（环境工程专业论文）用于快速检测二噁英的表面等离子体共振生物传感器的构建.pdf

中文摘要 二嗯英是一类毒性很大的持久性有机污染物。近年来，随着我国社会经济的 蓬勃发展，城市化进程不断加快，我国固体废物和医疗废物的产生量和处理 量都在不断增加。焚烧设施运行不当会造成二嗯英超量排放。现行的二嗯英 检测方法存在周期长、成本高、操作繁琐等种种弊端，难于快速检测。因此，开 发一种使用方便、运行成本低廉的二嗯英的快速检测技术对于检测和控n - 嗯英 污染具有重要意义。 论文首先介绍了表面等离子体共振( s u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c e ，s p r ) 生物 传感器系统。这种生物传感器具有能实时监测反应动态过程、反应动力学常数、 灵敏度高、抗背景干扰能力强、分析生物样品无需标记、所需试样少等优点，因 而被广泛应用于环境检测领域。在实验室已搭建的角度调制型s p r 生物传感器 的基础上，本文进行了一系列的完善和改进工作，主要内容包括设计了一种角度 调制型和强度调制型相结合的s p r 生物传感系统，开发了错位平行四边形光路 系统和多通道样品池，并在软件方面进行了完善优化。 其次，本文通过测定葡萄糖样品液和抗原抗体的免疫反应实验来测试所搭建 装置的灵敏度和重复性等特性。在运用角度检测方式检测较高浓度( 0 1 1 0 5 5 m o l l ) 变化的葡萄糖样品液时，葡萄糖的浓度与共振角度基本满足线性关系， 有着较好的线性相关程度( r 2 = 0 9 8 6 ) ；运用强度检测型方式检测较低浓度( 3 7 m m o l l ) 变化的葡萄糖样品液时，葡萄糖的浓度与反射光强强度度改变值基本 满足线性关系，并测定得到该系统对葡萄糖的检测下限达到0 18g l ；在抗原一 抗体的免疫反应实验中，对动态和静态两种状态下的性能表现进行了比较，表明 动态下能更好的反映样品池内抗原抗体结合情况。 在此基础上，通过实验优化了影响检测结果的各项条件，使用直接检测法和 间接检测法对2 ，3 ，7 ，8 t c d d 进行了检测，并将间接检测的结果同e l i s a 方法所 得的结果进行了比较分析。结果表明s p r 生物传感系统的检测范围为0 0 1 1 0 0 n g m l ，i c 5 0 为0 3 5 5n g m l ，相应的标准偏差为0 0 0 0 1 5 ，较之e l i s a 方法s p r 方法在检测范围，灵敏度和稳定性上具有一定的优势。此外通过一系列的样品溶 液进行验证发现，这两种方法所得的样品浓度线性关系良好。 关键词：二嗯英：表面等离子体共振；生物传感器；快速检测 a b s t r a c t d i o x i ni sc l a s s i f i e da so n eo ft h em o s tt o x i co fad a n g e r o u sc l a s so fc h e m i c a l s k n o w na sp o p s ( p e r s i s t e n to r g a n i cp o l l u t a n t s ) i nr e c e n t y e a r s ，w i t ht h er a p i d d e v e l o p m e n to fs o c i e t ya n de c o n o m y , t h es p e e do fu r b a n i z a t i o np r o c e s si sb e c o m i n g f a s t e r , t h eg e n e r a t i o na n dt r e a t m e n tc a p a c i t yo fs o l i dw a s t ea n dm e d i c a lw a s t ei s b e c o m i n gb i g g e ra n db i g g e r a m o n gt h es o l i dw a s t ed i s p o s a lm e t h o d s ，t h et e c h n o l o g y o fw a s t ei n c i n e r a t i o ns h o w sar a p i dd e v e l o p m e n tm o m e n t u m a c c o r d i n gt ot h e r e c e n t l yr e s e a r c h ，i ti se a s yt ob r i n ga b o u td i o x i ni nt h ep r o c e s so fw a s t ei n c i n e r a t i o n t r a d i t i o n a ld e t e c t i o nm e t h o d so fd i o x i n - l i k ec o m p o u n d sa t p r e s e n th a v et h e i ro w n d i s a d v a n t a g e ss u c ha sh i g hc o s t ，l o n gd e t e c t i o np e r i o da n dc o m p l i c a t e do p e r a t i o n s ， w h i c hl i m i tt h es h o r t - t e r mt e s to fd i o x i ni nav a r i o u si n d u s t r i e s t h e r e f o r e ，i ti so f g r e a ts i g n i f i c a n c ef o rm o n i t o r i n ga n dc o n t r o l l i n gt h ed i o x i nt od e v e l o par a p i d d e t e c t i o nt e c h n o l o g yf o rd i o x i nw h i c hh a st h ef e a t u r e so fe a s yt ou s ea n dl o w r u n n i n g c o s t f i r s t l y , t h es u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c e ( s p r ) b i o - s e n s o rs y s t e mi si n t r o d u c e di n t h et h e s i s t h eb i o - s e n s o rs y s t e mc a nm o n i t o ri n t e r a c t i o nb e t w e e nm o l e c u l a r , t h e d y n a m i cp r o c e s so fr e a c t i o na n dt h ek i n e t i cc o n s t a n tr e a lt i m e ，h a st h ef e a t u r eo fh i g h s e n s i t i v e 、s t r o n ga n t i - i n t e r f e r e n c ea b i l i t y 、l a b e lf r e ea n ds m a l la m o u n to fs a m p l e i th a s b e e nu s e dw i d e l yi nt h ea r e ao fe n v i r o n m e n t a lm o n i t o r i n g i nt h et h e s i s ，t h es y s t e m w h i c hw a sp u tu pb yl a b o r a t o r yi sr e f i n e da n di m p r o v e d t h em o d e lw h i c hw a s a n g l e m o d u l a t i o ni sc h a n g e dt ot h em o d e lw h i c hc o m b i n e st h ea n g l em o d u l a t i o nw i t h i n t e n s i t ym o d u l a t i o nt o g e t h e r , t h ed i s l o c a t i o np a r a l l e l o g r a mo p t i c a ls y s t e ma n d m u l t i - c h a n n e ls a m p l ec e l li sd e v e l o p e d ，i na d d i t i o n ，t h ea r e ao fs o f t w a r ei s i m p r o v e d a n do p t i m i z e d s e c o n d l y , i nt h et h e s i st h ef e a t u r e ss u c ha ss e n s i t i v i t ya n dr e p r o d u c i b i l i t yo ft h e s y s t e mw e r et e s t e db yg l u c o s es a m p l es o l u t i o na n da n t i g e n - a n t i b o d yr e a c t i o n t h e h i g hc o n c e n t r a t i o no fg l u c o s es a m p l es o l u t i o n ( o 11 0 5 5m o l l ) w a st e s t e di nt h ew a y o fa n g l em o d u l a t i o n t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e c o n c e n t r a t i o no f g l u c o s es a m p l ea n d t h er e s o n a n c e a n g l em e tt h eb a s i cl i n e a rr e l a t i o n s h i p ，a n dt h el i n e a rr e l a t i o n s h i pw a s i d e a l ；t h el o wc o n c e n t r a t i o no fg l u c o s es a m p l es o l u t i o n ( 3 - 7m m o l l ) w a st e s t e di n t h ew a yo fi n t e n s i t ym o d u l a t i o n ，t h ec o n c e n t r a t i o no f g l u c o s es a m p l ea n d t h ei n t e n s i t y o fr e f l e c t e dl i g h tm e tt h eb a s i cl i n e a rr e l a t i o n s h i p ，t o o t h ed e t e c t i o nl i m i tf o r g l u c o s e ss a m p l ew a s 0 18g 1 i nt h ep r o c e s so fa n t i g e n - a n t i b o d yr e a c t i o n ，t h er e s u l t s o fd y n a m i ca n ds t a t i cw e r ec o m p a r e dw i t he a c ho t h e ra n ds h o w e dt h a tt h ed y n a m i c r e s u l tw a sb e t t e rt or e f l e c tt h ec o n d i t i o n so fa n t i g e n - a n t i b o d yb i n d i n gp r o c e s s o nt h eb a s i co ft h ep r e v i o u se x p e r i m e n t s ，t h es a m p l es o l u t i o n so f2 , 3 ，7 ，8 一t c d d w e r et e s t e d f i r s t l y , t h ec o n d i t i o n so ft h ee x p e r i m e n t sw h i c hm a ya f f e c tt h et e s tr e s u l t s w e r eo p t i m i z e d ；s e c o n d l y , t h es a m p l es o l u t i o n so f2 , 3 ，7 ，8 一t c d dw e r ed e t e c t e db y d i r e c td e t e c t i o nm e t h o da n di n d i r e c td e t e c t i o nm e t h o ds e p a r a t e l y t h er e s u l t so f e l i s aw e r ec o m p a r e dw i t ht h er e s u l t so fi n d i r e c td e t e c t i o nm e t h o d t h ef i n a l l y r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ed e t e c t i o nr a n g eo fs p rb i o - s e n s o rs y s t e mw a s0 0 1 - 1 0 0 n g m l ，t h ei c 5 0w a s0 35 5n g m la n dt h ec o r r e s p o n d i n gs t a n d a r dd e v i a t i o nw a s 0 0 0 015 i ti sb e t t e rt ou s et h es p r t e c h n o l o g yf o rd i o x i nd e t e c t i o nt h a ne l i s a i nt h e a r e ao ff e a t u r e ss u c ha sd e t e c t i o nr a n g e ，s e n s i t i v i t ya n ds t a b i l i t y i na d d i t i o n ，as e r i o u s o fs a m p l es o l u t i o n sa r et e s t e db yt h et w ow a y s ，a n dt h er e s u l t so ft h et w ot e c h n o l o g i e s s h o wag o o dl i n e a rr e l a t i o n s h i p k e y w o r d s ：d i o x i n ；s u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c e ；b i o - s e n s o rs y s t e m ；r a p i d d e t e c t i o n 第一章绪论 1 1 课题的背景和意义 第一章绪论 持久性有机污染物( p o p s ) 是一类具有环境持久性、生物累积性、长距离 迁移能力和高生物毒性的特殊污染物。二嗯英是p o p s 中的一种，也是最具代表 性的有毒化学污染物，是目前已知的毒性最强的化学物质之一【1 1 。 二嗯英是人类在生产生活工程中并非有意生成的持久性有机污染物，目前它 广泛存在于环境介质中，产生的机理非常复杂，但有一点可以肯定，即燃烧过程 是产生二噫英的主要途径，在自然现象如火山喷发，森林大火等现象中就有可能 产生二噫英类化合物。二嗯英类化合物主要还是工业过程的副产品，其中能源、 固体废弃物燃烧是产生二嗯英类化合物的主要原因。2 0 世纪初以来，一些欧美 发达国家开始建设大规模的连续式焚烧炉，荷兰学者o l i e 等在1 9 7 7 年首次在垃 圾焚烧炉烟道及飞灰中发现了二嗯英类化合物后，就因其具有生殖发育毒性、致 癌性、致畸性、剧毒性、化学性质稳定、极难降解性、具有长距离迁移特性和生 物累积性等特性，引起了环境保护界的震惊，其能对人和动物产生大范围和长时 间的危害，从而引起了人类的恐慌【2 1 。在斯德哥尔摩公约和世界各国( 包括 我国) 要求控制的持久性有机污染物中，二噫英都名列其中。我国在2 0 0 4 年时 建立了二嗯英的排放清单，因排放总量较大而引起了国际世界的广泛关注【3 】，检 测二噫英就具有重要的意义。 自改革开放以来，我国社会经济蓬勃发展，城市化进程不断加快，人们的物 质生活水平也日益提高，与之而来的是城市垃圾的数量以每年超过10 的速度递 增。目前城市垃圾的处理方式主要以填埋为主，随着城市化进程的进展，土地资 源日益稀缺，垃圾焚烧发电技术成为了处理日益增多的城市垃圾的有效措施。 1 9 8 8 年，我国在深圳建立了第一座垃圾焚烧炉【4 】，并相继在广州、上海、天津等 城市采用了垃圾焚烧处理技术，目前已有多个城市建立起垃圾焚烧炉。但是在垃 圾焚烧处理过程中，如果运行不当将极易生成二嗯英类化合物。因此，垃圾焚烧 产生的污染物检测技术受到人们越来越多的关注1 5 , 6 。 二嗯英是两千多种多氯联苯产物的一部分，此外它也不是单一物质，而是一 类化合物的总称。二嗯英按化学结构可分为两大类：一类为多氯代二苯并二噫英 ( p o l y c h l o r i n a t e dd i b e n z o p d i o x i n s ，p c d d s ) ，一类为多氯代二苯并呋喃 ( p o l y c h l o r i n a t e dd i b e n z o p f u r a n s ，p c d f s ) ，总共有2 10 种同类物，分子结构图 第一章绪论 如图1 - 1 所示，在二嗯英结构中，每个苯环上可取代1 4 个氯原子。在二嗯英如 此众多的异构体同类物中，p c d d s 有7 5 种异构体同类物，而p c d f s 则多达1 3 5 种。在二嗯英化合物中，研究最多，最典型也是毒性最强的物质为2 ，3 ，7 ，8 四氯 代二苯并二嗯英( 2 ，3 ，7 ，8 t e t r a c h l o r o d i b e n z o p d i o x i n ，2 ，3 ，7 ，8 t c d d ) ，本文即以 此为主要的研究对象。此外还有1 3 种共平面多氯联苯( p o l y c h l o r i n a t e db i p h e n y l s ， p c b s ，2 0 9 种同系物) 类物质具有与二嗯英类似的毒性，这1 3 种共平面多氯联 苯物质通常也被归入为二嗯英类物质。 a ) p c d d s 2 3 1 m b p c d f s 图1 1 二嗯英分子结构图 1 1 1 二嗯英类化合物的来源 环境中二嗯英一般不会天然生成，亦非人为有意识的合成。二嗯英主要是在 废弃物的燃烧，化学工业生产，工业制造以及热处理工艺过程中产生的。根据美 国e p a 的调查，二嗯英的来源主要有三个方面 7 ，8 】： 1 9 0 的二嗯英来源于含氯化合物( 如多氯联苯( p c b s ) ，五氯酚，聚氯乙 烯( p v c ) 等) 的燃烧。虽然其产生的机制目前尚未研究透彻，但大致可归结为 飞灰表面的低温( 2 0 0 4 0 0 ) 异相催化反应。此外也有学者认为任何的燃烧过 程或多或少都会产生二嗯英； 2 含氯化学品和杀虫剂等的生产过程中也可能伴随产生二噫英； 3 纸浆和造纸工业的氯气漂白，废旧纸张( 含印刷油墨) 的回收利用等过 程也会产生二嗯英。 以上三种是产生二噫英污染的主要原因，这三种原因在不同国家，不同地区， 不同时间内对二嗯英产生量的贡献值大小也不尽相同。此外在中国还有一些行为 也会成为二嗯英的排放源，如染料化工，有机氯化工，高氯煤燃烧，含铅汽油的 使用，森林火灾，各种废弃物的燃烧以及炼铁，炼钢等过程。据曰本1 9 9 0 年的 第一章绪论 一项调查结果显示，垃圾燃烧排放的二嗯英为310 0 7 4 0 0g a ，达到了总排放量的 8 0 9 0 ，近年来固体废物燃烧发电所产生的二噫英也有愈演愈烈的趋势。 1 1 2 污染现状 1 9 9 9 年1 月，比利时、荷兰、法国以及德国相继发生严重的禽类产品及乳 制品的二嗯英污染事件，随后在一些猪肉和牛肉中也相继发现了二嗯英类似物， 事件的发生而引起了世界的广泛关注。二嗯英最早发现要始于美国在越战中使用 的一种被称为橙剂( a g e n to r a n g e ) 的脱叶剂，其危害现在还影响着当年的美国 士兵和越南百姓。最近几年来，二嗯英类似物污染环境和食物的事件也不断发生， 如2 0 0 9 年台湾高雄近万只鸭子因被检测出二嗯英而被集体捕杀，欧盟等国家出 口的畜牧产品中二嗯英含量严重超标，意大利一家化学工厂发生爆炸事故导致高 剂量的二嗯英泄露等：2 0 0 4 年乌克兰总统尤先科的血液和组织液中二嗯英类化 合物的浓度高出正常水平1 0 0 0 倍以上，并且面部还表现出来了明显的二噫英中 毒症状。二噫英相关的事件频频发生，一再给人们敲响了人们对环境和食品安全 的警钟。 在2 0 0 4 年我国提交的二嗯英排放清单中显示，在人体血液、母液和湖泊底 泥中都发现了二嗯英的存在，并因排放总量较大引起了广泛的关注，尽管其总体 浓度水平较低，但也应该引起我国国民的高度重视。 我国环境中二嚯英物质的来源主要是含有二噫英类杂质的化学品的广泛使 用，特别是长江中下游地域为消灭血吸虫长期大量使用含有二嗯英类杂质的五氯 酚钠，通过富集作用使人体血液，母液中的二嗯英含量超标。我国从“八五”计 划起就开始把垃圾焚烧技术列为国家攻关项目，并于1 9 8 8 年在深圳建立起第一 座垃圾焚烧炉，目前已在北京、上海、广州、南京、江苏、天津、武汉、大连等 全国大中城市建立了垃圾焚烧发电厂，且几乎每个省都在建设或准备建设垃圾焚 烧发电厂，这必将进一步加剧我国二嗯英的污染状况。 1 1 3 二嗫英类化合物的毒性作用原理 1 1 3 1 理化性质与毒性当量 二嗯英主要以两种形态存在【9 】：即挥发性的二噫英气体和固态的二嗯英颗 粒。常温常压下二嗯英为白色固体晶体，有着较高的熔沸点，蒸汽压很小，不溶 于水和有机溶剂，但脂溶性很强，并且易吸附在土壤，沉积物和空气飞尘上。二 嗯英热稳定性、化学稳定性和生物稳定性都很高，在高温、强酸、强碱、氧化剂 等的作用下仍能表现出极强的稳定性。它在空气中光化学分解半衰期为8 3 天， 第一章绪论 在土壤中半衰期达到了1 2 年，而在动物体内则高达2 4 年【l 。 二嗯英类化合物的毒性因氯原子的取代数量和取代位置不同而有差异，其中 含有1 3 个氯原子的被认为无明显毒性，含4 - 8 个氯原子的有毒，其中2 ，3 ，7 ，8 - 四氯代二苯并对二嗯英( 2 ，3 ，7 ，8 t c d d ) 是迄今为止人类已知的毒性最强的污 染物，国际癌症研究中心已将其列为一级人类致癌物；如果除了在2 ，3 ，7 ，8 位置 上被氯原子取代外，其他位置上也有被氯原子取代，随着氯原子取代数量的增加， 其毒性反而将有所减弱。由于环境二噫英类似物主要以混合物的形式存在，要评 价对人体健康的潜在效应不能简单的浓度相加。对二嗯英类的毒性进行评价时， 国际上常把各同类物折算成相当于2 ，3 ，7 ，8 t c d d 的量来表示二噫英的毒性，并 称这种方法为毒性当量( t o x i ce q u i v a l e n tq u a n t i t y ，t e q ) 【1 1 】，并为此引入毒性 当量因子( t o x i ce q u i v a l e n c yf a c t o r ，t e f ) 的概念，就是将某种p c d d s p c d f s 的毒性用来和2 ，3 ，7 ，8 t c d d 的毒性进行相比从而得到的系数。样品中某种 p c d d s p c d f s 的质量浓度或质量分数与其毒性当量因子t e f 的乘积，即为其毒 性当量( t e q ) 质量浓度或质量分数。而某种样品的毒性就等于样品中各同类物 t e q 的总和。表1 1 即为列出了g b l 8 4 8 5 2 0 0 1 规定的二嗯英毒性当量因子t e f 。 1 1 3 2 二嗯英的毒性效应 二嗯英的致癌性极强，o 1 克的二嗯英就可导致数十人死亡，上千只禽类死 亡，因此，世界卫生组织国际癌症研究中心将二嗯英划为一级致癌物。它能够导 致严重的皮肤损伤性疾病，同时二嗯英具有强烈的致癌，致畸作用，还有生殖毒 性、内分泌毒性和抑制免疫功能毒性【1 2 - 1 4 。若人体短时间内暴露于较高浓度的二 嗯英环境中，将导致皮肤的损伤和肝功能的改变；长期暴露在低浓度的二嗯英剂 量环境下，会出现视力模糊，肌肉、关节疼痛、恶心、呕吐等症状可使男性雌性 化，精子数量减少、生精能力降低，同时可改变女性月经周期和排卵周期，表现 为卵巢功能障碍、子宫重量降低；并能引起免疫抑制，还能作用于皮肤，导致严 重的“氯痤疮样”皮肤症状。此外还会造成生殖毒性与心血管系统、呼吸系统和 神经系统的毒性等。 1 1 3 3 二嗯英的毒性机理 二噫英类化合物被普遍认为是芳香烃受体( a r y lh y d r o c a r b o nr e c e p t o r ，a h r ) 的激活剂。它进入生物体内后，并不是通过与蛋白质或核酸形成结合物，从而对 机体造成直接的损伤，也不是直接损害机体，而是通过芳香烃受体诱导基因表达， 改变激酶的活性，从而引起蛋白质功能的改变等方法起到危害生物体的作用【1 5 】。 第一章绪论 2 ，3 ，7 ，8 四氯二嗯英 l ，2 ，3 ，7 ，8 五氯二嗯英 1 ，2 ，3 ，4 ，7 ，8 六氯二嗯英 1 ，2 ，3 ，7 ，8 ，9 - 六氯二嗯英 l ，2 ，3 ，4 ，6 ，7 ，8 一七氯二嗯英 八氯二噫英 2 ，3 ，7 ，8 四氯二苯呋喃 l ，2 ，3 ，7 ，8 五氯二苯呋喃 2 ，3 ，4 ，7 ，8 五氯二苯呋喃 1 ，2 ，3 ，7 ，8 ，9 六氯二苯呋喃 l ，2 ，3 ，4 ，6 ，7 ，8 七氯二苯呋喃 八氯二苯呋喃 2 ，3 ，7 ，8 - t c d d 1 , 2 ，3 ，7 ，8 一p s c d d 1 , 2 ，3 ，4 ，7 ，8 - h 6 c d d 1 , 2 ，3 ，7 ，8 ，9 h 6 c d d 1 , 2 ，3 ，4 ，6 ，7 ，8 一h 7 c d d 0 8 c d d 2 , 3 ，7 ，8 - t 4 c d f 1 ，2 , 3 ，7 ，8 - p s c d f 2 , 3 ，4 ，7 ，8 - p s c d f 1 , 2 ，3 ，7 ，8 ，9 - h 6 c d f 1 ，2 ，3 ，4 ，6 ，7 ，8 一h 7 c d f o s c d f 二嗯英类化合物质通过芳香烃受体介导机体基因表达的基本作用过程可分 为以下几个过程l l5 j ： 1 二嗯英类化合物进入细胞。二嗯英类化合物质通过被动扩散方式进入细 胞浆( 二噫英类化合物质均为脂溶性物质) ； 2 二嗯英类化合物与芳香烃受体结合。二噫英类化合物质进入胞浆后首先 与胞浆中的芳香烃受体结合，形成二聚物。该结合过程激活芳香烃受体。该过程 是一个多步骤的过程。其中h s p 9 0 对受体的激活起着重要作用，h s p 9 0 在配体 的结合过程中是必须存在的，并且可以抑制未与配体结合的受体与d n a 结合。 当配体与受体结合后，原与受体结合的h s p 9 0 就会脱落下来，暴露出受体的d n a 结合位点，从而导致受体激活。 3 配体受体复合物与d n a 识别位点结合。二嗯英类化合物与芳香烃受体 结合，从而使芳香受体激活后，随后配体受体复合物转移入细胞细胞核中。该 复合物与细胞核中的芳香烃受体核转位子蛋白( a hr e c e p t o rn u c l e a rt r a n s l o c a t o r p r o t e i n ，a r n t ) 结合形成三聚体，然后与d n a 结合。该蛋白质分子含有两个 功能部位：b a s i ch e l i x 1 0 0 p h e l i x ( b h l h ) 部位和p a s 功能部位，对于与d n a 的结合意义重大。 4 特异基因的转录及翻译。二噫英类化合物质激活的基因表达包括细胞色 素p 4 5 0 1 a i 和1 a 2 、谷胱甘肽s 转移酶、甲基醌氧化还原酶、醛脱羟酶等。其 中最主要的是细胞色素p 4 5 0 1 a i 和1 a 2 。 。 5 j j 叭 埘 5 j 叭 m o o 0 m 0 m 0 o c ； 第一章绪论 5 表达蛋白发挥作用。大量相关研究表明：二噫英类化合物质的毒性效应 与其对p 4 5 0 1 a i 的诱导以及与d r e 的结合之间具有很好的一致性。 二嗯英类化合物质毒性分子机理已经经过了二十余年的研究，目前为止仍然 只有一个大致的轮廓，有很多的细节问题没有完全研究清楚，尤其是基因表达后 表达产物发挥作用的途径，蛋白激酶激活后又是如何引起毒性效应的，以及芳香 烃受体存在于机体中的意义等问题最为广泛。这些问题也是当前二嗯英类化合物 毒理机制研究的重点及热点。 1 1 4 二嗯英类化合物常用检测方法 目前为止，根据对二噫英检测原理的不同，可将二嗯英的检测方法主要分为 化学分析法、免疫检测法和生物法【1 7 】三种。 1 1 4 1 化学分析法 目前对二嗯英检测的化学分析方法主要是气相色谱与质谱联用法( g c m s ) 。 由于二嗯英类化合物质在样本中含量非常低( 属于p p t 级别) ，而痕量分析容易 受到基质中其它成分的影响，所以在用色谱法进行检测时首先要对样本中待分析 物进行提取净化，然后用色谱柱分离，最后与检测器联用进行定性和定量分析【1 8 】。 该类方法又可以分为内标法、外标法和同位素稀释法三种。 1 1 4 2 免疫检测法 1 e i a 酶免疫法【1 9 】。该方法是利用老鼠克隆抗体d d 3 和二嗯英高度结合的 特性而建立的竞争抑制酶免疫法。适合于对二嗯英污染物毒性当量t e q 的测定。 2 d e l f i a 荧光免疫法【2 0 】。d e l f i a ( d i s s o c i a t i o n e n h a n c e m e n tl a n t h a n i d e f l u o r oi m m u n o a s s a y ) 法属于时间分辨荧光免疫分析法。该方法利用生物基因技 术选择出合适的抗原键合铕离子与样品中二嗯英竞争单克隆抗体，待免疫反应完 全后加入荧光增强液，使铕离子从抗原中解离下来，进入增强液，形成胶束，高 效地发出荧光。螯合物最终用时间分辨荧光法分析，其荧光强度与二嗯英的t e q 成反比。 1 1 4 3 生物学方法 1 酶活力诱导法【2 1 】。二嗯英进入生物机体内后将改变7 一乙氧基一异吩恶 唑酮一脱乙基( e r o d ) 酶的活性。在离体条件下，大白鼠肝癌细胞株的e r o d 酶 活力诱导与二嗯英的毒性也存在较好的计量关系，通过测定e r o d 酶的活性， 可以了解二嗯英激活a h r 受体的能力( 在一定浓度范围内具有线性的计量效应 第一章绪论 关系) ，进而获得测试样品中二嗯英的t e q 值。鉴于待检样品中有其他共存污染 物，目前的e r o d 法分析结果比化学法分析结果要偏高。目前一种快速灵敏的 离体m i c r o e r o d 生物法已用于环境样品中二噫英的检测。 2 荧光素酶报告基因法 2 2 】。二嗯英类物质产生毒性作用首先需要和细胞核 中的二嗯英反应增强子结合，从而诱导特异基因的表达。根据这个原理，把哺乳 动物细胞色素p 4 5 0 基因( c y p l a l ) 和萤火虫萤光酶这两个重要的基因作为报 告基因重组到h 4 i i e 大白鼠肝癌细胞系( 含a h r 传导途径的各个部件) 。脂溶性 二嗯英类污染物透过细胞膜与细胞内a h r 可逆性结合形成配体a h r 复合物，使 a h r 的构象发生改变，进入细胞核内。在细胞核内配体a h r 复合物和核内转运 蛋白a r n t 结合，形成配体a h r a r n t 复合物，特异性地与染色体上二嗯英应 答区域结合，并激活细胞色素p 4 5 0 基因和荧光合成酶基因合成荧光素。以此构 成c a l u x 系统萤光素酶诱导活性与二嗯英的毒性系数相对应，该测定系统合成 的荧光素量及荧光强度与测定系统中加入的二嗯英类物质的量成正比，最终测定 的结果也是t e q 。与e r o d 相比，该方法检测限可达2 4p m o l l ，线性范围更宽， 操作更简便，灵敏度为e r o d 的3 倍，并可通过基因工程改变质粒的方法进一 步提高灵敏度，适合大量样品的筛选和半定量测定。 3 a h 受体法 2 3 - 2 4 】。该方法也是从二嗯英的致毒机理出发。a h 受体是人和 动物体内的捆绑转录因子，调节这些化合物的不利影响。二嗯英类化合物在体内 和a h 受体结合，结合的紧密程度决定其毒性水平。因而用a h 受体法测定的是 二嗯英与a h 受体的结合程度。a h 受体是t e q 的生物学基础，所以用a h 受体 法更适用于健康评价。 生物学方法具有简便、快速、费用低、能更准确地反映二嗯英类化合物质对 机体的影响等优点。但是由于检测精度的限制，目前只能用于定性或半定量测定， 而且需要较长时间的细胞或细菌培养过程，不能做到实时检测。 由于检测技术和检测成本的制约，大大限制了对二噫英的检测。随着我国社 会经济的发展，人们物质生活水平的提高，对二嗯英的排放标准必将提高，并且 将会逐渐普及到大多数城市，因而对快速、灵敏的新型二嗯英检测技术的要求将 越来越迫切。 1 2 表面等离子体共振技术检n - 嗯英类化合物方法的提出 表面等离子体共振( s u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c e ，s p r ) 生物传感器技术是近 年来国际上迅速发展起来的新型生化分析仪。自l i e d b e r g 等于1 9 8 2 年首次应用 于生物化学传感器的研究领域【2 5 1 ，并成功地进行了气体检测和对抗原抗体相互作 第一章绪论 用的实时检测，并于1 9 8 3 年把s p r 生物传感器应用于i g g 蛋白质与其抗原的相 互反应的测定【2 6 】，b i a c o r e a b 公司以此开发出s p r 生物传感器，从此s p r 生物 传感器的研究进入了全面发展并不断深入，应用范围也日益扩大，研究领域多元 化，迅猛发展的时期。 目前s p r 技术已在国外被广泛的应用，每年都会有大量的相关论文发表， 且呈逐年递增的趋势。新的技术理论和方法的发展也推动了s p r 传感器向分子 问相互作用、蛋白质组学、细胞膜模拟药物筛选、临床诊断、等新兴领域扩展。 目前其主要研究领域包括药物筛选、食品工业检测、微生物检测、抗体和抗原作 用分析、有毒气体检测、d n a 分析、血液分析、环境检测等。在这些领域中， 表面等离子共振测量技术的应用有的方兴未艾，并在有的行业已经开始担当主要 的测试手段。 s p r 生物传感器技术具有以下其他检测技术所无法比拟的优点，并具有巨大 的发展空间： 1 实时监测反应动态过程，测定反应动力学常数。分子间相互作用是动态、 连续的过程，表面等离子体共振传感技术响应迅速，通过计算机实时采集处理信 号，可以方便快捷地实时监测生物反应动态过程，可以获得动力学常数 2 7 1 、离解 常数【2 8 】、甚至分子构型变化 2 9 1 等信息。 2 灵敏度高，抗背景干扰能力强。 3 分析生物样品无需标记。目前现有的生物分析方法中，大多需要对样品 进行标记，从而获得易于检测的信号变化，如荧光标记、放射性同位素标记以及 酶标记等，而标记的过程大多繁琐、费时、且容易引起检测的生物样品失活，从 而大大制约力生物分析方法的应用。表面等离子体共振传感器是将待测样品直接 吸附在膜的表面，然后进行检测，并不需要进行标记，从而可以客观的反映样品 的实际情况。 目前应用s p r 技术在环境领域有着广泛的应用，并可以检测多种污染物质 【3 0 】： 1 多环芳烃类，最早被发现和研究的致癌类化合物。测定方法的研究主要 集中在水中苯并芘的测定上【3 1 】； 2 多氯联苯类，在环境中分布广泛和难于降解具有潜在的致癌效应； 3 酚类，酚类化合物对人体也有较高的毒性； 4 烷烃，芳香族化合物； 5 农药及杀虫剂，目前主要集中在环境中阿特拉津和西玛津的测定上； 6 重金属离子，近年来，重金属的免疫检测技术取得了较大的进展，有望 成为方便可行的实用检测手段。其中利用制备抗不同重金属螯合物的单克隆抗体 第一章绪论 建立的s p r 免疫检测技术有着广泛的应用前景； 7 大气污染物的检测，该技术是在近年来才逐渐开展起来的，已有测定大 气中n 0 2 【3 2 】和n o ，h 2 s 的相关报道； 8 生物毒素，包括简单的小分子化合物到复杂结构的有机化合物以及蛋白 质大分子等，是目前研究中最热门的领域之一； 9 微生物以及病原体分析，目前已有研究表明s p r 技术在这一领域的应用 已取得进展，可检测军团菌，革兰氏阴性细菌，沙门氏菌和大肠杆菌等四类微生 物。 目前已有国外的几个研究小组用s p r 和q c m 传感器技术用于二嗯英类化合 物的检测，该研究小组运用商品化的s p r 和q c m 传感器运用2 ，3 ，7 ，8 t c d d 抗 体对二嗯英类化合物进行检测。综合以上研究小组的理论成果，利用我们实验室 搭建的s p r 生物传感系统，并进一步优化完善，运用免疫学的原理，提出了两 种测量方案，第一种为直接检测，即在s p r 传感器表面固定好2 ，3 ，7 ，8 t c d d 抗 体，利用t c d d 抗体与2 ，3 ，7 ，8 t c d d 分子特异性结合的特点，直接测定一定浓 度的二嗯英样品溶液。第二种为间接测量法，利用竞争物与2 ，3 ，7 ，8 t c d d 混合 样品液与t c d d 抗体竞争性结合的方法，间接性的测量出不同浓度的 2 ，3 ，7 ，8 t c d d 溶液的光强变化值，并绘制不同浓度的二嗯英溶液的光强强度改变 值趋势图，间接地计算出2 ，3 ，7 ，8 t c d d 的浓度。 1 3 酶联免疫吸附( e l i s a ) 法 酶联免疫吸附测定法( e n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ，e l i s a ) 方法是 将可溶性的抗原或抗体吸附固定到固相载体表面，通过免疫反应进行定性和定量 检测的一种检测方法。1 9 7 1 年瑞典学者e n g v a i l 和p e r i m a n n ，荷兰学者v a n w e e r m a n 和s c h u u r s 分别发表了其运用e l i s a 方法用于i g g 定量测定的文章， 使得该方法成为热门课题并开始进行了普遍研究【3 3 1 。目前e l i s a 方法已经成为 分析化学，生物等领域的前沿课题，并在市场上已有商品化的e l i s a 试剂盒应 用于各个应用方面。 1 3 1 免疫反应原理 抗原是能够刺激机体免疫系统从而启动机体的免疫应答，且能与其免疫应答 产物( 抗体或免疫效应细胞) 特异性结合发生一系列生物学效应的物质。当抗原 侵入到生物体内后，生物体内的免疫系统能够识别异物，激活体内的免疫系统， 产生能与抗原特异性结合的物质，即为抗体。抗体通常是由b 淋巴细胞或记忆 第一章绪论 细胞增殖分化成的浆细胞所产生的，可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋 白。通常所说的免疫反应实质上就是抗原抗体反应，也就是指抗原与相应抗体之 间所发生的特异性结合反应，这种反应即可在机体内进行，也可以发生在机体外。 抗原抗体反应具有特异性、比例性、可逆性三大特点，并且特异性是抗原抗体反 应的最主要特征。 1 3 2e l i s a 方法的原理 e l i s a 是一种集合了免疫学、生物化学及光学检测技术于一体的测定方法， 这一方法的基本原理是【3 4 , 3 5 】：首先是将抗原或抗体结合使其固定到固相载体的表 面，并设法保持免疫的活性，然后将抗原或抗体与某种酶连接起来成为酶标抗原 或抗体，这种连接获得的酶标抗原或抗体既保留了免疫活性，又保留了所连接酶 的活性。在测定时把受检标本( 待测其中的抗体或抗原) 和酶标抗原或抗体按不 同的步骤使其与固相载体表面的抗原或抗体反应。后用洗涤的方法将固相载体上 形成的复合物与其他物质分开，结合到固相载体上酶的数量与标本中受检物质的 量成一定的比例。最后加入酶反应底物，底物会被酶催化从而变为有色产物，产 物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应来定性或定量分析。 酶的催化效率很高，可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。 在这种测定方法中有3 种必要的试剂：固相抗原或抗体( 免疫吸附剂) ，酶 标记抗原或抗体( 标记物) ，酶作用底物( 显色剂) 。e l i s a 方法具有操作过 程简单易行、选择性好、灵敏度高、结果判断客观准