（环境工程专业论文）荷电粒子在垂直电泳中的迁移规律研究.pdf

摘要多年来，电泳技术在分离和鉴定荷电粒子中已经得到了广泛的应用。但其应用范围主要在于微量荷电粒子的分析与鉴定，而对于连续制备过程应用较少，因为在此条件时，电场中离子的迁移规律直接影响分离、鉴定的结果，因此，研究电泳过程中荷电粒子的迁移规律对优化电泳条件具有重要意义。本文首先利用容积为3 0 l 的大垂直电泳装置对苦咸水中氯离子的迁移规律进行了研究。考查了电压、进水流速和填料对氯离子浓度的影响，得出了氯离子浓度与电导率的拟合曲线。根据电导浓度曲线，测得了电泳室内不同位置的氯离子浓度，研究氯离子浓度在垂直电泳中的迁移规律。接着设计新的微型( 容积为6 0 1 1 1 l ) 电泳装置，与原来的装置相比，在结构上增加了两冷却室以减小电泳时焦耳热的影响。以硫酸钠和氨基酸混合物为研究对象，考查了硫酸根离予和甘氨酸、赖氨酸混合物的迁移规律。大电泳装置的实验结果表明：保持进水流速不变，电压越大，氯离子的迁移程度越大；对于金刚砂填料，随着进水流速增大，氯离子的迁移程度先增大后减小，存在一个较佳的进水流速，在该流速条件下，氯离子迁移的程度最大，相应的脱盐效果也较好；填料的粒径越小，其作为承载填料对进分离液的分散效果越好，从而在垂直电泳过程中荷电粒子的迁移程度越明显；在一定p h 值条件下，电导与氯离子的浓度成良好的线性关系，氯离子在电泳箱内横向和纵向分布规律与理论上基本相符，但石英砂填料下氯离子浓度与理论的偏离比金刚砂填料下的偏离大。微型电泳装置的实验结果表明：支持介贾滤纸在反应初期对实验结果的影响较大，当稳定运行时，可不考虑它的影响；随着电压的增大，硫酸根离子在电泳中的迁移程度较大，出样比较集中，硫酸根离子与钠离子的迁移速率之比与理论分析存在一定的差异；两性电解质氨基酸在电泳过程中的迁移规律较无机离子复杂，在本实验过程中没有发现明显的规律性；电场中赖氨酸在比甘氨酸容易带电，电泳时的迁移程度大；电压对氨基酸的迁移有很大影响；新设计的垂直电泳装置适合用于无机离子的分离，如用于分离两性电解质氨基酸还需进一步研究电泳条件或改进装置。关键词：垂直电泳；荷电粒子；迁移规律堕皇些兰垄垩皇皇堡! 塑垄堑塑堡竺壅a b s t r a c ti nm el a s tf e wy e a r s ，e l e c 们p h o r e s i st e c 王u l o l o g yh a sb e e nu s e d 州d e l yi 1 1t h es 印a m 廿o na n dd e t e m l i l 】a t i o no fc h a r g e dj o n s ，h o w e v e li ti sa p p l i e dm a i n l yi 1 1t l er n j c r o a n a l y s i s 锄dm e r ea r ef 音wr e p o r 【si i l _ 【1 1 ec o n t 曲u o u s0 p e r a t i o n s 曲c et h e 面g r a t i o no fc h a 唱e di o l l sh a st l ed i r e c t硼u e n c e0 nt l l ee 衢c i e n c yo fs 印锄_ c i o n 锄dd e t e 蛐a t i o n ，t h e b r e ，t l 】er e s e a i ho nt 1 1 ej 1 1 i 目a _ 【i o no fc h a r g e di o n si i lt 1 1 ee l e c 怕p h o r e s i sc a nh e l pt oo p 嘶z em ee l e 咖h o r e s i sc o n d i 石o n st oo b t a i l lg o o dr e s u l t s f i r s t l y ，妇r n i 掣蕊o no fc 1 l 协s e a w a t e ri ss 砌i e du s _ m gm e1 a r g ee l e c 唧h o r e s i se 州p m e n t 、v i t l lav 0 1 u t n eo f3 0 lt h e 姐u e n c eo fv o i t a g e ，n o wm l c ，p a d d 啦p r o p 枷e so nc o n c e m 甜o no fc 1 i sr c s e a n 出e d t h e 矗t t e dc u eo fr e l a t i o l l s m pb e n e e nc 彻d u c t i 啊锣a i l dc rc o n c e n 订a d o ni so b t a i l l e d a c c o r d i l l gt o 吐1 ec u n ，e ，t h ec o n c a m a t i o no fc l a td i 觚1 0 c a t i o no f e l e c 的p h o r e s i sc h a m b c ri sm e a s u r e d t h er n j g r a t i o no f c l t 1 1 ep r o c e s so f e l c c 打0 p h o r e s j si s咖d i e d s e c o n m y ，an e w 删a t u r e ( m ev 0 1 咖ei s6 嘶l ) d e c 咖s i se q “p m c n t ( s )h a sb e c nd e s i 印e d 1 h e 出s 喇出血gc o i l 丘g u r a t i o n 盘咖r eo fs 醯c o n l p a r e d 谢mt 1 1 ef o n n e ri s 也ea d 出d o no f 铆oc 0 0 h gc h 跚b e r st or e d u c e 幽e 甜色c to f f b m 血g h e a lo ne l e c 叻p h o f e s i s f 删y ，s e l e c 血g n a 2 s 0 4a n d m j x t u r eo f 锄i 1 1 0 捌da s 龇r e s e a r c ho b j 吼也e i n i g m d o no fc h a r g e d i o n s i i l n a 2 s 0 4 锄d i n j x t l r o f l y 如e a n d 9 1 y c i i l i s i n v e s 廿g a t e d 。t h e 删1 】s i o n s 砒忉砸e db y 也el a 唱ee l e c 仕o p _ h o r e s i se 甲衄m 髓ta r ea sf b l l o w s ：t h eb i g g e rm ev o l 纽g c ，也ee a s i c r 也cm i g r a d o no fc 1 。w l l i l ek e e p 迦也e 丘x e dn o wi a 城t h ei i l i 鲥0 ne 赚i m to f c r i ss t i e n g m e da t 血_ s ta n d 也e nw e a l ( e n e d 谢出1 h ei n c 坞a s eo f n a wm t e 出e nt h ec 砒啪m d 衄i s l l s 咄也eo p t h n a l 丑0 wr a t e i s f o u n da t w h i c h 也e 删凼啪i n i g 洲蚰q u 删t yo fc l _ i so b 莨血e d ，a n d1 1 1 ed e s a l 岛ge 伍c i e n c yi sw d l ；t l l ec o 1 p a r i s o no f t w 0k i n d so f p a d d i l 唱蛔恤t 也e 渤a l l e r 也ed i a m 惭o f p a 龇，也e 龇e c t o fd i 辨硒幽，也目e 也eb 逗留e rt l l ei n i g r a d o ne x t e n to fc b a r g e di o ni i lv e r d c a le k 碰r o p h o r e s i s ；a ：tc e r t a hp h t h er e l a t i o n s l l i po fc o n d u 耐v i l y 鲫dc rc o n c e 吼d o ni sl 泌鸥t 1 1 ed i 蚵b 砸0 no fc ri l l 仃a 1 1 s v e 】a l l dl o n 百蛐a ld i r e c d o no fe l 咖正b o r e s i sc b 枷b e ri si l e a d ym es 锄ew i t ht h e 也e 0 代d c a lv a l u c s ，b u t 也ed 印a r t u r e 盘d mt 1 1 e o r e 吐c a lv a l u e su s i n g 小l a r 眨s 趾di sb i g g e rt 1 1 a nu s i l l gc a 】 b o n 羽眦n ec o n c l u s i o n so b t a i n e db ys 髓a r ea sf o n o w s ：t h es 印p o m n gm c d i u n l f i l l e rp a p e rh a so b v i o u si n n 唧c eo n1 1 1 ee ) 中盯i n 磺1 tr e s u l 协砒t h eb e 酒m i n go fr e a c 廿o l l ，b u tw h 髓m ee q u i p m e n tr u ns 把a d i l y ，t b ei n n u e n c ec a nb en e 舀e c t e d ；t l em i 擎a 6 0 n c 衄l to fs o 一i ss 咖g i h e n e da n dt h ed i s 仃i b 嘶o no fs 吖1 sc o n c 印昀t c d 谢m 血e 访c r e a s eo fv 0 1 切瞎e ；t h em d oo f 商g r a 垃o nr 如o f s o 。t o n 矿i sd i 蹴矗o m 胁to f 吐l e m e o 巧锄a l y 8 i s ；雠血g 两0 n一大连理工大学硕士学位论文r e g u l a 丌t ) ，o fa l n p h 0 1 y t e 籼n oa c l d1 sm o r ec o m p 】e t h a n 仙a to fi n o r g a l l i ci o na n dm eo b v i o u sr e g u l 撕t yi sn o tf o u n di 1 1l h ee x p e r i m e n t ；i nc 】e c 研c a ln e l d ，t 1 el y s 访ei sc h a r g e de a s i e rt 1 1 a ng l y c j n ，s ot h ei t l i g r l t i o nq u a 】1 i t ) o f1 y s i l l ei s1 a r g e r 廿 柚g l y c i n ；t h ev o l t a g eh a so b v i o u s l yi i m u e n c eo nt h et n i 掣a t i o no fa l n i i 】oa c i d ，t h en e we q u i p m e n tc a i lb ea p p i i e dt os 印a r a t ei n o 唱a 1 1 i ci o n sa r 】ds o m e 商p r o v e m e n t sf o re q u i p m e n ta i l d 如r t h e rr e s e a r c ho nc o n d i t i o n so fe l e c t n o p h o r e s i ss 1 1 0 u l db eu i l d e n a l ( e nt os e p a r a t e 锄p h 0 1 y t ea 1 i 1 1 0a c i d -k e yw o r d s ：v 酬c a ld e c h 0 p h o r 锚i s ：c h a r g e di o ；m i g 瑚t i o nm 独创性说明作者郑重声明：本硕士学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得大连理工大学或者其他单位的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。作者签名：缝整日期：越：6 ：2 尘大连理工人学硕士学位论文1 电泳技术概述带电颗粒在一定的电场中向着与其电性相反的电极方向移动的现象，称为电泳。( e l e c 订o p h o r e s i s ，简称e p ) 。早在1 8 0 8 年俄国的物理学家p e n c e 进行了第一次电泳实验，发现了电泳现象【l 】，这个早期实验为电泳的理论和实践的发展及其应用奠定了基础。1 9 3 7 年，瑞典科学家t i s e l i l l s 设计了世界上第一台自由电泳仪，建立了移动界面电泳法( m o v m gb o u n d a r ye l e c 廿o p h o r e s i s ) ，用于蛋白质的研究，并成功地将血清蛋白质分成5个主要成分，从而将电泳发展成为分离技术，开创了电泳技术的新纪元【2 】。此后，各种电泳技术及仪器相继问世，先进的电泳仪和电泳技术的不断发展，使电泳技术在化学实验技术中的地位越来越重要。现在，电泳技术己在无机化学、有机化学、生物化学、分子生物学、放射化学和免疫化学等学科中成为各种带电物质分离鉴定的重要手段，是科研、教学、工业、医药等领域常用的快速而准确的分离分析方法。1 1 电泳的原理及分类1 1 1 电泳的分离原理口刈电泳的方式和方法虽然有很多种，但其基本原理是相同的。不同的物质，由于其带电性质、颗粒形状和大小不同，在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，因此可使它们分离。颗粒在电场中的移动方向取决于颗粒所带电荷的种类。带正电荷的颗粒向电场的负极移动；带负电荷的颗粒向电场的正极移动：净电荷为零的颗粒在电场中不移动。( 1 ) 电荷的来源固体和液体接触时，二者之间即有电位产生。固体表面带一种电荷，周围的液体带符号相反的电荷，这种叫做偶电层。胶体颗粒表面的电荷来源是：吸附液体中的某离子而带电，液体失去了该离子而带相反的电荷。通常阴离子易被吸附而使固体表面带负电。阳离子因水化程度较高，不易被吸附。作为胶体组成成分的带有不同电荷性质的离子不等量地进入溶液，例如碘化银胶体在有过量碘离子的情况下则带负电，在有过量银离子的情况下则带正电。固体表面吸附液体分子，然后这些分子解离。氨基酸或其他多电解质则由其本身所具有的功能团的解离而带电。氨基酸具有正负两类解离基，称为两性电解质嘲，氨基酸在酸性介质中带正电，在碱性介质中则带负电。在某一p h 值时，其正负电荷相等，此时的p h 即称为该氨基酸的等电点。荷电粒子在垂直电泳中的迁移规律研究( 2 ) 电泳迁移率定义任何物质由于其本身的解离作用或表面上的吸附其他带电的质点，在电场中便会向定的电极移动。带电的颗粒可以是小的离子，电可以是大分子，如蛋白质、核酸、病毒颗粒、细胞器等。这些带电荷的离子性化合物在施加电压的系统中向相应的阴极或阳极运动，迁移速度的快慢取决于带电的多少和分子的大小。不同的颗粒在同一电场中的迁移速率不同，常用电泳迁移率来表示。带电颗粒在单位电场强度下的迁移速率称为电泳迁移率。可以用公式( 1 1 ) 计算：u 2 e = ( 珈) ( 纠d = ：以所( 1 1 )其中卜电泳迁移率，锄2v 正s 11 卜- 颗粒迁移速率，c m s 4卜电场强度，v c m 。1萨颗粒迁移的距离，c m卜一支持物的有效长度，c mp 一加在支持物两端的实际电压，v卜_ j 疆电时间，s电泳后通过测量出n “以，即可计算出被分离物质的电泳迁移率玑在一定的条件下，不同物质的迁移率是不同的，从而达到分离的目的。p 划l l s 等人研究了不同的单糖、寡糖硼酸复合物和u v 吸收活性的关系，不经衍生直接分离了这些糖同。公式推导已知一个带有效电荷q 的质点，在粘性介质中( 液体或凝胶) 受到电场力的作用恒速迁移时，质点受到一个驱动力的同时还受到一个与其相平衡的摩擦阻力f7 。其驱动力为嘲根据s 协c k 定律，一个球形分子在粘性介质中泳动时所受的阻力( 摩擦力) 为f7 = 6 九，目式中：刁为介贡粘麦，为分子半径，v 为分子移动速度。当平衡时，庐f7 。即e 9 n 刁所以1 耳目d ，6 n ，叮大连理t 大学硕士学位论文即泸叫庐6 r 目从上述公式可知，电泳迁移率与颗粒所带电量成正比，而与颗粒半径、介质粘度成反比。在限定的电泳条件下( 电位梯度为1 v c m ) ，任何带电颗粒都具有自己的特定泳动度，它是带电颗粒的一个物理常数。1 1 ，2 电泳的分类( 1 ) 按分离的原理分类可分为移动界面电泳、区带电泳、等速电泳和等电聚焦电泳。移动界面电泳啊最早由瑞典科学家t i s e l i u s 建立，在u 形管中进行，移动界面电泳时，区带中常有不止一种的离子。样品的组成对不同区带的浓度、p h 值、电导等起着重要的决定作用。但是由于其电泳仪比较昂贵，而且分辨率也有限，已为其他电泳技术所代替。区带电泳电泳过程中，不同的离子成分在均一的缓冲溶液体系中分离成独立的区带，这是当前应用最广泛的电泳技术睁1 1 】。其特征是整个系统都用同一种电解质充满，这种电解质称为背景电解质，其可运载电流并具有一定的缓冲能力，能提供恒定的p h 值和电位梯度。当电流通过时，离子按特定的速度和方向移动。等速电泳1 2 1 4 】在专用的电泳仪内，当电泳达到平衡后，各区带相继分成清晰的界面，并以等速移动。由于相邻两条区带有着电位梯度的增加，导致等速电泳系统具有两个重要特征。第一个特征为区带界面的“自身校正”效应，当一区带达到恒稳态时，界面即不再变宽；第二个特征为后面的区带温度较前面的高，因此区带可用测温计检测。等电聚焦电泳 1 5 _ 1 月由于具有不同等电点p i 的两性电解质在电场中自动形成p h 值梯度，使被分离物移动至各自等电点的p h 聚焦聚成很窄的区带，被称为等电聚焦电泳，它的分辨率较高，现象与区带电泳相似，分离原理不同。( 2 ) 按有无固体支持物分类根据电泳是在溶液还是固体支持中进行，可分成自由电泳、支持物电泳两大类。自由电泳荷电粒子在垂直电泳中的迁移规律研究自由电泳包括：显微电泳( 也称细胞电泳) ，即在显微镜下观察细胞和细菌的电泳行为；移界电泳；柱电泳，在层析柱巾进行，可利用密度梯度的差别使分离的区带不再混合；自由流动幕电泳；等速电泳。支持物电泳支持物电泳是目前应用最多的方法，其支持物是多种多样的。包括：无阻滞支持物( 如滤纸、醋酸纤维薄膜、聚酰氨粉末、玻璃粉、淀粉、凝胶颗粒等) 和高密度的凝胶( 如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂或琼脂糖凝胶等) 。( 3 ) 根据操作方法分类可分为两维电泳、交叉电泳、连续或不连续电泳和电泳一层析相结合技术。1 1 3 电泳支持介质的选择作为电泳的支持介质，目前应用最为广泛的是醋酸纤维素膜、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉胶等【1 8 】。( 1 ) 醋酸纤维素膜将纤维素的羟基经已酰化得到纤维素的醋酸酯醋酸纤维素，将其溶于丙酮等有机溶剂，可涂布成均一细密的微孔薄膜，即醋酸纤维素膜。早期曾用作细菌滤膜，后来常用作区带电泳的支持介质。制各方法：将二醋酸纤维素置于l o o 1 1 0 烘箱内烘干，一般为2 小时，称取2 0 9放入5 0 0 m 1 血清瓶中，加入丙酮一水混合液( 丙酮7 0 i i l l ，去离子水或双蒸水3 0 m 1 ) 2 0 0 1 ，密闭均匀，放在沸水浴内加热使其充分溶解。然后室温静置2 4 4 8 小时使杂质沉淀。气泡消失后，倒在洁净的水平玻璃板上，用涂膜器或用平直的玻璃棒，两端卷垫3 4 层滤纸，匀速向一个方向涂布，待丙酮挥发后，将膜揭下，夹入平滑洁净的纸内压平备用。( 2 ) 琼脂糖凝胶琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线性高聚物。琼脂糖凝胶的制备是将琼脂糖在所需缓冲液中熔化成清澈、透明的溶液。然后将熔化液倒入胶模中，令其固化。凝固后，琼脂糖形成一种固体基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。( 3 ) 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶通常是用作垂直电泳的介质，其长度可为l o 1 0 0 c m 。丙稀酰胺在引发剂和稳定剂存在时可聚合为长链的聚丙烯酰胺凝胶。聚丙烯酰胺凝胶可根据需要制各成不同的浓度，表1 1 列出了制备不同凝胶所需试剂的体积。火连理工大学硕士学位论文表l _ l 制各聚丙烯酰胺凝胶所用试剂的体积t a b1 1t h er e g e n tv o l u m et op r o d u c ep o 】y a c 叫l a l l l j d eg e l试剂制备不同浓度( ) 凝胶所用试剂的毫升数35 50 8 o 1 2 0 2 0 0 此外，滤纸、玻璃珠、金刚砂、石英砂、硅胶等都可以作为电泳的支持介质，他们各有优缺点，适用于不同类型的电泳装置。电泳的支持介质，要根据电泳装置的类型、分离物质的性质及分离要求来选择，以达到较好的分离效果。总体上要求支持介质的性质要稳定，使用时间相对较长，对分离液的阻碍作用要适中，使分离速度满足实验要求。1 2 影响电泳迁移率的因素从电泳迁移率的分析可见，带电颗粒在电场中的电泳迁移率与本身所带净电荷的数量、颗粒的大小和形状及介质粘度有关。一般来说，所带净电荷的数量越多、颗粒越小、形状越接近球形，则在电场中的迁移速度越快，反之则越慢。电泳迁移率除了与颗粒自身的属性及电场强度有关外，还受缓冲液的p h 及离子强度的影响。一般来说，缓冲液的p h 值与物质的等电点相差越大，物质的解离度越大，有效迁移率越高，但电泳液中的离子增加也会使电泳迁移率降低。胶体粒子会吸附一些相反符号的离子形成离子氛，它使该粒子向相反的方向运动，降低了迁移率，所以离子浓度低，泳动速快，反之，则慢。影响电泳迁移率的因素除被分离物的本身性质之外，其所受到的外界因素影响可以用式( 1 _ 2 ) 表示：v = f 最d c 口( 1 _ 2 )由式( 1 2 ) 可以看出迁移速率( v ) 与电动电势( s ) ，所加的电场强度( e ) 及介质的介电常数( d ) 成正比，与溶液的粘度( 刁) 及常数( c ) 成反比。c 的数值为4 6 ，由颗粒大小而定。以区带电泳为例，全部影响因素可由图1 1 表示：荷电粒子在垂直电泳r i ，的迁移规律研究1 l i观察到的迁移速率li - j图1 1 区带电泳的影响因素f i g 1 1t h ei n f l u e n c ep a r 鲫e t e r so fz o n ee l e c t r o p h o r e s i s下面具体分析外界因素对电泳迁移率的影响。1 2 1 电场强度电场强度是指每厘米的电压降，又称为电位梯度或电势梯度。电场强度对颗粒的迁移速率起着十分重要的作用。电场强度越高，带电颗迁移速率越快。根据电场强度的大小，可以将电泳分为常压电泳和高压电泳。常压电泳的电场强度为2 l o 、，c m ，分离时问较长，需几小时到几天，适合于分离蛋白质等大分子物质；高压电泳电场强度为5 0 也0 0 v c m ，分离时间很短，有时只需几分钟，多用于氨基酸、多肽核酸、糖等小分子物质的分离。1 ，2 2 溶液p h 值溶液的p h 值决定着溶液中带电颗粒的离解程度，即决定着颗粒所带净电荷的多少。如对氨基酸、蛋白质等两性电解质而言，溶液p h 值离等电点p i 值越远，贝日颗粒所带净电荷量越多，迁移速率也越快；反之，则越慢。当溶液p h 等于溶质的等电点时，净电荷为零，迁移速率亦为零。因此，当分离某一氨基酸混合物时，选择一个合适的p h 值，火连理工大学硕士学位论文使各种氨基酸所带净电荷量差异较大，会产生更好的分离结果。为了使电泳过程中溶液的p h 值恒定，必须采用缓冲溶液。1 2 3 溶液的离子强度离子强度代表所有类型的离子所产生的静电力，也就是全部的离子效应，它取决于离子电荷的总数，而与溶液中的盐类的性质无关。溶液的离子强度越高，带电质点的迁移速率越慢；离子强度越低，质点的迁移速率越快。稀溶液的离子强度计算公式为卢1 2 衫式中：，为离子强度c 为离子的摩尔浓度，m o 扎z 为离子的价数一般最适合的离子强度在o 0 2 0 2m o l l 之间。若离子强度过高，则会降低颗粒的电泳迁移率，其原因是，带电颗粒能把溶液中与其电荷相反的离子吸引在自己的周围形成离子扩散层，这种静电引力作用的结果导致颗粒迁移率降低。若离子强度过低，则缓冲能力差，往往会因溶液口h 值变化而影响电泳迁移率。1 2 4 电渗电泳所用的支持物大都为多孔结构。在水溶液中，这些多孔支持物表面的化学基团因解离而带电。与此表面相接触的水溶液因感应相吸，也带有相反电荷。在电场作用下，液体对固体支持物的相对移动称为电渗。液体移动时，也带着被分离物质向同一方向移动。所以，若电渗和电泳移动的方向一致，则物质移动的距离实际上等于电泳和电渗两者距离之和。相反，若电渗和电泳移动的方向相反，则物质移动的距离实际上等于电泳和电渗距离之差。在实验中可以用中性物质与样品同时做电泳来校正这一误差，只需将中性物质的移动距离从实验结果中减去。1 2 5 焦耳热的影响电泳过程中由于通电产生焦尔热，热对电泳有很大影响。温度升高时，介质粘度下降，分子运动加快，引起自由扩散变快，电泳迁移率增大。在电泳过程中，可以通过控制电流、电压或在系统中安装冷却装置来刚氐热效应对电泳的影响。此外，支持物和电泳时间也会对电泳迁移率产生影响。一般要求支持物均匀，吸附力小，否则电场强度不均匀时，会影响区带的分离，实验结果与扫描图谱均无法重复。荷电粒子在垂直电泳中的迁移规律研究对于电泳时间，一般来说，电泳时间越长，离子迁移距离越大，分离效果越好。但是，随着离子迁移距离的增大，电泳带宽度增加，对分离是不利的。因此，要综合考虑多方面因素的影响来选择合适的时间。电泳的原理虽简单，但电泳的过程却是复杂的，影响电泳迁移率的因素很多不能被观察到，因而难以控制影响电泳迁移率的各种因素。选择适宜的电泳条件对分离的效果非常重要，不少学者在这方面做了大量工作口肛2 3 j 。a f 0 i l s o 【2 4 】等人研究了电泳过程中层流稳定性对物质传递的影响。建立了连续流动电泳的缓冲液数字模型，研究了电泳过程中流体动力、热传递与物质传递之间的联系。他们的建立的数字模型可以作为一种预测工具，不仅可以用于电泳装置的设计，而且帮助使用者选择合适的电泳操作条件以避免缓冲液流动过程的混流现象。砌s l a v 瞄j 等人对毛细管电泳的分离条件迸行了优化，将选择性、差分迁移率和分辨率作为最优函数的参量，用加入有机酸的人血清作用模型混合物进行了计算机模拟，得到了在该实验条件下毛细管电泳分离的最佳p h 值，在该p h 值下最优函数取得最大值。同时研究了毛细管区带电泳分离血清蛋白时电解液浓度对分离效果的影响嘲。综上所述，在实验中要根据分离物质的性质来综合考虑各种因素影响程度，从而选择合适的电泳条件。1 3 常用电泳技术电泳技术是一门古老而又年轻的技术。自从瑞典科学家t i s 曲u s 研制的第一台商品化移动电泳系统问世以来，在半个多世纪的时间里，电泳分析仪发展极其迅速。特别是随着支持介质的更新，各种各样的电泳分析装置相继推出，以适应不同国家实验室进行教学、临床和科研工作的需要。2 0 世纪7 0 年代以来，已有越来越多的自动化电泳分析仪相继被引入临床实验室，并在各种疾病的临床诊治中发挥着越来越重要的作用。1 3 1 纸电泳法( p a p c rd e c 乜d p h o r c s i s )纸电泳是2 0 世纪5 0 年代发展起来的一种电泳技术，是用滤纸作为电泳支持介质的一种方法。纸电泳的设备简单，应用广泛，是最早使用的一种电泳技术，也是一种通用的分离、分析手段。在早期的生物化学研究中，纸电泳曾发挥重要作用，但由于纸电泳时间长，分辨率较差，近年来已逐渐为其他快速、简便、分辨率高的电泳技术所代替。不过，纸电泳在植物化学成分的分离中应用较多，如糖类等可利用其衍生物的方法使其分子带电荷，再用纸电泳法进行分离。大连理工大学硕十学位论文1 3 2 醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素薄膜电泳也是2 0 世纪5 0 年代发展起来的一种电泳技术，是用醋酸纤维素薄膜作为电泳支持介质的一种方法。具有以下优点：电泳后区带界限清晰，分辨力比纸电泳要强得多；通电时间较短( 2 0 m i n 1 h ) ；它对各种蛋白质( 包括血清白蛋白、溶菌酶及核糖核苷酸) 都几乎完全不吸附，因此无拖尾现象；对染料也没有吸附，因此不结合的染料能完全洗掉，无样品处几乎完全无色。它的电渗作用虽高但很均一，不影响样品的分离效果，由于醋酸纤维素薄膜吸水量较低，因此必须在密闭的容器中进行电泳，并使用较低压电流避免蒸发。目前醋酸纤维素薄膜电泳己经广泛用于血清蛋白、血红蛋白、球蛋白、脂蛋白、糖蛋白等的分离分析以及免疫电泳中，尽管它的分辨力比聚丙烯凝胶电泳低，但它具有简单、快速等优点。1 3 3 聚丙烯酰胺凝胶电泳( p 0 1 y a c r y l 锄i d eg e le l e c 仃o p h o r c s i s ，n 幅e )聚丙烯酰胺凝胶电泳是2 0 世纪6 0 年代发展起来的一种电泳技术，是根据被分离物质所带的电荷多少及其分子大小、形状的不同，在电场的作用下，产生不同的移动速度而分离的方法。它具有电泳和分子筛的双重作用。此法重复性高，凝胶柱弹性好，无电渗作用，且设备简单，样品用量少，分辨率高，广泛用于分离蛋白质及较小分子的核酸，且能测定蛋白质、酶和核酸的分子量。如血浆脂蛋白目前常用的一种测定方法就是聚丙烯酰胺凝胶电泳法。此外，8 聚丙烯酰胺凝胶电泳还用于性别基因鉴定。聚丙烯酰胺凝胶电泳法目前还广泛应用于分子生物学、生物化学、细胞学、微生物学、植物学等学科的研究及临床化验口7 倒。1 3 4s d s 一聚丙烯酰胺凝胶电泳法( s d s - p o l y a 吲a n l i d eg de l e c 帅曲o r e s i s )s d s 一聚丙烯酰胺凝胶电泳法是2 0 世纪6 0 年代中期发展起来的一种电泳技术，是聚丙烯酰胺凝胶电泳的一种特殊分离技术。即在电泳系统中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠( s d s ) 。目前，研究生命科学的工作都普遍用该法测定大分子的分子量。此外，s d s 一聚丙烯酰胺凝胶电泳法还可以用于测定胸腺肽的相对分子质量。1 3 5 高效毛细管电泳法( h i 出p e r f b n a n c ec a p i l 研d e c 咖p h o r e s i s h p c e )高效毛细管电泳法是近几十年飞速发展起来的一项新的分析技术，它根据离子在缓冲溶液中迁移的速度与电场呈正比原理，将凝胶电泳解析度和快速液相色谱技术融为一体，是继高效液相色谱法出现后分析科学领域的又一次革命。其具有分辨率高( 理论板荷电粒子在垂直电泳中的迁移规律研究数1 0 6 1 0 7 m ) 、快速( 2 0 3 0 m i n 次) 、用量少、灵敏度高等优点，可方便地连续洗脱样品。h p c e 包括毛细管区带电泳、毛纲管凝胶电泳、胶束电动毛细管色谱、亲和毛细管电泳、毛细管电色谱、毛细管等电聚焦电泳和毛细管等速电泳。h p c e 在生物学中应用十分广泛，在蛋白质、激素多肽、核酸等的鉴定、分离方面发挥了显著作用。如郭丹【3 q等人利用高效毛细管电泳法测定了人血清中头孢拉定的含量，测定条件为：高压进样5 s 、分离电压2 0 k v 、温度2 5 、检测波长2 5 4 m 。实验结果证明该方法简单、快捷、灵敏。近期的研究表明，h p c e 对单糖、多糖o ”、腊类研究亦有远大前景，此外在临床分析【3 23 3 j以及细菌、细菌代谢物测定方面的应用日渐增多。高效毛细管电泳法由于分辨率高，速度快，样品用量少，在化学、生命科学、药物学、临床医学、环境科学等领域有着十分广泛的应用。从小无机离子到生物大分子，从荷电粒子到中性分子均能用高效毛细管电泳技术进行分离分析，尤其是对样品珍贵，取样量极少，机体复杂的生物大分子，高效毛细管电泳技术更展示出特有的分离能力与极大的应用前景口蝴。如用于分析西维因等农药网，用于药物一蛋白质结合研究，用于测定茶碱血浆浓度，用于测定中药郾j 、中成药的有效成分含量等。尽管还有许多技术问题有待进一步解决，但其在药物分析中的前景是引入注目的。1 4 电泳的发展与应用1 4 1 电泳的发展历史口9 】电泳技术早在1 5 0 多年前就已经发现，1 8 0 8 年俄国物理学家p e n c e 进行了世界上第一次电泳实验。这个早期实验为电泳的理论和实践的发展及其应用奠定了基础。2 0 世纪的2 0 年代和3 0 年代电泳理论和实践有了很大的发展。1 9 3 7 年，瑞典科学家t i s e l i u s 教授一诺贝尔奖获得者，设计出世界上第一台电泳仪，建立“移界电泳法( m o 询g b o u l l d 婶e p ) ”，成功地将血清蛋白分成了五个主要成分，即清蛋白、nl 一、a2 一、b 一、y 一球蛋白，才使电泳技术在生化分析中得到应用。1 9 4 2 年，m a r t i n 用等速电泳分离了氯离子、醋酸根、天冬酸根和谷氨酸根。1 9 4 9 年，出现了以制备为目的的连续流动电泳。在一个垂直伸长槽中，填满玻璃粉，利用垂直的或水平的电场使样品组分向槽的底部运动。多年以后，自由流动电泳设各才出现，电泳采用垂直槽，电场与缓冲液流动垂直。这被改进用作制各和分析蛋白质和细胞。1 9 5 3 年，l o n g s 砌在t i s e h l l s 的移动界面电泳仪中，在称为前导溶液和尾随溶液两条区带间，加入混合的阳离子( c a 寸、b a 2 + 和m 矿+ ) 。分离后，它们的有效迁移率自大连理工大学硕士学位论文前导溶液向尾随溶液递减，并认识到尾随溶液p h 值的重要性。同样，k a i m a l ( o v 也发现了这规律，他们用的电泳仪分离室里充满石英砂，因此消除了对流。1 9 6 1 年，k o n s t a r 】t i n o v 和o s h u r k o v a 介绍了一种基于“移动界面法”的分析方法。移动晃面法电泳技术的应用使解决生理问题达到了一个新的水平，从此开创了电泳技术的新纪元，并且改变了许多陈旧的概念。但由于t i s e l 池电泳仪比较昂贵，而且分辨率也有限，同时因为自由溶液受熟后发生密度变化产生对流，使区带混乱，不易推广，故2 0 世纪5 0 年代以后电泳技术又朝着支持物电泳方向发展。此后，各种电泳技术及仪器相继问世，先进的电泳仪和电泳技术不断的发展。5 0年代，改进电泳仪以及找寻滤纸( p 印e r ) 、醋酸纤维素薄膜( c e l h d o s ea c e t a t cm e m b r a n e ) 、淀粉、琼胶糖( a g a r o s e ) 作为支持介质。6 0 年代更找到聚丙烯酰胺凝胶( p o l y a c r y l a m i d e )为支持介质，并发展了s d s _ p o 驷c r y l a l l l i d e 电泳、等电点电泳、双向电泳和印迹转移电泳等技术。这些技术具有设备简单、操作方便、分辨率高等优点。目前，电泳技术已经成为生物化学、免疫学、分子生物学以及与之密切相关的医学、农、林、牧、渔、制药、某些工程分析中必不可缺的工具，发挥着重大作用。1 9 5 6 年，s 1 t 1 i t l l i e s 和d o n l i k 最早提出二维凝胶电泳。1 9 5 9 年，d a v i s 首先报道了聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶是一种多孔凝胶，它具有机械强度好、化学稳定性好、对p h 和温度变化稳定、非特异吸附和电渗都很小等特点。此外，这种技术设备简单、样品量小、时间短、操作方便、可分离物质分子大小范围广泛。1 9 6 4 年，0 r s t c i n 和n 耐s 介绍了盘状电泳，并导出电解质系统的迁移率和p h 值的公式。1 9 6 7 年，h j 鼬e n 设计了在试管中的自由区带电泳仪，使得无机离子、有机离子、氨基酸、蛋白质、核算、病毒和细菌的研究能够进行。1 9 6 8 年，v e r h a g g e l l 和e v e r a e n s 在e v e r a c s 和m a m n 工作的基础上制造了一种仪器把等速电泳技术引进了研究室。1 9 7 0 年a r l j n g e r 和r 0 u t s 发明了u v 吸收检测器。等速电泳随榆测器的发展得到了很大的发展。1 9 7 5 年，日o s e 等进行蛋白质的二维电泳实验，在热的s d s 尿素溶液中对样品进行预处理后，先进行等电聚焦而后进行p a g e 。几年后，a l l d 叙述了血清蛋白的分离和能够使二维凝胶电泳并行使用的半自动i s o d a l 系统。运用高电压，在窄孔径毛细管中区带电泳获得很高的分辨率，这种高效毛细管电泳技术在近十几年，尤其是近几年里迅速发展并广泛应用，已经成为与高效液相色谱技术相互补的重要分离方法。荷电粒子在垂直电泳中的迁移规律研究1 4 2 电泳技术的新发展电泳技术的新发展包括等电聚焦电泳( j s o e l e c 砸cf o c u s i n ge 】e c 廿o p h o r e s j s ，m f ) ，高分辨电泳o l i 曲r e s o l u t i o ne l e c n d p h o r e s i s ， 砸) ，双向电泳c h v od i i l l e n s i o n a le l e c t m p h o r e s i s ，2 d e ) 和毛细管电泳( c a p a i ye l e c t r o p h o r e s i s ，c e ) 或称毛细管区带电泳( c 印i l l a 叮z o n ee k c t r o p h o r e s i s ，c z e ) 和高效毛细管电泳咖曲p e 面n a l l c ec e ， p c e ) 。( 1 ) 等电聚焦电泳呷f )i e f 是一项具有很高分辨能力的电泳技术。应用窄p h 范围的两性电解质混合物，已可将p i 差只有0 0 2 p h 单位的大分子系列清晰分开。在一些特殊情况下，也能将h 差小到o 0 0 1 证j 单位的蛋白等大分子分开。聚丙烯酰眩凝胶是i e f 选用最广泛的介质，电泳区带规整，很少或可以说没有谱带的扩散。琼脂糖凝胶经选择和处理，孔径较大电内渗消除后也可用于f 。常业恬i 加 等采用薄层聚丙烯酰胺凝胶f ，在p h 7 2 曲o 之间，可同时将正常人血清c k 同工酶分为c k b b ，c k b m l ，c k b m 2 ，c k m m l ，c k 舭，c k m m 3 ，c k m m 4 共七条谱带，应用双波长薄层扫描，测出了各同工酶及其亚型的相对百分含量。( 2 ) 高分辨电泳( 】m 城)也首先是j 0 b a n s s o n 提出并命名的，随后j e p p s s o n 又作为推荐的选择方法发表。这项技术包括使用琼脂糖凝胶和高电泳电压，通过水冷系统防止过热的出现，而达到高分辨效果。相对而言，琼脂糖中硫酸和羧酸含量较低，电内渗低。因其可载荷的分子可大至1 0 6 道尔顿，所以几乎可以允许所有血浆蛋白，包括多种同工酶和同工酶亚型的电泳分析。与传统的醋酸纤维膜血清蛋白电泳分出5 6 条带相比，i 丑；l e 常规可分离1 5 条以上蛋白带。杨振华等经多年实验研究，先后开发研制出使用普通电泳仅器和一般光密度计即可定量的琼脂糖凝胶电泳方法，用于肌型肌酸激酶亚型 km m l ，m m 2 ，m m 3 1 ，c km b 亚型 田1m b 2 ) 4 “叼及天冬氨酸氨基转移酶( a s d 同工酶( sa s t ，ma s d 的分离测定m j 。( 3 ) 双向电泳( 2 d e )双向电泳( 2 d e ) 具有极高的分辨力。顾名思义，这项技术分两步进行，第一步是m f电泳；妍后，电泳胶取出与第一向呈9 0 。角进行聚丙烯酰胺凝胶( p a g ) 平板电泳。在p a g 中添加离子表面活性剂十二烷基磺酸钠( s d s ) ，从而改变了蛋白质原来荷电状态，使之达到更细微的分离目的。检出能力可达1 0 u g 蚀蛋白含量，分离区带的检测主要用荧光或放射性同位素自动扫描和计算机控制数据处理装置解决。h a r r i s o 等提出在常规工作中可应用的几个方面：1 ) 一些寡克隆或多克隆蛋白带图谱用其它技术分辨不清者；2 ) q 1大连理工人学硕士学位论文抗胰蛋白酶分型：3 ) 载脂蛋白e 分型；4 ) 某些遗传性疾病基因缺失状态或多型血清蛋白的分型。( 4 ) 毛细管电泳( c e ) ，毛细管区带电泳( c z e )毛细管电泳( c e ) 是分离技术中突破性进展，它融合了肌c 和常规电泳两项技术的优点于一体，而具有快速、自动化、可有效分析复杂混合物的特点典型的样品体积小到毫微升伽，l o 母升) 至微微升( p l ，1 0 4 2 升) 。检测器可采用不同类型，包括吸收光荧光、电导率、电化学、质谱或放射性同位素检测。c e 时间一般不超过1 0 分钟，在生物医学1 4 5 1 领域中c e 的应用十分广泛。1 4 3 电泳技术的应用( 1 ) 高效毛细管电泳( h p c e ) 在生命学科领域中的应用氨基酸的分析及蛋白质的肽图自从 c e 问世以来，许多学者对用 玎，c e 分离分析氨基酸进行了大量研究。肽类物质的分离是h p c e 应用最成功的领域之一， i p c e己广泛应用于医药工业中各种蛋白质的肽图标定。通过 丑，c e 能得到用于迸一步测序的肽片断，也能通过比较分析得到蛋白变种和改性的信息。蛋白质测序的第二步需要非常纯的单一肽馏分，现已证明c z e 具有收集足以用于蛋白质_ 澳4 序的肽的能力。核酸成分分析及d n a 测序母c e 的高效、高分辨和高速的特点，顺应了人类基因工程研究对核酸分析尤其是对d n a 分