强烈地依赖溶剂的极性。一般非 共价型 mip 的聚合过程中，主要依靠氢键等作用力与功能单体结合，受溶剂影响，在 分析中 mip 可能发生溶胀， 致使结合位点的三维结构发生改变， 对分析物的识别作用 减弱，因此非极性溶剂为首选。在极性溶剂中，印迹分子主要靠疏水性作用与功能单 体结合，一般受溶剂极性影响较小。溶剂的用量对 mip 中孔穴的立体结构也有影响， 用量太多会使 mip 的结构疏松、硬度变低而影响识别效果；用量太少又会减少 mip 中立体孔穴的数量。 1.3.1.2 印迹聚合物的制备方法 （1）本体聚合 早期大都采用本体聚合36制备 mip，即把印迹分子、功能单体、交联剂和引发剂 按一定比例溶于惰性溶剂，密封在一个真空的安培管中，经聚合制得棒状聚合物，经 粉碎、过筛、洗脱等得到所需粒状 mip。此法装置简单，条件易于控制，至今仍是制 备 mip 的主要方法之一；但后处理过程冗长、费时、费力，mip 利用率低，所得颗粒 的粒径分布不均匀，而且研磨过程中可能会破坏聚合物中的某些结合点，降低了其分 离能力，也难以大规模生产。 （2）原位聚合 原位聚合是在色谱柱或毛细管等反应器内直接聚合制得连续型棒状 mips，如图 1.3 所示。这种制备方法比较简便，没有繁琐的处理手续，且制得 mips 具有连续性、 均一性的特点，从而得到较好的分离效果。matsui 等37首先在不锈刚管内制得棒状的 华中科技大学硕士学位论文华中科技大学硕士学位论文 11 mip，所得色谱柱对印迹分子有一定的选择性，但柱效和分辨率不高。schweitz 等38 把毛细管柱作为合成整体 mips 的反应器，制备了预定选择性毛细管电泳色谱柱，研 究结果表明：2 min 内就可实现印迹分子外消旋体的基线分离。此法制得色谱柱的方 法简便，但柱压降偏高也限制了这种方法的广泛使用。 图 1.3 原位聚合法制备聚合物 （3）悬浮聚合 悬浮聚合是制备微球型 mip 常用方法之一，mayes 等39率先用全氟烃为分散介 质，加入特制的聚合物表面活性剂使印迹混合液形成乳状溶液，引发聚合后可得粒度 分布窄、形态规则的 mips 微球，作为 hplc 填料有低柱压和快速扩散的优点，低流 速下分散效果良好。 近来，hosay 等40提出了两步膨胀法制备印迹颗粒。第一步在水中进行乳胶聚合 制得 50500nm 直径的粒子，以此作为第二步膨胀的种子粒子；第二步将种子粒子 分散体系加入到交联剂、功能单体或添加剂、致孔剂和稳定剂组成的印迹混合物溶液 中，在恒定搅拌速度下完成第二步膨胀。然后加入模板分子在氩气保护和恒速搅拌下 华中科技大学硕士学位论文华中科技大学硕士学位论文 12 引发游离基聚合反应，生成球形印迹聚合物母体。以上过程产生的粒子由被印迹的连 续相和线型聚合物组成。 最后将模板分子和线型聚合物萃取除去， 得分子印迹聚合物。 此法可制得有很大孔体积的多孔穴粒子。上述过程如图 1.4 所示。 但此法也存在着不足之处，分散剂全氟烃不利于环保、价格偏高，而且表面活性 剂的用量要求严格，从而制约了此法的使用。 图 1.4 两步膨胀法制备印迹聚合物 （4）沉淀聚合 沉淀聚合又称非均相溶液聚合，是指聚合反应所使用的单体和交联剂及引发剂可 溶于分散剂中，体系为均相，产生的聚合物不溶而易沉淀，如图 1.5 所示。由于该方 法不需在反应体系中加入任何稳定剂，因此制备的聚合物微球表面洁净，可避免由稳 定剂或表面活性剂对模板分子的非选择性吸附41。但沉淀聚合合成的颗粒偏小，分散 剂的使用量大，对环境不友好。 图 1.5 沉淀聚合的产物外貌 华中科技大学硕士学位论文华中科技大学硕士学位论文 13 （5）表面印迹 表面印迹是把印迹分子和功能单体在溶剂中形成的复合物与表面活化过的硅胶/ 聚三羟甲基丙烷三丙烯酸酯粒子/玻璃等介质反应接枝聚合，从而制得 mip 的一种方 法， 其过程如图 1.6 所示。由于采用的大孔载体本身往往已经具备所要求的结构形态， 因此本方法不再需要后续的粉碎处理。本方法在具体操作中的一个难点在于如何才能 方便有效地向载体表面引入所需要的丙烯酸类双键单体。 较近期的文献42使用了将甲 基丙烯酸键联到二氧化硅粒子的表面作为印迹聚合体系的成份：甲基丙烯酸残基可与 模板分子产生共价作用或超分子作用，然后经自由基聚合形成表面印迹聚合物。 图 1.6 硅胶表面印迹 1.3.2 分子印迹聚合物的应用 由于 mip 孔穴可以重新选择性结合模板分子，对模板分子具有专一性识别能力。 同时，mip 具有很好的物理和化学稳定性，能够抵挡很强的机械作用力，因此，mip 可以应用在众多领域，如对映体和异构体的色谱分离、固相萃取、化学仿生传感器、 模拟酶催化等领域中展现了良好的应用前景。 1.3.3.1 色谱分离中的应用 mips 最广泛的研究领域之一是利用它的特异识别性去分离混合物。其使用的印 迹分子范围广阔， 无论是小分子(氨基酸、 药品和碳氢化合物)， 还是大分子(如蛋白质)， 华中科技大学硕士学位论文华中科技大学硕士学位论文 14 都已经被用于各种印迹技术中，并用于 hplc、tlc 和 ce 分离中。分子印迹聚合物 作为色谱固定相广泛应用于拆分外消旋体。 wulff g 首先把分子印迹聚合物作为 hplc 的固定相拆分模板-d-甘露吡喃糖苯苷的外消旋体43。 1.3.3.2 固相萃取剂 近年来，随着环境科学、生命科学、食品科学的发展，对复杂基体中痕量被 分析物的分离与检测成为比较突出的问题，目前传统的spe技术并不能够完全满足需 要，而mips具有能从复杂样品中选择性地吸附目标分子的能力，适用于分析样品的前 处理。它可以用作固相萃取剂从复杂的样品中分离富集痕量的被分析物，克服来自生 物、环境等样品中复杂基体等带来的影响，从而达到样品净化的目的，它对目标物的 高度选择性是普通spe所不能比拟的优点。 sellergren44首次报道了以maa为单体合成 的mip应用于pam的固相萃取， 引起了广大科研工作者的兴趣， 并于随后不断出现mip 用作固相萃取填料的文献报道。 2006年， christina schirmer等45人以maa为功能单体， 氯仿做溶剂，60的条件下，采用本体聚合的方法制备cap分子印迹聚合物，并对固 相萃取小柱淋洗、洗脱条件进行研究，发现用10ml水淋洗，5ml甲醇洗脱，萃取蜂蜜 中的cap，hplc检测，回收率达到94 %。 1.3.3.3 化学仿生传感器 化学或生物传感器是由分子识别元件和信号转换器(如电极、 光极、 场效应晶体管、 压电晶体、热敏电阻等) 所组成。近几十年来，生物传感器以其突出的灵敏度和特异 性引起了广泛的关注，使传感器技术的研究不断升温。与生物识别元件相比，分子印 迹聚合物具有专一性强，稳定性好，可大规模生产等优点。目前用 mip 膜传感器测 定的对象有氨基酸衍生物、吗啡、除草剂、有机溶剂、神经毒剂水解产物、金属离子 等。将分子印迹聚合物作为传感器的敏感部件，然后通过各种电、热、光、质等手段 转换成可测信号，可定量分析各种小分子有机化合物。 1.3.3.4 药物手性分离 随着药物研究的不断深入，人们逐渐认识到药物的有效成分往往具有不同的手性 华中科技大学硕士学位论文华中科技大学硕士学位论文 15 性质，尽管分子式相同，但其药效不同，甚至相反。因此有必要采取适当方法对其对 映体或异构体进行拆分。kempe 等人46以(s)-naproxen (萘普生) 为模板分子制备 mip 对其消旋混合物拆分，得到较好的效果，分离度为 0.83。另外，这种聚合物还可将 (s)-naproxen 与其结构类似物 ibuprofen(布洛芬) 和 ketoprofen(酮洛芬) 进行分离。 1.3.3.5 药物控制释放 mip 可以吸收大量与印迹分子结构相似的物质，可以被用来作为一种反应性控制 释放载体。以某种印迹分子为模板制得的印迹聚合物载着一定量的与该种印迹分子结 构相似的药物分子，这种聚合物在该印迹分子存在的溶液中可以加速药物分子的释 放。可以想象，这种吸附有药物分子的高聚物进入人体后，如果人体内存有该种印迹 分子，则其会同药物分子对高聚物产生竞争性吸附，从而导致药物分子的逐步释放。 1.4 本文的研究内容 本研究课题来源科技部农业成果转化基金项目农产品安全快速检测成套技术和 设备的中试与示范 。 样品的预处理是食品分析中的重要步骤，是提高分析结果准确度和灵敏度的保 证。cap 残留分析的传统预处理方法存在工作量大、回收率低等缺点，为寻找一种简 单、 有效、 绿色的预处理技术， 本论文研究了分子印迹技术与亚临界水萃取联用技术。 选择与人类健康密切相关的 cap 为模板分子合成印迹聚合物，并作为固相萃取剂与 亚临界水萃取联用，对饲料中的 cap 进行预处理，用 hplc 检测。 本文技术路线如图 1.7 所示： 华中科技大学硕士学位论文华中科技大学硕士学位论文 16 capmip 的制备 capmip的 表征 capmip- 固 相 萃 取柱条件优化 饲料中氯霉 素的测定 制备条件的优化 扫描电镜 吸附性能研究 模板分子与单体比例 制备温度 模板分子与交联剂比例 样品的预处理 液相色谱条件 上样液的选择 淋洗液的选择 洗脱液的选择 图 1.7 技术路线意图 亚临界水萃取 亚临界水萃取与mispe联用 华中科技大学硕士学位论文华中科技大学硕士学位论文 17 2 沉淀聚合法制备氯霉素分子印迹聚合物 2.1 前言 分子印迹技术兴起于 20 世纪 80 年代初， 是指为获得与目标化合物 （即模板分子） 在空间形状和结合位点完全匹配的聚合物的实验制备技术，所制得的聚合物即是分子 印迹聚合物(molecularly imprinted polymer，mip)。印迹分子 mip 具有预定性、识别 性和实用性三大特点，并且基于分子印迹聚合物具有亲合性和选择性，抗恶劣环境能 力强，稳定性好，使用寿命长等优点，在许多领域，如色谱中对映体和异构体的分离、 固相萃取、化学仿生传感器、模拟酶催化、临床药物分析和膜分离技术等领域均呈现 出良好的应用前景。 分子印迹聚合物通常是通过本体聚合制得大块聚合物， 再经过粉碎、 研磨、 筛分、 反复沉降制得一定颗粒直径的粉末材料。由于该颗粒外形不规则、大小不均一，作为 分离载体存在填装质量低、容易形成通道和理论塔板数低等诸多缺点。为了克服这些 缺点，近几年来出现了悬浮聚合(suspension polymerization)、分散聚合（dispersion ploymerization）和多步膨胀聚合(muti-step swelling polymerization)等方法，悬浮聚合、 分散聚合需要加入表面活性剂或稳定剂，这些物质会吸附在 mip 微球表面，不利于 mip 的使用；多步溶胀法操作繁琐，只适用于能与硅胶形成的共价键的印迹分子中， 应用面较窄。wang et al.47提出采用沉淀聚合方法合成甘油茶碱印迹聚合物，此法无 须特殊分散剂，能够一步制备聚合物微球，而且微球大小均匀，直径在 5 m 左右； 2006 年 haruyo sambe 等48用沉淀聚合方法合成尼古丁印迹聚合物；2008 年 xianwen kan 等49用对苯二酚进行沉淀聚合合成聚合物， 聚合物微球的直径约 700 nm， 相对于 结构类似的化合物儿茶酚，具有很高的识别能力。其他有关沉淀聚合方法合成聚合物 的报道也很多，如乌头酸50和除草剂5153沉淀聚合物的制备。虽然沉淀聚合合成的颗 粒偏小，有机分散剂用量大，对环境不友好，但是合成方法简单，无需特殊分散剂， 因此得到广泛应用。 华中科技大学硕士学位论文华中科技大学硕士学位论文 18 本文选用沉