（环境工程专业论文）酶抑制法快速检测有机磷农药残留方法的研究.pdf

摘要 有机磷农药目前广泛应用于农业、工业、医药等领域，并引起环境、食品污 染等问题。绝大多数有机磷农药具有很强的毒性，经过皮肤、呼吸以及肠胃吸收 等途径进入机体会引起严重的疾病。要预防和处理有机磷农药引起的环境、食品 污染等问题，最有效的策略就是及时、准确检测有机磷。近年来，有许多关于有 机磷农药残留的检测方法的文献报道。 本文利用酶抑制原理，采用生物传感器和分光光度法快速检测有机磷农药残 留。主要包括以下四个方面的内容： 1 综述了有机磷农药残留的检测方法。其中主要的方法包括：光谱法、色谱 法、酶抑制法、免疫法和生物芯片技术。光谱法和色谱法是监测检验部门分析有 机磷农药的主要方法，而酶抑制法则更适合于基层单位的快速检测，免疫法和生 物芯片技术代表未来的发展方向。 2 将乙酰胆碱酯酶交联于醋酸纤维膜上，制备成生物传感器。通过固定酶量、 底物浓度、酸度等方面优化了该传感器的制备条件和工作条件，发现对硫磷农药 在3 4 3 1 0 1 。- - 3 4 3 1 0 。6m o l l 的浓度范围内，抑制率与其浓度对数值呈线性 关系，检测限为2 4 5 1 0 1 0 m o l l 。当用于实际样品中对硫磷农药的测定时，取 得了较为满意的效果。 3 采用一种简便有效的方法，从鸡脑中提取乙酰胆碱酯酶，通过国家标准方 法对酶的活性进行检测，效果满意。利用博抑制原理，采用分光光度法测定有机 磷农药含量。对酸度、酶的用量、显色剂用量以及时间、温度等条件进行了优化， 发现对硫磷、辛硫磷和氧化乐果在1 0 1 0 1 0m g l 的浓度范围内，抑制百分 率与其浓度的对数值呈线性关系。检测限分别为5 7 1 0 m g l 、3 3 x1 0 。m g l 、 2 0 1 0 一m g l 。实验结果表明该方法用于实际样品测定时，效果满意。 4 分别从京2 号和9 4 2 8 号小麦中提取小麦酯酶，利用酶抑制原理，采用分光 光度法测定有机磷农药含量。对吸收曲线、酸度、酶的用量、显色剂用量以及时 问、温度等条件进行了优化，发现使用京2 号小麦酯酶，对硫磷在1 0 1 0 6 l o m g l 的浓度范围内，抑制率与其浓度对数值呈线性关系。使用9 4 2 8 号小麦 北京工业大学工学硕士学位论义 酯酶，对硫磷在1 0 1 0 - 51 0 m g l 的浓度范围内，抑制率与其浓度对数值呈线 性关系。检测限分别为4 7 7 1 0 m g l 、3 , 6 8 1 0 6 m g l 。实验结果表明该方法在 检测蔬菜、水果等农产品中的有机磷农药残留方面有着良好的应用前景。 关键词：有机磷农药；酶抑制法；生物传感器；分光光度法 a b s t r a c t o r g a n o p h o s p b o r u sp e s t i c i d e sa r ew i l d l yu s e di na g r i c u l t u r e ，i n d u s t r y , m e d i c i n e e t ca n dl e a dt o as e r i e so f p r o b l e m s o fe n v i r o n m e n t a l p o l l u t i o na n df o o d c o n t a m i n a t i o n t h e m a j o ro r g a n o p h o s p h o r u sp e s t i c i d e s h a v e s t r o n gt o x i c i t y c o n t a c t i n gw i t ho r g a n o p h o s p h o r u sp e s t i c i d e sa n da b s o r b i n gb ys k i n ，r e s p i r a t o r y s y s t e ma n dg a s t r o i n t e s t i n a lt r a c tl e a dt os e v e r ed i s e a s eo n eo ft h em o s ti m p o r t a n t p r e v e n t i v em e a s u r e si nt h i sc a s ei st or a p i d l ya n da c c u r a t e l yd e t e r m i n et h er e s i d u e so f o r g a n o p h o s p h o r u sp e s t i c i d e si n r e a ls a m p l e s i nr e c e n ty e a r s ，t h e r e w e r es o m e r e p o r t sa b o u tt h ef a s td e t e r m i n a t i o nt oo r g a n o p h o s p h o r u sr e s i d u e t h i sa r t i c l ew a sb a s e do ne n z y m ei n h i b i t i o np r i n c i p l ea n du s e db i o s e n s o r s t e c h n i q u ea n ds p e c t r o p h o t o m e t r yt o d e t e r m i n eo r g a n o p h o s p h o r u sr e s i d u e i tw a s d e v i d e di n t of o u rs e c t i o n sb e l o w ： 1 t h em e t h o d so fd e t e r m i n a t i o nt oo r g a n o p h o s p h o r u sr e s i d u ew e r er e v i e w e d t h em a j o rm e t h o d sw e r e ：s p e c t r u m ，c h r o m a t o g r a p h ，e n z y m ei n h i b i t i o n ，i m m u n o l o g y a n db i o l o g i c a lc h i pe t c s p e c t r u ma n dc h r o m a t o g r a p hw e r et h em a j o rm e t h o d st o d e t e r m i n eo r g a n o s p h o m sp e s t i c i d e s ，e n z y m ei n h i b i t i o nw a sb e t t e rf o rt h eg r a s s r o o t u n i tt or i s e ，i m m u n o l o g ya n db i o l o g i c a lc h i p sr e p r e s e n tt h ed e v e l o p i n gd e r e c t i o no f t h es t u d yf i e l d 2 a c e t y l c h o l i n e s t e r a s ew a sc r o s s l i n k e do na na c e l l u l o s ea c e t a t em e m b r a n c ea n d a s s e m b l e dt ob i o s e n s o r s t h ed e t e r m i n a t i o nc o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e ds u c ha s i m m o b i l i z a t i o na m o u n to fe n z y m e ，s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o na n db u f f e rs o l u t i o na c i d i t y i tw a sf o u n dt h a t ，w h e ni nt h ec o n c e n t r n i o nr a n g eo f3 4 3 1 0 1 0 3 4 3 1 0 m o l l ， i n h i b i t i o np e r c e n t a g ev e r s u sl o g a r i t h mo fp a r a t h i o nc o n c e n t r a t i o nw e r el i n e a ra n d d e t e c t i o nl i m i tw a s2 4 5 10 。1 0m o l l t h em e t h o dp r e s e n t e di nt h i sp a p e rh a db e e n a p p l i e di nt h ed e t e r m i n a t i o no f p a r a t h i o ni nv e g e t a b l e s 、 ，i 血s a t i s f a c t o r yr e s u l t s 3 a c e t y l c h o l i n e s t e r a s ew a se x t r a c t e df r o mc h i c k e nb r a i nb yas i m p l e ，e f f e c t i v e m e t h o d t h ea c t i v i t yo fe n z y m ew a st e s t e db yn a t i o n a ls t a n d a r dm e t h o da n dg o ta 北京工业大学工学硕士学位论文 s a t i s f a c t o r yr e s u l to r g a n o p h o s p h o r u sr e s d u e sw e r ed e t e m a i n e db ys p e c t r o p h o t o m e t r y b a s e do ne n z y m ei n h i b i t i o np r i n c i p l e t h ed e t e r m i n a t i o nc o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e d s u c ha sa c i d i t y , e n z y m ea m o u n t ，r e a g e n ta m o u n t ，t i m e ，t e m p e r a t u r ei tw a sf o u n dt h a t ， w h e n i n t h ec o n c e n t r a t i o nr a n g eo f l0 x 1 0 - 3 1 0 m g i ，t h e r e w a sa l i n e a rr e l a t i o n s h i p b e t w e e ni n h i b i t i o np e r c e n t a g ea n dp a r a t h i o n ，p h o x i m ，o m e t h o a t e c o n c e n t r a t i o n l o g a r i t h m a n dd e t e c t i o nl i m i tw a s5 7 1 0 m g 。，3 3 1 0 m g l ，2 o 1 0 一m g l w h e nt h i sm e t h o dw a sa p p l i e di nt h ed e t e r m i n a t i o no fp a r a t h i o ni nv e g e t a b l e s ，a s a t i s f a c t o r yr e s u l tw a so b t a i n e d 4 e n z y m ew a se x t r a c t e df r o mn o 2w h e a t a n dn o 9 4 2 8w h e a t b a s e do ne n z y m e i n h i b i t i o n p r i n c i p l eo r g a n o p h o s p h o r u s r e s i d u e sw e r e d e t e r m i n e d u s i n g s p e c t r o p h o t o m e t r y t h ed e t e r m i n a t i o nc o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e ds u c ha sa b s o r b a n c e c u r v e ，a c i d i t y , e n z y m ea m o u n t ，r e a g e n ta m o u n t ，t i m e ，t e m p e r a t u r e ，e t c i tw a sf o u n d 矗a tw h e nn o 2w h e a tw a su s e d ，i nt h ec o n c e n t r a t i o nr a n g eo f1 0 1 0 6 - 1 0 m g l ， i n h i b i t i o np e r c e n t a g ev e r s u st h ep a r a t h i o nc o n c e n t r a t i o nl o g a r i t h mw e r el i n e a rw i t ha d e t e c t i o nl i m i to f4 7 7x10 m g l ，a n dw h e nn o 9 4 2 8w h e a tw a su s e d ，i nt h e c o n c e n f f a t i o nr a n g eo f1 0 1 0 一l o m g l i n h i b i t i o np e r c e n t a g ev e r s u sp a r a t h i o n c o n c e n t r a t i o nl o g a r i t h mw e r el i n e a rw i t had e t e c t i o nl i m i to f3 6 8x1 0 6 m g l t h i s m e t h o dp o s s e s s e dg o o dp r o s p e c t si nt h ea p p l i c a t i o n so fd e t e c t i n gt h er e s i d u e so f o r g a n o p h o s p h o m sp e s t i c i d e si na g r i c u l t u r a lp r o d u c t s ，s u c h a sv e g e t a b l e sa n df r u i t s e t c k e y w o r d ：o r g a n o p h o s p h r o u sp e s t i c i d e s ，e n z y m ei n h i b i t i o n ，b i o s e n s o r s ， s p e c t r o p h o t o m e t r y 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得北京工业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 签名：舾拯日期：巡! r 关于论文使用授权的说明 本人完全了解北京工业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部 分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 签名：舾超导师签名：磁 日期：丛占j 一 第1 章绪论 随着我国经济的飞速发展，人民生活水平不断提高，人们关注的不再仅仅是 吃饱、吃好，而是吃得健康。卫生防疫部门对果蔬中农药残留量的检测结果显示， 近年某些地区农产品中农药含量超标严重，国内最好的地区也有5 的农产品农 药残留量超标，严重的地区高达8 5 ，农药残留量超标食物中毒每年有1 0 万人 次发生。以北京为例，虽然绝大多数果蔬产品已达到国家颁布的标准，但仍有近 2 0 的农产品在质量上尚未完全达标。同时，果蔬是百姓锓桌上每天必备的食品， 而农药是提高果蔬质量、防治病虫害的重要手段，对果蔬生产起着至关重要的作 用。但是，由于使用者普遍缺乏科学使用农药知识，片面追求产量，造成目前市 场上流通的果蔬都不同程度地存在农药残留问题，果蔬中农药残留带来的危害也 日益引起公众的关注。 目前普遍使用的农药主要为有机磷、氨基甲酸酯和拟除虫菊酯等三大类。拟 除虫菊酯毒性相对较低。引起人们中毒，对人畜造成危害的，主要是有机磷和氨 基甲酸酯类农药“1 。有机磷农药是目前最常用最重要的一类农药，它包括杀虫剂、 杀菌剂、除草剂等，具有品种多、防治对象多、杀虫效率高、对植物药害小、在 环境中易降解等优点，在各种农作物尤其是果蔬中得到广泛应用”1 。但有机磷农 药中的大多数品种属于高毒性，长期大量使用会造成许多潜在的危害，如污染环 境、药害及人畜中毒等，尤其是由果蔬中有机磷农药残留所引起的中毒现象十分 严重。已有研究表明，某些有机磷农药对动物有致畸形和致癌性”3 。因此加强对 果蔬中农药残留的检测对保护生态环境，尤其是保障人类健康有着十分深远的意 义。 近几年来，我国各地都在实施无公害行动计划，其重要内容之一就是监测、 治理各大城市果蔬中农药残留超标问题。果蔬农药残留的抽样检测，在许多发达 国家早已制度化，对农药残留量超标的果蔬能有效的进行控制“1 。我国g b 5 1 2 7 - 8 5 规定：粮食中的敌敌畏、对硫磷、马拉硫磷，限量标准分别为0 1 p p m 、o 1 p p m 、 3 p p m ，果蔬分别为0 2 p p m 和不得检出。要严格控制有机磷，就必须要有高效、 灵敏、准确的检测方法保证“3 。按照“十五”规划，5 个高毒品种( 甲胺磷、久效 磷、对硫磷、甲基对硫磷、氧乐果) 的总产量要从1 9 9 9 年的1 1 7 7 万吨削减到2 0 0 5 年的2 3 3 万吨，削减8 0 以上，这将为我国发展高毒有机磷农药替代品种提供巨 北京工业大学工学硕士学位论文 大的市场。近年来，高效、低毒、低残留杀虫剂在我国发展很快，薪产品不断开 发成功，并迅速得到推广应用，如吡虫啉、吡虫清、杀卟磷、嘧啶磷、甲基嘧啶 磷、二嗪磷、定虫隆等，其中毗虫啉的开发和推广最为成功。此外，国外一些进 口产品如锐劲特、除尽、米螨等也已成功地打入国内市场，其中，农地乐( 毒死 婢+ 氯氰菊酯) 、锐劲特、除尽已在我国得到大力推广，用于防治各种蔬菜害虫、 棉铃虫以及在近几年夏季的飞机灭蝗中发挥了重要作用。随着我国削减和禁用高 毒有机磷农药的力度进一步加大，高效低毒杀虫剂将会得到愈来愈广泛的应用“7 8 9 1 1 1 有机磷农药( o p s ) 有机氯农药曾是我国最大规模使用的农药，8 0 年代初达到高峰，1 9 8 3 年我国 开始禁用了六六六和滴滴涕等有机氯农药。目前，有机磷农药是我国使用量最大 的农药。 有机磷农药是含有c p 键或c o p ，c s p ，c n p 键的有机化合物，正式商 品有几十种，如对硫磷、氧乐果、敌敌畏、马拉硫磷、辛硫磷、甲拌磷、久效磷、 甲胺磷、敌百虫、乐果、甲基1 6 0 5 、谷硫磷等。大部分有机磷农药不溶于水，而 溶于有机溶剂，在中性和酸性条件下稳定，不易水解，在碱性条件下易水解而失 效。 有机磷农药是一种神经性毒物，它的毒性主要是抑制生物体内的胆碱脂酶的 酶活性，导致乙酰胆碱这种传导介质代谢紊乱，产生迟发性神经毒性，引起运动 失调、昏迷、呼吸中枢麻痹、瘫痪甚至死亡。作为典型的酶毒剂，有机磷农药可 以通过消化道摄入，也可以通过皮肤、粘膜、呼吸道吸收而引发中毒“。 各品种的毒性不同，多数属剧毒和高毒类，少数为低毒类。某些品种混合使 用时有增毒作用，如马拉硫磷与敌百虫、敌百虫与谷硫磷等混合剂。某些品种可 经转化而增毒，如1 6 0 5 氧化后毒性增加，敌百虫在碱性溶液中转化为敌敌畏而毒 性更大。”3 。 有机磷农药( 有机磷酸酯类农药) 在体内与胆碱酯酶形成磷酰化胆碱酯酶，胆 碱酯酶活性受抑制，使酶不能起催化乙酰胆碱水解的作用，导致组织中乙酰胆碱 过量蓄积，使胆碱能神经过度兴奋，引起毒蕈碱样、烟碱样和中枢神经系统症状。 第l 章绪论 磷酰化胆碱酯酶一般约经4 8 小时即“老化”，不易复能”。 当人们食用了农药残留超标的蔬菜以后，会直接危及人体的神经系统和肝、 肾等重要器官。有的人农药中毒后出现严重头晕、头痛、腹痛、食欲减退、视觉 模糊、恶心、呕吐、多汗等症状，重度中毒者还会出现胸有挤压感、肌肉颤抖等， 严重的可出现脉搏、呼吸加快及潜昏迷症状。而慢性中毒没有上述明显症状，反 而更加深了人们对残留农药的麻痹大意。因为残留农药会在人体内蓄积，超过一 定的量度后将导致一些慢性疾病，如肌肉麻木、咳嗽等，甚至会诱发癌症、心血 管疾病和糖尿病等，对孕妇来说，则会影响胎儿的发育，甚至会导致胎儿的畸形。 而且最新研究表明，农药残留长期作用于人体，还有可能导致基因突变。农药残 留在人体内积蓄后容易引起慢性中毒，出现神经功能紊乱、精神错乱、皮肤刺激 等症状，从长期看，餐桌污染会对经济和民族发展带来危害。“1 。 1 2 有机磷农药检测方法的应用进展 目前农药残留分析的主要方法是气相色谱法( g c ) 、高效液相色谱法( h p l c ) 等，这些方法虽然分析精度高，定量准确，但其样品的前处理复杂、检测耗时长、 成本高、需要技术熟练的操作人员。而我国蔬菜生产相对分散，蔬菜要保持新鲜， 即采即卖，由采收到市场销售，所经时间很短，不允许把从市场上所抽检的大量 样本用气相色谱、高效液相色谱等分析仪器进行分析，使这些精密昂贵的仪器在 基层使用不太现实“。因此必须研究出符合我国蔬菜产销特点的检测方法，能够 满足现场检测、时间短、成本低、显示直观、定性和半定量及判断其产品是否使 用安全的要求。 对果蔬中有机磷农药残留的检测一直是食品卫生科学领域的研究重点，并具 有重要的临床诊断价值。目前国内外文献中主要报道的方法主要有光谱法、色谱 法、酶抑制法、免疫法、生物芯片技术等。 1 2 1 光谱法 光谱法是根据有机磷农药中的某些官能团或水解、还原产物与特殊的显色剂 在特定的环境下发生氧化、磺酸化、酯化、络合等化学反应，产生特定波长的颜 色反应来进行定性或定量( 限量) 测定。检出限在微克级，见表1 1 。表1 1 反映的 3 北象工业大学工学硕士学位论文 是微量化学试验法，主要用于商品农药的鉴别试验，灵敏度不高，试验干扰因素 多，含不同基团的o p s 的反应也不一样，易出现假阴性。为提高灵敏度，用分光 光度计等来测定o p s 的方法( 即波谱法) 逐渐代替了微量化学试验。a o a c 规定 了用红外光谱法检测敌敌畏、保棉磷、甲拌磷，用分光光度法检测马拉硫磷，对 硫磷等。苟中坤“7 3 利用氟磷酸酯和氰磷酸酯在碱性过氧化氢溶液中使鲁米诺产生 冷光的原理，建立了一种简便、快速的测定方法，对敌敌畏的检测范围为0 2 5 9 9 ， 对敌百虫、对琉磷等的检测范围在o 1 0 0 9 9 。但是，光谱法只能检测一种或具有 相同基团的一类有机磷农药，灵敏度不高，一般只能作为定性方法。 表卜1 各种显色反应类型及灵敏度 t a b i e 卜1t y p eo fd i f e r e n tc o l o rr e a c t i o ra n ds e n s i t i v i t y 1 2 2 色谱法 色谱法是一类分离分析方法，它根据分析物质在固定相和流动相之间的分配 系数的不同达到分离目的，并将分析物质的浓度转换成易被测量的电信号( 电压、 电流等) ，然后送到记录仪记录下来的方法。目前应用于检测有机磷的色谱法主要 有薄层色谱法、气相色谱法和高效液相色谱法。 1 2 21 薄层色谱法( t l c ) 薄层色谱法是一种较成熟的、应用也较广的微量快速检测方法，先用适宜的 第1 章绪论 溶荆提取o p s ，经纯化浓缩后，在薄层硅胶板上分离展开，显色后与标准o p s 比 较来进行定性测定，用薄层扫描仪进行定量测定，检出限达o 1 0 0 1 9 9 。由于样 品中农残成份复杂，o p s 含量较低，为此，国内外针对该方法的不同实验步骤， 如提取方法、纯化、浓缩方法、薄层板的吸附剂种类、展开剂的配制、展丌方式 ( 如单向和双向展开) 以及显色方法都作了深入的研究和改进。s h e r m aj 用c 1 8 柱固相萃取水中的o p s ，v a h k e v i c ho v 用酶抑制显色的高效薄层色谱法 ( h t l c ) 来检测马铃薯中的o p s ，检测限提高到o 0 1 5 n g 。薄层色谱法与荧光 显色技术结合，对有机磷的检出限为0 0 - - 0 0 1 t g ，与酶抑制技术结合，检出限可 达0 0 0 1 9 9 。 1 2 2 2 气相色谱法( g c ) 气相色谱法是检测有机磷农药的国家标准方法，该方法是利用经提取、纯化、 浓缩后的o p s 注入气相色谱柱，程序升温气化后，不同的o p s 在固定相中分离， 经不同的检测器检测扫描绘出气相色谱图，通过保留时间来定性，通过峰或峰面 积与标准曲线对照来定量。具有即定性又定量、准确、灵敏度高，并且次可以 测定多种成分的优点。a o a c 对大部份o p s ，如乙拌磷、丰索磷、马拉硫磷、对 硫磷，在八十年代就建立了气相色谱检测方法。我国食品理化检验国家标准方法 也采用了气相色谱检测o p s ，检出限为l n g 。郑丽丽等“8 1 应用氮磷检测器和毛细 管气相色谱柱测定了环境中五种痕量有机磷农药，混合样品中各组分以谱峰分辨 较好，互不干扰，测得甲胺磷最低检出浓度可达0 0 1 m g m l ，在保证分辨效果的 前提下将分析时间缩短了9 m i n 。张曙明等“”以丙酮石油醚混合溶剂提取残留农 药，选用氮磷检测器和s p b 一1 7 0 1 毛细管柱，建立了同时测定中药中8 种有机磷 农药残留量的前处理及其毛细管色谱测定法，结果表明：敌百虫、敌敌畏等8 种 在2 5 m i n 内有良好的分离；3 个不同浓度的标准添加，其回收率为7 4 9 6 1 1 6 8 ， 相对标准偏差为o 7 1 1 6 9 1 。其他研究还报道了用凝胶渗透色谱法净化谷物、 饲料中的o p s 残留，检出限达o 0 1 - - 0 0 5 n g 。近年来毛细管气相色谱法( c g c ) 得到了不断发展和完善，使毛细管柱基本替代了原来的填充柱，不仅提高了灵敏 度、分辨率和检测速度而且稳定性，使用寿命都比填充柱优良。国外m i y a b a r am 和j o n a g a iy 分别用电子俘获检测和火焰光度检测的c g c 法测定了食品中几十种 北京工业大学工学硕士学位论文 o p s 。而国内专家陈泉、楼小华和余建新用c g c 法分别检测了1 3 种、2 5 神和7 种不同样品中的o p s ，检出限达0 1 2 0 n g ，回收率和重复性都很好。 目前，随着气相色谱仪的普及，对可能存在o p s 残留的样品如食品、果蔬、 谷物、饲料、茶叶、水产品、土壤、植物材料、水体以及血液、化妆品、羊毛脂、 牛奶都建立了气相色谱检测方法。 1 2 2 3 高效液相色谱法( h p l c ) 高效液相色谱法是在液相柱层析的基础上，引入气相色谱理论并加以改进而 发展起来的色谱分析方法。与g c 相比，不仅分离效能好，灵敏度高，检测速度 快，而且应用面广。对气相色谱不能测定的如沸点太高不能气化以及对热不稳定， 易裂解变质的o p s 都可以用h p l c 来检测。a o a c 中有近半数的o p s 都建立了 h p l c 法。b r a n c a r ，s h a r p g j 用h p l c 分别测定了食品和水中，谷物及其制品， 水稻中的o p s 。m a r t i n d a l er w 比较了h p l c 和g c 测定马铃薯中的o p s 。不断 改进的h p l c 技术也扩大了h p l c 检测o p s 的应用范围。m a l l e tvn 研究了7 种不同的萃取方法提取环境水中的o p s ，用h p l c 来检测。c a r a b i a sr 采用紫外 h p l c 来检测水果中的o p s 。黄聪”等采用高效液相色谱法对克线磷检测，最低 检测限为1 n g ，回收率为8 3 0 9 9 1 4 ，r s d 为2 2 6 4 3 7 。 由于高效液相色谱仪价格不菲，所以推广和普及该方法有一定的困难，但随 着经济的发展，h p l c 将以其无可比拟的优点必将在o p s 检测领域占重要地位。 1 2 3 酶抑制法( e l m - ) 酶抑制法是利用o p s 的毒理特性建立的一种快速检测方法。在一定条件下， 有机磷农药对某些酯酶催化水解的正常功能有抑制作用，其抑制率与农药的浓度 呈正相关。这些酯酶包括：各种动物来源的乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶以及从 某些植物中提取的植物酯酶。使这些酶与样本进行反应，如果试样中没有农药残 留或者残留量极少，酶的活性就不被抑制；反之，如果农药残留量比较高，酶的 活性就会被农药所抑制，再利用一些特定的颜色或p h 值等的变化，从而达到检 测有机磷农药的目的”“。酶抑制法主要包括电化学传感器法和分光光度法。具体 第1 章绪论 就是将a c h e 吸附在载体上( 纸片或电极) ，当检测含有o p s 的样品时，a c h e 活 性被抑制，从纸片的颜色变化或电极的读数指示变化上可以定性检测o p s ，与标 准o p s 比较则可定量。a o a c 在1 9 6 4 年最早公布了该方法检测o p s ，美国1 9 5 8 年就已研制出称之为酶片的商品来检测o p s ，灵敏度为o 1 1 0 m 趴g 。s i g m a 公 司也有类似的检测试剂盒出售。国内李发生、朱曜分别报道了纸片法检测食品和 出口冻肉中的o p s ，灵敏度为0 1 0 3 。国内也有生化公司正式生产和销售称之 为农药速测卡的产品。k u l y sf 研制了胆碱酯酶电流传感器，b e m a b e im 用胆碱 和乙酰胆碱电化学传感器检测o p s 。李发生也报道了利用酶传感器检测5 种o p s ， 最低检出浓度为1 0 1 0 。2m o l l 。h o l g e r 。”利用有机磷农药可以特异性地抑制胆 碱酯酶研制的一次性生物传感器，对对氧磷的最低检测限为2 t g k g 。李元光等。” 研制了有机磷农药现场快速检测仪片状一次性使用乙酰胆碱酯酶电极与单片微机 的有机结合体。仪器的响应时间为3 m i n ，测定敌敌畏、对氧磷的线性范围分别 为：o 5 4 3 1 9 9 m l ，0 1 1 5 0 9 9 m l 。生物传感器在有机磷的检测中，大大缩短了 检测的周期与时间。n a n d ak u n m a rn v _ 等。”用一乙酸萘酯和固蓝b 盐制备的生 色基质片，可用于有机磷的检测。韩承辉等”在面粉中提取的植物酶用于有机磷 检测试纸的制各，用2 , 6 一二氯靛酚乙酯做底物片，检出限为0 0 4 1 0 0 m g l 。 酶抑制法最大的优点是操作简便，速度快，不需昂贵的仪器，特别适合现场 检测以及大批样品的筛选检测，易于推广普及。但是灵敏度比仪器法要差一些， 重复性、回收率还有待提高。 1 2 4 免疫法 免疫就是机体接触“抗原性异物”或“异己分子”所发生的特异性生理反应。 抗原是引起机体发生免疫应答的最基本物质。但是有机磷属小分子化合物，只能 作为半抗原。如果让机体产生抗有机磷作用的抗体，就必须将有机磷分子与大分 子蛋白质结合后制各成具有抗原性的物质，再免疫动物，让动物机体产生具有特 异性的抗体。抗体对相应的抗原具有识别和结合的双重功能，可与抗原选择性地 结合，选择性强，灵敏度高，所以免疫学方法是一种简便、快速、灵敏、特异的 生物检测方法”。固相酶联免疫测定法对一种化合物或一组化合物具有特异性， 减少基质的干扰，不需要样品的净化与浓缩。王刚垛等用醋酸- 锌粉- 盐酸还原甲 北京工业大学工学硕士学位论文 基对硫磷，制备氨基甲基对硫磷，重氮化法使氨基甲基对硫磷与牛血清白蛋白及中 国鲎血蓝蛋白偶合，合成人工抗原m 1 6 0 5 b s a 、m 1 6 0 5 t t h 。m 1 6 0 5 b s a 免疫 新西兰兔1 0 周后，双向琼脂扩散试验和间接e l i s a 检测，证明得到了高价且具 有较好特异性的多抗血清，成功地合成了甲基对硫磷人工抗原。张卫国等用同样 的方法合成了甲基对氧磷人工抗原。邓安平等”1 应用阿特拉津( a t r a z i n e ) 半抗原衍 生物共价交联于载体蛋白分子上，制成免疫抗原，经免疫得到高质量的兔抗阿特 拉津抗血清，并建立了测定阿特拉滓酶联吸附分析( e l i s a l 竞争法，测定线性范围 为0 0 5 5 0 0 “g l ，最低检出限仅为0 0 1 8 0 0 2 2 p g l ，且精密度高，特异性强。 因为免疫法特异性强，所以一种试剂盒只能检测一种有机磷，不能检测到有机磷 的总量，且有机磷抗体制作过程难度较大“8 2 。 1 2 5 生物芯片技术 生物芯片的概念源于计算机芯片，生物芯片技术是在- - 4 , 片固相载体上储存 大量的生物信息( 多至几十万个) ，并与生物化学处理等技术相结合而发展起来的 一种新兴技术。将抗有机磷抗体固定于生物芯片上，通过被标记过的抗原( 有机磷 与其他大分子物质的结合物) 与抗体的特异性结合反应达到对有机磷的检测。在有 机磷农药中，最常用的显色技术是酶标技术、荧光素标记技术与发光免疫标记技 术。l u e k i n g 等将已知蛋白点印在p v d f ( p o l y v i n y l i d e n ed i f l u o r i d e ) 膜上，制成蛋白 微阵列，并将抗体与该芯片进行孵育反应，再将辣根过氧化物酶( h r p ) 标记的第 二抗体与芯片一抗体复合物反应，通过显色反应检测抗体的存在情况，从而对抗体 进行筛选。a l c o c e r 等利用生物芯片对2 9 种有机磷农药测定分析，背景于扰非常 低，以- b s a 包被支持物，用对硫磷标准液做竞争分析，线性范围为1 5 6 2 5 0 i _ t g m l 。 比较上述五大类检测方法，光谱法和色谱法是监测检验部门分析o p s 主要方 法，而酶抑制法则更适合于基层单位的快速检测，各有长处。免疫法和生物芯片 技术代表未来的发展方向，目前尚待完善。 随着人们生活水平与环保意识的提高，对环境与食品卫生的安全呼声也越来 越高，除了严格地控制有机磷农药的生产、运输、施放等环节外，必须要不断研 究新的检测方法来满足，快速检测与精确检测是有机磷检测面临的课题。在将来 第1 章绪论 的研究中，不但要在单一的检测方法中做文章，而且要在几种学科的相互结合上 下工夫，如酶抑制方法与免疫化学方面的结合，所研制的有机磷检测仪器要向快 速、简便、小型化等方向发展。 1 3 本研究课题的来源及研究工作主要内容 综上所述，有机磷农药大量使用引发的食物中毒己越来越引起各国政府和公 众的关注。加强对有机磷农药残留监测方法和环境毒理学研究，对于合理开发和 正确指导使用农药，保护生态环境，保护人类使康，避免和减少不必要的农业损 失等都具有重要的现实意义。而快速检测有机磷农药已经成为环境监测和食品卫 生领域的热点和重点。本论文的主要研究目的也正是在酶抑制原理的基础上，寻 找一种有效的、易于普及的有机磷农药检测方法。本论文主要完成了以下几项工 作： 研究出能够现场检测水质、食品等实际样品中农药残留量的化学传感器， 并对其电极表面机理做出合理解释，优化传感器的工作条件并对其响应能力做出 判断及合理推理： 寻找出从动植物体内提取酶源的简单、有效的方法； 使用所提取的酶源，利用酶抑制分光光度法检测有机磷农药残留，对工作 条件进行优化，根据灵敏性、准确性等条件选择出最佳酶源。 课题来源：国家自然科学基金( n o ，2 0 2 4 7 0 0 2 ) 、北京市教育委员会科技发展 计划项目基金( k m 2 0 0 3 1 0 0 0 5 0 0 8 ) 和中共北京市委组织部基金( k 1 0 5 0 1 2 0 0 2 0 1 ) 资助项目。 9 第2 章基于酶抑制原理的电化学生物传感器的研究 第2 章基于酶抑制原理的电化学生物传感器 的研究 2 1 化学传感器 2 1 1 化学传感器及其分类 化学传感器是由化学敏感层和物理转换器结合而成的，是能够提供化学组成 的直接信息的传感器件。对化学传感器的研究是近年来由化学、生物学、电学、 光学、力学、声学、热学、半导体技术、微电子技术、薄膜技术等多学科互相渗 透和结合而形成的一门新兴学科。 化学传感器分类如下：电化学传感器、光学传感器、质量传感器、热学传感 器。其中电化学传感器又包括：离子选择电极、生物传感器、气体传感器。下 文将对生物传感器详细介绍。 化学传感器的发展可分为两个阶段。在6 0 年代和7 0 年代，化学传感器家族 的主要成员是离子选择电极。从6 0 年代中期氟离子电极的研制开始，一系列固膜 电极和聚氯乙烯膜电极相继出现，应用涉及化学、生物、医学、工业、农业、海 洋、地质、气象、国防、公安、环保、宇航等各个领域，可谓盛行一时。从8 0 年代中期开始，由于生物传感器和气体传感器的发展，离子选择电极在化学传感 器中已不再占有压倒地位。 2 1 2 生物传感器 生物传感器是用固定化的生物体成分( 酶、抗原、抗体、激素等) 或者生物 体本身( 细胞、微生物、组织等) 为敏感元件，在与适当的能量转换器结合而成 的器件。它能测定许多化学和生物成分的含量。敏感元件的产生与待测化学量和 生物量( 或浓度) 相关的化学或物理信号( 原始信号) ，然后由能量转换器转换成 易于测量的电信号( 次级信号) 。 生物传感器的分类方法很多，若按生物敏感材料的不同来划分，它可分为酶 传感器、免疫传感器、细胞传感器和组织传感器：按换能器来划分，它可分为电 化学生物传感器、热学生物传感器、光学生物传感器、半导体生物传感器和声学 北京工业大学工学硕士学位论文 生物传感器。而电化学生物传感器主要为酶电极。“”1 。 生物传感器与传统的检测手段相比有如下特点： 生物传感器是由高度选择的分子识别材料与灵敏度极高的能量转换器结 合而成的，因而它具有很好的专一性和极高的的灵敏度，一般不需要进行样品的 前处理： 体积小，可实现连续的在线、在位、在体监测； 响应快、样品用量少，可以反复多次使用； 易于实现多组分的同时测定； 成本远低于大型分析仪器，便于推广普及。 但是，我们在看到生物传感器的优点的同时，也必须注意到它的缺点。例如 不同的酶，其选择性有很大的差别；其次，生物传感器的工作条件比较苛刻，生 物敏感材料只有在最佳的p h 范围内才有最大的活性，其工作温度大多数局限于 1 5 4 0 的狭窄范围内，并且只能在短时间内保持活性。因此本文在使用酶传感 器的同时，必须优化工作条件，使生物活性物质发挥最大程度的作用。 2 2 胆碱酯酶电化学生物传感器 胆碱酯酶生物传感器是将胆碱酯酶固定在电极表面，酶催化底物生成胆碱和 乙酸。本论文使用的乙酰胆碱酯酶( a c h e ) 是与神经化学传递有关的乙酰胆碱( a c h ) 的水解酶，有机磷农药能与胆碱酯酶不可逆结合形成性质稳定的磷酰化胆碱酯酶， 使其失去活性，难于发挥正常作用而引起中毒。过量的乙酰胆碱累积会造成许多 行为系统功能失调，有时甚至造成呼吸系统瘫痪而死亡。目前常用a c h e 与胆碱氧 化酶( c o x ) 共同修饰制各酶电极。c o x 可进一步氧化胆碱，其反应历程如下： a c e t y l c h d h e + h2 0 业坐骂c h 。l i n e + c h 3 c o o h ( 1 ) c h o l i n e + 2 0 2 + h 2 0 艘地业垒! o b e t a i n e + h 2 0 2 ( 2 ) 根据电信号的不同，可以分为电位型和电流型两类删。 2 2 1电位型 在反应( 1 ) 中，乙酰胆碱在乙酰胆碱酯酶的催化作用下，生成乙酸。乙酸可以 第2 章基于酶抑制原理的电化学生物传感器的研究 电离，从而改变溶液的p h 值。当有机磷农药抑制该酶反应时，水解反应生成的乙 酸量减少， h 改变，影响溶液p h 值。电位型酶电极最常使用的基底电极是p h 玻璃敏感电极，利用p h 电极响应信号的改变量间接测定有机磷农药。k u m a r a n ”4 。 采用多种方法将丁酰胆碱酯酶固定在p h 电极敏感端，从重现性、稳定性及实用 性等方面对酶电极进行了研究。用戊二醛和牛血清白蛋白与丁酰胆碱酯酶交联制 成酶膜，固定于p h 电极表面制备的酶电极效果最佳。他们用此方法将丁酰胆碱酯 酶交联在预活化了的尼龙一聚酰胺膜上，用尼龙网将