（环境工程专业论文）溴氰菊酯降解菌的筛选及降解特性研究.pdf

溴氰菊酯降解菌的筛选及降解特性研究 摘要 生物修复对降解污染基质中的农药是一种有效的环境污染修复方法。从自然界中 筛选出能够降解特定污染物的高效菌种，有针对性地投加到受污染环境中的生物强化技 术，能够快速提供具有降解作用的微生物，在环境的农药污染治理中显示出巨大的潜力。 溴氰菊酯是拟除虫菊酯类农药，这类农药为神经类毒物，属高毒性物质，其应用非常广泛， 是杀虫剂中的第三大类。该类农药残留已成为目前农产品的主要农药残留类型之一，在污 染环境的同时严重危害人类的健康。微生物在农药残留降解过程中起着重要的作用，微生 物降解技术已成为去除农药残留的绿色生产技术。因此，积极开展溴氰菊酯降解菌的筛选 工作有着重要意义。 本论文目标是寻找能够降解溴氰菊酯农药的高效降解菌。从长期使用溴氰菊酯的菜园 土壤和过期的农药中筛选出能够以溴氰菊酯为唯一碳源生长的降解菌株，并研究其降解效 率、降解特性及其农药降解谱。此外，通过室内盆栽试验研究其最优化降解条件。 最终分离得到两株溴氰菊酯降解菌( 编号为x 0 9 、x 2 4 ) 。经b i o l o g 自动微生物分析系 统鉴定结果为：菌株x 0 9 为阴沟肠杆菌e n t e r o b a c t e rc l o a c a e ，菌株x 2 0 为荧光假单胞菌 p s e u c l o m o n a s f l u o r e s c e n s 。两种降解菌在溴氰菊酯为唯一碳源的选择性培养基中生长良好， 在p h7 o 、添j j l l 5 0 m g l 溴氰菊酯为唯一碳源的基础培养基中，3 0 c 振荡培养，接种7 天后， 对溴氰菊酯的降解率分别达6 2 8 2 、4 3 2 5 。菌株x 0 9 、x 2 0 对溴氰菊酯的最大耐受浓度 为8 0 0 m g l 。 降解菌株的最优化降解条件为温度3 0 、p h7 0 、接种量2 5 和培养时间9 6 h 。其中 菌株x 0 9 在该条件下降解率高达6 5 以上；菌株x 2 0 在外加少量碳源如淀粉、葡萄糖、 牛肉膏等，可以显著提高其降解能力，达到6 9 3 。此外，两种降解菌对其他拟除虫菊酯 类农药也有一定的降解能力，对氯氰菊酯、甲氰菊酯、氰戊菊酯的平均降解率分别为5 3 0 ， 4 9 9 ，5 6 7 。 室内盆栽正交试验统计结果表明，各种因素对菌株降解能力影响大小依次为菌株种 类、处理时间、喷菌量、处理方式及施药量。统计分析结果为，最优化降解条件为菌株 x 2 4 ，施药量为1 0 m g l ，喷菌量为5 m i d 株，处理方式为菌液与农药混和喷施以及处理时 间为7 天。另外，菌液和农药混和喷施的处理方法取得了较好的降解效果，为溴氰菊酯降 解菌剂的研究及微生物修复农药残留问题提供了一定的数据参考。 关键词：溴氰菊酯，生物降解，阴沟肠杆菌，荧光假单胞菌 s t u d yo ni s o l a t i o na n dd e g r a d i n gc h a r a c t e r i s t i c so f d e l t a r n e t h r i n d e g r a d i n gb a c t e r i a a b s t r a c t b i o r e m e d i a t i o ni sa l le n v i r o n m e n t a l l y - b e n i g nm e t h o df o rd e g r a d i n gi n s e c t i c i d e sf r o m c o n t a m i n a t e ds u b s t r a t e s b a c t e r i at h a tc a ne f f e c t i v e l yd e g r a d ep e s t i c i d ec o m p o u n dh a db e e n i s o l a t e df r o mn a t u r a le n v i r o n m e n t ，t h e yc a nb ep o u ri n t oc o n t a m i n a t e ds y s t e ma n do b v i o u s l y e n h a n c e dt h ee f f e c t ，t h e r e f o r e ，t h e yh a v ee x t r a o r d i n a r yp o t e n t i a li nb i o r e m e d i a t i o n p y r e t h r o i d s a r en e u r a lt o x i c u ms u b s t a n c ea n di sv e r yh a r m f u lt oh u m a nh e a l t h i t so r i g i ne x i s t e dw i l d l yi n o u r l i f e s y n t h e t i cp y r e t h r o i di n s e c t i c i d e si st h et h i r dl a r g e s tc l a s so fi n s e c t i c i d e s t h er e s i d u eo f t h i sk i n do fi n s e c t i c i d e sh a sb e c o m eo n eo ft h em o s td o m i n a n ti n s e c t i c i d er e s i d u e si nf a r m p r o d u c e a n dm i c r o o r g a n i s mh a si m p o r t a n tf u n c t i o no nd e g r a d i n gp e s t i c i d er e s i d u e s t h e r e f o r e ， t h et e c h n o l o g yo fm i c r o b i a ld e g r a d a t i o nh a st u r n e di n t ot h eo r g a n i cp r o d u c t i o nt e c h n o l o g yt o r e m o v ep e s t i c i d er e s i d u e s i nt h i st e x t ，o u rg o a lw a st of i n db a c t e r i at h a tc o u l dd e g r a d et h ep y r e t h r o i d st h a ta r eu s e di n a g r i c u l t u r ep r o d u c t i o n w ei s o l a t e db a c t e r i af r o mp e s t i c i d e t r e a t e dc o n t a m i n a t e ds o i lf r o m v e g e t a b l eg a r d e n i n i t i a ls c r e e n i n gw a so i le n r i c h m e n tm e d i a ，w h i c hs u b s e q u e n ts e q u e n t i a l i s o l a t i o no nm i n i m a lm e d i ac o n t a i n i n gt h ep e s t i c i d e sa ss o l ecs o u r c e a sar e s u l t ，t w os t r a i n sw h i c hg r e wp a r t i c u l a r l yw e l l ( d e s i g n a t e dx 0 9a n dx 2 0 ) w a s e n t e r o b a c t e rc l o a c a ea n dp s e u d o m o n a sf l u o r e s c e n sr e s p e c t i v e l y ，i d e n t i f i e dw i t ht h eb i o l o g w h o l e a u t o m i c r o b i a la n a l y s i ss y s t e m w et h e nu s e dg a sc h r o m a t o g r a p h yh p 6 8 9 0t om e a s u r e t h er a t e so f d i s a p p e a r a n c eo ft h ed e l t a m e t h r i nf r o mp h7 0 ，l i q u i d c u l t u r e sm a i n t a i n e d a e r o b i c a l l ya t3 0 c o t h e rt h a n5 0 m g lo ft h ep e s t i c i d e s ，t h em e d i aw e r ec a r b o nf r e e s e v e n d a y sa f t e ri n o c u l a t i o nw i t hx 0 9a n dx 2 0 t h ec o n c e n t r a t i o n so ft h ed e l t a m e t h r i nd e c r e a s e dw a s 6 2 8 2 a n d4 3 2 5 r e s p e c t i v e l y t h eo p t i m a lc o n d i t i o n sf o rt h ea e r o b i cd e g r a d a t i o no fd e l t a m e t h r i nb yt w os t r a i n ss h o u l db e n u t r i t i o na g a rs u b s t r a t ew i t ht h ec o n t e n to f5 0 m g ld e l t a m a t h r i n ，a t3 0 * ( 2 ，w i t hp h7 0a n d9 6 h o u r sa n di n o c u l a t i o n2 5 g r o w t hm e a s u r e da so p t i c a l d e n s i t y m e a s u r e dt h er a t eo f d i s a p p e a r a n c eo fo t h e rp e s t i c i d e s ，w es h o w e dt h a tt w os t r a i n sa l s od e g r a d et h ec y p e r m e t h r i n ， f e n p r o p a t h r i na n df e n v a l e r a t e ，5 3 9 ，4 9 9 a n d 5 6 7 b e i n ga v e r a g ed e g r a d e dr e s p e c t i v e l y ， a f t e r7d a y s p r e l i m i n a r yo b s e r v a t i o no ft h es t a i n s ，t h e yw e r ea l lg r e wn e g a t i v er e a c t i o n ，w e f u r t h e ri n d e n t i f yt h ep h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lo ft h es t r a i n s s i n c ex 0 9e n t e r o b a c t e r c l o a c a ea n dx 2 0p s e u d o m o n a sf l u o r e s c e n sc a nd e g r a d eab r o a ds p e c t r u mp e s t i c i d e s ，i ts h o u l d b ea b l et ou s ei ti nab i o r e m e d i a t i o np r o c e s st om i n i m i z ec o n t a m i n a t i o no ft h ep r o d u c ta n dt h e i l e n v i r o n m e n td u r i n gp r i m a r yp r o d u c t sc u l t i v a t i o n f r o mt h ep o t c u l t u r eo r t h o g o n a le x p e r i m e n ts t a t i s t i c a la n a l y s i sr e s u l t ，w ec a r ls e et h e o p t i m a lc o n d i t i o n sf o rt h ed e g r a d a t i o no fd e l t a m e t h r i nw e r et h a t ，s t r a i n x 2 0 ，e a c hp l a n tw a s s p r a y e d1 0 m g ld e l t a m e t h r i n ，5 m lc u l t u r el i q u i d ，s p r a y i n gb a c t e r i ac u l t u r el i q u i dm i x e d w i t h d e l t a m e t h r i na n dk e p tf o r7d a y s i nt h i sp a p e r ，t h r o u g hn e a r l yt w oy e a r so fl a b o r a t o r yw o r k ，w e i s o l a t e dd e l t a m e t h r i n d e g r a d i n gb a c t e r i a s t u d yo ni t sd e g r a d i n gc h a r a c t e r i s t i c s ，t h e nw e s i m u l a t e de n v i r o n m e n t a lc o n d i t i o n s ，e x p l o r et h e yd e g r a d a t i o ne f f e c t w ew o r kf o rm i c r o b i a l r e m e d i a t i o no fp e s t i c i d er e s i d u e s ，t h e np r o v i d ed a t ab a s i s k e y w o r d s ：b i o r e m e d i a t i o n ，d e l t a m e t h r i n ， e n t e r o b a c t e rc l o a c a e , p s e u d o m o n a s f l u o r e s c e n s i i i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽 我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过 的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了 谢意。 学位论文作者签名：签字日期：年月日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解吉林农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交 论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保 存、汇编学位论文。同意吉林农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文 的全部或部分内容。 学位论文作者签名：签字日期：年月日 吉林农业大学硕士学位论文澳氰菊酯降解菌的筛选及降解特性研究 第一章绪论 1 1 我国环境污染生物修复概况 生物修复是指利用生物的生命代谢活动减少环境中有毒有害物质，使被污染的环境能 够部分或完全地恢复到初始状态的过程。这项技术是近2 0 年发展起来的一项用于治理环境 污染的新技术，同传统的化学、物理处理技术相比具有明显优势。其特点为处理成本低、 处理效果好，对环境影响小，无二次污染等。随着我国人民生活水平的不断提高，生态环境 保护日益受到重视，国家对环境污染治理和修复的人力、物力的投入逐年增加l ，寻求一 条快速、有效的环境污染修复方法是今后人们关注的热点。生物修复以其特有的优势必将 成为最有发展潜力和市场前景的技术。 广义的生物修复包括植物修复、动物修复和微生物修复，狭义的生物修复是指微生物 修复。在农业生产实际中，生物修复实际上是指利用微生物的作用对进入环境中的污染物 质，如大分子有机污染物、重金属等进行治理与修复，是一种较为理想有效的治理农业污 染的途径。我国环境污染的生物修复研究主要集中在对污染土壤、污染水体的修复，其原 理是利用土壤中和水体中天然的微生物资源，人为投加目的菌株，或用构建的特异降解功 能菌种投加到各污染环境中，将滞留的污染物快速降解和转化成无害的物质，使土壤或水 体环境恢复其天然功能。自然的生物修复是一个较慢的过程，难于实际应用。因此，生物 修复技术日益工程化，在人为促进条件下进行生物修复，利用微生物的降解作用，去除污 染环境中石各种有毒有害污染物，同时通过改变降解过程及环境的理化条件如温度、湿度、 p h 值、通气及营养条件等来完成，也可接种经特殊驯化与构建的工程微生物提高降解速 率【2 j 。微生物还具有氧化、还原、分离以及转移和变换元素周期表中大部分元素的能力， 大部分环境污染物都能被微生物降解。生物修复就是利用微生物的上述能力去除和解毒土 壤、水体等环境中的污染物，从而使受污染的环境部分或完全恢复到原始状态。可以说， 微生物修复环境污染有着独特的优势及修复效果。 在我国利用微生物修复环境污染的技术方法主要有两种：原位修复技术、异位修复技 术【3 1 。原位修复技术是在不破坏环境基本结构的情况下的微生物修复技术，这类方法主要 有投菌法、生物培养法和生物通气法等，主要用于被有机污染物污染的环境修复；异位修 复处理污染环境时，需要对污染的环境进行大范围的扰动，主要技术包括预制床技术、生 物反应器技术、厌氧处理和常规的堆肥法，这种方法处理效果好、速度快，但仅仅适宜用 于小范围的污染治理。针对不同污染问题采取不同的处理方法能达到较理想的效果。但无 论原位还是异位，特定微生物的功能及其在生物修复过程中的表达条件则是环境修复技 术成功的关键所在，所以通过改变污染环境中微生物的生长生态条件，可以提高生物修复 的效果。上述方法要想获得高的污染去除效率，关键是菌种的驯化和筛选。几乎每一种有 机污染物或重金属都能找到多种有益的降解微生物，因此，寻找高效有针对性的污染物降 解菌是也生物修复技术研究的重点。 1 吉林农业大学硕士学位论文溴氰菊酯降解菌的筛选及降解特性研究 对于污染环境的修复，低处理成本是技术开发的首要条件，因此利用土著微生物的污 染物代谢能力是设计生物修复的关键坏节。这类生物修复主要是利用土著微生物的代谢能 力、活化土著微生物降解能力或者添加具有高速分解难降解化合物能力的特定微生物，针 对不同的污染环境，利用不同的修复微生物及改善其生长条件【4 】。如地下水的原位生物修 复多依靠天然生物修复作用【5 】。对具有高效降解能力的土著微生物特性研究始终是环境生 物技术领域的研究重点。常见的降解有机污染物的土著微生物包含细菌、真菌、放线菌等， 其中假单胞菌属是最活跃的菌株，对多种有机污染物如农药等化合物有分解作用，其模式 菌株全基因组序列测序已经基本完成。 虽然生物修复技术有其独特的优势与效果，但是应用生物方法修复环境污染问题也有 许多制约因素。影响环境污染生物修复的主要因子有：( 1 ) 污染物的性质。重金属污染 物在土壤中常以多种形态贮存，不同的化学形态对植物的有效性不同。某种生物可能对某 种单一重金属或一种重金属的某一价态具有较强的修复作用。重金属污染的方式( 单一污 染或复合污染) 、污染物浓度的高低也是影响修复效果的重要因素。另外有机污染物的结 构不同，其微生物降解差异也较大1 6 j 。( 2 ) 环境因子。了解和掌握环境的水分、营养等供 给状况，拟订合适的管理方案，可提高生物修复的效率。( 3 ) 生物体本身。微生物的种类和 活性直接影响修复的效果。由于微生物的生物体很小，吸收的污染物质量较少，难以后续处 理，限制了利用微生物进行大面积现场修复的应用。因此，在选择修复技术时，应根据污染物 性质、环境条件、污染程度、预期修复目标、时间限制、成本及修复技术的适用范围等因 素加以综合考虑1 7 j 。 生物修复作为环境生物技术的核心部分，因其本身具有快速、高效及费用低廉的优点， 被称为是一种环境友好替代技术，近年来在基础和应用研究上取得了重大进展，显现出良 好的开发前景，在国内受到日益广泛的重视。然而，在实验室条件下成功的生物修复技术， 并不表明在污染处理现场能得到成功应用，其中存在技术放大的问题，如微生物的降解效 率问题，干扰因素的影响评估问题等。一般说来，实验室进行的微生物降解研究，大多是 在很好的人为调控的理想状态下以单组分纯种微生物进行，被干扰因素极少，因此很容易 对结果做出解释；而现场的污染物与其他的物质混杂在一起，污染物的降解是包括土著微 生物在内的多种微生物联合作用的结果，而且干扰生物降解的因素很多，实验室得出的所 谓最佳条件在现场条件下可能根本无法实施，或即使实施也得不到同样的结果峭j 。此外， 对生物修复技术的现场放大除了微生物技术外，还涉及如环境地学、水利学、环境化学及 土壤学等多学科知识，因此生物修复技术的应用是一项复杂的系统工程，必须在对生物技 术方法与微生物学原理的深刻理解的基础上，与其他学科的技术成果相结合，才具有乐观 的应用前景，并产生巨大的经济与社会效益。目前有关污染环境的生物修复在我国尚处于 蓬勃发展的研究时期，但还没有进入工程实施阶段，实际运作上还缺少实例，生物修复技 术在我国的应用与开发需要更为详细的基础工作铺鹅。 2 吉林农业大学硕士学位论文溴氰菊酯降解苗的筛选及降解特性研究 1 2 国内菊酯类农药残留现状 从农业生产的实际情况来看，农药在植物保护中的重要地位不可动摇，暂时还不能采 取以禁用农药来解决农药残留的有机农业生产模式，为了保证农业的产量，农药还将在今 后相当长的时间内继续被广泛使用。目前，拟除虫菊酯是国内代替有机氯和其它剧毒长残 留杀虫剂的主要类型之一，是仅次于有机磷、氨基甲酸酯的一类杀虫剂，约占世界杀虫剂 的2 0 。这类农药在我国的使用面积已占杀虫剂总使用面积的1 3 以上，由于其具有高效、 低毒、用量少、击倒快、残留量少、价格低等特点广泛应用于防治茶树、蔬菜、果树、棉 花、花卉害虫等农业生产中。 8 0 年代以来，有工业生产的拟除虫菊酯类农药大量投入市场，主要有杀灭菊酯( 氰戊 菊酯) 、敌杀死( 溴氰菊酯) 、来福灵( 顺式氰戊菊酯) 、功夫( 三氟氯氰菊酯) 、灭扫利 ( 甲氰菊酯) 、天王星( 联苯菊酯) 等6 种。其中溴氰菊酯具有高效杀虫特性( 杀虫效率比 d d t 大1 0 0 倍、比西维因大8 0 倍、比对硫磷大4 0 倍) 1 9 j 。这类农药主要应用于茶树、果树、 蔬菜以及家庭中的多种虫害的防治，保障了农作物的稳产高产，与人们的生活息息相关。 早期人们认为拟除虫菊酯类农药普遍具有对环境稳定、易分解、低度、低残留等特点，它 对环境和人类的危害并未得到足够的重视。然而近些年来，随着拟除虫菊酯农药使用的日 益广泛和使用时间的延长，有关菊酯类农药的残留污染问题及危害也日益暴露出来，引起 了科研工作者和人们的高度重视【摊1 4 1 。研究表明这类农药的大量使用或施药不当，也会通 过各种途径危害到环境的安全，造成此类农药在植物或动物体内蓄积产生毒性，进而损害 人体健康。胡春容等1 1 5 1 总结了拟除虫菊酯农药的毒性的研究发现拟除虫菊酯为神经毒物， 这类毒物能刺激乳腺癌细胞增加和p 5 2 基因的表达，具有拟雌激素活性、生殖内分泌毒性， 对免疫、心血管等多方面造成危害。农药的大量及不合理使用不但造成环境染污问题，并 且残留在农产品上，进而影响人体健康。另外，2 0 0 2 年鲁兴萌等研究发现，即使低浓度的 拟除虫菊酯农药会对些经济昆虫造成极大的危害，如家蚕等。2 0 0 1 年桐乡和海宁发生的 桑园中毒事件就是由于菊酯类农药残留问题引起的，而导致家蚕中毒的氯氰菊酯的浓度 大大低于目前的检测水平。这些都说明了拟除虫菊酯类农药并不像早期人们认为的对环境 和人畜安全，不会对环境造成污染。随着农药检测技术和对菊酯类农药毒理的进一步研究， 拟除虫菊酯类农药的危害还会被人们更深入的认识和了解。 我国加入世界贸易组织( w t o ) 以来，发达国家更是充分利用技术性检验来实现其 贸易保护主义，农药残留标准的范围扩大和标准限制更加严格，尤其是对茶叶等有优势农 产品的限制更加严格，这让我国的农产品面临严峻的考验。国内颁布的茶叶的最高残留量 ( m r l ) 参照值为2 m g k g ，而国外实施o 1 m 眺g 的标准。我国在1 9 9 3 - 1 9 9 8 年对来自全国 1 4 个省市的1 3 0 0 多份茶样的分析结果，按国内l 拘2 m g k g 标准，氰戊菊酯有0 5 0 - - 4 5 0 超标，而按国外的0 1 m g k g 标准实施氰戊菊酯超标率达4 5 - 1 0 0 ；1 9 9 8 年绿茶超标率为 7 3 0 ，红茶为5 0 8 ，平均残留水平为0 4 1 1 3 2 m g k g 。据1 9 9 9 年上半年的分析结果，氰 吉林农业大学硕士学位论文溴氰菊酯降解菌的筛选及降解特性研究 戊菊酯按国际o 1 m g k g 标准计算，检出率高达9 0 以上，超标率达7 0 以上。1 9 9 9 年出口 到德国的茶叶中氰戊菊酯农药残留超标4 倍甚至到1 0 0 倍，相当数量的茶叶不能出口( 陈宗 樊，2 0 0 0 ) 。除此之外，其它些具有很大市场竞争潜力的农产品，如水果、蔬菜、瓜果 等也由于农药残留超标而遭到欧盟国家的拒绝，给我国的农业经济带来了极大的损失。 1 9 9 2 - - 一1 9 9 3 年，我国对主要城市郊区蔬菜进行了抽样调查显示上海蔬菜中菊酯类农药超标 达8 5 3 倍( 曾显光等，2 0 0 2 ) 。2 0 0 2 年，欧盟因农残监控体系的建立和运行问题，宣布停 止从我国进口蜂蜜，这对我国的蜂产品产业提出了巨大的挑战。可见，拟除虫菊酯农药的 残留问题日益严重，我的茶叶等优质农产品面临更加严峻的形势。农药残留问题是当前我 国农业亟待解决的重点之一，也是我们环境工程领域应重点研究的课题之一【摊2 0 1 。 溴氰菊酯的分子式为c 2 2 h 1 9 b r 2 n 0 2 ，分子量5 0 5 2 4 ，含有卤素双键、酯键、氰基等官 能团，在化学组成中有三个不对称碳原子( 如图1 1 ) ，即有8 个旋光性异构体，其中仅有 1 r ，3 r ，2 s 及1 r ，3 s ，2 s 两种具有杀虫活性，它们是商品杀虫剂敌杀死、凯素灵等的主 要成分【2 1 j 。其常用剂型有：2 5 溴氰菊酯可湿性粉剂( 凯素灵，k 卅t h r i n ) 、2 5 溴氰 菊酯乳油( 凯保安k o b i 0 1 ) 、2 5 溴氰菊酯乳油( 敌杀死，d e c i s ) 等2 2 j 。 按我国农药毒性分级标准，溴氰菊酯属中等毒性杀虫剂。原药大鼠急性经口l d 5 0 为 1 3 8 7 m g k g ，急性经皮l d s o 大于2 9 4 0m g l 【g ，吸入l 岛。为6 0 0 m m 3 。对鱼类和水生昆虫等 水生生物高毒，大多数鱼类l c s o t j 、于l p p b ：对家蚕和蜜蜂剧毒。其杀虫活性很高，以触杀 和胃毒作用为主，对害虫有一定的驱避与据食作用，无内吸几熏蒸作用。杀虫谱广，击倒 速度快，尤其对鳞翅目幼虫及蚜虫杀伤力大，但对螨类无效。其作用部位在昆虫的神经系 统，是神经性毒剂，使昆虫过度兴奋、麻痹而死亡。 纯品为白色斜方形针状晶体，熔点1 0 1 1 0 2 ，常温下几乎不溶于水，溶于丙酮及 二甲苯等芳香族有机溶剂。1 0 0 下2 4 d 时未见分解，1 5 0 下2 4 d x 时稍有分解，1 9 0 才 有显著分解。在酸性介质中较为稳定，在碱性介质中不稳定，易发生苄基的外消旋化，酯 键断裂，发生皂化反应。对光稳定，在玻璃瓶中暴露在空气和光下，两年内仍无分解现象。 、x 足。一 图1 - 1 溴氰菊酯的分子结构式 f i g 1 1m o l e c u l a rs t r u c t u r eo fc y p e r r n e t h r i n 4 吉林农业大学硕士学位论文溴氰菊酯降解菌的筛选及降解特性研究 1 3 国内外研究现状 目前无公害、绿色、有机食品倍受青睐，用生物修复方法解决农药残留问题可为绿色 食品生产提供一条新的途径【2 3 】。随着农药残留问题的日益突出和人们环保意思的提高，大 量的研究工作者开始投入对农药残留的研究中来，解决污染问题的手段与方法不断地被提 出和更新。农药残留的解决有多种途径，包括：禁用农药、传统的化学处理方法和微生物 降解。为解决农药污染问题我国的科研工作者做了大量的研究工作，传统的方法是采取化 学法如焚烧、掩埋，这些方法的副作用很大，往往造成环境的二次污染，并且作用很慢。 化学处理方法对于规模较小的污染源或农产品的农药残留在一定程度上还是可行的，但对 大规模的面源污染则无能为力，而且物化方法处理效果不彻底无法从根本上解决农药残留 问题( d a v ee ta 1 ，1 9 9 4 ) 。 生物转化或微生物降解则是近年来研究讨论比较热的问题。自然界中，微生物种类繁 多，代谢类型极为丰富，底物范围广泛，能够利用从结构最简单的小分子到结构复杂的木 质素等各种各样的物质，能够降解大量的有机污染物并能转化为无机物小分子，因而微生 物在农药残留的降解方面也起着非常重要的作用。农药微生物降解的研究从本世纪4 0 年代 开始，用微生物降解方去除农药残留污染具有绿色、无二次污染、降解效率高等特点成为 环境科学领域的研究热点，微生物降解技术已成为去除农药残留的绿色生技产术。迄今为 止，有关农药残留微生物降解的研究主要集中在以下几个方面： 一、可降解菌株的筛选。 各国研究人员已从土壤、污泥、污水、垃圾处理场中分离得到多种农药的活性微生物 ( 见表1 2 ) ，这些降解微生物包括细菌、真菌、放线菌和藻类，其中细菌的研究较为深入。 在这些微生物中，有的具有降解专一性，有的具有很强降解广谱性，分离得到的这些农药 降解菌株为解决我国农药降解问题奠定了基础。从微生物的降解研究对象看，一般与生产 实践紧密相关。早期d d t 的残留污染较为严重，人们便分离出了许多可以降解d d t 的 微生物；随后除草剂在国内外大量应用，降解除草剂的微生物的分离和利用便成为国内外 近期研究的热点；在我国杀虫剂尤其是有机磷杀虫剂的使用仍占主导地位，因此有关农药 残留生物修复的研究便以有机磷杀虫剂为主；最近几年，绿色壁垒事件中频频出现有关拟 除虫菊酯类农药残留问题，于是部分科研工作者便已经开始了有关该类农药降解微生物的 研究。可以预见，随着农药新品种的不断涌现，新的污染问题也将产生，新的可降解这些 农药的微生物也将被人们发现并利用。 二、农药降解菌的获得途径与鉴定。 可降解农药微生物的获得途径主要有：从收农药污染严重的土壤或水体中筛选分离具 有优良性状的菌株；定向培育及诱变育种优良菌株等。从受农药污染严重的土壤或其他环 境中筛选分离具有优良性状的菌株是目前采用最多的一种方法，一般是利用农药排污口及 其周围或长期使用某一种农药的土壤，经富集培养，分离出可降解农药的高效菌株。定向 吉林农业大学硕士学位论文澳氰菊酯降解菌的筛选及降解特性研究 培育优良菌种方法就是在土壤中通过人为多次施药，培育可降解该农药的微生物，当再次 施药时，经降解速率的测定，如发现农药在该土壤中的降解速度大于未施药的土壤，则可 以确定降解该种农药的微生物种群已被培育起来，而后从中分离高效菌株( a l l a l l ，1 9 8 7 ) 这 方面的研究已经有过很多成功的例子。王兆守等通过紫外诱变育种获得高效菌株( 王兆守 e ta 1 ，2 0 0 3 ) 。刘玉焕等用亚硝基胍( n t g ) 诱变曲霉属乐果降解菌，都达到了良好的降 解效果。本次实验也尝试使用这样的方法进行菌种的驯化培育，进而筛选出高效降解菌。 降解菌株的鉴定同样是农药微生物降解中一项重要的工作，它对于开发农药降解菌资 源、阐明降解机理、构建工程菌及利用混合菌降解农药具有重要意义。常用的鉴定方法主 要是根据降解菌的形态特征、培养特征及生理生化特征等对菌种进行鉴定，随着分子生物 学技术和其它学科的发展，一些先进的技术也被广泛应用于降解菌株的鉴定中，这些技术 包括：g c 含量测定、d n a 杂合率测定、r r n a 相关度测定、r r n a 的碱基序列测定、核糖 体蛋白的组分分析等，另外一些其它技术如红外吸收光谱、核磁共振、脂类分析、细胞色 素类型以及辅酶q 的类型等也被广泛应用捌。 本文采用b i o l o g 微生物自动分析系统对细菌进行鉴定。b i o l o g 微生物自动分析系统 是美国b i o l o g 公司从1 9 8 9 年开始推出的一套微生物鉴定系统，最早进入商品化应用的是革 兰氏阴性好氧细菌鉴定数据库( g ，其后陆续推出革兰氏阳性好氧细菌( g p ) 、酵母菌( y t ) 、 厌氧细菌( a 和丝状真菌( f f ) 鉴定数据库。b i o l o g 系统6 1 0 1 版数据库共包括1 9 7 3 种微生物， 其中酵母菌5 2 个属、2 6 7 个种。与其他鉴定系统相比，b i o l o g 微生物自动鉴定系统能鉴定的 酵母菌种类多，数据量大，适用范围广，可用于环境、食品、工业和临床某些病原菌的鉴 定分析。目前，b i o l o g 微生物自动分析系统已成为国际上酵母菌多相分类鉴定常用的技术 手段之一。台湾的一些研究人员将酵母菌5 f j b i o l o g 微平板( m i c r o p l a t e ) 上不同碳源利用的结 果作为生理生化反应结果，结合形态观察等其他实验方法，对株c r y p t o c o c c l l s 菌和一株 c a n d i d a 菌进行了鉴定1 2 9 j 取得了理想的实验效果。由美 雪b i o l o g 公司生产的用于微生物菌种 鉴定的自动分析系统，可鉴定包括需氧细菌、厌氧细菌、酵母菌和丝状真菌在内的2 0 0 0 余 种微生物，几乎涵盖了微生物学不同领域中比较重要的菌种，所涉及领域包括制药、生物 技术、化妆品、兽医和临床医学、农业和环境科学、食品加工和安全，也可应用于微生物 代谢、特性和群落等的分析研究。与拥有的系统数量相比，我 b i o l o g 系统的应用范围和程 度远远不够，应用研究成果也较少【2 9 3 4 】现我国已累计引进b i o l o g 微生物自动分析系统有 1 0 0 余台，主要应用于细菌的鉴定分析f 3 1 3 4 1 ，应用于酵母菌鉴定的研究成果很少1 3 4 1 。因此， 采用b i o l o g 自动微生物分析仪对细菌进行鉴定是较为高效、准确的分析手段。 三、微生物中降解酶的研究。 近些年研究发现农药微生物降解作用其实质是酶促反应，共生或单一微生物对农药的 降解作用都是在酶的参与下完成的。这些降解酶有些是微生物固有的，有些是由于变异产 生的，而且降解酶往往比产生这种酶的微生物菌体本身更能忍受异常环境条件，并且同样 6 吉林农业大学硕士学位论文溴氰菊酯降解菌的筛选及降解特性研究 条件下酶的降解效果远胜于微生物本身，特别是对低浓度农药，这些降解酶具有广谱性， 在降解某种农药的同时，亦可以同时对其它农药也有降解作用。介于农药降解酶的特性， 人们设想利用降解酶作为净化农药污染的有效手段，有关农药降解酶的研究已经受到广泛 的关注。可降解农药的酶有多种，主要有加氧酶、脱氢酶、偶氮还原酶和过氧化物酶等。 目前，降解酶在农药生物修复中的研究主要集中在酶对外部环境要求、酶的降解效能、酶 的降解谱、酶促降解机理、酶的固定化技术以及酶在农药降解中的具体应用等。此外，农 药降解酶基因的克隆与表达也已正成为近期农药生物降解领域的研究热点，并且已经取得 了一定的成绩。另外，研究农药降解菌的降解基因主要位于质粒上，将这些降解质粒导入 易于繁殖的宿主菌中获得高效表达，提高酶的产量，或将不同降解质粒导入同一菌株中， 提高降解能力将成为一项重要的研究内容。 表1 2 常见的可降解农药微生物 t a b l e1 - 2 m i c r o o r g a n i s m si s o l a t e df o rt h ed e g r a d a t i o no fp e s t i c i d e s 7 吉林农业大学硕士学位论文溴氰菊酯降解菌的筛选及降解特性研究 有关拟除虫菊酯类农药的微生物降解，国内外已有不少学者进行了相关的研究【2 2 2 4 l ， 由于拟除虫菊酯是2 0 世纪8 0 年代才开始作为一类替代农药出现的，应用的时间不长，所以 人们对拟除虫菊酯类农药的微生物降解研究的较晚也较少1 3 捌。国内外已有的研究主要集中 在降解现象，降解菌株的分离、鉴定及生理生化特性、酶学、不同光学异构体的降解、降 解途径等方面。表1 3 为目前已筛选到的菊酯类农药降解菌。 国外对菊酯类微生物降解的有关研究有：埃及m a g d o u b 等【3 6 1 。1 9 8 9 年和印度m i s r a 等【3 7 1 1 9 9 6 年研究乳酸菌对牛奶中氰戊菊酯的降解情况，发现乳酸菌可以吸附并降解牛奶 中氰戊菊酯，接种乳酸菌到受氰戊菊酯污染的牛奶中培养一段时间可以降低农药残留，从 而减少经济损失。印度r a n g a s w a m y 等1 3 州研究也发现，分离自土壤的细菌对氯氰菊酯和 氰戊菊酯具有降解作用。巴西m u s u m e c i 等1 3 9 】研究表明，假单胞菌对土壤结合态氯氰菊 酯残留具有去除作用。这种细菌在普通培养基中丧失降解活性，但在以氯氰菊酯为唯一c 源的基础培养基中具有降解活性。美国l e e 等【加】从受污染的沉积物中分离出5 6 株拟除虫 菊酯降解菌，其中6 株能够在水相中转化联苯菊酯和氯菊酯及在沉积物中转化联苯菊酯。 在水相中联苯菊酯被菌株s t e n o t r o p h o m o n a sa c i d a m i n i p h i l a 迅速降解，半衰期由7 0 0h 以 上降到3 0 1 3 1h 。氯菊酯异构体可被菌彬l e r o m o n a ss o b r i a 、e r w i n i a c a r o t o v o r a 和y e r s i n i a f r e d e r i k s e n i i 降解。和联苯菊酯类似，接入降解菌后，顺式和反式氯菊酯半衰期缩短了近 1 0 倍。然而在沉积物存在条件下菌株s a c i d a m i n i p h i l a 降解联苯菊酯受到显著抑制，可能 是联苯菊酯被强烈吸附到固相中使降解菌无法接触到。联苯菊酯在农田沉积物中半衰期为 3 4 3 - - 4 6 6h ，而在河流沉积物中半衰期增加到9 8 0 1 2 0 0h 。联苯菊酯在接种过的泥浆中的 降解和未接种的系统相比没有显著增强。英国g r a n t 等【4 卜4 3 】从使用拟除虫菊酯的菜园土壤 和农田土壤的混和土样中分离出拟除虫菊酯降解菌。经显微镜方法、生物化学和遗传技术 手段分析鉴定，两株优势菌分别属假单胞菌属和沙雷氏茵属。通过1 6 s r r n a 基因序列比 对，假单胞菌属菌株为荧光假单胞菌，沙雷氏菌属菌株为s e r r a t i ap l y m u t h i c a 。这两个菌 株在矿质肉汤和蔗糖培养基中都长得很好，前者的生长限制因子是矿物质含量，而后者是 c 源。荧光假单胞菌细胞生长和对氯氰菊酯和氟氯苯菊酯降解l l s e r r a t i ap l y m u t h i c a 更快， 对拟除虫菊酯类农药的耐受性也更强。用分离到的菌株处理含有氯氰菊酯的绵羊蘸洗液， 在2 5 、8 0r m i n 条件下培养1 4 天，和对照相比，对2 5 0m g l 的氯氰菊酯去除率约为6 6 7 。埃及h a s h e m 等【删从使用过拟除虫菊酯( 氰戊菊酯、溴氰菊酯和氯氰菊酯) 的土壤中 分离出8 株拟除虫菊酯类农药降解菌，经鉴定都属于芽孢杆菌属，这些降解菌都能以单种 的拟除虫菊酯为唯一c 源生长。 在我国有关农药微生物降解的研究，在有机磷和有机氯的降解方面较多，菊酯类较少。 菊酯类微生物降解的研究主要集中在降解菌的分离及降解效果的研究方面。虞云龙等1 4 5 】 从杭州农药厂废水排放1 3 的污泥中分离到1 株高效降解菌a t c a l i g e n e ss p y f l l ，在试验条件 下，o d 4 1 5 岫为0 2 0 时，该菌株对5 0m g l 的氰戊菊酯、溴氰菊酯、三氟氯氰菊酯、甲氰 8 吉林农业大学硕士学位论文澳氰菊酯降解菌的筛选及降解特性研究 菊酯、氯氰菊酯、氯菊酯的降解速率分别为5 0 6 、8 0 1 、3 0 4 、9 2 4 、2 0