（林木遗传育种专业论文）双Bt基因克隆与植物表达载体的构建.pdf

摘要 近年来，随着植物抗虫基因工程的研究不断深入，转基因植物的生态安全性和 合理利用问题受到了广泛关注。人们在研究评价转基因植物生态安全性的同时，也 在探索其合理利用途径，期望通过科学应用避免和减少转基因植物对生态环境的可 能不利影响。然而，转基因植物生态安全性评价和合理利用，必须建立在对转基因 植物抗虫选性的充分了解的基础之上。目前，在杨树抗虫基因工程育种方面，国内 外已经开展了大量工作，人们已将多种不同抗虫基因成功转入杨树。其中苏云金芽 孢杆菌( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ，简称b t ) 抗虫基因的研究最多，应用最为广泛。根据 b t 编码的杀虫蛋白的杀虫特性，可分为6 大类。但是，目前在杨树抗虫基因工程中 应用最多的是抗鳞翅目害虫的b t c r y i 和抗鞘翅目害虫的b t c r y l l l 类基因。 迄今，转b t 基因对非目标昆虫、土壤微生物、哺乳动物及人类等影响的研究 方面，己取得阶段性成果。研究表明，转不同类型抗虫基因的杨树对昆虫具有一定 的选择抗性，对非靶标昆虫没有毒害作用。这一方面说明，转& 基因树木具有杀 虫谱窄，针对性强的特点；另一方面也说明，其安全性较高，不会对非靶标害虫及 其他生物造成危害。为了扩大杀虫谱，提高抗虫效果，将转不同类型b t 基因树木 混合栽种，或者将不同类型b t 基因构建在一个表达载体上，通过基因转化，获得 转多b t 基因树木，在生产上栽植应用，通过多种抗虫基因抗性互补，可大大提高 转基因树木的抗虫能力。 本试验分别构建了融合b t l 的植物表达载体p c a m b i a l 3 0 5 b t l 、融合b t 3 的 的植物表达载体p c a m b t a l 3 0 5 b t 3 ，以及同时融合b t l 和b t 3 两个抗虫基因的植 物表达载体p c a m b i a l 3 0 5 - b t l - b t 3 。 主要研究成果如下： 1 、通过p c r 技术，从p b i n 4 3 8 中克隆出抗虫基因b t l 测序结果显示，所克隆 b t l 基因全长1 8 3 6 b p ，与原基因序列( 改造后的基因) 1 0 0 同源。 2 、通过p c r 技术，从p b c c 3 中克隆出抗虫基因b t 3 。测序结果显示所克隆b t 3 基因全长1 7 9 4 b p ，与n c b i 所登陆的基因( 基因登录号：m 8 4 6 5 0 ) 1 0 0 同源。 3 、通过d n a 重组技术，将b t l 基因正向插入中间载体的c a m v 3 5 s 启动子和n o s 终止子之间，构建成p c a m b i a l 3 0 5 b t l 植物表达载体。 4 、通过d n a 重组技术，将b t 3 基因正向插入中间载体的c a m v 3 5 s 启动子和n o s 终止子之间，构建成p c a m b i a l 3 0 5 - b t 3 植物表达载体。 5 、采用p c r 技术，从p c a m b i a l 3 0 5 b t 3 克隆出3 5 s b t 3 - n o s 基因片段。克隆 后，将3 5 s b t 3 - n o s 正向插入p c a m m a l 3 0 5 b t l 中间载体的s m ai 和h i n d 两酶 切位点之间，构建成同时表达b t l 和b t 3 的p c a m b i a l 3 0 5 b t l b t 3 植物表达载体。 关键词：抗虫基因；b t c r yia ；b t c r y l i l 4 ；基因克隆；植物表达载体构建 c l o n g i n go f t w o b tg e n e sa n dc o n s t r u c t i o no f p l a n te x p r e s s i o nv e c t o ri nw h i c h f u s e dt h eb tg e n e s a u i h o r ： w a n gy - p m g m a j o r ： f o r e s tg e n e t i c sa n dn b r e e d i n g s u p e r v i s o r p r o y a n gm i n - s h e n g a b s t r a c t i nr e c e n ty e a r s ，p l a n ti n s e c t r e s i s t a n tg e n e t i ce n g i n e e r i n gh a sb e e nd e e p l ys t u d i e d a n da p p l i e d e c o l o g i c a ls a f e t ya n dr a t i o n a lu s eo f t r a n s g e n i cp l a n t sh a v ea l s ob e e nw i d e l y c o n c e r n e da r o u n d i nt h es t u d ya n de v a l u a t i o no fe c o l o g i c a ls e c u r i t yo ft h et r a n s g e n i c p l a n t s ，t h ee f f e c t i v ew a y sa n dr e a s o n a b l eu s om e t h o d sa r eb e i n ge x p l o r e db yw h i c ht o a v o i dt h ea d v e r s e l ye c o l o g i c a le n v i r o n m e n tc a u s e db yt h et r a n s g e n i cp l a n t s h o w e v e r , t h ee c o l o 百c a ls e c u r i t ye v a l u a t i o na n dr a t i o n a lu t i l i z a t i o no ft h et r a n s g e n i cp l a n t sm u s tb e f o u n d e do nt h ef u l l yu n d e r s t a n d i n go ft h er e s i s t a n ts e l e c t i v i t yo ft h et r a n s g e n i cp l a n t s c u r r e n t l y , al o to fw o r kh a sb e e nc a r r i e do u ti ng e n e t i c a l l ye n g i n c e r e di n s e c t - r e s i s t a n t p o p l a rb r e e d i n gw o r l d w i d e ，b yw h i c hm a n yd i f f e r e n ti u s e c t - r e s i s t a n tg e n e sh a v eb e e n t r a n s f e r r e di n t op o p l a rs u c c e s s f u l l y b a c i h u st h u r i n g i e n s i s ( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ，c a l l e d b t ) w a st h em o s td e e p l yr e s e a r c h e da n du f i l i z e dw i d e l ya si n s e c t - r e s i s t a n tg e n e su p d a t e a c c o r d i n gt ot h ei n s e c t i c i d a lc h a r a c t e r i s t i ce n c o d e db yb ti n s e c t i c i d a lp r o t e i n , t h eb t g e n e sc o u l db ed i v i d e di n t os i xm a j o rc a t e g o r i e s h o w e v e r , a n t ib t e r y il e p i d o p t e r a np e s t s a n dp e s tr e s i s t a n c ec o l c o p t e r ab t c r y l hg e n ew e r et h em o s tw i d e l yu s e di np o p l a r i n s e e t - r e s i s t a n tg e n e t i ce n g i n e e r i n ga tp r e s e n t s of a r , t r a n s f e r - b tg e n eh a sb e e na c h i e v e di m t i f lr e s u l t so i ln o n - t a r g e ti n s e c t s ， e d a p h o n , m a m m a l i a na n dh u m a ni m p a c to fs u c hr e s e a r c h r e s e a r c hs h o w e dt h a tt h e t r a n s g e n i ci n s e c t - r e s i s t a n tp o p l a r s 、i t i ld i f f e r e n tt y p eg e n e so fb th a dc e r t a i ns e l e c t e d r e s i s t a n c e so ni n s e c t s ，a n dh a dn o tt o x i co nn o n t a r g e ti n s e c t s i ts h o w e dt h a tt r a n s f e r - b t g e n ei np o p l a rh a df e wi n s e c t i c i d a ls p e c t r u ma n dw e l l - t a r g e t e df e a t u r e s o nt h eo t h e r h a n d ，i ta l s os h o w e dt h a ti th a dg o o ds a f e t y , a n dh a dn o th a r mt on o n - t a r g e ti n s e c t sa n d o t h e rb i o l o g i c a lh a z a r d s i no r d e rt oe x p a n di n s e c t i c i d a ls p 髓a n di m p r o v er e s i s t a n c e e f f e c t , t r a n s f e r r e dd i f f e r e n tt y p e so fb th y b r i dt r e e sw a r em i x p l a n t e do rt h ed i f f e r e n t t y p e so fb tg e n ew e r ec o n s t r u c t e di no n ee x p r e s s i o nv e c t o r , b yt h i sw a y , t r a n s g e n i c p o p l a rt r e e sw i t hm u l t i p l eb tg e n e sw e r eg e n e r a t e db yg e n et r a n s f o r m a t i o n t h e i n s e c t - r e s i s t a n tc a p a c i t yo f t r a n s g e n i ct r e e sc o u l db eg r e a t l ye n h a n c e db yc o m p l e m e n t a r y i n s e c t - r e s i s t a n tc h a r a e t e r i s t i co fav a r i e t yo fi n s o a - r e s i s t a n t g e n e si np r o d u c t i o n a p p l i c a t i o n s i nt h ee x p e r i m e n t , t h ep c a m b i a l 3 0 5 - b t lp l a n te x p r e s s i o nv e c t o rf u s e db t lg e n e ， t h e p c a m m a l 3 0 5 b t 3p | a n te x p r e s s i o n v e c t o rf u s e db t 3 g e n e , a n d t h e p c a m b i a l 3 0 5 - b t l - b op l a me x p r c a s i o n v e c t o rf u s e da l lb t la n db t 3g e n ew e l e s e p a r a t e r l yc o n s t r u c t e d t h em a i nr e s u l t sw c r os u m m a r i z e da sf o i l o w s ： 1 b t lg e n ew a sc l o n e df r o mp b i n 4 3 8b yp c r t h er e s u l to fs o q u c ea n a l y s i ss h o w e d t h a tl e n g t ho f t h eg e n ew a s1 8 3 6b p i tw a s1 0 0 i d e n t i t yt ot h eo n # r o ds e q u e n c eo f b t l ( r e c o n s t r u c t e ds e q u e n c e ) 2 b t 3g e n ew a sc l o n e df r o mp b c c 3b yp c r t h er e s u l to fs e q u 衄c ea n a l y s i ss h o w e d t h a tl e n g t ho ft h eg e n ew a s1 7 9 4b p i tw a ss a u l ea st h eb t 3g e n er e l e a s e di nn c b i g e n b a n k ( a c c e s s i o nn o m 8 4 6 5 0 1 3 i nt h ee x p e r i m e n t , 1 1 地b t lg e n ew a si n s e r t e di n t ot h ep o s i t i o nb e t w e e nc a m v 3 5 s p r o m o t e ra n dn o st e m n i n a t o ro fe x p r e s s i o nv e c t o rp c a m b i a l 3 0 5 ，b a s e do nd n a r e c o m b i n a n tt e c h n o l o g y n 坞b i n a r ye x p r e s s i o nv e c t o rp c a m b i a l 3 0 5 b t lh a sb e e n c o n s ( r u c t e d 4 i nt h i se x p e r i m e n t , t h eb t 3g e n ew a si n s e r t e di n t ot h ep o s i t i o nb e 咐嘲c a m v 3 5 s p r o m o t e ra n dn o st e r m i n a t o ro ft h ee x p r e s s i o nv e c t o rp c a m b i a l 3 0 5b yd n a r e c o m b i n a n tt e c h n o l o g y t h ep c a m b i a l 3 0 5 一b t 3 # a n te x p r e s s i o nv e c t o r sh a sb e e n c r e a t e d 5 3 5 s - b t 3 - n o sg e n es e g m e n tw a sc l o n e df r o mp c a m b i a l 3 0 5 - b t 3b yp c r 1 1 l e 3 5 s b t 3 - n o sg e n es e g m e n tw a si n s e r t e di n t ot h ep o s i t i o nb c q w e e ns m aia n d 肼，l d o fm e d i ae x p r e s s i o nv e c t o rp c a m b i a l 3 0 5 一b t l mp c a m b i a l 3 0 5 - b t l - b t 3p l a n t e x p r e a s i o nv e c t o r sf u s e dt w og e n e sb t la n db t 3 h a sb e e na c h i e v e d k e yw o r d s ：i n s e c t - r e s i s t a n tg e n e ；b t c r yi 一；b t c r y l l l a ；c l o n i n g ；c o n s t r u c t i o no fp l a n t e x p r e s s i o nv e c t o r s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逦j 丘盔些太堂或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在 论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：互茗彳签字日期：么唧年口i 月节日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塑j 丝壅些太堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅本人授权洹j 匕盔些太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：互厉孕 签字日期： 弘7 年。月铲i t 学位论文作者毕业后去向 工作单位： 通讯地址： 导师签名： 签字日期：司年。6 月，驴e t 电话： 邮编： 双b t 基因克隆与植物表达载体构建 1 1 苏云金芽孢杆菌( b t ) 1 引言 自b a r t o n 、f i s c h h o f r 和h i l d e r 等1 9 8 7 t ”1 年首次报道抗虫转基因植物以来，至1 9 9 5 年，抗虫 转基因马铃薯己进入商品化生产1 9 9 6 年，抗虫转基因棉花和玉米也进入商品化生产h 抗虫基 因进入实践应用的时代植物抗虫基因种类很多，目前广泛使用的主要有3 种，即豇豆胰蛋白酶 抑制剂基因( c p t i ) 、植物凝集索基因( 1 e e t i n g e n e ) 雨l 来源于苏云金芽抱杆菌的杀虫结晶蛋白基因( b t 基因) 。其中，b t 基因的应用最为普遍j 。苏云金芽孢杆菌( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ，b t ) 属革兰氏冈1 性细菌，是目前世界上应j 1 1 j 最广泛的微生物杀虫削。在其芽孢形成过程中产生许多蛋白，由于这 些蛋白具有特异的杀虫活性，所以又称杀虫晶体蛋白( 简称i c p s ) 。该蛋白是由特定基因编码的， 该基因称为杀虫蛋白基因 6 1 1 1 1 苏云金芽孢杆菌的研究历史 苏云金杆菌的发现有上百年的历史。最初由日本人石渡( i s h i wa m ) 在1 9 0 1 年从病蚕尸体中分 离出一株所谓猝倒细菌( s o t t o b a c t e r i a ) 。1 9 11 年e r n s tb e d i n e r 在德国苏云金( t h u r i n g i a ) 的一个面 粉厂的地中海粉斑螟( a n a g u s t ar u c h n i e l a ) 患病幼虫中，又分离到这种产伴孢晶体的芽孢杆菌 1 9 1 5 年定名为苏云金芽孢杆菌一般称苏云金杆菌( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s b e t l i n e r ) 。此时，发现苏 云金杆菌含有伴孢晶体( p a r a s p o r a l c r y s t a o ，但未曾说明苏云金杆菌的孢晶体有杀虫作用从1 9 2 0 年到1 9 5 0 年这一段时期内，有许多人曾用苏云金杆菌进行防治害虫的田间试验上世纪5 0 年代， 证实了苏云金杆菌具有杀虫活性1 9 5 6 年，a n g u s 将伴孢晶体与孢子分开之后，发现单独伴孢晶 体仍然存在杀虫活性，证明了苏云金芽孢杆菌中的伴孢晶体蛋白是杀虫活性的主要来源苏云金 芽孢杆菌大多致菌株都能产生多种类型的伴孢晶体蛋白( p a r a s p o r a le a 3 , s t a lp r o t e i n ) ，即6 内 a l l o p h a g a ) 等多种昆虫，以及线毒素或杀虫品体蛋白( h s e c t i c i d a lc r y s m lp r o t e i n ，i c p ) 对鳞翅目 ( l e p i d o p e r a ) 、双翅目( d i p t e r a ) 、鞘翅目( c o l e o p t e r ) 、膜翅目( h y m e n o p t e r a ) 、同翅目( h o m o p t e r a ) 、 直翅目( o r t h o p t e r a ) ，食毛目( m a l l o p h a g a ) 等多种昆虫，以及线虫、螨类和原生动物等具有特异性 的杀虫活性 1 1 2 杀虫晶体蛋白的结构与功能 杀虫晶体蛋白是一种碱性蛋白虽然目前已清楚该类晶体蛋白可作为杀虫剂应用，但对于每 一种杀虫晶体蛋白来说均有各自特定的杀虫谱。研究发现，所有杀虫晶体蛋白均由氨基酸组成， 根据分子量大小，可以杀虫晶体蛋白的大致分为3 个范围：1 2 9 - 1 3 8k d 、6 5 - 7 8k d 和2 5 - 2 8k d 目前，研究最详细的是c r y l 晶体蛋白，该类型晶体蛋白由1 1 0 0 1 2 0 0 个氨基酸组成，分子量为 1 3 0 - 1 4 0 k d 。不同蛋白晶体之间的c 端具有高度的保守性，同源性大于9 0 但n 端的差异性很 大，同源性只有4 0 - 9 0 该类晶体蛋白的c 端具有亲水性，具有9 哳叠的二级结构，主要用 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 于伴胞晶体的形成；n 端含有疏水区具有a - 螺旋结构，是发挥特异毒力的功能区域1 7 j 。对c ，) ，3 a a 、 c r y l 4 a 和c 4 纠三种晶体的x - 射线衍射晶体图分析表明，上述三种晶体均有3 个结构域：结构域 l 由1 - 2 9 0 个氨基酸构成含有3 个反向平行的a 螺旋：结构域由2 9 1 5 0 0 个氨基酸组成，含 有3 个反向平行具有棱柱b 哳叠结构的b 新叠；结构域由5 0 1 - 6 4 4 个氨基酸构成。含有2 个 反向平行的a 晰叠。c 端包裹其中m c y t 2 a 与c ，) ，3 a a 、c r y l a a 在c 端的氨基酸同源性小于2 0 ， 结构差异性大，它只有一个结构域含有两个外缘的a 螺旋( 包裹着内层一个混合组成的b 折叠) 。 研究发现，结构域参与毒索与受体的结合，消除c o , l a b 结构域的3 7 0 - 3 7 5 之间的氨基酸及定 点诱变3 7 1 3 7 5 之间的氨基酸残基，发现其能显著降低烟草天蛾( m a n d u c as e x t a ) 的活性原因就是 突变的蛋白不能识别相应的受体蛋白i l ”“ 1 1 3b t 毒蛋白的杀虫机理 杀虫晶体蛋白杀死昆虫的过程和机理为：( 1 ) 晶体在昆虫中肠内的溶解；( 2 ) 中肠蛋白酶的降 解；( 3 ) 中肠膜受体与毒蛋白的结合；( 4 ) 毒蛋白插入中肠细胞表层形成离子通道，使敏感细胞的 渗透平衡破坏，导致虫体自溶。对于鳞翅日敏感的比虫食入的晶体蛋白在其中肠碱性环境中溶 解，溶解程度因晶体蛋白的不同而异i l “州 b t 杀虫活性源于芽胞形成时产生的杀虫结晶蛋白( 喇c i d a ic r y s t a lp r o t e i n ，i c e ) 或苏云金杆 菌毒蛋白( b tt o x i cp r o t e i n ) 。b t 毒蛋白有伴孢品体内是以原毒素( p r o t o x i n ) 的形式存在。当被昆虫 摄食之后在昆虫幼虫的肠道内经p 酶水解转变为6 5 - 7 0 k d 带有n - 末端的具有杀虫活性的毒 性多肽分子，与敏感昆虫肠道上皮细胞表面的特异受体相互作用，诱导细胞膜产生一些特异性小 孔，扰乱细胞的的渗透平衡，引起细胞膨胀甚至裂解导致昆虫停止进食而最终死亡l 。7 1 现在己 证明，b t 毒蛋白受体为氨肽酶n 和钙粘着蛋白( 血e 血) 类似物u ” 氨肽酶n ( a p n ) 的结构和位点密度的改变是昆虫对m 毒素产生抗性的主要机制i j ”内毒素与 靶细胞膜上受体的结合是b f 毒素作用的关键环节，毒素与受体结合的改变是产生抗性的主要原 因结合的改变表现在3 个方面：( 1 ) 毒素与细胞膜上受体的结合由于竞争性抑制作用( c o m p e t i t i v e i n h i b i t i o n ) 而受阻；( 2 ) 受体一级结构的改变导致受体结合位点的减少；( 3 ) 受体二级结构的修饰 ( s e c o n d a r ym o d i f i c a t i o n ) 导致受体结合位点的减少，即受体结合蛋白的某些残基改变影响毒素与受 体问的结合。如烟草毒蛾的受体结合蛋白a p n 为一种糖原蛋白，它含有多个特异性的糖基结合 点，这些结合点的饰变直接影响毒素在受体上的结合作用。因此，这些特异性位点的变化，也可 能是抗性产生的机理之一1 2 0 i 1 1 4b t 毒蛋白基因的分类 b t 大约有6 9 个血清型、8 2 个血清型亚种、8 种非鞭毛生物型和2 3 5 个基因型，表达c r y ，c y t ， 坳- 三大类型蛋白的大家族。不同基因型杀虫谱不同根据杀虫谱的不同，将杀虫基因分成六大 类，统称为c r y 基因，用罗马数字i 、等来命名，分别代表几种杀虫范围。在每一类型 下，根据氨基酸序列的同源性，又分为a b ，c 等不同的基因型。在同一基因型下根据限制性 内切酶的酶谱和分子量的大小，又分为a ，b ，c 等不同的基因亚型1 2 l 】 2 双b t 基因克隆与植物表达载体构建 随着b t 基因研究的不断深入，已有数千个b t 菌株被分离纯化。自s c b n c p f 等在1 9 8 1 年将苏 云金杆菌库尔斯达克变种h d i 菌株的毒蛋白基因分离、克隆并在1 9 8 5 年完成其核苷酸序列分 析以来，已有6 0 多个杀虫晶体蛋白基因被分离、克隆。由于最初对其了解的限制在分类上比 较混乱1 9 8 8 年k n o w l e s 和e l l a r 提出根据杀虫谱进行分类的分类系统，把杀虫蛋白基因分为5 类：i 类为特异地抗鳞翅目昆虫；类为特异地抗双翅目和鳞翅目昆虫；类为特异地抗鞘翅目 昆虫；类为特异地抗双翅目昆虫；v 类为无毒性的结晶蛋白。但由于没有考虑杀虫晶体蛋白基 因之间的相似性，使有些基因具有不同的名称。 随着新的基因不断被克隆和发现，发现有些序列相似，但其杀虫活性却不同的基因，而有些 基因具有相同的杀虫活性，同源性却又相差很大，所以以序列同源性和生物活性划分类别的分类 系统很难统一c r i c k m o r e 等在1 9 9 5 年国际无脊椎动物病理学会年会( s l p ) 上提出了以杀虫品体蛋 白氨基酸序列的同源性为唯一依据、区别m 基因的新分类系统，现己被各国广泛采纳：该分类 系统中，同源性在4 5 以下，为第一等级，用阿拉伯数字表示：同源性在4 5 7 s 之间为第二 等级，用大写英文字母表示：同源性在7 8 9 5 之问为第三等级，用小写英文字母表示；同源 性在9 5 以上。为第四等级。用阿拉伯数字表示只要来自b t 的伴孢包涵体( 晶体) 、与已知的 c r y 或q 瞳具有高同源性，即可纳入该系统i 丑j 此外，该系统对新基因的命名也提出了要求：( 1 ) 具有杀虫活性的杀虫晶体蛋白可以来自苏云金芽孢杆菌，也可是与已知的蛋白有明显相似序列的 任何蛋白质： ( 2 ) 表达的毒素蛋白必须在伴孢晶体内 ( 3 ) 基因的核苷酸序列或蛋白质序列必须 在主要的国际数据库中登记。截止2 0 0 6 年9 月2 6 日，杀虫蛋白基因按其核苷酸序列的同源性己 被分o y i v 、c y t l 、c y t 2 等共5 3 类，3 7 3 种，c r y 基因3 4 9 种，c 叫基因2 4 ，其中7 0 多种由中国科 研人员发现( h t t p w w w b i o l s 鳓“a k h o m e , q q e i l c k 口“”。_ c r i o r e 旭t ) 1 1 5b t 杀虫晶体蛋白对昆虫的杀虫活性 对鳞翅目幼虫有杀虫活性的晶体包括c r y l a 到c r y l k 的大部分蛋白，以及c r y 2 a ，c r y 3 a ，c r y 3 b ， c r y 4 a ，c r y 4 b ，c ，州，c r y 9 c 和c r y l s a ，但其中个别蛋白不具有对鳞翅目一些昆虫的活性或者活 性较低如c r y l a a 对海灰翅夜f 兜( $ p o d o p t e r al i t t o r a l i s ) 、草地贪夜蛾( s p o d o p t a r a f u g i p e r d a ) $ l 黑迁 移地老虎( a c t e b i a f e n n i c a ) 没有活性。对甜菜夜蛾( s p o d o p t e r ae x i g u a ) 、粉纹夜蛾( t r i c h o p l u s i a 棚毒 性较低；c r y l a b 对黑迁移地老虎和海灰翅夜蛾没有活性，对甜菜夜蛾、美国棉铃虫( h e l i c o v e r p a z e a ) 、棉铃虫和家蚕( b o m b y xm o r t 9 低毒；c r y l a c 对海灰翅夜蛾、草地贪夜蛾、家蚕和黑迁移地老 虎无毒，对美国棉铃虫和白斑毒蛾( d 吗妇l e u c o s t i g m a ) 低毒；c r y i b a 对甜菜夜蛾、海灰翅夜蛾、 烟芽夜蛾( h e l i o t h i sv i r e s c e n s ) 、烟草天蛾、粉蚊夜蛾、甘蓝夜蛾、舞毒蛾、家蚕、黑迁移地老虎和 白斑毒蛾无毒，对玉米螟低毒；c r y l c 对草地贪夜蛾和棉铃虫没有活性，对烟芽夜蛾和舞毒蛾低 毒c r y 2 a a 对小菜蛾、烟芽夜蛾无活性，对甜菜夜蛾低毒；c r y 3 a l 对甜菜夜蛾和粉蚊夜蛾无毒； c r y 9 a 对棉铃虫无毒，脚鲥对玉米螟没有活性。 对鞘翅目昆虫有话性的杀虫晶体蛋白包括c r y l b a 、c r y l l a 、c r y l l b 、c r y 3 a 、c r y 3 b 、c r y 3 c 、 c r y 3 d 、c r y 7 a 、c r y s a 、c r y s s 、c r y l 4 a a 和c r y l 8 a a 其中c r y 3 a 、c r y 3 b 、c , y 3 c 和c r y 7 a a 对马铃 薯甲虫( l e p t i n o t a r s ad e c e r n l i n e a t a ) 有毒，c r y 7 a a 对黄守十一星叶甲( d i a b r o t i c au n d e r d m p u n c t a t a ) 有杀虫活性。c r y 3 c 对马铃薯甲虫的毒力分别是c r y 3 b 和c r y 7 a a 的5 倍和1 8 倍 3 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 对双翅且昆虫有活性的杀虫晶体蛋白包括e r y l b a 、c r y 2 a a 、c 0 4 a 、e r y 4 b 、c r y l 0 a a 、c r y l l a a 、 o 3 , 11 b a 、e r y l 6 d a 、c r y l 7 a a 、e r y l 9 a a 、c r y 2 0 a a 、c y t l a a 、c y t l a b 、c y t l b a 、c y t 2 a a 、c y t 2 b a 和c y t 2 b b 其中c r y 2 a a 和c r y 4 4 对伊蚊( 4 耐口4 阁旧及冈比亚按蚊( a n o p h e s g a m b i a e ) 有毒性；c r y 4 b 对伊蚊， 斯氏按蚊( a n o p h e ss t e p h e n s o 及尖音库蚊( c u l e x 舶啦，u ) 有毒性；c r y i o a 对伊蚊有毒性；c r y l i a 对 伊蚊和五带淡色库蚊( 讹g 咖咖缸船) 有毒性c r y l1 b 对五带淡色库蚊有毒性 1 2 杨树b t 抗虫基因工程的研究现状 国外b t 抗虫基因工程的研究始于2 0 世纪8 0 年代。1 9 8 7 年，比利时植物遗传系统公司首次 报道苏云金芽孢杆菌毒蛋白转基因植株此后，b t 杀虫基因引起了世界各国的广泛关注1 9 8 8 1 9 8 9 年美国依阿华大学首次成功地将b t 基因构建至根癌农杆菌( a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e m ) 的t i 质粒中，并以该质粒为载体导入到杨树杂种，获得了抗虫转基因植株田j 这是最早的关于 转m 基因杨树抗虫基因工程的报道1 9 9 1 年，m c c o w n 等利用放电式基因枪法将b t 基因导入银 白杨x 大齿杨( p a l b a x p g r a n d i d e n t a t a ) 获得了抗虫转基因植株b t i i ( c r yia ( a ) ) ，该转基因系 对大幕毛虫致死率达6 0 * 冽：l e p l e 等( 1 9 9 2 ) 将b t o y m ( a ) 导入欧洲山杨银白杨 ( p t r e m u l a x p a l b a ) 在转化植株中表达了抗虫基因 2 9 1 k i e i n 舀等( 1 9 9 4 ) 将b t 毒蛋白基因导入 了杂种杨n c 5 3 3 9 ( p a l b a p g r a n d m e n t a t a ) ，获得了抗枯叶蛾和舞毒蛾( l y m a n t r i ad i s p a r ) 的转基因 植株【捌h o w e ( 1 9 9 4 ) 用农杆菌介导法将b t 毒蛋白基因导入银白杨大齿杨杂种，获得了含有 m 毒蛋白基因的抗性愈伤组织1 3 1 1 f r a n c i s ( 1 9 9 6 ) 成功地将c r yi ( 功导入杂种杨 n m 6 ( p n i g r a x p m a x m o w c z f f ) ，获得了转基因植株s t r a u u ( 1 9 9 9 ) 将携带c a m v 3 5 s 启动子的 c r y l i 似) 基因表达载体导入了美洲黑杨p d e l t o i d s ，获得了高效毒杀美洲黑杨叶甲虫( c h r y s om e l a s c r i p t a ) 的转基因植株 我国杨树b i 抗虫基因工程的研究始于1 9 8 9 年，是世界上杨树m 抗虫基因工程研究开始较 早的国家，近年来，先后在欧洲黑杨衅n i g r a ) 、美洲黑杨、欧美杨僻e u r a m e r c a n a ) 、毛白杨 ( p t o n u m t o s a ) 及一些有价值的杂种杨上获得了b t 抗虫转基因植株。其中，伍宁丰等首次报道了用 m 基因转化欧洲黑杨哪1 对转基因植株研究发现，完整的b t 基因中存在着许多对其高效表达不 利的因素，因此在转基因植物中b t 基因的表达水平很低抗虫效果也不理想田j 对此，中科院 微生物所对b t 基因的5 端和3 端进行了改造，消除其上不稳定的元件，构建了带有双转录增强 子的3 5 s - o - b t - n o s 嵌合基因载体，并在1 9 9 3 到1 9 9 7 年间与中国林科院合作以农杆菌介导法先 后将其成功地导入欧洲黑杨、欧美杨和美洲黑杨，获得了高效毒杀舞毒蛾和杨尺蠖( a p o c h e i m a c i n e r a r i u s ) 雕j 转基因植株i ”捌，其中转化的欧洲黑杨于1 9 9 4 年被列入国家重点科技成果推广项目 获得了国家商品化许可。郑均宝等0 9 9 5 ) 用含有完全改造的b t 基因表达载体p b 4 8 7 成功地转化 了7 4 l 杨【p a l b a ( p d a v i d i a n a x p s i m o n i ox p t o m e n t o s a 9 ”之后又将p b 4 8 7 和部分改造的b t 基 因表达载体p b 4 8 6 成功地导入了毛白杨雄株”。南京林业大学与中国农业科学院生物技术所合 作，将大小为1 8k b 经人工改造的b t 基因导入了杨树n l - s 1 0 6 ( p d e l t o i d s x p s i m o n i o l 3 9 1 ，在室 内控制和自然条件下对转基因植株的大田移植苗进行杀虫性测定结果表明，转基因杨对杨小舟峨 ( m i c r o n z e l a l o p h a 蛔g f 0 枷) 幼虫具有显著的抗性【柏j 。饶红字等用根癌农杆菌介导法将b i 毒蛋白 4 双b t 基因克隆与植物表达载体构建 基因转入杨树n l - 8 0 1 0 6 ( p o p u l u s de l t o i d e s x p l s i m o n i o ，获得再生植株，p c r 和 p c r - s o u t h e r n b i o t l i n g 证实b t 基因已整合到杨树基因组，部分转基因植株对l 龄舞毒蛾幼虫有明 显抗虫性l 。此外，胡建军等还报道了在大田自然感虫条件下转b t 基因欧洲黑杨对杨尺蠖等害 虫的抗虫效果及其对非转基因植株产生的交叉保护作用，发现转基因植株能有效地控制林分的虫 口密度。使非转基因植株在某种程度上得到了转基因植株的保护。詹亚光应用农杆菌介导法，首 次将抗虫基因【蜘蛛杀虫肽与苏云金杆菌杀虫毒蛋白基因( b t 基因) c 肽序列的嵌合基因】导入白 桦基因组中，喂虫试验初步表明具有一定的抗虫性 4 2 1 。姜静等用农杆菌介导的叶盘法，将b t 基 因c 肽序列和蜘蛛杀虫肽组成的融合基因导入小黑杨，也发现转基因株系具有明显的抗虫效果 【3 】 为解决昆虫易对单个抗虫基因产生耐受性问题研究者开始将多个不同类型的基因同时导入 同一杨树中，增强转基因树的杀虫能力c o r l l u 等发现，表达p i s 和b t c r y 3 a 的双价基因杨树能 阻止幼虫生长，抑制害虫发育，提高幼虫的死亡率 螂郑均宝等和高宝嘉等用部分改造的b t c r y l 4 c 基因和慈菇蛋白酶抑制荆( a p i ) 基因构建的双抗虫基因表达载体，通过农杆菌介导法转化7 4 1 毛白 杨，s o u t h e r n 杂交证明2 种基因均己单拷贝整合入转基因植株，其对美国白蛾( h y p h a n t r i a c u n e a ) 和舞毒蛾的抗虫效果主要表现为对低龄幼虫的毒杀作用和对高龄幼虫生氏发育的抑制作用m 撕1 李明亮等用农杆菌介导转化法将蛋白酶抑制剂基因了p i 导入含b i 基因的转基因欧洲黑杨杀虫 试验结果表明含有双抗基因的植株抗虫能力明显高于仅含b t 基因的植株i 1 。饶红宇采用双基因 共转法将经改造的b t c r yb l a 基因和c p t i 基因转入杨树n l - 8 0 1 0 6 获得的转双价基因杨树对l 龄 舞毒蛾幼虫有明显的杀虫活性嗍张冰玉等采用农杆菌介导法获得8 种银