（环境工程专业论文）葡萄藻在废弃物中培养的适应性及调控研究.pdf

浙江大学博士学位论文摘要 摘要 包括生物质能在内的新能源是当今世界各国优先发展的科研重点之一。由于 微藻具有繁殖快、含油量高、不占用耕地、固碳效率高及易于与现有工业技术集 成等优势，以其为原料的微藻燃料成为近年来生物质能领域的研究热点。然而， 目前微藻燃料仍面临生产成本过高从而难以实现商业化的主要问题。因此，如何 降低其生产成本是相关科研亟待解决的重点和难点。微藻燃料生产涉及微藻培 养、微藻采收、油质提取等多个环节，其中，微藻培养涉及的因素最多，故该环 节可改进的潜力也很大。目前微藻培养过程通常需投入大量人力、物资及能耗， 如光生物反应器构建、温光条件控制、淡水资源占用、化学肥料投加、灭菌处理 能耗等。因此，本研究主要围绕降低微藻培养成本的思路，以葡萄藻7 6 5 ( 肋们阳凹凇6 m 堋玎7 6 5 ) 为研究对象，开展了低成本光生物反应器的构建及灭 菌新技术、不同碳源对葡萄藻生长代谢的影响及其调控适应机制、葡萄藻在竹制 品工业废水中的生长代谢及相应废水水质变化情况、葡萄藻在猪场稳定塘废水中 的生长代谢状况及相应废水水质变化情况等研究工作，主要取得了以下结果： ( 1 )成功构建了一套3 l 光生物反应器，该反应器具有构建和运行成本低、 结构简易、操作简便、运行稳定等优点；成功应用了一种用于光生物反应器灭菌 的新方法，即次氯酸钠法，该方法具有简便易行、成本低廉、易于推广等优点。 ( 2 ) 在上述构建的光生物反应器内，葡萄藻7 6 5 能够在2 2 0 c 0 2 曝气 条件下维持良好的生长状态；采用2 0 c 0 2 曝气时能够获得最大藻体密度2 3g ，f l 、 最高烃类物质含量2 4 、最高油质含量1 2 7 ；葡萄藻对高浓度c 0 2 曝气的适应 与藻体集落形态变化、代谢调控p h 值及体内胡萝卜含量提高等因素有关。另外， 葡萄藻7 6 5 能够以n a h c 0 3 作为碳源进行生长，且生长状况与以n a 2 c 0 3 为碳源 时相似；葡萄糖( 5g l ) 在有光照的情况下能够刺激葡萄藻7 6 5 快速生长，其最 高藻体密度可达2 1g l ；而在没有光照情况下该藻种不能利用葡萄糖进行完全异 养生长。 浙江大学博士学位论文 摘要 ( 3 ) 在不经灭菌的竹制品工业废水中接种培养8 天后，葡萄藻7 6 5 藻体密 度和烃类含量分别为同等条件下人工培养基( b g l l 培养基) 培养的1 9 2 和1 9 8 倍，且在此期间废水中未检测到其它藻种；接种1 2 天后，废水中的葡萄藻藻体 密度开始下降，并出现少量小球藻和轮虫。此外，废水中总氮、硝氮和总磷的含 量随葡萄藻藻体密度的增加而下降，当废水中葡萄藻藻体密度达到最高时 ( 5 2 7 1 0 5 个m l ) ，废水中总氮、硝氮和总磷的去除率分别为7 0 6 、6 6 1 和 7 4 o 。 ( 4 ) 尽管研究所用的养猪场稳定塘废水的色度和浊度都很高，且未经灭菌 处理和p h 值调节，葡萄藻7 6 5 仍能在该废水中呈现良好的生长状态，并能在开 放培养模式下维持较长时间( 2 4 天以上) 的生态竞争优势。葡萄藻7 6 5 在稳定塘 废水培养下的最大藻体密度为o 9 4g l ，是同等条件下人工培养基( b g l l 培养基) 的1 7 3 倍；在稳定塘废水中该藻的最大烃含量为2 3 8 ，是对照b g l l 培养基的 2 倍多。此外，当稳定塘废水中葡萄藻的藻体密度最大时，废水总氮和总磷的去 除效率分别达9 3 7 和9 8 6 。 总之，本研究表明可以用烟道气中的高浓度c 0 2 为葡萄藻培养提供碳源，用 养猪场稳定塘废水为葡萄藻培养提供营养底物及淡水载体，这不仅有利于降低葡 萄藻的培养成本，同时对环境保护也具有重要意义。 关键词：微藻燃料，葡萄藻，烃，光生物反应器，烟道气，竹制品工业废水， 猪场稳定塘废水 浙江大学博士学位论文 a bs t r a c t w i t ht h em p i dc o n s u m p t i o no ff o s s i lm e i s 鲫i di t s 证c r e a s i n g l y r i o u sg r c e n h o u s c e 丘e c t ，g o v e m m e n t s a t t a c h g r e a ti m p o r t 锄c e t 0t h cd e v e l o p m e mo fb i o e n e r g y m i c r o a 培a r c ag r o u po fu 1 1 i c e l l u i a ro r s i i l l p l e m u l t i c e l l u i a rp h o t o s y l l t h e t i c m i c r o o 略粕i s m st h a tc a nf i xc 0 2e 街c i e n t l y i nr e c e n ty e a r s ，m i c r o a k a eh a v ea 缸r a c t e d i n o r ca t t e n t i o nf o rt h cp o s s i b i l i t yo fb e i n ge x p l o i t e d 船ar c n c 、a b l es o u r c eo fm e i s ， w h e r e a si t sc o 瑚m e r c i a ld e v e l o p m e n th a sb e e np r c v e n t e db ye c o n o m i cp r o b l c m s t 6 1 0 w e rt h ec o s to fm i c r o a l g a lb i o m e l sp r o d u c t i o i l ，t h ep o t e n t a lo fu s i n g2 - 2 0 c 0 2 ， b a m b o o m d u s t r i a lw a s t e w a t e ra n ds w i n el a g o o nw a s t e w a t et 0c u h i v a t e 勘f ，) 帕c d 凇 6 ，口柳盯w e r ci i l v e s t 噜a t e d t h er e s u l t sw e r e 粥向l l o w i i l g ： ( 1 )ap h o t o b i o r e a c t o rw 嬲s u c c e s s 如h ye s t a b l i s h e d ，w i t hs e v e m la d v a m a g e s ，s u c h 嬲1 0 w e rp r i c e ，e 舔i l yc o n t r o l 龃ds t a b l eo p e r a t b nc h 硼吼e r i s t i c s i na d d i t i o i i ，an o v e l m e t h o d 瑚i n gs o d i l i mh y p o c h l o r i t e s o l u t i o n 、v a ss u c c e s s m l l yu t i i i z e df o r t h e p h o t o b i o r e a c t o rs t e r i i 诎i o n ( 2 ) 最6 阳枷f f7 6 5c o u i dg r o ww e l lw i t h o u t 锄yo b v i o u si n h i b i t i o n 岫d e ra l l t e s t e d2 - 2 0 c 0 2c o n c e n t r a t i o 璐w i t h 硼a c r a t i o nr a t eo fo 2w 甄e v e nw i t h o u ta n y c u l t u r ep h 删u s t m e n t ( 啪g e d 的m6 0t o8 0 ) t h em a x i m u mb i o m a s sa m o n ga l l c o i l d i t i o 璐w a s2 31g lo n2 5 t i ld a ya t2 0 0 0 2 h y d r o c 孤b o nc o n t e n ta n da l g a l c o l o n ys i z ei 1 1 c r e a s e dw 确t h ei l l c r e a s eo fa 现c o n c e m r a t o n an e g a t v ec o r r e l a t i o n b c t w e e na 培a lb i o m a s s 甜l dc u h u r et o t a lp h o s p h o r u sw 嬲o b s e r v e d ( 丘o m 一0 8 2 8t o - o 9 1 l ，尸 o 0 1 ) n a h c 0 3c o u l db eu s e db y 刀6 阳姗打7 6 5 嬲c 甜b o ns o u r c e i n a d d i t i o 玛i f m e r ew a s5g lg l u c o s ei i lb g l lm e d i u i n ，幽eg r o w t i lr a t eo f b b r a u n i i7 6 5 c o “db cg r e a t l y m c r e 髂e dw h e nt h es t r a i l lw a si i il i g h ti i l s t e a do fd i l r l m e s s 【3 ) o nd a y0 一1 2a r e ri r l o c u 瞰i o i l ，最6 朋堋l f 黟e w 、) v e l i mt h eb a m b o o m d u s t m l w a s t e w a t e r a n db o t ht h eg r o 、玑hr a t e 甜l dh y d r o c a r b o nc o m e n to ft h ea l g a ew e r e h i 曲e rt h a nt h o s eg r o w ni i l e i g tlm e d i u m ( c o n t r 0 1 ) d u r i n gt h i sp e r i o d a r e r8d a y s 舶mi l l o c u l a t i o 玛t h ea l g a lc o l o n yd e n s i t ya n dh y d r o c a r b o n n t e n ti i i b a m b o o i i l d u s t r i a lw a s t e w a t e rr e a c h e d1 9 2 孤d1 9 8t i i i l e so ft h ec o m r 0 1 d u r m gt h es a m e 浙江大学博士学位论文a b s l r 竺t p e r i o d ，c o n t a m i i 斌i o nb yo t h e ra 培a es p e c i e sw a s d c t e c t e di i lt h es y s t e m o nd a y l2 2 4m e r 劬c u l a t i o n ，t h eg r o 埘ho f 丑6 阳硼打i l lb a m b o oi i l d u s t r i a lw a s t e w a t e rw 舔 o b v i o u s l yh l h m i t e d 觚ds o m e 鳓z d 汜肋s p 觚dr o t i f e r s mt h ew a s t e w a t e r w e r ef o 咖d 1 na d d 量c i o n ，7 0 6 t o t a ln i t r o g e n ，6 6 1 n i t r a 土c 锄d7 4 0 t o t a lp h o s p h o m si i l t h e w a s t e w a t e rw e r er e m o v e dw h e nt h ea 培ad e n s i t yi i li tr e a c h e dt h eh i 曲e s tp o 硫 ( 4 ) t h ea l g a 咖i nc o u l di i l a i n t a i l lac o m p e t i t i v ea d v a n t a g eo v e rt h e2 6 d a y c u l t i v a t i o n ms w i n el a 9 0 0 nw a s t e v 旧t 既t h eh i 曲e s td 拶b i o m a s so fa l g ag r o w n i nt h e w a s t e w a t e rw a so 9 4m gl - la td a y2 4 ，w h i c h 、瑚1 7 3t i i t l e st h a tg r o w n 证b g l l m e d i u m a n dt h ea i g a i h y d r o c a r b o nc o n t e n tw a s2 3 8 ，r n o r et h a n 搬，i c et h a ti f lb g l l m e d i u m a d d i t i o n a i l 弘a b o u t9 3 7 a n d9 8 6 o ft na n dt p mt h ew a s t e w a t e rw e r e r e m o v e d ，s u g g e 戳m gt h a te n v 的呲e n t a ib e n e 位南r t h ea 培a i ns u m m a r y ，c 0 2 矗m mn u eg a sa i l da c r a t e d - s w i n e - l a g o o n - w a s t e w a t e rc o u l d r e p h c ec h e m i c a lc a r b o na n dn m r i e m si l l 占6 朋娜打m i f i c i a lc u h i v a t i o n ，r e s p e c t i v e l y t h ec u l t u r eo fm i c r o a l g a eu s i n gn u eg a s 硼dw a s t e w a t e rw o u l db c n e f i tb o t hm i c r o a l g a l b b f u l sp r o d u c t i o na n de n v i r o 咖e n tp r o t e c t i o n k q 啊o r d s ：m i c r o a l g a eb i o 向e i s ，b d 抑c d c c 螂6 ，口堋疗，h y d r o c “b o n ，p h o t o b i o r e a c t o r ， f 1 u eg a s ，b 椰b o oi i l d u s t r i a lw a s t e w a t e r ，s w i i l el a g o o nw a s t e w a t e r 浙江大学博士学位论文图目录 图目录 图1 1 葡萄藻集落的显微照片6 图1 2 葡萄藻烯和鲨鱼烯的生化合成途径一8 图2 1 藻种活化期的藻体颜色和形态特征2 6 图2 2 光生物反应器内藻液o d 6 8 0 和藻体干重的关系曲线图2 7 图2 3 葡萄藻7 6 5 在b g l l 中的生长曲线2 8 图2 4 光生物反应器系统结构示意图2 9 图3 1 葡萄藻7 6 5 在高浓度c 0 2 曝气下的生长曲线3 9 图3 2 高浓度c 0 2 处理下藻体叶绿素含量变化4 1 图3 3 高浓度c 0 2 处理下藻体肛胡萝卜素含量变化4 2 图3 - 4 高浓度c 0 2 曝气下葡萄藻7 6 5 的细胞和集落显微结构4 4 图3 5 高浓度c 0 2 曝气下藻液的p h 值变化4 7 图3 6 高浓度c 0 2 曝气下藻液的t p 变化4 8 图3 7 高浓度c 0 2 曝气下葡萄藻7 6 5 的烃类及油质含量4 9 图3 8h c 0 3 。以及葡萄藻对葡萄藻生长的影响5 l 图3 9h c 0 3 。以及葡萄藻对葡萄藻7 6 5 叶绿素含量的影响5 2 图3 1 0h c 0 3 。以及葡萄藻对葡萄藻7 6 5 胡萝卜素含量的影响5 2 图3 1 l 改良b g l l 培养液的总氮含量变化5 3 图3 1 2 改良b g l l 培养液的总磷含量变化5 4 图4 - l 葡萄藻在竹制品工业废水和b g l l 培养基中的生长曲线5 8 图4 2 竹制品工业废水中的总氮含量6 0 图4 - 3 竹制品工业废水中的硝氮含量6 l 图4 4 竹制品工业废水中的氨氮含量6 2 图4 - 5 竹制品工业废水中的总磷含量6 3 图4 6 竹制品工业废水中的c o d 含量6 3 浙江大学博士学位论文图目录 图5 1 葡萄藻在a s l w 和b g l l 培养基中的生长曲线7 0 图5 2a s l w 和b g l l 中藻体叶绿素含量7 l 图5 - 3 葡萄藻7 6 5 在b g l l 培养基和a s l w 中的p 胡萝卜素含量7 2 图5 - 4 葡萄藻7 6 5 在a s l w 和b g l l 培养基中的集落特征7 5 图5 5a s l w 中的总磷含量变化7 7 图5 6a s l w 中总氮含量变化7 8 图5 7 a s l w 中硝态氮含量变化7 9 图5 8a s l w 中氨氮含量变化8 0 图5 9a s l w 中c o d 含量变化_ 8 0 浙江大学博士学位论文 表目录 表目录 表1 1 葡萄藻常用培养基的大量元素成分及含量1 l 表2 1b g l l 培养基成分组成2 l 表2 2 不同微藻密度表征方法的主要特点2 2 表2 33l 光生物反应器系统的运行参数3 0 表3 1 高浓度c 0 2 试验中光生物反应器系统的运行参数3 4 表4 1 竹制品工业废水的主要理化性质5 6 表4 2 接种葡萄藻后竹制品工业废水中的微生物种类及其数量变化情况6 4 表5 1a s l w 的主要理化性质6 7 表5 2 不同起始磷浓度下培养液中微藻种类及数目8 2 x 浙江大学博士学位论文第1 章绪论 第1 章绪论 1 1 课题背景 自工业革命以来，石油、天然气、煤等化石燃料的大量使用，不仅使人类面 临不可再生资源加速枯竭的困境，同时使地球的生态环境也遭受了巨大破坏。能 源和环境问题已经成为各国发展经济、保持社会稳定的重要限制因子。因此，近 年来许多国家和地区都从战略安全的角度考虑，将生物质能等可再生能源的开发 作为重要课题，投入了巨额资金进行科研攻关( m a n s f i e l d 等，2 0 0 6 ；t a y l o r ，2 0 0 8 ) 。 由于以粮食作物作为主要能源基质的传统生物质能在开发过程中遇到了生产周 期长、光合效率低、原料不足、加重温室效应、可能引发粮食危机等一系列问题， 其发展受到诸多限制( l i 等，2 0 0 8 ；s e a r c h i i l g e r 等，2 0 0 8 ) ，开发新型生物质能源 势在必行。 微藻( m i c r o a l a g e ) 是对能够利用来自空气、废气、可溶性碳酸盐等各种碳 源的c 0 2 进行类似于植物细胞光合作用的单细胞和简单多细胞生物体类群的总称 ( w a n g 等，2 0 0 8 ) ，通常指自由生存于各种水体环境，如淡水、咸水( 盐分小于 3 5 ) 、海水( 盐分约等于3 5 ) 、盐水( 盐分大于3 5 ) ，具有宽泛的温度、p h 值适应性，且只能在显微镜下观测到的藻类( w a n g 等，2 0 0 8 ；f a l k o w s k i 和r a v e n ， 1 9 9 7 ) 。微藻是地球上最早出现的生命体形式之一，它在地球生命进化史中发挥 了极其重要的作用。微藻出现前地球大气中含有大量c 0 2 ，而0 2 的含量极低，好 氧生物无法生存。微藻在繁殖过程中通过光合作用大量吸收大气中的c 0 2 并将其 转化为有机物，同时向大气释放0 2 ，从而使大气中c 0 2 和0 2 的组成比例转变到适 宜好氧生物生存繁衍的水平，推动了地球生命的持续进化，进而形成了地球如今 相对稳定的生态系统( f a ( o w s k i 等，2 0 0 4 ) 。尽管目前微藻生物质总量只占地球 全部光合生物质的0 2 ，但其生产效率十分惊人，据估计地球上大约5 0 的有机 碳和大气中4 0 5 0 的0 2 都是由微藻光合作用产生的( p r 0 踮蛐，2 0 0 9 ) 。 微藻光合作用的生化机制与陆生植物类似，不同的是微藻对太阳能的转化效 浙江大学博士学位论文 第l 章绪论 率要高得多。这是因为：首先微藻的结构极为简单，与陆地植物相比它不用因支 撑像植物那样庞大的枝体结构而消耗大量能量；其次，由于微藻大多生活于水体 中，不需要耗费能量将水体和营养进行长距离运输，这也有助于其将更多的能量 用于生物质合成( s h e e h a n 等，1 9 9 8 ) 。依靠现有技术，微藻能够将最高1 5 的光 合有效光转化成生物质，而陆生植物的光合效率远远低于这一数据，例如陆生植 物中光合效率最高的甘蔗的光合效率也只有3 5 4 0 。此外，与陆生植物将油 质作为能量的一种形式集中储存于种子不同，每个微藻细胞都是一个油质加工 厂。尽管微藻和植物油质代谢途径基本一致，但是单位面积上微藻的油质产量远 远超过植物( p r o 霉锄，2 0 0 9 ) 。正是基于上述两点考量，尤其是对单位面积产油 效率的考量，微藻被视为一种潜力巨大的生物能源基质( c h i s t i ，2 0 0 7 ) 。 微藻燃料( m i c r o a i g a eb i o 如e l s ) 是指以微藻作为氢气、油质、烷烃、乙醇等 燃料来源的生物质能源形态。作为一种新型的生物质能源基质，微藻具有生命周 期短、含油量高、不占用耕地、种类繁多、利于工业化开发等优点( b r o w n 等， 1 9 9 3 ；s p o l a o r e 等，2 0 0 6 ；c h i s t i 等，2 0 0 7 ) 。近年来，随着人们对温室效应的持续 关注，利用微藻细胞固定c 0 2 ，同时进行生物燃料生产成为生物质能源领域的研 究热点( g a v r i l e s c u 和c h i s t i 2 0 0 5 ；m i k e ，2 0 0 9 ) 。 人类对微藻燃料的关注起始于上世纪7 0 年代发生的能源危机中g e l p i 等 ( 1 9 7 0 ) 发现葡萄藻( b d 以，d c d 卯淞6 册f f ) 具有很高的烃类物质含量，且其烃类成 分与工业汽油十分接近。世界上首先进行大规模微藻燃料开发的国家主要是美国 和日本。美国能源部( 以前称能源管理委员会) 从1 9 7 6 年到1 9 9 8 年花费2 5 0 0 万美 元实施了“水生物种计划”( a q u a t i cs p e c i e sp r o g r a m ，a s p ) ，试图用微藻生产生物 燃料以替代化石燃料。a s p 计划主要侧重于微藻的户外大规模开放式培养，这种 微藻培养方式主要受限于微藻培养体系的环境条件难以控制，培养体系容易受到 杂藻污染而造成系统崩溃；此外，a s p 研发人员认为光生物反应器在藻类大规模 生产微藻燃料上并非关键因素( s h e e h a n 等，1 9 9 8 ) 。该计划于1 9 9 8 年的总结报告 中指出以微藻生产生物燃料虽然在技术上问题不大，但在当时经济上却是不可行 的。不过a s p 项目的结题报告同时指出，虽然a s p 计划没有获得理想的研究成果， 2 浙江大学博士学位论文第l 章绪论 但它应该被看做今后微藻燃料研究的起点，而非终点。日本的政府机构地球革新 技术研究所( r e s e a r c hi i l s t i t u t eo f i 衄o v a t i v e 融h n o i o g yf o rt h ee e 甜h ，t e ) 于 1 9 9 0 年制定了微藻固碳产能研究计划，耗资1 1 7 亿美元开展了世界上最大规模的 微藻固碳产能研究项目( h o w 甜d 等，1 9 9 7 ) 。该计划主要侧重于利用光生物反应 器培养高固碳效率、高产油率的燃料微藻。由于项目开发的光生物反应器成本过 高而于1 9 9 6 年终止。 2 0 0 8 年上半年国际原油价格一度逼近2 0 0 $ ，b b l ，这引起人们对于微藻燃料的 重新重视( w i j 航l s 和b 盯1 ) o 鼢，2 0 l o ) 。2 0 0 9 年美国能源部再次制定了一项新的总 投资8 亿美元的微藻能源开发计划，并出版了涉及微藻燃料的基础科研、技术改 良及商业化应用等较全面的国家微藻燃料技术路线图( n a t 沁m la l g a lb b l s t e c h n o l o g yr o a d m a p ) ( p r o g m m ，2 0 0 9 ) 。 国内有关微藻燃料的科研起步相对较晚，早先的报道比较有限。其中，中科 院水生所( 许常虹等，1 9 8 8 ) 的研究起步较早，清华大学对小球藻异养培养生产 油质的研究较系统( w u 等，1 9 9 9 ；w u 和s h i ，2 0 0 8 ) ，另外中科院过程所( 郝建 欣等，2 0 0 2 ) 、暨南大学( 胡章喜等，2 0 0 9 ) 等科研院所对微藻燃料的研发也有 零星报道。近年来，微藻燃料引起国际上的广泛关注，国内许多单位也开始重视 微藻燃料的研究。如2 0 0 9 2 0 1 0 年两年间中科院新成立的青岛生物质能源所、上海 高等研究院、宁波工业研究院等科研单位都专门设立了微藻生物能源的研究团 队；此外，国家2 0 1 1 年启动了首个微藻燃料相关国家重点基础研究发展计划( 9 7 3 ” 计划) 项目j 微藻能源规模化制备的科学基础”。 目前国内外微藻燃料的商业化开发面临的主要问题仍然是生产成本过高，如 何降低微藻燃料的生产成本仍是今后科研攻关的重点( w i j 仃e l s 和b a r b o s a ，2 0 1 0 ) 。 微藻燃料生产成本的构成主要包括藻种筛选、培养、采收、脱水及油质提取等五 方面，要想降低微藻燃料的生产成本需对这五方面的每个细节通盘考量，才能最 终实现微藻燃料的商业化开发( w i j 艉l s 和b a r b o 鼢，2 0l0 ) 。 微藻作为一种生命体，其生命活动与环境因子包括光照、温度、营养物 质等密切相连。在藻类生长繁殖的各种环境条件中，光是其生长发育的首要调节 浙江大学博士学位论文第l 章绪论 因子。如光强对葡萄藻的影响主要包括倍增时间( v l a d i s i a v 等，1 9 9 4 ) 、集落大小 ( 2 抽n g 和e i i c h i ，1 9 9 8 ) 、代谢产物的种类及数量等( w b i f 等，1 9 8 5 ) 。f a l k o w s k i 等( 1 9 9 1 ) 研究认为光驯化是微藻细胞能否被暴露于高光强下而不至于产生光抑 制现象的关键环节。o y a m a 等( 1 9 9 7 ) 将适应较低光强的葡萄藻u t e x 5 7 2 置于 2 5 7 2 旺m - 2 s 1 的光强条件下，藻体烃含量以及细胞中的氮和磷浓度都会有所下 降，而对于在前期接受了强光( 1 0 0 ，0 0 0l u x ，大约1 4 0 嶂n 1 2 s 。1 ) 处理的藻体，高光 强下培养可以得到明显高于对照的生物量( 7k g m 3 ) 和烃含量( 藻体干重的5 0 ) ， 这是由于经过驯化处理的藻种适应了高光强的环境。另外持续光照下，葡萄藻烃 含量增加到光暗交替培养的4 倍( l u p i 和f e m a n d e s ，1 9 9 4 ) 。可见，微藻可以通过 人工驯化适应光强的变化，且通过这种适应性驯化能够提高微藻的生物量和能源 物质含量。微藻燃料的生产成本主要来自于温度、光照、营养物质等环境条件的 人为控制。要实现低成本的微藻固碳产能，一是可以通过藻种驯化使其能够在逆 境环境下生长从而减少人为控制条件或降低控制成本：再有就是降低人为控制环 境的建造和运行成本，使藻种在其普遍适宜的环境条件中生长。 葡萄藻是一种从温带到热带广泛分布的藻类，其在自然界的生长繁殖速度快 ( m a s a k a z u 和m a 鼢h 的，1 9 9 7 ) ，含油率高( b a n e 巾e 等，2 0 0 2 ) ，所含烃类平均 热值高( h e l d 等，1 9 8 5 ) ，因此葡萄藻是微藻燃料研究领域的典型研究对象之一。 据估计，与一个发电容量为1 0 0m w 的火电厂相比，用葡萄藻生产相同容量的电 能，一年能少排放1 5 1 0 5 吨c 0 2 ( s a w a y a m a 等，1 9 9 9 ) 。日本由r j t e 机构实施微 藻燃料研发过程中，成功筛选获得了在光生物反应器内固碳速率超过lg ( c 0 2 ) ( l d ) ，含油量超过1 5 的葡萄藻藻种s i 3 0 ( m a s a k a z u 和m a s a h 的，1 9 9 7 ) 。葡萄藻 是所有产烃藻种中研究最多，被认为最有可能实现固碳产能工业化的藻种之一 ( 唐赢中等，1 9 9 7 ) 。然而，葡萄藻燃料的开发同样面临生产成本过高的技术瓶 颈，研究如何降低葡萄藻燃料的生产成本对于推动微藻燃料的发展具有重要意义 ( b a n e r j e e 等，2 0 0 2 ；m e t z g e r 和l a 唱e a u ，2 0 0 5 ) 。 4 浙江大学博士学位论文 第l 章绪论 1 2 葡萄藻的生物学特征 1 2 1 概述 葡萄藻的拉丁名为肋棚旧c d 搬6 m 枷豇。胡鸿钧等编著的中国淡水藻类一 系统、分类及生态一书中是这样描述葡萄藻的：葡萄藻属于黄藻门 ( x 锄t h 叩h y t a ) ，黄藻纲( x a n t h o p h y c e a e ) ，柄球藻目( m i s c h l o r i c k l c e ) ，葡萄 藻科( b o t 叮o c o c c a c e a e ) ，葡萄藻属( 肋幻幻c c 淞k i j _ t z s p e c i e sa l g a m 毗8 9 2 ， 1 8 4 9 ) ：葡萄藻单个细胞为椭圆形，宽3 6 “m ，长6 1 2 斗m ，通常2 个或4 个为一 组，多数包被在不规则分枝或分叶的、半透明的胶群体胶被的顶端( 如图2 ) ；色 素体1 个，杯状或叶状，黄绿色，具有1 个裸出的蛋白核。同化产物为淀粉或脂 肪；以亲孢子营无性生殖。孢子形成为纵分裂，群体断裂为小群体；为湖泊常见 类；有时能形成水华；细胞内贮藏丰富的长链烷烃类化合物。 从上述描述中可以得出以下四点信息：嫩z 早在1 8 4 9 年就已经分离鉴定 了葡萄藻藻种；葡萄藻单细胞的形态很小，但多个葡萄藻单细胞可构成集落 结构；葡萄藻细胞内含有丰富的可燃成分；自然界中葡萄藻能够形成水华， 因此其具备快速繁殖能力。 1 2 2 葡萄藻的显微结构 葡萄藻单细胞从侧面看呈卵形，从顶部看呈圆形葡萄藻单细胞宽约4 9 m ， 长约8 1 3p m 。葡萄藻单细胞顶部一般包在胞外基质( e x o 眦l t r 泌) 中( 如图1 1a b ) ， 胞外基质是由烃类、中性脂、胞外多糖( e x 叩o j y s a c c h a r i d e s ，e p s ) 构成。其中 中性脂经尼罗红染色后，于荧光显微镜下呈明亮的红色( 如图1 1c ) ( t a n o i 等， 2 0 1 1 ) 。由胞外基质将多个葡萄藻单细胞包被成集落形态。集落内的单细胞排列 呈辐射状，集落的大小则由集落中的单细胞数目决定，其直径一般在3 0 5 0p m 。 油质含量丰富的葡萄藻集落在显微压片时甚至可以观测到有油滴从集落溢出( 如 图1 1a ) 。同时葡萄藻细胞内部同样充满丰富的代谢产物( 如图1 2b ) 。多个葡 萄藻集落串联在一起在扫描电镜下呈葡萄串状( 如图1 - lc ) ( m e t z g e r 和l a 曙e a u ， 2 0 0 5 ) 。透射电镜显示( 如图1 1d e ) ：葡萄藻单细胞具有多层细胞壁结构，叶绿 浙江大学博士学位论文 第l 章绪论 体发达，细胞核大，核仁清晰，液泡较少，高尔基体体积较大，线粒体内脊多。 另外葡萄藻细胞内还有许多圆形的胞内烃。 图1 1 葡萄藻集落的显微照片( m 曲e g e r 和l a 唱e a u ，2 0 0 5 ；、e t a i i ，1 9 8 5 ) ( a b ：干涉相衬显微图：c ：尼罗红荧光染色图：a ：光学显微图：b 、f ：透射电镜图：c e ： 扫描电镜图) f i g 1 一lm i c r o s c o p yo f 肋砂o c c 淞6 阳姗f fc o l o n y ( m e t z g e ra n dl a 唱e a u2 0 0 5 ；w e e t a n1 9 8 5 ) ( a - b ：d j 丘酹e n t j a l i n t e r f e r e n c ep h a s ec o n t r a s t ( d i c ) f n j c r o g r a p h s ；c ：f l u o r e s c e n c em i c r o g r a p l l s ( t a n o i ，k a w a 洲e ta 1 2 0 l o ) ；a ：l i g h tm i c r o s c o p y ；b & f ：t r a l l s m i s s i o ne i e c 【r o nm i c r o s c o p y ；c ： s c a n n i n ge l e c 仃o nm i c r o s c o p y ) ( m e t z g e r a j l dl a r g e a u 2 0 0 5 ；w e e t a l l ，19 8 5 ) 6 浙江大学博士学位论文第l 章绪论 1 2 3 葡萄藻的烃类成分及其合成途径 尽管葡萄藻被科学家分离鉴定的时间很早，但直到2 0 世纪3 0 - 4 0 年代，当地 质科学家发现其可能与石油沉积岩的形成有关时，才开始引起科学家的关注( 唐 赢中等，1 9 9 7 ) 。 葡萄藻油的化学成分主要是烃类物质。据报道，葡萄藻的烃类含量占其细 胞干重的2 8 6 ( m e t z g e r 和l a 耀e a u ，2 0 0 5 ) 。根据葡萄藻所合成的烃类代谢产 物种类的不同，葡萄藻一般被分为三个品系，即a 品系、b 品系和l 品系。其中 葡萄藻a 品系主要合成碳原子数目在2 5 3 l 间的奇数碳链烃类物质，这类烃以n 二烯烃和三烯烃为主，其中以c 2 7 h 5 l 三烯烃和c 2 7 h 4 8 四烯烃较为常见，烃类含量 占藻体干重的o 4 6 1 ；葡萄藻b 品系主要合成三萜类烷烃，又称葡萄藻烯 ( b o t d ，o c o c c e n e ，c n h 2 n - l o ) ，其碳链碳原子数目在3 0 - 3 7 ，烃类含量占藻体干重的 3 0 - 4 0 ：葡萄藻l 种：该种只能合成一种烃类，即碳原子数目为4 0 的四萜烯， l 种葡萄藻的烃类含量一般都较低，在o 1 8 之间( b a n e r j e e 等2 0 0 2 ；m e t z g e r 和l a 曙e a u ，2 0 0 5 ) 。 目前，有关葡萄藻烯烃类物质的生化合成途径还不确定。图1 2 总结了葡萄 藻烯和鲨鱼烯可能的生化合成途径，可见这两种烯烃的合成底物为法尼醇 ( f a r n e s 0 1 ) ，法尼醇在磷酸激酶的作用下生成法尼醇二磷酸( f a r n e s o ld i p i l s p h a t e ， f p p ) ，法尼醇二磷酸又经过两步中间反应生成二磷酸鲨鱼烯前体( p r e s q u a l e n e d i p h o s p h a t e ，p s p p ) ，二磷酸鲨鱼烯前体再经过脱磷酸作用生成带有环丙烷羰基 阳离子的中间体( c y c l o p r o p y lc a r b o n y lc a t i o n ) ，该阳离子可在鲨鱼烯合成酶的作 用下最终合成鲨鱼烯，同时也可能在葡萄藻烯合成酶的作用下合成葡萄藻烯 ( b o t 秽o c o c c e n c e ) ，葡萄藻烯可以s 腺苷甲硫氨酸为甲基来源完成甲基化作用， 最终生成葡萄藻烯的各种同源异构体衍生物。 浙江大学博士学位论文第l 章绪论 h 瓣三触 r l i h 挎 附 瓢； s 掣d 簋坼 蛾越取 3 姗 3 专h 瓢 _ 一 l 鬣l l 掣 1 i t 2 硝l 37 锄一一 嘲舻黝m 、冒2 “ 跏耳三蕃 锣n 畦阱c1 ? 竺。 ( 毒科删媳 帆蛔，删丧融徘； 图l - 2 葡萄藻烯和鲨鱼烯的生化合成途径( b 锄e i j e e 等，2 0 0 2 ) f i g 1 - 2m e c h 锄i s mo f b i o s 州h e s i so f b o 拓y o c o c c e n 船a n ds q u a l e 北i n 丑6 例阿疗( b a i l e i j e ta l ， 1 3 营养条件对葡萄藻生长代谢的影响 大多数葡萄藻都是通过叶绿体进行光合自养生长( m e t z g e r 和l a 唱e 肌，2 0 0 5 ) ， 少数藻种也能够利用有机物进行异养生长或自养异养混合生长( w e e t a l l ，1 9 8 5 ) 。 葡萄藻的生长代谢要受到水、光照、温度、营养、p h 值等多种因素的影响。由于 许多文献已经对上述因素进行了深入研究与较详尽综述( 如：m e t z g e r 和l a r g e a u ， 2 0 0 5 ) ，本文主要结合课题需要对影响葡萄藻生长代谢的营养条件的研究进展进 行总结。 8 黪茂姆蠹 浙江大学博士学位论文第l 章绪论 1 3 1 葡萄藻在自然界的生长代谢 葡萄藻在自然界的分布十分广泛，从现有发现的葡萄藻藻种所处气候带来 看，它在热带、亚热带和温带地区都能生长；从其生长的水体环境来看，包括淡 水河流、咸水湖泊、水库、池塘等各种水体( m e t z g e r 和l 鲫笋a u ，2 0 0 5 ) 。从葡 萄藻在自然界的广泛分布状况可以推测出葡萄藻能够对自然环境条件的变化具 有较强的适应性。许多研究报道葡萄藻能在世界多地形成水华( w 敬e 和h i l l e n ， 1 9 8 0 ；d a y a m n d a 等，2 0 0 7 ；p a p a 等，2 0 0 9 ) ，这表明其具有在开放环境下迅速生 长占据有利生态位成为优势藻种的潜力。但其形成机制尚待深入研究。p a p a 等 ( 2 0 0 9 ) 研究发现葡萄藻水华发生时，藻体集落密度与水体d o 值呈显著负相关， 而与水深、p h 值、温度等参数的相关性不大。不过，该研究中葡萄藻集落密度 与温度相关陛不大，可能是由当地气温变化不显著所致；而与p h 值相关性不大 则可能缘于葡萄藻本身对p h 值的较强适应性及自我调节能力。另外，各种自然 及人为因素引起的n 、p 等营养盐的输入可能是引发葡萄藻水华现象的重要原因 ( w 狄e 和h i l l e n ，1 9 8 0 ；许常虹和俞敏娟，1 9 8 8 ；p a p a 等，2 0 0 9 ) 。水体中其他 水生动植物的种类、数量及葡萄藻本身不饱和脂肪酸代谢也会通过生物协同竞争 和化感作用等对葡萄藻水华的形成产生重要影响( w