（环境工程专业论文）蛋白质在污染土壤生物学评价中应用的可行性研究.pdf

蛋白质在污染土壤生物学评价中应用的可行性研究 论文评阅人1 ： 评阅人2 ： 评阅人3 ： 评阅人4 ： 评阅人5 ： 答辩委员会主席： 委员1 ： 委员2 ： 委员3 ： 委员4 ： 委员5 ： 论文作者签名： 指导教师签名：渤茎垒 罗安程教授浙江大学环境与资源学院 林琦副教授浙江大学环境与资源学院 金赞芳副教授浙江工业大学生物与环境工程学院 吕镇梅副教授浙江大学生命科学学院 沈超峰副教授浙江大学环境与资源学院 梁新强副教授浙江大学环境与资源学院 a u t h o r ss i g n a t u r e ： s u p e r v i s o r ，ss i g n a t u r e ：卫刍塑丛i t h e s i sr e v i e w e r1 ：p r o f e s s o r a n c h e n gl u o t h e s i sr e v i e w e r2 ：a s s o c i a t ep r o f e s s o r q il i n t h e s i sr e v i e w e r3 ：a s s o c i a t ep r o f e s s o r z a n f a n g j i n t h e s i sr e v i e w e r4 t h e s i sr e v i e w e r5 ： c o m m i t t e ec h a i r ：p r o f e s s o r x i a n g y a n gx u c o m m i t t e e m a n1 ：p r o f e s s o r w e i 】| 【i a n gw u c o m m i t t e e m a n2 ：p r o f e s s o r j i y a ns h i c o m m i t t e e m a n3 ：a s s o c i a t ep r o f e s s o rz h e n m e il v c o m m i t t e e m a n 4 ： a s s o c i a t ep r o f e s s o r c h a o f e n gs h e n c o m m i t t e e m a n5 ：a s s o c i a t ep r o f e s s o r x i n q i a n gl i a n g d a t eo f o r a ld e f e n c e ： 丛堑也窆，2 q ! 三 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包含为获得盘姿盘堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 形纸 签字日期： 矽，弓年；月7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解迸姿盘堂有权保留并向国家有关部门或机构送交本 论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝姿态堂可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段 保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 导师签名：私z 之 俐白久 签字日期：如j 弓年乡月罗日 签字日期：扣，；年弓月，j 日 致谢 本论文是在我的导师陈英旭教授的悉心指导和严格要求下完成的。恩师渊博的专业知 识、严谨的治学态度、忘我的工作热情对我影响深远! 恩师所提供的良好的科研条件，使 我在学术方面得到了提高与锻炼。在此，谨向恩师致以崇高的敬意和最衷心的感谢! 感谢施积炎教授和李锋老师在论文选题、实验方案设计与实施、以及论文撰写与修改 等方面的指导、鼓励与帮助，我在此表示衷心的感谢! 感谢浙江大学环境保护研究所吴伟祥教授、沈超峰副教授和秦智慧老师在科研、工作 和学习生活中给予的指导、关心和帮助，我在此表示最诚挚的谢意! 感谢在学 - j 、工作和生活中给予我无私帮助的陈晨、陈玲桂、崔静岚、邓辉、董达、 冯琪波、顾佳涛、郭茹、黄孝肖、刘飞翔、鲁亢、彭程、王成、王亮、吴一鸣、徐辰、岳 乾坤、周曼曼、朱神海等好友，特别是当我面对各种困难时，你们始终给予我最大的鼓励 与支持。感谢陈蕾、段德超、刘婷婷、龙冬艳、栾静、王莹莹、杨远强、余昱葳等师兄师 姐在实验开展、数据分析等方面提供的帮助。此外还要感谢陈曦、冯佳蓓、何俊昱、李若 冰、龙碧波、宋婕、孙丽娟、王梦、王毅、张海、张翼翔、邹丽莎等同学在日常工作中的 协助与配合! 我们一起渡过三年难忘的美好时光，衷心祝愿你们身体健康，学业、事业有 最后，要特别感谢我的父母、亲人。在我多年的求学过程中，你们在物质和精神上给 予了我最无私的支持与帮助! 在此，谨以此篇献给所有关心、支持、帮助我的人! 张曦 二o 一三年一月于浙江大学启真湖畔 浙江大学硕士学位论文 摘要 近年来，随着我国工业化进程的迅速发展，土壤污染问题日趋严重。人们为了恢复污 染土壤的生态功能，采取了一系列方法对土壤进行修复，但在评价土壤污染状况、确定修 复方法和评估修复效果的过程中，如何选择合适的土壤污染评价指标成为关键。本论文主 要针对浙江省台州市电子垃圾拆解区多氯联苯污染农田土壤和富阳地区铜矿冶炼厂周边 重金属污染农田土壤，首先比较了两种常用土壤蛋白质提取方法，考察其用于后续研究的 可行性；然后结合传统生物学手段( 酶活性和微生物生物量碳) 和现代分子生物学分析技 术( 基因组学和蛋白质组学) 等方法，研究上述污染土壤中生物指标的变化。通过和常规 生物评价指标相比，考察土壤蛋白质在污染土壤评价中应用的可行性，初步揭示污染物胁 迫下微生物群落多样性和土壤蛋白质的变化规律，以期为蛋白质在实际污染土壤评价中的 应用提供理论依据。主要结论如下： ( 1 ) 柠檬酸s d s 分步提取法相对于n a o h 提取法能够有效去除土壤中有机质同时获 得大量蛋白质样品，是相对高效的土壤蛋白质提取方法。 ( 2 ) 酸性磷酸酶、蛋白酶和多酚氧化酶在p c b s 污染土壤中的活性显著升高( p 0 0 5 ) ， 且多酚氧化酶活性与p c b s 浓度之间呈显著正相关( p 0 0 5 ) ；土壤蛋白质在p c b s 胁迫下 则显著减少( p 0 0 5 ) ，- 9p c b s 浓度之间呈显著负相关( p 0 0 1 ) ，且随着p c b s 浓度升高， 土壤中大分子蛋白质逐渐减少，出现大量小分子蛋白质。与多酚氧化酶相比，蛋白质与 p c b s 浓度之间关系更紧密，更适合作为土壤p c b s 污染的指示物。 ( 3 ) 土壤酸性磷酸酶和脱氢酶活性在重金属胁迫下受到抑制而其中脱氢酶对重金属 更加敏感，且脱氢酶活性与c u 、z n 和p b 含量之间呈显著负相关( p 0 0 5 ) ；土壤微生物 生物量碳和蛋白质含量与c u 、z n 、p b 和c d 含量之间呈显著负相关( p 0 0 5 ) ，且蛋白质 在重金属轻微污染时便大幅减少。后续通过使用p c r d g g e 和s d s p a g e 等分子生物学 手段分析发现，重金属胁迫下土壤细菌和放线菌群落结构变化明显，随着重金属含量增加， 细菌和放线菌的s h a n n o n 指数逐渐降低，且土壤中低分子量蛋白质大量表达。通过比较酸 性磷酸酶、脱氢酶、微生物量和蛋白质对重金属的响应，蛋白质更适合作为土壤重金属污 染的指示物。 关键词：土壤；重金属；多氯联苯；酶；微生物生物量；蛋白质；微生物群落结构 i i 浙江大学硕士学位论文 浙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t w i t ht h ed e v e l o p m e n to fi n d u s t r i e si nc h i n a ，t h ei s s u eo fs o i l p o l l u t i o ni sb e c o m i n g i n c r e a s i n g l y s e r i o u sa n ds o m em e a s u r e m e n t sh a v eb e e nt a k e nt or e c o v e rt h e e c o l o g i c a l f u n c t i o n so fc o n t a m i n a t e ds o i l t h e r ei sa nu r g e n tn e e dt os e l e c ta na p p r o p r i a t ei n d i c a t o ri nt h e p r o c e s so fa s s e s s i n gs o i lp o l l u t i o n ，c h o o s i n gr e m e d i a t i o nm e t h o d s ，a n de v a l u a t i n gt h ee f f e c to f r e m e d i a t i o n c o n s e q u e n t l y , w ec h o s es o i lc o n t a m i n a t e db yp o l y c h l o r i n a t e db i p h e n y l s ( p c b s ) a n dh e a v ym e t a l sa ss t u d yo b j e c t st oe x p l o r et h ec h a n g e so fs o i lb i o l o g i c a li n d i c a t o r su n d e r p o l l u t a n t ss t r e s s f i r s t l yw ec o m p a r e dt w os o i lp r o t e i ne x t r a c tm e t h o d st h a tw e r eu s e dm o s tt o i n v e s t i g a t et h e i re x t r a c te f f i c i e n c yf o rf o l l o w i n gr e s e a r c h e s c o m p a r i n gw i t hs o m ec o n v e n t i o n a l b i o l o g i c a li n d i c a t o r sb yc o m b i n i n gt r a d i t i o n a lb i o l o g i c a lt e c h n o l o g y ( e g e n z y m e sa c t i v i t y ， m i c r o b i a lb i o m a s s c a r b o n ，e t c ) a n dm o d e mm o l e c u l a rb i o t e c h n o l o g y ( e g g e n o m i c s ， p r o t e o m i c s ，e t c ) ，t h ep o t e n t i a lo fs o i lp r o t e i na sa ni n d i c a t o rf o rs o i lp o l l u t i o nw a sd i s c u s s e d i n o r d e rt op r o v i d et h e o r e t i c a lb a s i sf o ru s i n gp r o t e i na sa ni n d i c a t o rf o rn a t u r a ls o i lc o n t a m i n a t i o n ， w ed i ds o m ep r e l i m i n a r yw o r ka b o u tt h ev a r i a t i o n so fm i c r o b i a lc o m m u n i t ys t r u c t u r ea n ds o i l p r o t e i nu n d e rc o n t a m i n a n ts t r e s s 1 1 1 em a i nc o n c l u s i o n sa r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) c o m p a r e dw i t hn a o he x t r a c t i o n ，c i t r a t e s d se x t r a c t i o nc a nr e m o v es o i lo r g a n i c m a t t e re f f e c t i v e l ya n do b t a i nm o r es o i lp r o t e i n t h ec i t r a t e s d se x t r a c t i o ni sar e l a t i v eh i g h e f f i c i e n c ye x t r a c tm e t h o df o rs o i lp r o t e i n ( 2 ) a c i dp h o s p h a t a s e ，p r o t e a s e ，a n dp o l y p h e n o lo x i d a s ea c t i v i t yi n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y 6 0 0 0 5 ) i ns o i lc o n t a m i n a t e db yp c b s f u r t h e r m o r e ，t h ep o l y p h e n o lo x i d a s ea c t i v i t yw a s s i g n i f i c a n t l yp o s i t i v e l yc o r r e l a t e dp 0 0 5 ) w i t hp c b sc o n c e n t r a t i o n o nt h ec o n t r a s t ，t h e c o n t e n to fs o i lp r o t e i nw a ss i g n i f i c a n t l yn e g a t i v e l yc o r r e l a t e dp 0 0 1 ) w i t hp c b sc o n c e n t r a t i o n t h ep r o t e i nw a ss e p a r a t e db ys d s - p a g es h o w e dt h a tw i t hp c b sc o n c e n t r a t i o ni n c r e a s i n g ， t h e r ew e r el e s sl a r g em o l e c u l a rw e i g h tp r o t e i n sa n dm o r el o wm o l e c u l a rw e i g h tp r o t e i n s c o m p a r e dw i t hp o l y p h e n o lo x i d a s e ，t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e np r o t e i na n dp c b sw a sm o r e c l o s e l y t h e r e f o r e ，i ti sm o r er e l i a b l et ob ea na s s e s s m e n ti n d i c a t o rf o rs o i lc o n t a m i n a t e db y p c b s ( 3 ) s o i la c i dp h o s p h a t a s ea n dd e h y d r o g e n a s ew e r ei n h i b i t e db yh e a v ym e t a l s ，t h e d e h y d r o g e n a s ew a s m o r es e n s i t i v et oh e a v ym e t a l s d e h y d r o g e n a s ew a ss i g n i f i c a n t l yn e g a t i v e l y c o r r e l a t e dp o 0 5 ) w i t hc u ，z na n dp b s i m i l a r l y ，s o i lm i c r o b i a lb i o m a s sc a r b o n ( m b c ) a n d s o i lp r o t e i nw e r es i g n i f i c a n t l yn e g a t i v e l yc o r r e l a t e d6 0 0 0 5 ) w i t hc u ，z n ，p ba n dc d m o r e o v e r ， s o i lp r o t e i nd e c r e a s e ds h a r p l yo n c et h es o i ls l i g h t l yc o n t a m i n a t e db yh e a v ym e t a l s s u b s e q u e n t l y ， i i i 浙江大学硕士学位论文 t h ev a r i a t i o n so fs o i lb a c t e r i aa n da c t i n o m y c e t ec o m m u n i t ys t r u c t u r e sw e r es t u d i e db ym o d e m m o l e c u l a rb i o l o g i c a lm e t h o d s ( e g s d s - p a g e ，p c r - d g g e ，e t c ) t h em i c r o b i a lc o m m u n i t y s t r u c l 吡i e sc h a n g e ds i g n i f i c a n t l yu n d e rh e a v ym e t a l ss t r e s s w i t ht h ei n c r e a s eo fh e a v ym e t a l s c o n c e n t r a t i o n ，t h es h a n n o ni n d e xd e c r e a s e da n dt h e r ew e r em o r el o wm o l e c u l a rw e i g h tp r o t e i n s i ns o i l c o m p a r e dw i t ht h er e s p o n s e so fa c i dp h o s p h a t a s e ，d e h y d r o g e n a s e ，m b ca n dp r o t e i nt o h e a v ym e t a l s ，p r o t e i ni sm o r es u i t a b l et ob ea ni n d i c a t o rf o rs o i lp o l l u t e db yh e a v ym e t a l s k e yw o r d s ：s o i l ，h e a v ym e t a l s ，p o l y c h l o r i n a t e db i p h e n y l s ( p c b s ) ，e n z y m e ，m i c r o b i a lb i o m a s s ， p r o t e i n ，m i c r o b i a lc o m m u n i t ys t r u c t u r e i v 浙江大学硕士学位论文 目录 摘要。i a b s t r a c t i i i l 文献综述1 1 1 弓ij 言1 1 2土壤环境质量的生物学评价指标1 1 2 1 土壤酶活性2 1 2 2 生物标记物3 1 2 3 土壤微生物生物量4 1 2 4 土壤微生物群落组成5 1 3蛋白质作为土壤污染评价指标的潜在优势6 1 4 土壤蛋白质提取方法7 1 4 1 影响土壤蛋白质提取效果的因素7 1 4 2 几种土壤蛋白质提取方法8 1 5 土壤蛋白质的分离与鉴定11 1 5 1 蛋白质的分离11 1 5 2 蛋白质的鉴定1 1 1 6 蛋白质在土壤污染评价中的应用1 2 1 7 立题依据、研究内容及技术路线1 2 1 7 1 立题依据1 2 1 7 2 研究目标1 4 1 7 3 研究内容1 4 1 7 4 技术路线1 5 2 材料与方法1 7 2 1土壤样品采集与基本理化性质分析1 7 2 1 1 土壤样品采集1 7 2 1 2p h 值测定1 7 2 1 3 有机质含量测定1 7 2 2 土壤污染物含量测定1 7 2 2 1 多氯联苯( p c b s ) 含量测定一1 7 2 2 2 重金属含量测定1 8 2 2 3 重金属生物可给态含量测定1 9 2 3 土壤蛋白质提取方法1 9 2 3 1 氢氧化钠提取法1 9 2 3 2 柠檬酸十二烷基硫酸钠( s d s ) 分步提取法2 0 2 4 土壤蛋白质定量与分离2 0 2 4 1 蛋白质含量测定2 0 2 4 2 蛋白质分离2 0 1 浙江大学硕士学位论文 2 4 3 银染显色2 1 2 5 土壤微生物群落结构分析。2 1 2 5 1 土壤d n a 提取2 1 2 5 2 聚合酶链式反应( p c r 扩增) 。2 1 2 5 3 变性梯度凝胶电泳( d g g e ) 2 3 2 5 4 d g g e 图谱分析2 3 2 6 土壤微生物生物量碳测定2 3 2 7 土壤酶活性测定2 4 2 7 1 蛋白酶活性测定2 4 2 7 2 酸性磷酸酶活性测定2 4 2 7 3 多酚氧化酶活性测定2 5 2 7 4 脱氢酶活性测定2 5 2 8 数据统计与分析2 5 3 结果与讨论2 7 3 1土壤蛋白质提取方法比较2 7 3 2 土壤酶活性和蛋白质作为p c b s 污染土壤评价指标的可行性分析2 8 3 2 1 土壤基本理化性质及p c b s 含量分析2 8 3 2 2p c b s 对土壤酶的影响2 9 3 2 3p c b s 对土壤蛋白质的影响3 0 3 3 用于重金属污染土壤评价的微生物指标比较研究一3 2 3 3 1 土壤基本理化性质、重金属总量及生物有效态含量分析3 2 3 3 2 重金属对土壤酶的影响3 5 3 3 3 重金属对土壤微生物生物量碳的影响3 7 3 3 4 重金属胁迫下土壤微生物多样性的变化规律3 9 3 3 5 土壤蛋白质在重金属胁迫下的变化规律4 4 4 全文研究结论与展望。4 7 4 1主要研究结论4 7 4 2 研究特色、创新点与不足4 7 4 3 研究展望4 8 参考文献5 1 作者简介5 7 2 1 文献综述 1 文献综述 1 1引言 土壤是环境的重要组成部分，通过各种途径进入环境的污染物质，大约9 0 承载于土 壤中 1 1 。土壤环境依靠自身的组成和性能，对进入土壤的污染物有一定的缓冲、净化能力， 但当进入土壤的污染物质量和速率超过土壤能够承受的容量和净化速率时，就破坏了土壤 环境的自然动态平衡，使得污染物质逐渐积累，引起土壤的组成、结构和性状改变，功能 失调，质量下降，导致土壤污染。土壤污染不仅使其肥力降低，还可能成为二次污染源， 污染水体、大气和生物，进而通过食物链危害人体健康【2 1 。土壤中污染物种类繁多，但以 化学污染物最为普遍和严重。主要污染物有重金属( 如h g 、c d 、p b 、c r 、c u 、z n 等) 、 类金属( 如a s 、s e 等) 、硫化物、氟化物、放射性元素( 如1 3 7 c s 、9 0 s r 等) 、有机污染 物( 如多环芳烃、多氯联苯、氰化物等) 、农药与病原菌【2 ，3 1 。随着我国工业化进程的迅 速发展，土壤污染问题日趋严重。全国受各种有机污染或化学品污染的农田达60 0 0 万h m 2 ， 受重金属污染的耕地约25 0 0 万h m 2 。其中农药污染面积约16 0 0 万b m 2 ，主要农产品农药 残留超标率高达1 6 2 0 ；而每年被重金属污染的粮食则多达12 0 0 万t 【4 1 。 土壤环境质量是土壤维持生产力、环境净化能力以及保障动植物健康能力的集中体 现，而土壤环境质量评价是土壤环境质量研究的基础和重要内容之一。土壤环境是否受到 了人为污染，其污染程度如何，需要采用灵敏而有效的方法予以评估。在确定土壤环境确 实已经受到污染后，要判断是否需要立即进行修复以及采用何种方法进行修复，也需要通 过对污染土壤进行诊断来回答。污染土壤经过修复后，是否达到预期目标或者修复标准， 仍然需要通过修复现场的土壤诊断加以判断。 土壤环境多介质、多界面、多组分以及非均一性和复杂多变的特点，使得土壤环境污 染具有区别于大气环境和水环境污染不同的特点。土壤环境污染具有隐蔽性与滞后性、积 累性与地域性、不可逆转性以及治理难而周期长的特征。基于土壤污染特点，选择合适的 评价指标成为土壤环境质量评价过程中的关键。 1 2 土壤环境质量的生物学评价指标 作为土壤污染评价的指标应该具备以下三个特征 5 】，首先是要对所有能引起土壤质量 变化的因素敏感，其次要对特定污染物质的影响有一致的变化，最后要能够反映土壤污染 的程度。 用于评价土壤污染的指标主要包括物理、化学和生物三个方面。尽管理化指标在土壤 浙江大学硕士学位论文 评估过程中具有重要作用，但其只有在土壤受到严重污染时才会响应【6 1 。而土壤生物学 特征在土壤稍微受到污染物胁迫时便会发生变似8 ，9 1 ，因此对土壤质量的变化更敏感。目 前用于土壤污染评价的生物学指标主要有土壤微生物量、微生物群落组成、土壤微生物生 物量碳、潜在可矿化氮、土壤呼吸强度、微生物代谢熵和土壤酶等【7 ，1 0 。其中土壤酶和土 壤微生物参数是最早也是应用最多的用于反映土壤质量的生物学指标，1 2 】。 1 2 1 土壤酶活性 土壤酶是由微生物、动植物活体分泌及由动植物残体、遗骸分解释放于土壤中的一类 具有催化能力的生物活性物质，参与包括土壤中的生物化学过程在内的自然界物质循环， 是土壤的组成成分之一。根据作用原理具体可以分为水解酶类、氧化还原酶类、转移酶类、 裂合酶类四大类。k a n d e l e r 等指出土壤微生物的组成结构往往决定土壤酶的合成，环境因 子变化所引起的土壤微生物群落的改变会在土壤酶活性上得到体现，此外土壤酶活性还具 有测定简单、廉价和快速等优剧1 3 - 1 6 。因此，通过分析土壤中酶活性状况及其变化可以在 很大程度上对土壤环境质量进行评价。常用的土壤酶活性指标主要包括蛋白酶、脱氢酶、 过氧化氢酶、磷酸酶、蔗糖酶等。 周礼恺等【1 7 1 将土壤酶活性用于重金属污染土壤的环境质量评价，证明脲酶活性对h g 、 c d 、p b - z 种重金属的抑制作用恢复得较少较慢，可作为h g 、c d 和p b 污染程度的指示指标。 罗虹等1 8 1 研究了重金属c u 、c d 、n i 复合污染对土壤酶活性的影响，指出脲酶和脱氢酶活 性可作为指示土壤c u 、c d 、n i 复合污染程度的主要预警指标。黄峥等【1 9 1 分别研究了铜离 子与铜镉离子复合污染对稻田土壤酶活性的影响，建议综合使用脲酶和磷酸酶活性作为评 价和预测稻田土壤铜镉污染的生物学指标。沈国清等【2 0 】则将酶活性应用于重金属和多环芳 烃复合污染土壤的环境质量评价中，研究表明脱氢酶活性是表征复合污染的一项重要参考 指标。宫璇等【2 1 ，2 2 1 分别研究了芘和菲对土壤酶活性的影响，结果表明土壤脲酶、脱氢酶、 磷酸酶活性可以作为芘和菲污染土壤的生态毒理指标。大量案例表明土壤酶活性指标能够 在很大程度上反映土壤环境质量。 尽管酶活性具有诸多优点，但也有文献指出土壤环境的复杂性及污染物类型会影响酶 活性对污染物质的响应 1 5 , 2 3 - 2 6 】。例如土壤脱氢酶只有在活细胞内才会表现出活性，因此被 用来直接表征土壤微生物活性 2 7 1 ，但是脱氢酶的活性与土壤类型、污染物类型和浓度密切 相关【1 5 2 4 1 。p i c h t e l 和h a y e s 2 8 1 以及m c c a i t h y 等 2 5 1 研究指出在粉煤灰污染下酸性土壤中脱氢 酶活性降低，n k a n n a n 和o b l i s a m i 2 9 研究表明被造纸废水污染的碱性土壤中脱氢酶活性显 著升高。b a m a h 和m i s h r a t 2 3 1 研究表明低浓度除草剂会激活土壤脱氢酶，使其活性显著升高。 2 1 文献综述 一些水解酶也表现出与脱氢酶类似的环境行为【1 3 ，2 6 1 ，因此，单一的土壤酶活性在很多情况 下不能真实地反应污染物对土壤的影响，需要结合多种酶活性或者其他生物指标综合评价 土壤污染状况，而酶活性是否能作为可靠的土壤质量评价指标也有待进一步研究。 1 2 2 生物标记物 生物标记物是通过测量体液、组织或整个生物体能够表征对一种或多种化学污染物暴 露和( 或) 其效应的生化、细胞、生理、行为或能量上的变化，是衡量环境污染物暴露及 效应的生物反应。生物标记物根据不同的功能可分为两大类，第一类是指示生物对污染的 暴露反应，如指示对重金属暴露的键联金属蛋白质( 金属硫蛋白，m e t a l l o t h i o n e i n s ，m t s ) 。 虽然此类标记物不能指示污染物的毒性效应，但是有助于研究生物对化学分析方法难以检 测到的环境不稳定化合物的暴露。第二类是指示污染物对生物体的健康状况的损害效应， 如d n a 损伤。这类标记物在揭示污染物毒性效应的分子机理方面具有重要作用4 ，3 0 1 。 生物标记物的特征表现在特异性、广泛性和预警性三个方面。特异性即对特定的有机 污染物或重金属的暴露，有特定的生物标记物。广泛性是指从微观分子到宏观生态系统， 生物标记物在各个不同生物组织上体现着污染物和生物之间的因果作用关系。预警性是指 污染物与生物体之间所有的相互作用都始于分子水平，生物标记物的产生是对污染物暴露 的早期反) 立1 4 , 3 0 , 3 1 。 与其他方法相比生物标记物主要有以下优点：( 1 ) 了解污染物的生物有效性在时间 与空间的积累效应；( 2 ) 确定污染物与暴露风险的对应关系，从机理上了解污染物对生 物体的危害；( 3 ) 可应用于不同生境或不同营养级的生物，揭示不同的污染途径； ( 4 ) 可以部分避免实验室数据外推至野外条件下引起的毒性波动与变化；( 5 ) 能同时指示母 体污染物与代谢产物的暴露与毒性效应；( 6 ) 表现混合污染的毒性相互作用关系； ( 7 ) 若将不同层次生物的系列测定综合，通过标记物的短期变化可以预测污染物的长期生态效 应【3 2 】。 细胞色素p 4 5 0 、金属硫蛋白( m t s ) 和d n a j j 口合物是三种典型的生物标记物。细胞色 素p 4 5 0 是一种微粒体单加氧酶，在多种外源有机污染物的生物转化第一阶段起重要作用。 例如在哺乳动物体i 勾p 4 5 0 是由外源污染物键联芳烃受体诱导而来，这种产生机制是使p 4 5 0 成为有机污染生物标记物的依据 3 0 , 3 3 。金属硫蛋白( m t s ) 是相对分子量较低、富含半胱 氨酸的蛋白质，绝大多数动物体内都存在金属硫蛋白，金属硫蛋白可以作为金属暴露的生 物标记物。一些有机污染物经过代谢产生亲电子产物，与核酸和蛋白质结合，形成共价化 合物。d n a j j 口合物的形成是生物体对异质生物质的吸收、代谢和大分子修复等诸多过程作 3 浙江大学硕士学位论文 用的综合结果，它的产生常导致突变和肿瘤形成，是化学癌变的初级阶段。d n a 加合物适 合作为有机污染物暴露和损伤效应的生物标记物【4 】。 尽管生物标记物在污染物生态毒性研究中有重要意义，但其也存在诸多不足。主要表 现在三个方面：( 1 ) 生物标记物的测定比较困难、费用较高；( 2 ) 有些生物标记物的特 性不够明显；( 3 ) 部分生物标记物在指示实际环境条件下的暴露和效应时，灵敏度欠佳。 因此，生物标记物只是污染物毒性综合诊断的一个有效组分雨不是一种万能的方法。寻找 更具敏感和特异性的生物标记物，研究更加简便的测定方法成为今后研究的重点3 2 ，3 4 1 。 1 2 3 土壤微生物生物量 土壤微生物是土壤生态系统的基本组分，几乎参与土壤中的一切生物及生物化学反 应，在土壤功能及土壤过程中具有直接或间接的重要作用。由于土壤微生物的比表面积远 远大于动物和植物，可与环境因子充分作用，因此与植物或动物群落相比，土壤微生物对 环境改变和胁迫的反应更敏感】。目前，将微生物学指标用于土壤环境质量评价成为研究 的热点。研究表明，微生物生物量和微生物群落结构等微生物学参数对人为活动、外源污 染物等外界条件的反应非常敏感。污染物进入土壤后，会导致微生物生物量和微生物呼吸 速率的不寻常变化和微生物群落结构组成和功能多样性的改变 3 6 1 。 土壤微生物生物量( 简称土壤微生物量，m i c r o b i a lb i o m a s s ，m b ) ，是指土壤中体积 小于50 0 0j x r n 3 的生物总量，是土壤有机质的活性部分，但不包括活的植物体( 如植物根系 等) 。广义的土壤微生物量应包括微生物量碳( m b c ) 、微生物量氮( m b n ) 、微生物 量磷( m b p ) 和微生物量硫( m b s ) 。土壤微生物量是土壤养分的储存库和植物生长可利 用养分的重要来源，反映了土壤同化和矿化能力，是土壤活性强弱的标志。土壤微生物量 的大小与土壤中有机质含量以及土壤理化性质密切相关。与微生物个体数量指标相比，土 壤微生物量对环境变化更加敏感，是土壤生态系统变化的预警及敏感指标，亦能较早指示 生态系统功能的变化，因此土壤微生物量已成为近年来土壤学研究的热点之一【3 7 - 4 0 1 。 l e i t a 等【4 1 】研究了p b 、z n 和t 1 对土壤微生物量碳的影响，结果表明z n 和t 1 能够显著降低 微生物量碳，而p b 对其则没有显著影响。v i s q u e z m u r r i e t a 等 4 2 】的研究表明土壤微生物量 与重金属a s 、p b 和c u 总量呈显著负相关，k o n o p k a 等【4 3 】指出随着土壤中p b 浓度的增加微生 物量会显著减少，m o r a 等【删研究发现微生物量碳与土壤可溶性c u 、c d 、z n 呈负相关。 a o y a m a 等【4 5 】研究表明微生物量会随着土壤c u 含量的增减而降低，特别是与c u 的c a c l 2 提取 态呈显著负相关。k n i g h t 等【4 6 】分别探讨了p h 和重金属c d 、c u 、z n 对微生物量碳的影响， 结果表明随着土壤p h 值降低，c u 会显著降低微生物量碳，而c d 和z n 对其没有显著影响。 4 1 文献综述 与重金属污染对微生物量的影响不同，j o e r g e n s e n 等 4 7 1 研究发现燃油污染土壤中的微生物 量碳会显著增加。 虽然目前采用土壤微生物量作为污染评价指标的研究很多，但其也具有局限性，即某 些环境条件下( 如土壤遭受轻微重金属污染) 微生物量没有发生明显变化，而土壤中的微 生物群落结构却发生了显著改变【4 6 】，进而影响土壤环境的物质循环和生态功能。其原因在 于污染土壤中出现的耐受菌株以及微生物群落结构的改变会弥补因敏感菌株在污染物胁 迫下死亡而造成的微生物量减少 4 8 1 。f r o s t e g a r d 等 4 9 】的研究也证明了这一点，其在研究中 发现土壤重金属在降低微生物量的同时也会改变微生物的群落结构。因此，微生物量在作 为土壤污染评价指标方面还需要深入研究。 1 2 4 土壤微生物群落组成 随着科学技术的进步，微生物学指标研究方法也越来越丰富。较早的研究主要是采用 测定土壤微生物生物量、土壤呼吸强度、可培养微生物区系以及碳素利用法( b i o l o g ：测试 系统) 等方法来进行，这些方法的缺点是只能提供群落的功能、活性以及可培养微生物的 数量等信息，而不能揭示群落的遗传结构多样性。因此，定量描述土壤微生物的多样性特 别是其在土壤环境中行使的功能成为目前研究的热点，同时也是难点。因为大多数土壤微 生物( 约有8 0 - 9 9 ) 不能够通过传统培养方法鉴别，常规生化指标( 如土壤酶) 也不能 直接反映土壤中实际的微生物状况【1 1 ，3 5 ，5 0 ，5 1 1 。然而，随着基因组学、转录组学和蛋白质组 学的蓬勃发展，一些基于土壤核酸和蛋白质的新方法为解决这一问题提供了新的可能与方 案。 分子生物学研究方法主要流程是从土壤中有效提取微生物的d n a 或r n a ，经过纯化 后结合聚合酶链式反应( p c r 扩增) 、分子克隆等分子生物技术进行分析。分子生物技术 方法可以克服传统培养法造成的信息大量丢失的缺点，能够更全面更客观的对样品进行分 析，更精确地揭示土壤微生物种类和遗传多样性。目前应用较广的方法主要包括随机扩增 多态性d n a 标记( r a p d ) 、限制性内切酶片段长度多态性技术( r f l p ) 、扩增片段长 度多态性技术( a f l p ) 、p c r 单链构象多态性检测( p c r s s c p ) 、p c r 变性梯度凝胶 电泳( p c