（环境工程专业论文）荧光原位杂交技术检测反应器中微生物实验条件优化的研究.pdf

苏州科技院硕卜学伊论文摘嘤 摘要 本研究利用荧光原位杂交( f l u o r e s c e n ti n s i t uh y b r i d i z a t i o n ，f i s h ) 法检测反应器中 的目标菌群：如聚磷菌，硝化细菌等：确定实验操作步骤和较好的检测条件并用f i s h 法对厌氧氨氧化菌进行摸索性实验。经过对影响杂交试验结果的几个主要因素的研究 比较，初步优化了检测条件，得出以下结论： 1 聚磷菌液较好的预处理条件和杂交条件为： ( 1 ) 样品在抹片前应先经过l 倍磷酸盐缓冲液离心清洗两次。 ( 2 ) f i s h 法检测反应器样本中聚磷菌的实验条件：杂交温度4 6 ，杂交时f 白1 2 h ， 洗脱液中n a c l 浓度7 0 m m o l l 。 2 检测生物膜中硝化细菌时，较好的预处理条件和杂交条件为： ( 1 ) 样品在热固定前不需l x p b s 清洗。 ( 2 ) 检测生物膜中硝化细菌的实验条件： 硝酸细菌：杂交温度4 6 c ，杂交时i n j 5 h ，洗脱液中n a c i 浓度5 5 m m o l l 。 亚硝酸细菌：杂交温度4 6 ，杂交时间3 h ，洗脱液中n a c i 浓3 0 - - 4 0 m m o l l 。 3 对厌氧氨氧化细菌检测的初步优化条件： ( 1 ) 切片后经由5 0 、8 0 、9 9 三级脱水步骤可获得较好效果。 ( 2 ) 黏附液中明胶与硫酸钾铬配比为1 0 ：1 。 ( 3 ) 包埋时液体石蜡与污泥的配比为l ：1 0 。 关键词：荧光原位杂交，聚磷菌，硝化细菌，厌氧氨氧化菌，杂交优化 苏州科技。? 院硕十伊论文 a b s t r a c t a b s t r a c t f l u o r e s c e n ti ns i t uh y b r i d i z a t i o n ( f i s h ) i su s e dt oi n v e s t i g a t et h et a r g e ts p e c i e ss u c h a s p h o s p h a t ea c c u m u l a t i n gb a c t e r i a ，n i t r i f y i n gb a c t e r i a i nt h er e a c t o r t h ee x p e r i m e n t a l s t e p sa n db e t t e rc o n d i t i o n so fd e t e c t i o na r es e tu p ，t h eg r o p i n ge x p e r i m e n to fa n a m m o x b a c t e r i ai sd o n e b yf i s h b yc o m p a r i n g s o m e i m p o r t a n tf a c t o r s t h a ta f f e c tt h e h y b r i d i z a t i o nt e s t s ，f o l l o w i n gr e s u l t sa r es h o w n ： 1 o p t i m i z e dp r e t r e a t m e n t a n dh y b r i d i z a t i o nc o n d i t i o n so fd e t e c t i n gp h o s p h a t e a c c u m u l a t i n gb a c t e r i aa r ea sf o l l o w s ( 1 ) t h es a m p l em u s tb ew a s h e dt w i c eb y1x p b s ( 2 ) f i s hc o n d i t i o n sf o rd e t e c t i n gp h o s p h a t ea c c u m u l a t i n gb a c t e r i ai nt h er e a c t o ra r e ： t e m p e r a t u r ei s4 6 ( 2 ，h y b r i d i z a t i o nt i m ei s2 h ，s o d i u mc h l o r i d ec o n c e n t r a t i o ni nt h e e l u a t e i s7 0 m m o l l 2 o p t i m i z e dp r e t r e a t m e n t a n dh y b r i d i z a t i o nc o n d i t i o n so fd e t e c t i n gn i t r i 聊n g b a c t e r i ao ns l i d eo ft h ea t t a c h e db i o f i l ma r ea sf o l l o w s ( 1 ) n os a m p l ew a s h i n gb e f o r ef i x i n g ( 2 ) f i s hc o n d i t i o n sf o rd e t e c t i n gn i t r i f y i n gb a c t e r i ao ns l i d eo f t h ea t t a c h e db i o f i l ma r e a sf o l l o w s o n i t r o b a c t e r ：t e m p e r a t u r e i s 4 6 * ( 2 ，h y b r i d i z a t i o nt i m e i s5 h ，s o d i u mc h l o r i d e c o n c e n t r a t i o ni nt h ee l u a t ei s5 5m m o 儿 ( 趸) n i t r o s o m o n a s ：t e m p e r a t u r ei s4 6 ( 2 ，h y b r i d i z a t i o nt i m e i s3 h ，s o d i u mc h l o r i d e c o n c e n t r a t i o ni nt h ee l u a t ei s3 0 - - 4 0m m o l l 3 i n i t i a lo p t i m a lc o n d i t i o n so fa n a m m o xa r ea sf o l l o w s ( 1 ) a f t e rs l i c e d ，i tm u s tb ed e h y d r a t e db ye t h a n o lo f 5 0 、8 0 、1 0 0 i no r d e rt og e t ab e t t e rr e s u l t ( 2 ) t h er a t i oo fg l u t i na n dp o t a s s i u ms u l f a t ed o d e c a h y d r a t ei nl i q u i da d h e s i o ni s ：10 ：1 ( 3 ) t h er a t i oo fl i q u i dp a r a f f i na n ds l u d g ew h e ne m b e d d i n gi s ：l ：10 k e w o r d s ：f l u o r e s c e n ti ns i t uh y b r i d i z a t i o n ( f i s h ) ，p o l y p h o s p h a t e a c c u m u l a t i n go r g a n i s m s ， n i t r o b a c t e r i a ，a n a m m o x ，h y b r i do p t i m i z a t i o n i i 苏州科技学院学位论文独创性声明和使用授权书 独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究 工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体， 均已在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 论文作者签名：兰埏起日期：迎年为二2 日 学位论文使用授权书 苏州科技学院、国家图书馆等国家有关部门或机构有权保留本人所送交论文的复 印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅。本人完全了解苏州科技学院关于收集、保 存、使用学位论文的规定，即：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学 校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以采用 影印、缩印、数字化或其他复制手段保存汇编学位论文：同意学校在不以赢利为目的 的前提下，用不同方式在不同媒体上公布论文的部分或全部内容。 ( 保密论文在解密后遵守此规定) 论文作者签名 指导教师签名 期：么旦年细旦日 期：如韶年，月 瓤 苏州科技院硕十学伊论文第章引言 第一章引言 1 1 前言 用活性污泥法处理污水是当今世界上最主要的污水处理工艺之一，并已有8 0 多年 的历史，但是关于活性污泥中起主要作用的微生物的群落结构与功能关系的知识仍非 常有限，这也是微生物生态学家一直非常感兴趣的问题。长久以来，自然环境中微生 物群落的多样性检测和动力学分析一直是建立在分离和培养的方法上，但此方法存在 许多缺点i lj ：1 非常耗时，需额外进行生理生化特性的鉴定，在实验室纯培养条件下 测定单个种的生理生化特性可能使表现型产生偏差；2 直接显微计数得到的细胞总数 与活皿计数法或最大数目法( m p n ) 得到的细胞总数间存在很大差异( 后两者分别 是前者的1 1 0 ) ，因为环境中大多数微生物是不可培养的：3 由此方法得出的结 果会引起微生物群落结构的组成在很大程度上发生偏移，从而导致检测优势细菌群落 成员的失败。因此试图用直接的方法分析活性污泥中细菌群落结构的特性。最近l o 年 来，随着p c r 、核酸测序等现代分子生物技术的发展，快速准确地鉴定细菌成为可能。 在环境微生物学中，已经开始应用这些技术对各种生境中的群落生态演替规律、种群 数量波动等进行检测。其中荧光原位杂交( f l u o r e s c e n c ei ns i t uh y b r i d i z a t i o n ，f i s h ) 技 术是应用广泛、最为有效的技术之一【2 l 。 应用f i s h 技术对环境微生物群进行研究在一定程度上可以真实的反映出微生物 群落在颗粒污泥内部的组成【3 l 和空i 日j 分布情况【4 5 】，同时还可以原位分析其数量分布及 丰度1 6j 。因此，为了解活性污泥反应器中微生物群落组成，本文对目标菌群荧光原位 检测的实验方法和条件等进行摸索和优化，以期得到完整的实验步骤和较佳的实验结 果。 1 2 研究方向 1 反应器中目标菌群荧光原位杂交流程的建立和优化 ( 1 ) 目标菌群杂交流程的初步建立 ( 2 ) 聚磷菌、硝化细菌杂交参数测试 ( 3 ) f i s h 法检测厌氧氨氧化菌摸索性实验 苏州科技院硕十学伊论文菊：审文献同颐 2 i 反应器中微生物的检测 第二章文献回顾 微生物对整个生态系统都有着十分重要的影响，在自然界的物质循环中、在空气 与水的净化中、对工农业的生产、对生命科学的研究都有着突出的贡献。过去的几十 年中，在污水净化和污染水环境生物修复领域，已研发和应用了许多技术经济性能良 好的生物除磷、脱氮系统。然而对这些除磷、脱氮系统中微生物相的研究还很不够。 因此，了解和检测微生物的种类具有十分重要的意义。 检测反应器中微生物是微生物生态学研究的重要内容之一。其方法主要有以下几 种【7j ：显微镜检测。显微镜技术快速廉价，可以直接观察和大致分辨微生物，但是 由于缺乏形态学方面的指标而不易得到可靠的结果。微生物培养。培养的方法周期 长，不适用于难培养的微生物，而且不能反映环境中微生物群落组成和多样性。分 子生物学检测。最近几年，分子生物学技术开始被广泛应用于微生物群落结构分析， 且发展迅速，研究的焦点集中在具有保守序列的1 6 sr r n a 上。研究方法包括分子杂交 法、p c r 法、d g g e 法、t g g e 法、r f l p 法、e r i c p c r 法和克隆基因文库分析法等， 具有很高的灵敏性，与传统的检测方法或其它不依赖培养技术的方法相比显示出明显 的优越性，推动了微生物群落结构研究的快速发展。但是，这些基于p c r 的方法可能会 在扩增反应中引入误差，降低所得信息的精确度。作为一种不依赖p c r 的分子分析技 术，利用核酸探针的荧光原位杂交( f l u o r e s c e n ti ns i t uh y b r i d i z a t i o n ，f i s h ) 技术不但能探 讨微生物问的亲缘关系，还能观察菌相分布和测定细菌数量【8 l 。目前，f i s h 技术广 泛应用于微生物分子生态学和环境微生物学中，已成为微生物群落研究的重要技术手 段，对环境中复杂的混合微生物群落进行及时监控和准确鉴定也变得越来越重要，为污 染治理和防治提供了新的思路和方法。 2 2 常用的各种检测微生物技术 2 2 1p c r 扩增技术 1 聚合酶链式反应技术简介 聚合酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n m ，p c r ) ，由1 9 9 5 年获得诺贝尔化 学奖的美国科学家m u l i s 所发明1 9 1 。它其实是一种d n a 的快速扩增技术，其扩增效 率之高就象核裂变的“链式反应”那样。p c r 技术通过两个短的称为引物的d n a 小 片段和一种耐热的酶的作用，可以在3 个小时内把特定的d n a 量提高1 0 0 0 万倍。 这种技术一问世，立刻引起了分子生物学研究的一场革命，人们利用这种轰动全世界 的技术很快就把微观领域的生物学研究大大地往前推了一步。可以这么说，p c r 技 2 苏| f l i i 科技学院硕卜学伊论文菊：章文献同顾 术使分子生物学研究一下子获得了突破，而且随着p c r 技术的h 趋完善，p c r 在人 类社会生活中的应用也越来越广泛。比如说在“d n a 指纹”中我们提到，科学家们 只需要一根头发甚至一个细胞就可以完成d n a 指纹的鉴定工作，这罩实际上就要采 用p c r 技术，因为一个细胞中的d n a 含量实在太少了，人们根本不可能检n 至l j 它的 指纹；有了p c r 技术就好办了，通过p c r 技术把这个细胞中的d n a 片断扩增1 0 0 0 力倍，这样d n a 量就足够作指纹鉴定了。再比如，在医院罩检验血液中的某种病毒， 有时病毒量极少( 例如有的艾滋病病毒携带者) ，通过传统的检查方法费力又费时， 这时p c r 技术也许就可以帮上忙。可以先选定这种病毒d n a 上的一段d n a ，设计 合适的引物d n a ，然后通过p c r 技术扩增很快就可以判断出血样中是否扩增出了大 量的d n a ，如果是的话，那么就说明血样中带有该种病毒了。p c r 方法不但有极高 的灵敏度，而且可以同时一次做近百个扩增反应，省时省力效率高。 2 p c r 技术的特剧旧】 p c r 技术具有两个明显的特点，一是被扩增的d n a 所需量极小，理论上讲一个 分子就可以用于扩增了：二是扩增效率高，几个小时就扩增1 0 0 0 力倍以上。 3 p c r 技术的原理 类似于d n a 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引 物。p c r 由变性一退火一延伸三个基本反应步骤构成： ( 1 ) 模板d n a 的变性：模板d n a 经加热至9 6 左右一定时间后，使模板d n a 双链或经p c r 扩增形成的双链d n a 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下 轮反应作准备； ( 2 ) 模板d n a 与引物的退火( 复性) ：模板d n a 经加热变性成单链后，在温度降 至6 8 左右时，引物与模板d n a 单链的互补序列配对结合； ( 3 ) 引物的延伸：d n a 模板一引物结合物在t a q d n a 聚合酶的作用下，以d n t p 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 d n a 链互补的半保留复制链重复循环变性一退火一延伸三过程，就可获得更多的“半保 留复制链”，另附原理图一个： 3 苏州科技院硕 ：学伊论文第i 章文献同颐 ；：= = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = ；： y；苎 3 - ：3 。一，3 。 _ _ - - _ - _ _ _ _ - l i - - _ _ - _ - - - _ - ， ，。立弘荀3 r 。 | r 3 主重弘5 3 5 5 3 。 3 。5 ，3 3 5 5 3 。 3 。5 。 y l 3 。 3 。5 。 5 3 。 3 ，。 5 。3 3 。，。 5 3 。 ；： ；。 图2 1p c r 技术原理图 注：( 1 ) 9 6 c 高温下使双股d n a 打开( 2 ) 在约6 8 c f 让引子与d n a 配对( 3 ) 在7 2 cd n a 延长( p = 聚合酶) ( 4 ) 第一循环完成，做出的两段双股d n a 又可当作下一个循环模板，这样每次循环都使得扩增的d n a 片段加倍。 ( 4 ) p c r 扩增产物 p c r 扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格 地限定在两个引物链5 端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是 由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中， 以两条互补的d n a 为模板，引物是从3 端开始延伸，其57 端是固定的，3 端则没有固 定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结 合外，还要同新合成的链( 即“长产物片段”) 结合。引物在与新链结时，由于新链模板 的5 端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3 端被固定了止点，保证了新片段的 起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出 “短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以 忽略不计，这使得p c r 的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯d n a 片段供分 析】。 2 2 2d n a 测序法【1 2 】 1 d n a 测序法简介 4 苏州干? 技号1 境硕f 学伊论文 第：章文献同颐 常用的d n a 测序方法是自动荧光d n a 淤 序。先将d n a 的4 个碱基用f i 刚颜色的染 料着色，再将这些染料加在4 个脱氧核苷的终端，从而使所有的d n a 片断以染料标记的 终端结束。这些d n a 片断接着在聚丙烯酰胺凝胶上被分离，而荧光则被激光激发后得 到探测。d n a ；1 9 1 | 序与p c r 类似，采用高温使d n a 双链变性，引物被退火后得到延伸。这 一方法的优点在于它可以进行多轮测序反应而不需要加入新的酶，就像p c r 反应一样， 而且，只要使用标准质粒m i n i p r e p s 就能够得到足够的用于测序反应的d n a 。t a q d n a 多聚酶也是d n a 澳, j 序反应中常用的酶，它能使染料标记的d n a 终端分布更加均匀，具 有较高的测序准确度。d n a 测序中使用的模板主要是克隆载体干n p c r 扩增d n a 两种， 前者主要包括单链抗菌素载体、双链质粒载体、p h a g e m i d 载体( 含有单链抗菌素复制 源的双链质粒) 等：后者主要包括单链p c r 扩增产物和双链p c r 扩增产物。当模板是 p c r 扩增d n a 时，必须保证过量的引物在测序前得到清除，否则会影响测序结果。引物 的去除可通过很多方法实现，如从琼脂电泳切胶回收法，酚一氯仿一乙醇法以及商品化 的微柱纯化法等。d n a 沏f 序后一个重要的步骤就是序列的分析，只有经过准确和合理 的序列分析爿。能最终鉴定目标微生物。目前，可以进 t d n a 序列分析的工具很多，最常 用的有以下几种： 2 序列数据的获得 可以通过e n t r e z ( 由美国国家生物技术信息中心开发) ，s r s ( t h 欧洲生物信息学院 开发) ，d b g e t l i n k d b ( 由日本k y o t o 大学和东京大学人类基因组中心开发) 等网络数 据资源得到有关的序列信息。 3 数据库查询和序列的排列( a l i 鄹哪e n t ) 数据库查询的软件或网络资源较多，一般常用b l a s t 进行查询。对目标序列进行 查询的同时也能对序列进行初步的排列，为后面的系统发育分析提供基础。 4 系统发育分析( p h y l o g e n e t i ca n a l y s i s ) 系统发育分析是确定微生物在发育过程中种属关系的一种手段，其主要方法包括 直接创建方法( 基于距离评分方法) 、树查找方法( 检约法和最大可能性法) 等。 2 2 3 变性梯度明胶电泳【5 7 l 双股d n a 是由互补碱基问所形成的氢键而结合形成的，加入变性剂可将双股 d n a 问的氢键打断，造成变性。由于各种菌种l 日j 序列组合不同，相同浓度之变性剂 所造成的变性程度也会不同，因此在跑电泳时，d n a 序列穿过g e l l 拘难易度便有所差 别。d g g e 便是在g e li - _ 添加具浓度梯度的变性剂，使得相同长度但不同碱基的序列分 开。而将分离所得的d g g e 亮带配合f i s h 法加以分析便可获得族群组成。而此种需要 放大核酸数量的方法，由于它们需要破坏细胞以萃取核酸，因此经常无法提供细胞在 族群中的空间关系。 5 苏州科技学院硕 。学伊论文菊：章文献同顾 i nii i 曼 m m , 皇曼曼! 曼皇曼曼曼曼曼! 皇曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼皇曼曼曼曼皇曼量曼曼! 曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼皇曼! ! 皇! 皇 2 2 4 核酸杂交5 去( n u c l e i ca c i dh y b r i d i z a t i o n ) 1 核酸杂交法 核酸杂交法是指一段带有标记物的已知序列的核酸片段，与其互补的核酸序列杂 交，形成双链。此序列可由杂交过程及侦测标记物质是否存在，而判断样品中有无待 检测的核酸【l4 1 。 核酸杂交法最早可分为两种【b 】，一种为在溶液中进行杂交的液相杂交( s o l u t i o n h y b r i d i z a t i o n ) ，另一种为将生物样本固定于担体上的固相( i m m o b i l i z a t i o n ) 杂交。固相 杂交是将参加杂交反应的一条核酸先固定在固体支持物如硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、 乳胶颗粒、磁珠和微孔板上，而另一条反应核酸则游离在溶液中一即把核酸和探针核 酸分别位于固体支持物和溶液中。液相杂交所参加反应的两条核酸都游离在溶液中。 在过去的数十年中液相杂交时有应用，但杂交后很难将未杂交的核酸探针移除；与液 相杂交相比，固相杂交的优点主要体现在杂交反应后：固相反应后，未进行杂交的 游离片断很容易被漂洗去除；固体支持物上留下的杂交物容易检测：能有效防止 靶核酸的自我复制。因此，在实际应用中，固相杂交法远较液相杂交应用广泛。常用 的固相杂交法为菌落杂交法( c o l o n yh y b r i d i z a t i o n ) 和原位杂交法( 加s i t uh y b r i d i z a t i o n ) ， 二者的优点皆为无须萃取细菌细胞中核酸即可观察杂交讯号，但是原位杂交法却可以 更进一步地观察细菌细胞的外形及分布，成为目前观察环境中微生物所广泛使用的杂 交法【1 7 , 1 8 j 。 2 核酸探针 核酸探针按来源及性质划分可分为基因组d n a 探针、e d n a 探针、r n a 探针和人 工合成的寡核苷酸探针等几类【1 引。d n a 探针是最常用的核酸探针，长度在几百碱基 对以上的双链d n a 或单链d n a 探针。e d n a 探针是指互补于m r n a 的d n a 分子链。 e d n a 是由r n a 经一种名为反转录酶的d n a 聚合酶催化产生的，这种反转录酶能以 r n a 为模板，根据碱基配对原则，按照r n a 的核苷酸顺序合成d n a ( 其中u 与a 配对) 。 d n a 探针( 包括c d n a 探针) 主要优点是：这类探针多克隆在质粒载体中，可以无 限繁殖，取之不尽，制备方法简单；与r n a 探针相比，d n a 探针不易降解，一般 能有效抑匍 d n a 酶活性：d n a 探针的标记方式比较成熟，有多种方法可以选择。 r n a 探针是一类很有前途的核酸探针，由于r n a 是单链分子，所以它与靶核酸序列 的杂交效率极高。与其他探针相比，使用标记的r n a 探针进行杂交的优点有【l 8 】： r n a ：d n a 和r n a ：r n a 的杂交体 i , d n a ：d n a 杂交体更稳定，因而可使用更严 格的条件增加信噪比：单链r n a 探针不会发生自动退火，故所有r n a 探针都可用 于杂交：对于标记的r n a 探针而言，只有插入序列被转录，而质粒不被转录，因此， 增加了探针的特异性；杂交完成后，可利用r n a 酶除去为杂交的r n a 探针，从而 降低杂交反应的本底：探针不需要变性而直接可用于杂交。然而r n a 探针制作过程 6 苏州科技? 院硕十! 伊论文第：章文献同颐 i i 一 ；ii i ii| i i o 皇曼曼! 曼皇曼鼍 繁杂，且易受环境中存在的r n a 酶( r n a s e ) 破坏，故在操作上难度较高i 旧】。寡核苷酸 探针f 1 6 】是长度在1 8 3 0 个被标定的碱基聚合物【2 0 】。它具有以下一些独特优点：由 于是短链，序列复杂度低，相对分子质量小，所以，和等量靶位点完全杂交的时i b j 比 克隆探针短：寡核苷酸探针可识别靶序列内1 个碱基的变化，因为短探针中碱基的 错配能大幅降低杂交体的t m 值：一次可大量合成寡核苷酸探针，使得这种探针价 格低廉1 16 1 。 3 探针标汜物 探针的标记物可以分为放射性标记物和非放射性标记物两种【旧】。核酸探针发展早 期，多使用放射性同位素如3 2 p 、3 5 s 、3 h 、1 2 5 i 等来标记核酸探针，这是因为放射性同 位素的一些固有优点如灵敏度、特异性高及方法简易，配合放射自显影技术，使其成 为最具敏感度和分辨率的探针标记。因此，在相当长的时间内，放射性同位素被视为 探针的传统标记物且发挥着重要的作用，甚至在今天，在一些有条件的实验室，放射 性同位素标记核酸探针仍继续被使用。但是，放射性同位素也有明显的缺陷：半衰 期短，必须经常标记探针：费用高，需要进口试剂，价格高；检测时间长：用放 射自显影需要较长的曝光时间；放射性同位素对人体有害，实验室和环境易被污染， 放射性废物处理困难【1 6 1 4 】。非放射标记物的出现，使得核酸探针杂交法更容易操作。 常用的非放射性标记物有生物素( b i o t i n ) 、地高辛( d i g o x i g e n i n ，d i g ) 以及荧光素 ( f l u o r c h r o m e ) 等【2 0 1 。第一个被实际运用设计的非放射性标记物标记d n a 探针是生物 素。这种早期探针的标记方法是通过酶促聚合作用将生物素标记的脱氧核苷酸渗入到 d n a 中，这是一种常用的利用酶学标记方法渗入到d n a 中的生物素修饰核苷酸。地 高辛作为一种半抗原，其修饰核苷酸的方式与生物素相似，也是通过一个连接臂将地 高辛半抗原和核苷酸分子相连。目前地高辛的应用比生物素更广泛。荧光素标记核酸 探针已有商品化试剂盒，其灵敏性与地高辛和生物素相似。特别是在近期，随着染色 表2 1 探针的标记物1 8 1 7 苏”i 科技院硕 学伊论文 筇：章文献同颐 体荧光原位杂交技术的迅猛发展，使得荧光素标记探针的开发和发展也有了突飞猛进 的进步。下表列出了一些非放射性探针的标记分子。 2 3 各种微生物检测方法的优缺点 表2 2 各种微生物检测方法的优缺点 2 4 原位杂交( i ns i t uh y b r i d i z a t i o n ) 法 原位杂交技术是应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待检 测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合而形成杂交体，然后再应用与标记物相应 的检测系统，通过组织化学或免疫组织化学方法在被检测的核酸原位形成带颜色的杂 交信号，在显微镜或电子显微镜下进行细胞内定位。这一技术为研究单一细胞中d n a 和编码各种蛋白质、多肽的相应m r n a 的定位提供了手段，使从分子水平研究细胞内 基因表达及有关基因调控提供了有效的工具。可视为组织化学或免疫细胞化学中革命 性的进步。 8 耋些些些耋譬鎏土耋生鲨耋薹，；茎圣墼 ：些 图2 - 2 原为杂交法原理 2 4i 荧光原位杂交( f l u o r t ：s c e l i li ns i t uh y b r i d i z a t i o u ，f i s h ) 法 通过荧光标记的已知核苷酸序列的探针在细胞内和特异的互补核酸序列杂交，通 过荧光激发荧光信号来检测即荧光原位杂交法 2 1 i f i s h 技术具有以下优点 6 j = 1 f i s h 采用非放射性的生物素标记探针，不存在辐射型污染问题。 2 f i s h 法可以将整体微生物环境清晰的地呈像出来而不需要额外的抽提和扩增 等易引起偏差的步骤。因而，f i s h 法被广泛应用于环境微生物种群的结构形态研究。 3 用这一方法可以避免细菌的培养，清楚井方便地观察到样品中细菌的细胞数量 和空问位置，而且可以通过不同的寡核苷酸探针同时对不同类群的细菌在细胞水平上 进行原位的定性定量分析和空间位置识别。 4 该技术基于抗体、抗原鉴特异性识别与结合等特点，实验周期短、特异性好、 灵敏度高、定位准确，定位长度在l k b 的d n a 序列的灵敏度与放射性探针相当。 5 荧光探针经济稳定一次标记后可在2 年内使用，且只要具有荧光显微镜，一般 常规的实验室均可进行。 2 42 荧光原位杂交法简介 已有的微生物群落结构、功能、分布及其生态学等研究结果仅表明混合菌群具有 较高的生物多样性，但只有非常少的微生物被分离和鉴定。而只有了解微生物单一菌 株功能特性、混合菌群多样性咀及微生物结构的形成特性，才能提高对环境处理系统 的控制能力。因此，结合f i s h 技术用于环境微生物的研究，可用以研究环境微生物 9 苏州科技学院硕十学伊论文第。：章文献同颐 生态系统的组成、结构与功能，尤其是具有特殊分层结构、多样化代谢菌群共存与协 同偶合等特性的颗粒污泥，对于深层次了解环境微生物种群关系、群落结构与处理效 率的相关性。进一步提高废水处理效率具有重要的理论和实用意义。 2 4 3 荧光原位杂交法常用荧光素 表2 3 荧光原位杂交实验常用荧光素2 2 1 2 4 4 荧光原位杂交法常用探针 探针是能够与特定核苷酸序列发生特异性结合的、己知碱基序列的核酸片段。它 可以是长探针( 1 0 1 0 0 0 b p ) ，也可以是短核苷酸片段( 1 0 - - 一5 0 b p ) ，可以是从r n a 制备 的c d n a 探针，也可以是p c r 扩增产物或人工合成的寡核苷酸探针。探针既可以用放 射性核苷酸标记，也可以用非放射性分子标汜。核酸杂交试验并不要求探针与靶核酸 序列之间百分之百地互补。有限数目的非互补碱基对的存在是可以接受的1 2 3 j 。 目前f i s h 中使用的寡核苷酸探针主要依据1 6 sr r n a 分子的核苷酸序列来设计， 因为1 6 sr r n a 大量存在于细胞中，被包埋于核糖体中，不会发生横向基冈转移，具 有遗传稳定性，同时核苷酸数目比较适中【2 2 1 。f i s h 探针一般为长度在1 5 一 3 0 个碱基 的基因片段，易渗透到目标细胞或组织中。通常在寡核苷酸探针的5 通过共价键与简 单荧光染料相连【2 训。最近几年广泛应用寡核苷酸探针的f i s h 技术对特异微生物进行 了鉴定和定量分析，表2 4 中列举了一些微生物f i s h 杂交中应用的特异寡核苷酸探 针。 1 0 苏仆l 科技7 院硕 ? 学伊论文 菊：章文献同顾 表2 4f i s h 杂交中常用的寡核苷酸探针 2 4 5 荧光原位杂交法步骤和原理 荧光原位杂交的主要步骤可分为1 样本的制备、2 杂交、3 杂交后清洗和4 观 烈1 7 1 ，分别叙述如下。 1 样本的制备 样品的制备主要包括：( 1 ) 载玻片的处理：( 2 ) 组织细胞的取材和固定；( 3 ) 组织细胞 的涂片或切片的制备。 ( 1 ) 载玻片的处理 用于原位杂交的载玻片应用洗衣粉等彻底清洁，去除灰尘和油脂。当检测的靶核 酸足r n a 或使用r n a 探针时，最好使用酸洗过的载玻片。因为，原为杂交过程步骤 繁多，若载玻片处理不好，切片样品在杂交过程中可能会从载玻片上脱落下来。特别 是采用甲醛固定、石蜡包埋组织时更易发生。为避免切片脱落，可使用铬钒明胶、3 氨丙基三乙氧基硅烷( a p e s ) 丙酮溶液、多聚l 赖氨酸或v e c t a b o n d 黏附剂预先包被载 玻片，从而有助于组织、细胞与载玻片的牢固黏附。a p e s 处理对于甲醛固定的组织 效果最好，因为它可以使组织与载玻片发生共价结合。以下介绍载玻片处理的常规过 程。 载玻片的酸洗：所需试剂包括1 m o l lh c i 、d e p c 处理的水、9 5 乙醇。 操作如下： 载玻片浸泡在l m o l lh c i 溶液中3 0 m i n ( 室温) - - - , d e p c 水浸洗载玻片_ 9 5 乙醇 清洗载玻片_ 载玻片置于空气中自燃干燥一重复上述步骤一次。 载玻片的黏附剂处理有如下方法：i 载玻片的a p e s 预处理：将载玻片浸泡在 苏州科技学院硕 4 忙论文第：章文献同颐 a p e s 溶液中达1 0 s 一用丙酮清洗载玻片- d e p c 水冲洗载玻片_ 置于空气中自然干燥 _ 4 存放：i i 载玻片的多聚l 赖氨酸预处理：将酸洗过的载玻片浸泡在多聚l 赖氮酸 溶液中4 5 m i n ( 室温) - - * d e p c 水冲洗载玻片两次一载玻片置于空气中自然干燥一4 存放：i i i 载玻片铬钒明胶预处理：清洁载玻片浸泡于铬钒明胶溶液1 m i n 一载玻片置 于3 7 c 干燥机中2 3 h _ 室温下防尘存放：i v 载玻片的v e c t a b o n d 预处理：清洁载玻片 浸泡于丙酮5 m i n _ 载玻片置于v e c t a b o n d 稀释液5 m i n - - * d e p c 水洗涤载玻片5 m i n x 2 - 载玻片置于3 7 干燥机中2 一- 3 h - * 室温下防尘存放。 ( 2 ) 组织细胞的取材与固定 组织细胞的取材应尽可能保持新鲜。由于组织细胞离体后会很快发生自溶，组织 细胞内的核酸酶会降解靶核酸，所以新鲜组织或培养细胞应尽快加以固定( 一般要求 在3 0 m i n p 勺) 。 杂交前细胞样本固定的目的是为了增加核酸探针对细胞的穿透性、维持细胞形态 和结构、防止离体后的组织细胞发生自溶及避免组织细胞中的固有物质( 0 n 蛋白质、 多肽、核酸等) 形成不溶性沉淀等【r 7 1 。一般而言，f i s h 实验中固定剂的选择应符合以 下三个方面：保持细胞结构；最大可能地保持细胞内d n a 或r n a 的含量水平； 使探针易于进入组织细胞内。通常用于原位杂交的固定剂有两大类：沉淀固定剂和 交联固定剂。 沉淀固定剂有乙醇、乙醇与乙酸混合物( 3 ：1 ) 或甲醛等，它们可使细胞形态发生改 变。另外，他们能增加组织细胞的通透性而产生高强度杂交信号。然而，沉淀剂固定 剂不能很好地固定r n a ，且在操作过程中组织细胞容易从载玻片上脱落。乙醇：乙酸 ( 3 ：1 ) 对于d n a 的保留非常有效，通常比某些交联固定剂还能产生更强的杂交信号。 交联固定剂如甲醛、多聚甲醛或戊二醛能牢固地将r n a 或d n a 固定在细胞内。 这些固定剂能交联蛋白质，并烷化单链核酸上的碱基，这种作用的对于保持细胞形态 非常有效，但有可能会阻止探针以及检测试剂的扩散【l9 1 。相对来说，多聚甲醛不会与 蛋白质产生广泛的交叉连接，不会影响探针穿入组织细胞。一般来说，实际操作中固 定格氏阴性菌使用3 4 多聚甲醛即有不错的效果；但是对格兰氏阳性菌和甲烷菌， 则须改用乙醇搭配溶菌酶来固定( 1 7 l 。浸泡固定剂的时间不宜过长，太长的浸泡时i 日j 反 而会导致细胞的穿透性不佳，尤其是生物膜不宜浸泡超过4 h 【z 8 】：一般均浸泡l h 为 丰1 2 9 lo ( 3 ) 组织细胞涂片或切片的制备 以原位杂交观察环境中微生物之采样，其固定方法大致有三种，一为用离心方式 收集细菌细胞，再以固定剂固剧30 1 ，此方法多用于环境杂质多的微生物采样，可以避 免杂交后观察时的背景干扰。其缺点在于无法保持其组织学形态结构，所以不能够进 行更细致的组织学定位。其二是使微生物直接附着生长于载体( o n 玻片、聚乙烯片) 上， 1 2 苏州i 科技7 1 院硕卜：伊论文第：章文献同晒i ! 再将整个载体浸入固定剂固定1 2 9 1 ，此法的优点是能保留细菌细胞原本生长的状况。其 三为用包埋法将生物膜包覆起来，以切片机切片后，将薄膜置于玻片上进行固剧3 1 1 ， 此方法多用在较厚的块状生物膜或活性污泥颗粒。现在，用于原为杂交的组织切片主 要有两类：冷冻切片和石蜡切片。两种切片各有其优缺点，不可相互取代。因此，在 实际应用中，对这两种切片法应跟据具体的实验要求加以选择。冷冻切片能更好的保 存核酸，同时也更容易被检测。石蜡切片的制备方法上将取材的组织先用甲醛等固定 后再以石蜡包埋进行保存。石蜡切片由于可极好的维持细胞形态而被常规应用，但同 时由于甲醛固定可引起的过度交联，会使探针和检测试剂难以渗透进入组织细胞内， 从而使石蜡切片的细胞检出率下降。所以，石蜡切片也有其弱点。浸泡固定剂后的细 胞样本，为了使细胞形念不易破坏且更牢固地附着于载体，以利后续杂交过程，通常 将固定的样本依序浸泡于递增浓度的乙醇中，室温风干后再行荧光原位杂交1 2 8 j 。 m a n ze ta l t 2 8 】将玻片放入反应器中使生物膜附着生长，再取出固定并观察，结果得知 附着性微生物的活性较悬浮性者为高，并推论其活性可能会随担体材质不同而改变； k a l m b a c he t 口f 【3 2 1 探讨配水系统生物膜的组成时，除利用玻片外，还以聚乙烯和聚氯 乙烯等材质作为生物膜生长的载体，结果显示以聚氯乙烯为载体时，生物生长量较多。 2 杂交 杂交的目的是为了使探针和细胞中的目标核酸序列，能经由序列互补配对的方式 形成稳定的杂交体。而影响其结果的因素除了前述之细胞的穿透性外，还应注意以下 几个环节1 1 8 】： ( 1 ) 探针的浓度：选择探针浓度应遵循一个基本原则，即所选探针应给该杂交实验 带来最大的信号比值。同时背景染色的高低也与探针浓度有关。这一原则可概括为在 使用最低探针浓度的情况下获得最大限度的探针与靶核酸的结合度。探针浓度根据其 种类和具体试验而定：在原位杂交细胞化学中，探针浓度以o 5 - 5 0 p g m l 为宜：生物 素标记探针浓度以0 5 - 5 0 1 t g m l 。 ( 2 ) 杂交的温度和时间：原位杂交中，多数d n a 探针需要的t m 值是9 0 ，而 r n a 探针则要9 5 。这种高温对保存组织形态完整和保持阻止切片黏附在载玻片上 是不可能的。因此，杂交过程中常规要加入3 0 , - - - 5 0 e p 酰胺于杂交液中。实际采用 的原位杂交温度比t m 低2 5 ，即3 0 - 6 0 c 之洲5 1 。此外，根据探针种类的不同， 具体温度尚有一定差异：r n a 和c r n a 探针一般在3 7 , - , 4 2 。c 左右，而d n a 探针或 组织细胞内靶核酸为d n a 的，则必须在8 0 - 9 5 c n 热变性，时间5 1 5 m i n ，然后 在冰上搁置l m i n ，再置入盛有2 x s s c 溶液的湿盒内，在3 7 - - 4 2 孵育过夜。用寡核 苷酸探针杂交时，适宜温度较t m 值低5 。杂交时间过短会造成杂交不完全，而 过长则会增加非特异性染色。从理论上讲，核苷酸杂交的有效时间是3 h 左右。 ( 3 ) 杂交严格度：杂交的严格度是指通过杂交及冲洗条件的选择对完全配对及不完 1 3 苏州科技7 7 院硕 学伊论文 第：章文献同顾 全配对杂交体的鉴别程度。严格度决定探针除了和完全互补的目标核酸序列杂交外， 是否能和非完全互补的核酸序列错误配对；严格度若愈高，探针错误配对的机率就愈 低【1 9 】。影响严格度最重要的因素为杂交时之温度，而杂交温度又与双股核酸解离之温 度( m e l t i n gt e m p e r a t u r e ，t m ) 有密切之关系【2 引。每1 的序列错误配对会使t m 减少0 5 1 4o c t ”1 ，而杂交温度愈低，探针和不完全配对的核酸序列形成杂交体的机率就愈 高1 1 9 l 。理论上杂交温度应