（环境工程专业论文）藻胆蛋白降解的蛋白质工程研究.pdf

摘要 藻胆蛋白是蓝藻进行光合作用必不可少的捕光复合体。本文采用分子生物学 和蛋白质工程方法研究蓝藻藻胆蛋白的降解机制，将为从源头控制蓝藻生长、解 决水华问题提供重要的帮助。 首先利用多质粒组合在大肠杆菌体内进行重组，得到了具有光学活性的色素 蛋白p c b c p c b ( 8 4 位) 和p c b ，c p c b ( 1 5 5 位) 。对体内重组色素蛋白进行光谱分 析，吸收光谱和荧光光谱均表明藻蓝胆素与脱辅基蛋白c p c b 形成了共价连接， 从而证实在大肠杆菌体内成功生成了色素蛋白p c b c p c b ( 8 4 位) 和 p c b c p c b ( 1 5 5 位) 。藻胆蛋白体内重组的实验研究有助于进一步了解藻胆体的构 成并对藻胆蛋白在实践中的应用具有重要意义。 然后将质粒p e t - o a 、p e t - o b 、p e t - r a 、p e t - c a 和p e t - c p c a 转化大肠杆菌获 得表达菌种，进行大量表达，分别获得四种蛋白酶o a 、o b 、r a 、c a 与脱辅 基蛋白c p c a 。同时利用大肠杆菌大量表达并纯化了五种体内重组色素蛋白 p c b a p c a 、p c b a p e b 、p c b c p c a 、p c b c p c b ( 8 4 位) 和p c b c p c b ( 1 5 5 位) 。 最后本文重点研究了o a 、o b 、r a 、c a 四种蛋白酶与藻胆蛋白降解之间 的关系。首先在体外进行了这四种蛋白酶与脱辅基蛋白c p c a 之间的复合物实验。 实验结果表明四种蛋白酶与脱辅基蛋白之间均未形成复合物。其次进行了四种蛋 白酶分别对五种色素蛋白p c b a p e a 、p c b a p e b 、p c b c p c a 、p c b c p c b ( 8 4 位) 和p c b c p e b ( 1 5 5 位) 的酶活性研究，并对不同温度下蛋白酶的活性大小进行 分析比较。实验结果表明四种蛋白酶对于不同的色素蛋白活性显著不同，其中蛋 白酶o a 的酶活性最大，r a 的活性次之，c a 的活性最小，而o b 对五种色素 蛋白均没有活性。同时随着温度的升高，o a 、r a 和c a 蛋白酶的活性显著升高。 酶活性实验证实了o a 、r a 和c a 蛋白酶对于不同的色素蛋白均显示出酶 活性，但活性又显著不同，说明藻胆体的降解机制十分复杂，藻胆蛋白的降解过 程很可能存在多种酶的协同作用。三种蛋白酶可能都参与了藻胆蛋白的降解过 程，但在降解过程的作用有所不同。o a 蛋白酶酶活性最好，推测其参与藻胆蛋 白的降解过程并可能发挥重要作用。但在复合物实验中并未发现o a 等蛋白酶直 接与c p c a 形成复合物，说明蛋白酶与c p c a 之间的相互作用虽然存在，但形成 复合物的过程可能还需要其他辅助因子的参与，这需要在后继的研究中进一步探 明。本文的研究结果将对藻胆蛋白降解机制的研究提供有用数据并为从分子生物 学层次上解决蓝藻水华问题奠定重要的理论基础。 关键词：蓝藻，水华，藻胆蛋白，蛋白酶 a b s t r a c t p h y c o b i l i p r o t e i na r et h ea b s o l u t e l yn e c e s s a r yc o m p l e x f o rp h o t o s y n t h e s l so f c v a n o p h y t e s i nt h i sp a p e r , m o l e c u l a rb i o l o g ya n d p r o t e i ne n g i n e e r i n gm e t h o d sh a d b e e nu s e df o rr e s e a r c ho fd e g r a d a t i o nm e c h a n i s mo fp h y c o b i l i p r o t e i n ，t h a t r e s e a r c n w i l lp r o v i d ei m p o r t a n th e l pf o rc o n t r o l l i n gb l u e g r e e na l g a ef r o ms o u t c ea n d8 0 l y i n g t h ew a t e rb l o o m f i r s t l y t h er e c o n s t i t u t i o n 伽v i v oo fu s i n gm u l t i p l a s m i dr e c o m b i n a n th a d b e e n d o n ei n 西幽“f 幽勋c o l i a n do b t a i n e dc h r o m o p r o t e i n s p c b c p c b ( 8 4b i t ) a n d p c b c p c b 05 5b i ow h i c hh a v eo p t i c a l l ya c t i v e t h ec h r o m o p r o t e l n s h a db e e n e x 眦i n e db ys p e c t r a la n a l y s i s ，a b s o r p t i o ns p e c t r u ma n d f l u o r e s c e n c es p e c t n 肌b o t n s h o w e dt h a tc l 哟m o p r o t e i n sp c b c p c b ( 8 4b i t ) a n dp c b _ c p c b ( 1 5 5b i t ) s u c c e s s f u l l y g e i l e r a t e di ne肛 e x p e r i m e n t a l r e s e a r c ho fr e c o n s t i t u t i o n nv 1 v do i p h y c o b i l i l ：i r o t e i n sh a sc o n t r i b u t e dt o ab e t t e ru n d e r s t a n d i n go ft h ec o m p o s l t l o no i p h y c o b i l i s o m e s a n d h a sg r e a ts i f n i f i c a n c e f o ra p p l i c a t i o ni np r a c t l c e o ft h e p h y c o b i l i p r o t e i n s t h e n 坟a n s l a t e dt h ep l a s m i dp e t - o a ，p e t - o b ，p e t - r a ，p e t - c aa n d p e t - c p c am e 疗a n do b t a i n e de x p r e s ss t r a i n ，ag r e a td e a lo fe x p r e s s i o nw e r eg l v e l lf o u rk i n d s o fp r o t e a s e so h ,o b ， r a ，c aa n da p o p r o t e i nc p c a a n dam a s so t 1 1 v e c h r o m o p r o t e i n sp c b a p c a , p c b a p c b ，p c b c p c a ，p c b c p c b ( 8 4 ) ， p c b c p c b ( 15 5 ) h a d b e e ne x p r e s s e da n dp u r i f i e di ne c o l i - f i n a l l y , t h i sp a p e rf o c u s e s o nt h er e l a t i o n s h i po ff o u rk i n d so fp r o t e a s e so a ，o b ， r a c aa n dd e g r a d a t i o no fp h y e o b i l i p r o t e i n t h i sp a p e rd e s i g n e dp r o t e l nc o m p l e x e x p e r i m e n t nv i t r oo f f o u rp r o t e a s e sa n da p o p r o t e i nc p c a t h ee x p e n m e n tr e s u l t s s h o w e dt l l a tp r o t e a s e sa n da p o p r o t e i nc p c a d i dn o td i r e c t l yf o r mc o m p l e x t h e nt o u r p r o t e a s e s ，h y d r o l y t i ca c t i v i t ya c t e do nf i v ec h r o m o p r o t e i n sh a d b e e nr e s e a r c h e d ，觚d c o m p a r e df o u rp r o t e a s e s a c t i v i t yu n d e rd i f f e r e n tt e m p e r a t u r e s t h e r e s u l t so ft h l s e x p e m e n ts h o w e d t h a tt h ea c t i v i t y o ff o u r p r o t e a s e s a c t e do n 蝴e r e m c h r o m o p r o t e i n sh a sd i s t i n c t i o n ，t h ea c t i v i t yo f o ai sm a x i m u m ，r a sa c t i v i t yt a k e s s e c o n dp l a c e ，c a sa c t i v i t yi sm i n i m u m ，o b h a sn oa c t i v i t yf o rf i v ec h r o m o p r o t e l n s a n da c t i v i t i yi se n h a n c e dw i t hi n c r e a s i n gt e m p e r a t u r e a c t i v i t ye x p e r i m e n tc o n f i r m e d t h a tp r o t e a s e so a ，r aa n dc a a l lh a v ea c t l v l t l e s f o rd i 行c r e n tc h r o m 叩t o t e i n s ，b u tt h ea c t i v i t i e sa l e d i f f e r e n ta sw e l l t h i sr e s u l tr e v e a l s t h a tt h ed e g r a d a t i o nm e c h a n i s mo fp h y c o b i l i p r o t e i n i s v e r yc o m p l e x a n dt h e d e g r a d a t i o np r o c e s so fp h y x o b i l i p r o t e i n sm a yn e e dm u l t i p l ee n z y m e ss y n e r g i e s t h r e ep r o t e a s e sa lep r o b a b l yi n v o l v e di np h y c o b i l i p r o t e i nd e g r a d a t i o np r o c e s s ，b u t t h er o l ei nt h ed e g r a d a t i o np r o c e s si sd i f f e r e n t t h ea c t i v i t yo fo a i sb e s t ，s u g g e s t i n g i t sp a r t i c i p a t i o ni np h y c o b i l i p r o t e i nd e g r a d a t i o np r o c e s sa n d m a yp l a ya ni m p o r t a n t r o l e h o w e v e r , p r o t e a s e sd i dn o td i r e c t l yf o r mc o m p l e xw i t ht h ec p c a ，i n d i c a t i n gt h e i n t e r a c t i o nb e t w e e nt h ep r o t e a s e sa n dc p c ae x i s t ，b u tt h ep r o c e s so ff o r m a t i o no f c o m p l e x e sm a ya l s on e e dt h ei n v o l v e m e n to fo t h e rs u p p o r t i n gf a c t o r s ，w h i c hr e q u i r e s f u r t h e rp r o v e di nt h ef o l l o w u ps t u d y t h er e s u l t so ft h i sp a p e rw i l lp r o v i d eu s e f u l d a t af o rd e g r a d a t i o nm e c h a n i s mo f p h y c o b i l i p r o t e i na n dl a ya l li m p o r t a n tt h e o r e t i c a l b a s i so ns o l v i n gt h ew a t a tb l o o mi nm o l e c u l a rb i o l o g yl e v e l k e yw o r d s ：c y a n o b a c t e r i a ，w a t e r b l o o m ，p h y c o b i l i p r o t e i n ，p r o t e a s e i i i 独创性声明 本人声明，所呈交的论文是本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得 武汉理工大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示了谢意。 签名：叠垄盏 日期：鲨星：! ! ：q 一 学位论文使用授权书 本人完全了解武汉理工大学有关保留、使用学位论文的规定，即 学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权武汉理工大学可以将本学位论文的 全部内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制 手段保存或汇编本学位论文。同时授权经武汉理工大学认可的国家有 关机构或论文数据库使用或收录本学位论文，并向社会公众提供信息 服务。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 研究生( 签名) ：l 司咯 导师( 签名) ：互亥昨尹日期 沙卜1 | 武汉理_ 【= = 学硕士学位论文 1 1 蓝藻藻胆体 1 1 1 藻胆体概述 第1 章引言 蓝藻( b l u e g r e e na l g a e ) ，又称作蓝绿藻、蓝细菌( c y a n o b a c t e r i a ) 。它广 泛分布于海洋和淡水中，是一种环境适应能力极强的原核生物。蓝藻的形 态结构简单，无固定细胞核，包括两个光系统，具有类似于高等植物的放氧光 合作用，同时还具有固氟和氢代谢等功能。 藻胆体佃h y c o b i l i s o m e ，简称p b s ) 是存在于红藻和蓝藻中的一个膜联合的 复合物，为光合作用捕获光能。它规则地分布在叶绿体内囊体的表面，紧密地 与光舍系统1 i ( p s i i ) 相连【“。藻胆体由不同种类的藻胆蛋白( p h y c o b i l i p m t e i n ) 和无色素的连接多肚( 1 i n k e r p e p t i d e s ) 组成，具有高度组织化的结构。藻胆蛋 白和连接多肽在藻胆体中分别约占其总量的8 5 和1 5 t ”。藻胆蛋白在藻胆体 中发挥吸收光能的作用连接多肽构成藻胆体的骨架，它连接各种藻胆蛋白形 成藻胆体，并能促进藻胆蛋白分子问的能量传递。 藻胆体在不同藻类中的形状和大小不同。依据形态的不同，可将藻胆体大 致分为半盘状藻胆体、半椭球形藻胆体、微管束形藻喈体和双圆筒状藻胆体。 半盘状藻胆体在蓝藻中存在最普遍，也是目前研究最透彻的一种藻胆体p l 。藻 胆体的内部生理结构可由电子显微镜检震k 半盘状藻胆体的分子结构模式如图 - i 所示。藻胆体的结构大致可分为“核”和“杆”两部分，核由三个圆柱体 组成，核的周围分布着六个成辐射状的杆。每个核圆柱体由四个圆盘组成，圊 盘中的主要蛋白质是别藻蓝蛋白( a l l o p h y c o c y a n i n ，简称a p c ) ，与光合系统 i i ( p s ) 相连。杆由藻蓝蛋白( p h y c o c y a n i n ，简称p c ) 和藻红蛋白 ( p h y c o e r y 嘶1 ) ，简称p e ) 或者藻红蓝蛋白( p h y c o e r y t h o c y a n i n ，简称p e c ) 组成。 虱卜1 藻胆体的分子结构模型图 武汉理工人学硕士学位论文 藻胆体是藻细胞内重要的光捕获器官，藻胆体内的能量由外向内单向传 递，首先藻红蛋白直接捕获光能，然后将光能传递给藻蓝蛋白，藻蓝蛋白再将 光能传递给别藻蓝蛋白，最后进行光合作用的光能经过别藻蓝蛋白到达叶绿素 a f 4 】，即p e _ p c _ a p c _ c h l a 。 1 1 2 藻胆体降解研究 在特定的营养胁迫条件( 如缺氮或缺硫) 下，蓝藻的颜色会呈现由蓝绿色 到黄绿色的变化，这种现象被称之为“漂泊现象，由蓝藻中藻胆体的降解引 起。在缺氮的环境中，蓝藻将藻胆体内的藻胆蛋白作为内部营养源进行消耗1 5 1 ， 导致藻胆体内色素遗失。藻胆蛋白占蓝藻细胞中可溶性蛋白的一半，它们在缺 氮条件下的降解是一个复杂的过程。 藻胆体的降解按照有序的方式进行，降解先从杆部位的外围开始，然后是 整个杆的完全降解，最后以核的完全降解结束f 6 j 。藻胆体的降解是可逆的，一 旦氮源充足，藻胆体便重新开始合成。目前仍然不清楚藻胆体的详细降解机制。 在遗传学和生物化学方向，对藻胆体降解已经进行了十几年的研究，发现 在藻胆体降解过程中存在大量基因编码的蛋白质。第一个确定与藻胆体降解相 关的基因是n b l a t7 1 。在此之后，相继确定了其他与藻胆体降解过程相关的基因： n b l b 、n b l c 、n b l r 、n b i s 和a i d 。研究已经确定了藻胆体降解中包含的蛋白酶， 证明蛋白质在体内的水解活动能够降解藻胆蛋白，但是这些体内的蛋白酶的具 体作用机理仍然不清楚。 1 1 3 藻胆蛋白 藻胆蛋白( p h y c o b i l i p r o t e i n ) 由藻胆色素与相应的脱辅基蛋白中保守半胱 氨酸残基上的巯基以硫醚键共价结合形成，它是一类结构相似的色素蛋白【8 1 ， 主要吸收4 5 0 - - - - 6 6 0 n m 范围内的可见光。藻胆蛋白能捕获叶绿素和类胡萝卜素所 捕获不到的光能，在藻胆体中起到捕获光能并将光能传递到光合作用反应中心 的作用。当蓝藻处在缺乏氮源的生长环境中时，藻胆蛋白可作为储存蛋白的形 式维持藻细胞的生存。在藻类中，藻胆蛋白的重量占整个细胞干重的2 5 2 8 【9 1 。 根据藻胆蛋白中色素的种类及色素捕获光能大小的不同，可将藻胆蛋白分 为：较高能量的藻红蛋白或藻红蓝蛋白、中等能量的藻蓝蛋白、较低能量的别 2 武汉理工大学硕士学位论文 藻蓝蛋白，在有异型胞而不含藻红蛋白的蓝藻中，藻红蓝蛋白在藻红蛋白所在 的位置代替藻红蛋白行使捕获光能的功能。分离纯化得到的藻蓝蛋白能发出紫 色荧光，分离纯化的藻红蛋白发橙红色荧光【8 】。 每种藻胆蛋白通常由各自的两种不同的亚基构成，即0 c 亚基和p 亚基( 某些 藻胆蛋白中存在y 亚基) 。两种亚基分别含有约1 6 0 - - ，1 8 0 个氨基酸残基，每个亚 基连接1 4 个辅基色素，这样的构成使藻胆蛋白具有特定的吸收光谱【l0 1 。各亚 基的氨基酸序列有相似性，不同藻胆蛋白的同种亚基也有较高的同源性。 1 1 4 藻胆色素 藻胆色素是一类线性四吡咯化合物，含有四个相互连接的吡咯环，分子量 约6 0 0 d a 。一个藻胆体中大约含有3 0 0 8 0 0 个共价偶联的藻胆色素【l 。藻胆 素分子内共扼双键的数目与位置的不同导致吸收波长不同，从而使藻胆色素呈 现不同的颜色。 目前己知的藻胆色素有8 种，在蓝藻藻胆蛋白中的色素有4 种，即藻红胆素 ( p h y c o e r y t h r o b i l i n ，简称p e b ) ，藻蓝胆素( p h y c o c y a n o b i l i n ，简称p c b ) 、藻 尿胆素( p h y c o u r o b i l i n ，简称p u b ) 、藻紫胆素( p h y c o v i o l o b i l i n ，简称p v b ) 。 藻胆色素来源于血红素的代谢，在相应的血红素氧化酶的催化下，血红 素被氧化而共轭环断裂形成胆绿素。胆绿素由特定的酶部分还原和异构化为 特定的藻胆色素【l 引，如胆绿素在p c b 氧化还原酶p c y a ( 编码基因为p c y a ) 的催化 下，生成藻蓝胆素p c b ；在酶p e b a 和酶p e b b 的共同催化作用下则形成产物p e b ； 在酶f i y 2 的催化下生成光敏胆色素( p h y t o c h r o m o b i l i n ，简称p b ) ；在酶 b v r b v d r 的催化下生成胆红素( b i l i r u b i n ) 。 1 2 藻胆蛋白的体内重组研究现状 蓝藻中，藻胆色素通过与脱辅基蛋白多肽链的保守半胱氨酸残基以硫醚键 共价结合而构成藻胆蛋白，藻胆蛋白的体内重组即指藻胆色素与脱辅基蛋白在 体内的连接过程，该连接需要特定的裂合酶催化实现【l 3 1 。裂合酶指所有催化由 底物除去某个基因而残留双键的反应、或通过逆反应将某个基团加到双键 上去的反应的酶。 由于一些细菌光敏色素的脱辅基蛋白与p c b 、p o b 等线性四吡咯发色团 的结合是自催化的【l4 1 ，植物光敏胆色素与相应脱辅基蛋白的连接也是自催化反 武汉理1 二火学硕士学位论文 应，因此它们的联合反应均无需裂合酶的参与【1 5 】。 集球藻( s y n e c h o c o c c u ss p ) p c c 7 0 0 2 的七个多肽链上有8 个不同的色素 连接位点，f a i r c h i l d 肭1 1 6 l7 】在集球藻p c c 7 0 0 2 中发现了第一个具有位点特异性 的色素蛋白裂合酶，即基因c p c e 和c p c f 的表达产物c p c e 和c p c f 。它们能在 体外正确的催化藻蓝色素p c b 与o 【一c y s 一8 4 的连接，而不能催化p c b 与其它位 点的连接。t o o l e y 等【l8 】在大肠杆菌体内构建了携带c p c e c p c f 和c p c a 的质粒 及p c b 合成酶的质粒，并成功重组得到具有正确构象的a c p c 。同样是在集球 藻p c c 7 0 0 2 中，s h e n 等【l9 】发现与c p c t 能催化c p c b 上1 5 5 位半胱氨酸残基与 p c b 的连接，c p c t 与c p e t 有较高同源性。 i - c h e nh u 等1 2 0 】的实验研究显示a p c a 与p c b 能进行自催化连接，无需裂 合酶的参与。另外，在鱼腥藻p c c 7 1 2 0 中，z h a o 等1 2 l 】研究工作者发现c p e s 在大肠杆菌体内催化变藻蓝蛋白亚基a p c a a 2 b d f 与p c b 的重组。 j o h n 等【2 2 】的研究指出c p e r 和c p e t 可能是催化藻蓝色素与脱辅基蛋白 c p c b a 连接的裂合酶。在鱼腥藻p c c 7 1 2 0 中，z h a o 等【2 3 j 研究者通过同源性分 析发现基因a l r c p e s 的编码蛋白c p e s 是一种新的裂合酶，它能催化p c b 与 c p c b 和p e c b 结合，结合位点在8 4 位的半胱氨酸残基上。 s t o r f 掣2 4 】发现层理鞭枝藻的藻红蓝蛋白裂合酶p e c e p e c f 的专一性底物 是p c b 和p e b ，并且它们与p e c e p e c f 之间的亲和性最强。z h a o 等【2 5 】的研究 指出了仅p e c 生物合成的裂合酶或异构酶是p e c e p e c f 。t o o l e y 等【2 6 j 在大肠杆 菌体内表达了p e c e p e c f 和p e c a 的质粒及p c b 合成酶的质粒，得到具有可逆 光变色的0 c p e c 。 1 3 集胞藻p c c 6 8 0 3 蛋白酶研究现状 1 3 1 集胞藻p c c 6 8 0 3 集胞藻( $ n e c h o c y s t 括s p ) p c c 6 8 0 3 是种生活在淡水中的单细胞 蓝藻，通过二分裂的形式繁殖，具有天然的d n a 转化系统，在适宜碳 源存在下，能够进行光能异养生长。集胞藻p c c 6 8 0 3 属于蓝藻门、蓝 藻纲、色球藻目，色球藻科，集胞藻属。p c c ( p a s t e u rc u l t u r ec o l l e c t i o n 的缩写) 指法国巴斯德研究所蓝藻保藏库，6 8 0 3 指藻株编号。 集胞藻p c c 6 8 0 3 基因组序列的测正于1 9 9 6 年首次完成，它是广泛用于光合 作用和蓝藻生物学研究的重要模式。蓝藻集胞藻p c c 6 8 0 3 拥有一个3 5 7 m b 的基 4 武汉理下大学硕士学位论文 因库，接近6 0 个编码肽酶的基因座，或者它的遗传能力接近2 t 2 7 1 。集胞藻 p c c 6 8 0 3 基因组有多于2 0 倍的质体染色体的编码潜力，它是第一个蓝藻基因序 列【2 8 】。 1 3 2 蛋白水解酶简介 蛋白水解酶( p r o t e a s e s ) 又称蛋白酶，是一类裂解肽链中肽键的酶，广泛 存在于植物体内。蛋白酶具有各种各样的功能，对于细胞保持结构、适应变化 和维持稳态( h o m e o s t a s i s ) 具有重要的作用。当外界光、温度等环境因子发生 变化时，生物体内需要高效的蛋白质量控制。蛋白酶与分子伴侣结合，共同参 与蛋白的折叠、错误蛋白的降解等质量控制过程。 蛋白质水解活动是存活状态细胞的生理活动中的一个基本过程，在蛋白质 水解活动发生损坏时，蛋白水解酶对细胞动态平衡的影响变得格外明显，蛋白 质水解过程的损坏导致细胞生理状况发生剧烈改变【2 9 】。 根据国际肽酶命名法，所有的蛋白水解酶都由肽酶作为分类标准。随着集 胞藻p c c 6 8 0 3 基因组序列测定的完成，对其蛋白酶的结构特点、存在形式、 生理功能等方面的研究也取得了巨大进展。集胞藻p c c 6 8 0 3 中主要有五类蛋 白酶，即c l p 蛋白酶、d e g 蛋白酶、f t s h 蛋白酶、c t p 蛋白酶及s p p a 蛋白酶。 1 3 3c l p 蛋白酶的研究现状 c l p 蛋白水解酶是原核生物和叶绿体中最主要和最重要的蛋白水解酶，它 是可溶的多亚基蛋白质合成物，属于依赖a t p 的丝氨酸类型，即该酶的水解活 性需要a t p 的参与。o p 蛋白酶是由多个c l p 蛋白亚基组成的复合体。根据结构 和功能的不同，大多数c l p 蛋白可分为c l p p 蛋白亚基和h s p l 0 0 c l p 分子伴侣两 大类【3 0 1 。 集胞藻p c c 6 8 0 3 的c l p 蛋白酶由8 个基因编码，如表卜1 所示为四个相 类似的蛋白质水解酶( c l p p l ，c i p p 2 ，c i p p 3 ，c l p r 或者c l p p 4 ) 和四个调节 亚基( c l p c ，c i p b l ，c l p b 2 ，c l p x ) ，其中前三个c l p p 亚基是同分异构体【3 。 c l p 蛋白酶对于细胞生长和压力适应极其重要。c l p 蛋白酶不仅是蓝藻细胞 生长发育所必需的，还与蓝藻在高光、低温、u v b 等外界胁迫下的稳定生长 和长期适应密切相关。 在真细菌、哺乳动物和植物叶绿体中，c l p p 作为依赖c l p 蛋白酶的蛋白质 5 武汉理t 大学硕士学位论文 水解亚基而起作用。在s o k o l e n k o 的研究中2 9 1 ，通过对集胞藻p c c 6 8 0 3 中三个c l p p 基因( c l p p l 、c l p p 2 、c l p p 3 ) 的基因敲除研究指出这些基因有4 5 到7 5 的同 源性，但没有相互重合的多余的功能。c l p r ( c i p p 4 ) 不包含对催化活性至关 重要的s e r 和h i s 氨基酸残基，因此这个亚基可能是非催化性的，并且它可能参 与t i p 复合物的寡聚蛋白结构的形成，或者发挥调控作用。 表l 一1c l p 蛋白酶的类型与细胞内可能定位 s o k o l e n k o 等的研究【2 9 】成功获得- j c l p p 2 和c l p b 2 基因的插入诱变体。插入诱变 体a c l p p 2 的菌株不能在正常的光能自养条件下生长，并且对光胁迫和营养胁迫 高度敏感，当光强高于1 0 u e m 五s 1 时停止生长。由此推断蛋白亚基c i p p 2 在光合 反应系统中应具有一定的重要作用。另外，野生型集胞藻p c c 6 8 0 3 在缺氮、磷、 铁时会出现光漂白现象，在缺硫、铜条件下不出现，而z l c l p p 2 突变体在缺氮、 缺磷、缺铁条件下前两天比野生型生长得更快，而在缺硫条件下的生长与野生 型没有区别。据此推断，c i p p 2 可能与藻胆体的降解有关联。突变体d c l p b 2 菌 株在正常的光合自养条件下及高光强下均可以生长，但高光强下颜色加深，即 出现色素沉着现象。另外，研究中未能获得c l p p l 、c l p p 3 、c l p c 、c l p x 和c l p b ! 各自的基因突变菌株，这说明上述基因是细胞生长发育所必需的。 c a p 亚基与蛋白质水解活动的调节或者作为分子伴侣的功能有关。c l p c 是 一个c l p 蛋白质的h s p l 0 0 伴侣。与藻胆体的降解有密切关系的n b l a 基因同 c l p c 通过其n 端的保守性结构域相互作用【7 j 。 1 3 4d e g 蛋白酶的研究现状 d e g 蛋白酶属于不依赖刁：a t p 的丝氨酸肽酶，广泛存在于细菌与真核细胞 中。通常d e g 蛋白酶的c 端有一个或两个p d z 蛋白相互作用结构域。高温时，p d z 6 武汉理工大学硕十学位论文 结构域处于开放状态，底物可以进入催化区域被降解，因而蛋白酶表现水解活 性；低温时，外围的p d z 结构域处于封锁状态，底物不能进入催化区域，因而 d e g 蛋白酶表现分子伴侣活性【3 。 如表卜2 所示，在集胞藻p c c 6 8 0 3 中存在三个彼此同源的d e g 蛋白酶，分别 是：h h o a 、h h o b 、h t r a ，它们均只有一个p d z 结构域。 表l 一2d e g 蛋白酶的类型与细胞内可能定位 有蛋白质组的分析【3 2 】表明集胞藻p c c 6 8 0 3 中的h h o a 是细胞周质中的一个 可溶性蛋白质。在h h o a 和h t r a 蛋白酶的n 端均有一段疏水性氨基酸和典型的序 列切割位点a i a - x a l a 结构域，该结构域在蛋白转运至周质空间时可以被相应的 酶识别。p i t t e r 等【3 3 j 的研究发现h t r a 位于外膜上。h h o b 蛋白酶的n 端有疏水性 的跨膜结构，但没有a l a x a l a 结构域，跨膜结构能帮助h h o b 蛋白质转移到细 胞周质或者内囊体内腔【z 9 1 。 在原核生物中，d e g 蛋白酶在细胞抵制各种环境胁迫的反应中发挥作用， 比如热胁迫、氧胁迫，及高光胁迫等。 s o k o l e n k o 等研究者印】使用基因的突变或敲减研究了集胞藻p c c 6 8 0 3 中 h t r a 、h h o a 及h h o b 的蛋白功能。在该研究中，未能分离出完整敲除h t r a 基因 的突变菌株，这说明h t r a 基因可能是细胞生长发育所必需的。该研究成功获得 了对h h o a 及h h o b 进行插入失活的突变体，在正常生长条件下，d h h o b 突变藻 比野生型藻颜色更深，生长速度更快，并且在缺磷条件下比野生型表现得更为 敏感。a h h o a 突变藻在正常生长条件下与野生型藻相比没有可见的表型特征， 但是敲除突变体的菌株比野生型菌株对热胁迫的反应更为敏感，并且比野生型 更能适应缺铁条件的影响。这些结果还表明，虽然h h o a 与h h o b 有很高的同源 性，但在集胞藻p c c 6 8 0 3 的细胞中它们的生理功能存在差别。 同时s o k o l c n k o 的研刭2 9 】指出在h t r a 、h h o a 及h h o b 的任何双突变体中没有 发现明显的表型特征，这说明h t r a 、h h o a 及h h o b 可能有部分相同的功能。 m y l e s 的研究【3 4 】中同样指出t d e g 蛋白酶之间存在着功能的重叠。 p a u l o t 3 5 】获得了同时敲除集胞藻p c c 6 8 0 3 中d e g 蛋白酶三个基因的突变体。 研究指出这三个基因在低光照条件下并不是细胞生存所必需的。突变藻对光氧 7 武汉理t 大学硕士学位论文 化的胁迫更为敏感，高光强下在添加了葡萄糖的平板上生长明显受到抑制。与 野生型相比，突变藻的光合系统i i ( p s i i ) 合成速率减慢，d 1 蛋白的降解变慢， 由此判断d e g 蛋白酶与细胞对高光强的抵制有关，同时在光合系统i i ( p s i i ) 的修 复中有直接或间接作用。 另p b p i t t e r 掣3 6 l 使用体内重组构建的h h o a 蛋白质来研究其在集胞藻 p c c 6 8 0 3 中的特点。该研究表明h h o a 的蛋白质水解活性在适宜温度和p h 值下 增强，并且在有m g + 和c a 2 + 加入的情况下有促进效果，并且h h o a 的蛋白质水 解活动是由温度而定的。 1 3 5f t s h 蛋白酶的研究现状 f t s h 蛋白酶广泛存在于各种原核生物和真核生物中，它是属于依赖a t p 的 金属蛋白酶，参与细胞内膜蛋白和细胞质蛋白的各种降解过程。 与其它的a t p 依赖肽酶一样，f t s h 蛋白酶拥有一个相同的二聚物和或者 四聚物结构【3 7 】，其多聚体结构是接触反应活动所需要的f 3 8 1 。原核生物和真核生 物中的f t s h 蛋白酶都具有共同的保守模块( m o t i f ) ，包括n 端跨膜域、a a a 结 构域、锌离子结合模块等【3 9 1 。 集胞藻p c c 6 8 0 3 中的f t s h 蛋白酶家族包括四个同源的蛋白酶，分别为 f t s h l 、f t s h 2 、f t s h 3 、f t s h 4 ，见表卜3 。 表1 3f t s h 蛋白酶的类型与细胞内可能定位 f t s h 蛋白酶参与各种细胞内的降解活动，从蛋白质移位酶亚基s e c y 的降解 到热胁迫转录因子0 3 2 和转录激活因子九ci i 的降解【4 0 , 4 1 】，f t s h 蛋白酶都有参与 其中，同时f t s h 蛋白酶与多种逆境胁迫响应密切相关。 在集胞藻p c c 6 8 0 3 中，b a i l e y _ 【4 2 1 通过体内诱变成功构建了失活四个编码 f t s h 蛋白酶基因的突变体。研究结果显示突变体a f t s h l 和d f t s h 3 在正常生长条 件下不能存活；a f i s h 4 没有明显的表型特征；a f i s h 2 有明显的色素沉着现象， 并且光合系统i ( p s i ) 的生物发生过程受到损坏。以上研究结果说明蛋白酶 f t s h l $ l l f t s h 3 是细胞正常生长所必需的，f t s h 2 蛋白酶是控制d 1 蛋白质转换所 武汉理工人学硕士学位论文 需要的。 在高光强环境胁迫条件下，尤其是在伴随诸如极端温度的其他环境胁迫条 件的情况下，植物和藻类的光合作用性能会降低。导致这种光抑制作用的主要 原因是光合系统i i ( p s i i ) 复合体发生了不可逆转的光损坏。在集胞藻p c c 6 8 0 3 中，p a u l o 的研究【4 3 l 显示在插入触基因的突变体中，光合系统i i ( p s i i ) 的修复 受到破坏，并且d 1 蛋白质降解缓慢。该研究说明f t s h 2 蛋白酶对p s i i 的有效修 复至关重要，它参与d 1 蛋白质的早期降解，并且对集胞藻p c c 6 8 0 3 防止长期光 抑制有重要作用。 进行含氧光合作用的有机体的光合系统i i ( p s i i ) 复合体容易被u v b 放射 损坏，损坏后的光合系统i i ( p s f l ) 复合体会在体内进行修复活动以维持机体的 正常生理活动。在集胞藻p c c 6 8 0 3 中，有研究 4 4 1 研究了f t s h 2 蛋白酶对u v b 辐 射损坏下的p s i i 反应中心亚基、d 1 和d 2 的影响。该研究失活s l r 0 2 2 8 基因，a f i s h 2 菌株的光合系统i i ( p s i i ) 对u v b 辐射的敏感性较强。免疫印迹法显示在u v b 辐射下，d f i s h 2 的d l 蛋白质币1 d 2 蛋白质的降解缓慢，并且d 1 蛋白质和d 2 蛋白 质在恢复时期的复原程度比野生型的d 1 和d 2 蛋白质的复原程度低。 1 3 6c t p 蛋白酶的研究现状 集胞藻p c c 6 8 0 3 中的c t p 蛋白酶包括c t p a 、c t p b 和c t p c ，它们编码羧 基末端的内部蛋白酶( c t p s ) ，其对应基因、蛋白类型及细胞内可能定位如表卜4 所示。 表l - 4c t p 蛋白酶的类型与细胞内可能定位 通过对c t p 基因产物的氨基酸序列的比较分析，可将，c t p s 蛋白酶分成三个 不同的组，即真核状态的c t p a 蛋白质、原核状态的c t p a 蛋白质和原核状态 的c t p b c 蛋白质【4 引。 虽然集胞藻p c c 6 8 0 3 中的c t p s 的整体结构非常相似，但是在假定的膜接 触区域和活动场所中均存在区别【4 5 1 。蓝藻中的c t p 基因与大肠杆菌中的叻，基 因有高于3 0 的同源性，蓝藻中的c t p 基因编码细胞周质中的可溶性蛋白质 4 6 , 4 7 1 。 9 武汉理t 大学硕士学位论文 集胞藻p c c 6 8 0 3 中的c t p 蛋白质之间有较高同源性，但是它们在集胞藻 p c c 6 8 0 3 细胞中发挥不同的作用，并且它们的细胞功能彼此之间不能替代。 在集胞藻p c c 6 8 0 3 中，s h e s t a k o v 等研究者【4 8 】成功构建敲除c f 叫基因的突变 体，该突变体菌株不能进行正常的生长活动，这是由于光合系统i i ( p s i i ) 复合 体的d 1 蛋白质的c 端处理出现了损坏。 a n b u d u r a i 研究者【4 9 l 在集胞藻p c c 6 8 0 3 中使用插入失活方法构建c 别突变 体，以研究c t p a 蛋白酶在集胞藻p c c 6 8 0 3 中的功能。在该研究中，研究者通过 插入一个卡那霉素抗性的基因到c 别的译码序列中，以阻止c t p a 基因的活性。 这项研究显示d c t p a 导致光合系统i i ( p s i i ) 的活动削减，这说明集胞藻p c c 6 8 0 3 中的c t p a 蛋白质可能是损坏d 1 蛋白质特定成分的一个处理酶。 i v l e v a 研烈5 0 】发现c t p c 基因的失活可对集胞藻p c c 6 8 0 3 的细胞造成致命 伤害，因此c t p c 蛋白酶是细胞生长发育所必需的；失活c t p b 基因的突变体