（发酵工程专业论文）黑曲霉酸性β甘露聚糖酶高产菌株的诱变育种及固态发酵.pdf

摘要 摘要 本研究论文以一株实验室保藏的酸性p 甘露聚糖酶产生菌黑曲霉( a s p e r g i l l u s n i g e r ) l w - 1 作为原始出发菌株，首先经自然分离筛选出一株产酶较稳定的n 9 作为诱 变出发菌株，再经真空微波和甲基磺酸乙酯( e t h y lm e t h a n e s u l f o n a t e ，e m s ) 逐级诱变 处理，采用基础发酵培养基固态发酵筛选以及斜面传代培养，获得了一株高产、稳产1 3 甘露聚糖酶的e 3 0 菌株。其产p 甘露聚糖酶活性达3 6 6 7 5u g 干曲，是原始出发菌株 ( 1 7 0 4 8u g 干曲) 的2 1 5 倍。e 3 0 菌株三角瓶麸曲种子保藏两个月，产酶活性稳定。 对a s p e r g i l l u sn i g e re 3 0 所产p 甘露聚糖酶进行最适反应p h 和p h 稳定性实验，结果与 a s p e r g i l l u sn i g e rl w - 1 一致，判定为酸性酶。 以诱变育种筛选出的a s p e r g i l l u sn i g e re 3 0 作为种源，对其三角瓶固态发酵工艺条 件进行优化。经单因素试验和正交实验设计，从有机碳源混合比例、有机氮源与有机碳 源比、魔芋粉添加量、玉米浆添加量、料水比、无机氮源的种类和添加量、k h 2 p 0 4 加 量、表面活性剂等方面，考察其对突变株e 3 0 三角瓶发酵产酶的影响。获得黑曲霉e 3 0 最优化发酵培养基及培养条件为：2 5 0m l 三角瓶装基料( 豆饼粉：玉米粉：麸皮= 1 0 ： 0 9 ：8 1 ) 1 0 0g ，魔芋粉0 7g ，n h 4 n 0 30 1 8 5g ，c a c i z o 0 1 2 5g ，m g s 0 4o 0 1 2 5g ，k h 2 p 0 4 0 0 3 6g ，料水比为1 ：1 7 ，自然p h ；最佳培养条件为：3 3 。c 静置培养9 6h ，期间在2 4h 翻曲1 次。最高产酸性p 甘露聚糖酶酶活性为：5 5 8 7 6u g 干曲。为优化前的1 5 2 倍。 以三角瓶优化发酵培养基及发酵条件为基础，对a s p e r g i l l u sn i g e re 3 0 曲盘发酵工 艺条件进行了较全面、系统的研究。制定了曲盘发酵进程曲线( 包括：曲盘发酵过程中 b 甘露聚糖酶活性、曲料水分、还原糖含量、曲料p h 、曲料中心温度的变化) 。根据进 程曲线，试验了曲料初始p h 、发酵过程中加水量、通气状况改变和变温操作对曲盘发 酵产酶的影响。获得了较为适合的曲盘发酵条件：即发酵2 4h 后加相当于基料2 0 的 水；发酵前期( 7 2h 之前) ，每隔一定时间将曲盘取出培养箱放置2 0 分钟；实行变温操 作( 3 3 发酵4 8h ，后将温度降低到3 0 ) ；自然p h 。最高曲盘发酵产酸性p 甘露聚 糖酶酶活性为4 8 9 2 3u g 干曲。 关键词：黑曲霉酸性d 甘露聚糖酶诱变育种 固态发酵 a b s t r a c t a b s t r a c t t h er e s e a r c hs t a r t e df r o mn a t u r a l l yi s o l a t i n gap a r e n ts t r a i na s p e r g i l l u sn i g e r l w - 1w h i c hc o u l dp r o d u c ea c i d i ci b - m a n n a n a s e t h e np u ti tt h r o u g hv a c u u m m i c r o w a v ei r r a d i a t i o na n de t h y lm e t h a n e s u l f o n a t ef o rp r o c e s s i n g b yb a s i cm a d i u m s o l i d s t a t ef e r m e n t a t i o na n dm u l t i g e m e r a t i o nc u l t i v a t ea n ds c r e e n i n go b t a i n a h i g h y i e l da n ds t a b l e1 3 - m a n n a n a s eo np r o d u c i n gs t r a i na s p e r g i l l u sn i g e re 一3 0t h e e n z y m ea c t i v i t yo ft h i ss t r a i nr e a c h e d3 6 6 7 5u gw h i c hw a s2 15t i m et h eo r i g i n a l s t r a i n y i e l d ( 17 0 4 8u g ) t h ee n z y m ea c t i v i t y o fe 一3 0r e m a i n e ds t a b l ea f t e r t w o m o n t hs t o r a g e a n dt h e1 3 - m a n n a n a s ep r o d u c e db ya s p e r g i l l u sn i g e re - 3 0i sa c i d e n z y m e ，w h i c hh a sb e e np r o v e db yt h eo p t i m u ma n ds t a b l ep he x p e r i m e n t u s i n ga s p e r g i l l u sn i g e re - 30a sap a r e n ts t r a i n t oi m p r o v et h ec o n d i t i o ni n s o l i d s t a t ef e r m e n t a t i o n i no r d e rt ot e s tt h ei m p a c to fd i f f e r e n to r g a n i cc a r b o n r e s o u r c em i x i n gr a t i o ，d i f f e r e n tk o n j a kp o w d e ra n dc o r ns t e 印q u a n t i t y , d i f f e r e n t i n o r g a n i cn i t r o g e nr e s o u r c ea n di t sq u a n t i t y , k h 2 p 0 4q u a n t i t ya n dd i f f e r e n tc n r a t i o d e s i g n e ds i n g g l ef a c t o rm e t h o da n do r t h o g o n a le x p e r i m e n t t h eb e s tc u l t u r e m e d i u mc o n t a i n st h ef o l l o w i n g ：s o y b e a r lc a k ep o w d e r1 og ，c o i t ip o w d e r0 9g ， w h e a tb r a n8 1g ，k o n j a kp o w d e ro 7g ，n h 4 n 0 30 18 5g ，c a c l 2o 012 5g ，m g s 0 4 0 012 5 g ，k h 2 p 0 40 0 3 6g ，a n d l ：1 7m a t e r i a l - w a t e rr a t i o t h eb e s tc u l t u r e c i r c u m s t a n c ei s ：3 3 f o r9 6h o u r s t h ee n z y m ea c t i v i t yo ft h eh i g h e s ty i e l ds t r a i n r e a c h e d5 5 8 7 6u g ，w h i c hw a s1 5 2t i m et h eo r i g i n a l3 6 6 7 5u g b a s e do nt h eo p t i m a lf l a s kc u l t u r em e d i u ma n df e r m e n tc o n d i t i o n s ，k o j ip l a t e f e r m e n t a t i o nf o ra s p e r g i l l u sn i g e re 一3 0w a ss t u d i e dc o m p r e h e n s i v e l y t h ep r o c e s s c u r v eo fk o j ip l a t ef e r m e n t a t i o n w h i c hi n c l u d ee n z y m e a c t i v i t y o fa c i d i c 1 3 - m a n n a n a s e ， w a t e rc o n t e n t s ， o l i g o s a c c h a r d i e sc o n t e n t s ，p h o fm a t e r i a la n d t e m p e r a t u r eo fc e n t r a lm e d i u mh a db e e nd e s i g n e da f t e r 10 8hf e r m e n t a t i o n t h em o s t s u i t a b l ec o n d i t i o n si nk o j ip l a t ef e r m e n t a t i o nw e r ef o u n da f t e rs e v e r a le x p e r i m e n t s t h es t r a i na s p e r g i l l u sn i g e re 30s h o w e dh i g ha n ds t a b l ea c i d i c1 3 - m a n n a n a s e a c t i v i t y ( 4 8 9 2 3u 曲w i t ht h ec o n d i t i o n so f2 0 w a t e ri n c r e a s ei nm e d i u m ，o x y g e n i n p u tq u a n t i t yi n c r e a s ei np r e 一7 2 h ，t e m p e r a t u r ea d j u s t m e n tf r o m3 3 。ct o3 0 ca f t e r 4 8 ha n dn a t u r a lp h k e y w o r d s ：a s p e r g i l l u sn i g e r a c i d i c1 3 - m a n n a n a s e b r e e d i n g s o l i d s t a t ef e r m e n t a t i o n l i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、；1 2 编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 导师签名： 日 期： 娜8 一弓弓j 一矗 厶塑 越刀下 盐 一 第一章绪论 第一章绪论 1 1 b 甘露聚糖酶简介 p 一甘露聚糖酶( p 1 ，4 d m a n n a nm a n n o h y d r o l a s e ，e c3 2 1 7 8 ) 是一种能降解甘露聚 糖、葡萄甘露聚糖和半乳甘露聚糖主链中p 1 ，4 d 甘露糖苷键的水解酶，属于半纤维素 酶类【1 1 。其在食品、医药、造纸、纺织、饲料、精细化工和石油丌采等行业中有着广泛 的应用前景【2 ，3 1 。目前，国内外相关文献报道中，关于微生物p 一甘露聚糖酶的研究主要包 括：产b 一甘露聚糖酶微生物( 包括细菌、真菌、放线菌等) 的分离筛选；发酵产酶条件( 包 括固态、液体产酶培养基和培养条件的优化、外界环境因素对微生物产酶的影响) ；酶 的分离纯化及其理化性质( 包括组分数、分子量、等电点、最适温度和p h 值、温度和 p h 稳定性、动力学特性和底物专一性等) ；以及酶基因的克隆与表达、高产酶工程菌的 构建等。 1 1 1 3 - 甘露聚糖酶的作用方式及水解产物1 4 i p 甘露聚糖酶的作用底物包括甘露聚糖和异甘露聚糖，其中异甘露聚糖主要有葡萄 甘露聚糖( g l u c o m a n n a n ) 、半乳甘露聚糖( g a l a c t o m a n n a n ) 以及半乳葡萄甘露聚糖 ( g a l a c t o g l u c o m a n n a n ) 。不同来源的p 甘露聚糖酶对不同来源的底物作用方式和作用产物 是不同的。p 甘露聚糖酶水解底物的方式和深度主要与0 【半乳糖残基和葡萄糖残基在主 链中的位置、含量、酯酰化的程度有关，并且底物本身的物理状态也会影响酶对底物的 作用。如，结晶状态的甘露聚糖不易被降解；底物浓度过高会对酶的活性中心起保护作 用，影响酶对底物的作用效率。另外，不同来源的p 甘露聚糖酶对底物存在状态的要求 秒。甄。 a p y 6 图1 - 1b 一甘露聚糖酶和l ，4 - p d - 甘露聚糖链结合模式 f i g 1 - 1 ；- m a n n a n a s ea n d1 , 4 1 3 - d - m a n n a nb o n dm o d e l 也不一样，如瓜儿胶种子( g u a rs e e d ) 产生的b 甘露聚糖酶，要求底物中有5 个连续的甘 露糖残基( 图1 1 ) ，酶主要结合在b 、d 残基的羟甲基一侧，a 、c 、e 三残基的2 个羟 基侧，半乳糖若与b 、c 、e 残基通过仅1 ，6 糖苷键相连或取代其中某个残基，都将改 变糖链的基团位置和构型，进一步影响与酶的结合。c 、e 被葡萄糖残基取代，同样不 被酶降解，但如果b 、d 残基被葡萄糖残基取代，因仍然有羟甲基位于相同的一侧，并 不影响酶的降解。而从a s p e r g i l l u sn i g e r 中获得的p 甘露聚糖酶则对底物中连续的4 个残 基有要求。bvm c c l e a r y 认为，1 ，4 b d 甘露聚糖有2 重轴的缎带式结构是必要的，这 江南人学硕+ 学位论文 种构型只允许半乳糖在甘露聚糖主链的两侧。 甘露聚糖经d 甘露聚糖酶作用后，通过h p l c 或纸层析法分析，主要产物是寡聚糖 ( 一般2 1 0 个残基) ，产物聚合度的大小与酶和底物的来源有关 5 - 8 】，但相对来说，产生 单糖( 甘露糖) 很少或根本不产生。 1 1 2 b 甘露聚糖酶的来源和诱导 p 甘露聚糖酶的来源较广泛，包括细菌、真菌、放线菌、植物以及软体动物等。微 生物是产生b 甘露聚糖酶的主要柬源。已报道的如细菌中的芽孢杆菌、假单胞菌、弧菌， 真菌的曲霉、木霉、酵母、青霉、多孔菌、核盘菌和放线菌中的链霉菌都是产p 甘露聚 糖酶的常见类群。表1 1 列出了一些产生该酶的微生物【7 】。 表1 - 1 部分产生b - 甘露聚糖酶的微生物 t a b l e1 - 1s o m ep m a n n a n a s ep r o d u c i n gm i c r o o r g a n i s ms t a i n s 2 笫一章绪论 在一些低等动物，如海洋软体动物( 1 i t t o r i n ab r e v i e u l a ) 的肠道分泌液中；豆科植物如 四棱豆、长角豆等萌发的种子中；天南星科似r a c e a e ) 植物魔芋的球茎中；松属、桉木木 材，棉籽、咖啡豆、椰肉及成熟的番茄果实中都发现了d 甘露聚糖酶酶活性的存在【3 邓6 | ， 并且不同来源的酶具有不同的特性，可应用在不同的领域。 微生物产p 甘露聚糖酶一般以胞外诱导酶的形式存在于微生物体中，只有很少的以 组成酶形式存在。对于大部分产d 甘露聚糖酶的微生物，在培养基中添加少量的甘露多 糖或甘露寡糖，如魔芋粉、槐豆胶、角豆胶或其水解物等，能极大提高产酶水平。有时 其它一些半纤维素类物质或苯酚类化合物( 一类表面活性剂) 也能有效增加微生物1 3 甘 露聚糖酶的分泌水平。 1 1 3d 甘露聚糖酶的理化性质 不同微生物产生的1 3 甘露聚糖酶的组分数、相对分子质量、等电点、酶动力学特性、 底物专一性等都有一定的差异。其相对分子质量小的只有2 2k d a ，大的则可达到6 2k d a ， 相差悬殊。细菌中研究最为详细的要数芽孢杆菌，一般等电点( p i ) 在4 0 5 5 ，最适反 应温度5 0 7 0 ，最适反应p h 在5 5 7 o ，通常称为碱性p 甘露聚糖酶，一般具有较强 的耐热性。真菌来源的p 甘露聚糖酶其p i4 0 5 0 ，最适反应温度5 5 7 5 c ，最适反应 p h4 5 5 5 ，通常称为酸性d 甘露聚糖酶。相对细菌来说，真菌来源的p 甘露聚糖酶p h 稳定性、最适反应p h 都偏低，耐热性也比较差。而植物细胞产生的p 甘露聚糖酶，其 最适反应温度和耐热性要比细菌和真菌低，最适反应p h4 5 5 5 ，略显酸性，这些特点 可能是由植物生长环境和生理条件所决赳引。 许多微生物产生的b 甘露聚糖酶为多分子型，即产生几种同工酶。这些酶可能在相 对分子质量或等电点上有着微小的差别，但在水解甘露聚糖时活力却明显不同，有着一 定的互补关系。这说明微生物1 3 甘露聚糖酶的诱导和分泌是一个复杂的代谢调节过程 1 4 0 o 1 1 4d - 甘露聚糖酶的遗传基础1 3 9 i 到目前为止，只有少数几株菌的b 一甘露聚糖酶基因被分离和克隆，并经过序列分析， 如极端嗜热厌氧菌( c a l d o c e l l u ms a c c h a r o l y t i c u m ) 、荧光假单孢菌( p s e u d o r n o n a s f l u r e s c e n s 江南人学硕士学位论文 s u b s p e c i e sc e l l u l o s a ) 、变青链霉菌( s t r e p t o m y c e sl i v i d a n s6 6 ) 等。这些基因大多只有一个开 放阅读框( o r f ) ，在该o r f 自i 有与1 6 sr r n a 相结合的序列。原核生物成熟肽的序列前 还有比较明显的信号肽序列及加工特点。另外，b a c i l l u s a m 0 0 1 、t r i c h o d e r m ar e e s e i 的 p 甘露聚糖酶基因的o r f 能产生不止一种p 甘露聚糖酶，它们的n 端氨基酸序列是相 似的，证明它们经过了不同的转录、翻译和蛋白质加工过程。t r i c h o d e r m ar e e s e i 产生的 五种b 甘露聚糖酶也很可能不只是一个基因的产物。这些基因产物往往都有多个功能 域，起着催化和结合底物的作用。使人吃惊的是，除荧光假单孢菌产生的d 甘露聚糖酶 仅有单一的催化功能域外，这些酶大多具有纤维素结合域( c b d ) 。从c a l d o c e l l u m s a c c h a r o l o y t i c u m 的m a na 与c e l a 、c e l b 、c e lc 的序列分析来看，它们属于同一个纤 维素半纤维素双功能基因家族( f a m i l y2 6 ) ，这一家族的基因有l 至多个c b d 和多个酶 活性域。这一结果很可能是植物纤维素和半纤维素总是相伴存在的组织结构的一种反 映，一方面可以更好地结合靶物，另一方面破坏底物的晶状结构有利于水解。 关于1 3 甘露聚糖酶的调控目前研究不多。有资料证明，除干腐菌( m e 础l i ss i l v e s t e r ) 、 褐环乳牛杆菌( s u i l l u sl u l e u s ) 、褐疣柄牛杆菌( l e c c i n u ms c a b r u m ) 的d 甘露聚糖酶是组成酶 外，大多数b 甘露聚糖酶是诱导酶。不仅诱导效率依赖于基质的结构，而且引起诱导作 用的多糖并不都是p 甘露聚糖酶作用的底物。许多资料说明，微生物来源的p 甘露聚糖 酶是胞外酶，但也有与细胞膜或细胞壁结合的p 甘露聚糖酶的报道，如甘露聚糖气杆菌 ( a e r o b a c t e rm a n n a n o l y t i c u s ) 、类菌体( b a c t e r o i d e so v a t u s ) 。对于d 甘露聚糖酶的起源，是 起源于一个还是两个古老序列，仍有待进一步研究。 1 1 5 3 - 甘露聚糖酶的应用 近年来，随着科学的进步和人们生活水平的提高，健康饮食、科学生活成为了时代 主题。其中功能性低聚糖( 包括甘露低聚糖) 的研究和应用成为人们最为关注和期许的 话题，在此背景下，甘露低聚糖的更多生理功能被一一发现并应用到相关行业。酶法产 甘露低聚糖是甘露低聚糖生产中最高效、便捷的方法。随着d 甘露聚糖酶应用领域的不 断拓展，其需要量逐渐增加，对d 甘露聚糖酶的研究和开发也越来越多，其在食品、饲 料、造纸、印染、纺织、石油开采、医药和生物研究技术等多方面都有广泛应用。 1 1 5 1 3 - 甘露聚糖酶在食品工业中的应用1 4 1 - 4 3 l d 甘露聚糖酶能够水解甘露聚糖和异甘露聚糖生成甘露低聚糖( 由2 l o 个单糖单 位构成的低聚糖组合) ，甘露低聚糖可作为肠道有益菌双歧杆菌的增殖因子，可有效改 善肠道菌群结构，调节肠道功能。近年来不断有研究报告指出，甘露低聚糖还具有保肝、 抗肿瘤、增强人体及动物免疫力、降低胆固醇、抗衰老等生理功能，可适用与老年人、 儿章的日常保健。它还是可替代蔗糖的健康甜味剂，用于饮料、糖果、饼干、果脯币n - g l 制品等食品。 甘露聚糖大量存在于自然界，和木聚糖共同构成仅次于纤维素的自然第二大组分， 许多动植物体内都存在甘露聚糖，其中有许多作为食品加工过程中的原料。甘露聚糖的 4 第一章绪论 存在会导致产品黏度、澄清度和其他物理性状的不达标，并且因原料黏度大，对生产设 备的要求较高，同时也增加了清洗难度和生产能耗，如何解决食品加工过程中的原料黏 度、降低能耗是目前食品加工行业中的难题。p 甘露聚糖酶可降解植物胶生产功能性低 聚糖【卯，可有效降低食品黏度和增加食品功能营养的双重功效，被广泛的应用于食品加 工过程中。目前有关p 甘露聚糖酶用于食品加工的报道主要有：用于速溶咖啡生产，降 低咖啡提取物的粘度【3 0 】；用于果汁、蔬菜汁的澄清。 1 1 5 2 b - 甘露聚糖酶在饲料工业中的应用1 4 5 l 谷类、豆类及其副产品中普遍存在一种抗营养因子一p 1 ，4 一d 甘露聚糖，它不能被 动物体内的消化酶所分解，造成肠道内容物黏度增加，降低动物对饲料中营养物质的消 化吸收，使饲料的利用率不高。不仅如此，不被动物吸收利用的甘露聚糖进入动物肠道 可为厌氧有害的微生物增殖发酵提供碳源并产生毒素，造成雏鸡、仔猪肠道疾病，抑制 畜禽生长。b 甘露聚糖酶可分解甘露聚糖，降低肠道内容物的黏度；它能破坏饲料中植 物的细胞壁结构，使营养物质能与消化酶充分接触，提高饲料的利用率；p 甘露聚糖酶 可促进营养成分消化，改善动物肠道微生物生态及动物体的健康状况；还可提高微量元 素的生物利用率，并且降解产物甫露寡糖可吸附真菌毒素；在饲料中添加甘露聚糖 酶，还可减少抗生素等化学药物的使用。 目前，d 甘露聚糖酶是我国已经批准使用的1 2 种饲料级酶制剂中的一种，并作为 一种高效的饲料添加剂广泛应用于饲料工业中。从上个世纪9 0 年代以来，欧美国家9 0 的家禽饲料中添加酶制剂，6 0 的猪用日粮中添加酶制剂。我国起步较晚，但其一直是 饲料生产和应用研究的重点，甘露聚糖酶作为一种重要的饲料用酶，近年来受到了越来 越多的重视。据相关报道将甘露聚糖酶添加到鸡( 家禽) 饲料中，可有效的提高肉鸡的 生长，提高蛋鸡产蛋率，提高饲料利用率，并且减少鸡粪便的排泄，减轻了环境压力。 甘露聚糖酶应用在猪日常饲料中，可增强猪的抗病能力，减少抗生素等的应用，有利于 生产高品质的猪肉及系列肉制品。 1 1 5 3 d - 甘露聚糖酶在造纸和纺织工业中的应用 4 2 , 4 3 , 4 6 , 5 9 ，6 5 ，“l 在造纸和纺织工业中，原料主要由纤维质和半纤维质组成，这两种成分的组成结构 直接影响生产出来的纸和纺织品的品质。传统的造纸工艺中，人们采用漂白粉( c a ( c i o ) 2 ) 对纸浆进行漂白，增加纸的美感；使用化学碱提取纸浆。这些工艺由于大量的使用化学 制品，使造纸污水不达标排放，造成了严重的环境污染。将d 甘露聚糖酶运用于纸浆的 漂白，一方面可以得到比单纯用氯漂白、碱提取过程更好的纸浆特性，提高了纸的质感 和美感，还可以减少氯和碱的用量以及由它们带来的环境污染问题。在具体的应用上可 以同时与木聚糖酶协同作用【3 。 在纺织品的生产过程中，b 甘露聚糖酶可用于布料软化、抛光。粗制品布料往往含 有一些纤维素、半纤维素短链，造成布匹质地较硬，质感不好。将酶制剂应用于纺织品 的软化、抛光可以很好的提升纺织品的品质，并且也为环境保护作出巨大贡献。 江南人学硕十学位论文 1 1 5 4 1 3 - 甘露聚糖酶在其他方面的应用 近年，中科院微生物研究所、辽河油田井下作业公司和山东沂水酶制剂厂联合将p 甘露聚糖酶制剂用于低温油井破胶，取得了突破性进展【l 】。由于甘露聚糖酶可降解食物 中含有的甘露聚糖或甘露异聚糖，生成甘露低聚糖，刺激人身体的免疫功能和自愈系统 】，因此，甘露聚糖酶也被应用于医药工业中。近些年，p 甘露聚糖酶还用于蛋白质工 程等生物技术中。 1 2 微生物诱变育种研究背景1 4 8 l 目前，微生物在解决人类粮食、能源、健康、资源和环境保护等方面显露出日益重 要且不可替代的特殊作用。微生物的研究利用，尤其是微生物的诱变育种研究成为生命 科学研究的重点。根据诱变剂的种类不同，可将诱变育种分为物理诱变、化学诱变、生 物诱变和空间诱变育种。 常用的物理诱变剂有：非电离辐射的紫外线( u v ) 、激光和离子束；可引起电离辐 射的x 射线、丫射线和快中子；还有近年来刚刚兴起的新型物理诱变方法微波诱变。 微波是一种频率在3 0 0 m h z 3 0 0 g h z 之间波动的低能电磁波谱【6 铺。从l8 世纪科学家 们发现其参与并影响多种生命过程开始，微波便和我们的生活密不可分。微波诱变起始 于1 9 7 6 1 9 7 8 年之间，由同本东京大学的s a s a k i 等在同步发射装置上进行了噬菌体、病 毒孢子和低等真核生物的突变效应的研究开始，此后，便相继有相关报道出现【6 8 1 。利用 物理诱变方法对微生物进行诱变，不仅操作简单方便、能耗少、诱变效果较好、诱变周 期短，且对人体的危害少。因此，物理诱变是目前微生物诱变育种方法的首选。其中使 用最多的是紫外线( u v ) 诱变。 化学诱变剂中，主要有烷化剂、碱基类似物和吖啶化合物。其中的烷化剂因可与巯 基、氨基和羧基等直接反映，从而引起基因突变。最常用的烷化剂有n 甲基n 硝基- n 亚硝基胍( n t g ) 、甲基磺酸乙酯( e m s ) 、甲基亚硝基脲( n m u ) 、硫酸二乙酯( d e s ) 和环氧乙酸等。采用化学诱变剂对微生物进行诱变效果良好，诱变机理清晰明了，它能 诱发微生物点突变和导致染色体畸变这类d n a 的大损伤。但其缺点是毒性大会导致人 类等高级哺乳动物细胞癌变，因此操作时需加倍小心。 生物诱变主要是利用微生物之间的相互关系，通过另一种微生物生长代谢过程中所 产生的次级代谢产物对诱变株产生作用，使诱变株的遗传变异向人们所需方向进行。这 种方法最符合微生物生态的要求，但诱变菌难求且过程难以控制，故较少使用。 1 9 7 3 年，美国首次发射s l l 空间实验室，成功的在空间生产出产量大、纯度高 的治疗心血管病的尿激酶药物。另外，在7 0 年代，德国也曾对细菌、放线菌进行了空 间生长实验，发现细菌、放线菌的生物量成倍增加，大肠杆菌的基因重组率显著增加， l g 枯草杆菌形成的孢子数比对地面上的孢子数增加了4 倍。由此开启了空间微生物育 种的先河。空间微生物诱变育种是利用空间的高真空、微重力、强辐射、高能粒子和交 变磁场的特殊环境，使微生物菌种的基因变异，再经地面筛选、驯化，增加微生物制品 6 第一章绪论 的产量和质量，甚至产生新的对人类发展有用的微生物代谢产物【4 9 1 。但微生物的空间诱 变育种要依附于国家航天事业的发展程度，需求量大，但实践的机会很小。因此，许多 研究者通过对空间环境的部分模仿来实现诱变育种，本论文所采用的真空微波诱变也有 相似的出发点。 目前所见报道中，有关于p 甘露聚糖酶产生菌的诱变育种还很少。李江华【6 3 1 等通过 u v 对产1 3 甘露聚糖酶黑曲霉菌株进行诱变，取得了很好的效果。本研究也试验了u v 对黑曲霉产1 3 一甘露聚糖的影响，试验结果不理想，排除了这种诱变方法而采用了真空微 波和e m s 复合诱变方法。 1 3国内外发展现状及课题研究目的 1 3 1 国内外发展现状 对p 甘露聚糖酶的研究始于上个世纪，五十年代末，丌始出现有关微生物生产d 甘 露聚糖酶。1 9 5 8 年，c o u r t i o s 第一次报道了能产生p 甘露聚糖酶的真菌；1 9 6 0 年，w i l l i a m 和d o e t s c h 报道了细菌产生的p 甘露聚糖酶；1 9 6 5 年，r e e s e 和s h i b a t a 提出了d 甘露聚 糖酶的概念和定义【4 7 ，4 8 1 。7 0 年代后，有关p 甘露聚糖酶的研究及相关文献报道逐渐增多。 研究工作主要涉及：产p 甘露聚糖酶微生物菌株的选育，产酶发酵工艺条件的优化、酶 的分离纯化和理化特性，酶的作用机理，不同来源酶的特性及应用等方面【1 9 , 5 0 - 5 2 】。进入 9 0 年代，随着基因工程和蛋白质工程技术的不断发展和广泛应用及p 甘露聚糖酶在食 品、医药、造纸、饲料和石油开采等领域中所具有的潜在的应用前景，对p 甘露聚糖酶 的研究开始转向酶基因的克隆、表达和活性位点等方面【“4 5 1 ，目前已有一些微生物和动 植物的1 3 甘露聚糖酶基因被克隆，并在大肠杆菌和真菌表达体系中获得了表达，但成熟 的报道并不多。 在现有的文献报道中，所见最多的为微生物发酵生产1 3 甘露聚糖酶。主要包括液体 发酵和固态发酵。 其中液体发酵主要为细菌，如，如“n 等【5 3 】利用黑曲霉n c h 1 8 9 产酶活性2 8u m l ； 余红英【5 4 】利用枯草芽孢杆菌s a 2 2 发酵产酶活性达2 2 3u m l ；马延和等5 5 3 利用嗜碱芽 孢杆菌b a c i l l u ss p n 1 6 5 发酵产酶活性达3 0 0u m l ；陈一平【4 】对芽孢杆菌m 5 0 进行了发 酵产酶试验，发酵液酶活力高达3 3 0u m l ；g r o b w i n d h a g e r t 5 6 】报道在2 0 l 发酵罐中进行 葡萄糖流加发酵产酶试验，发酵液酶活力高达4 6 2u m l ；j i a n g 等【5 7 】报道了枯草芽孢杆 菌w y 3 4 产酶活性达11 0 5u m l ；柴萍萍等【5 8 】利用枯草芽孢杆菌w y 4 5 发酵产酶活性最 高达2 8 0 0i j m l ，。 固态发酵主要为真菌，也有少部分细菌固态发酵。k u r a k a k e 等5 9 1 利用泡盛曲霉 a s p e r g i l l u sa w a m o r ik 4 发酵所产酶活性达5 0u g 干曲；h e c k 等6 0 1 对b a c i l l u sc i r c u l a n s b l 5 3 菌株的固态发酵培养基进行了优化，其最高产p - 甘露聚糖酶活性为5 6 0 u g ；o n g 等【6 1 】利用黑曲霉发酵产酶活性达2 2 5 2u g 干曲；j u h a s z 等报道了不同碳源对 t r i c h o d e r m ar e e s e i 产纤维素和半纤维素酶的影响，其最高产p 甘露聚糖酶活性为4 5 0 0 7 江南人学硕+ 学位论文 u g 。韦赞等【6 2 】利用枯草芽孢杆菌w y 3 4 发酵所产酶活性达7 6 5 0u 儋干曲；李江华【6 3 】 等利用黑曲霉w a 9 2 0 4 产酶活最高达8 9 8 4u g 干曲。 1 3 2 课题研究目的及立题依据 微生物固态发酵的历史悠久。从公元前2 6 0 0 年，古埃及人学会了制作面包，人类 就同微生物的固态发酵结下了不解之缘。相继的利用微生物发酵制作的鱼肉制品成为人 们生活中必不可少的佳肴。1 9 4 0 年以后，出现了液体发酵，因为液体发酵的过程容易控 制，生产设备比较现代化，几乎取代了所有利用固态发酵生产微生物代谢产物的工艺。 但进入9 0 年代，微生物固态发酵的优势不断被发现，如：固态发酵具有比液体发酵更 高的产率；固态发酵是自然界许多微生物生存环境的最好再现，有利于微生物的生长及 发酵生产；固态发酵可以利用其他农业、工业的废料作为原料，降低能量消耗和生产成 本；而且还可以有效的防止环境污染，因此，微生物的固态发酵又重新受到了科学研究 和工业生产的青睐【6 蛐4 | 。 近年来随着对自然界半纤维素资源的开发、利用，饲粮中甘露聚糖抗营养因子的消 除以及甘露低聚糖药用价值的发现，使得对b 甘露聚糖酶的需求量越来越大，但就国内 外相关报道来看，6 甘露聚糖酶的产酶酶活性普遍不高，极大的阻碍了酶的应用。目前， 市场上b 甘露聚糖酶商品酶制剂很少，有美国c h e n g e m 公司生产的和美酵素，还有国内 博士奥集团生产的华分酶。因为产量小，产品的相对价格很高，大大降低了酶的应用。 为了提高b 甘露聚糖酶发酵产率和产酶酶活性，国内外学者都作出了很大贡献。主要的 提高酶活的方法有：高产菌株的选育；发酵工艺及产酶条件的优化等。我国对微生物1 3 甘露聚糖酶的研究工作早期主要集中在生产菌种的筛选、诱变，诱导产酶、分离纯化及 性质，酶水解底物方式，以及应用等方面，相关的研究报道已有多篇。但多见于对细菌 产碱性p 甘露聚糖酶的研究，有关真菌产酸性p 甘露聚糖酶的报道尚不多见。 黑曲霉是公认安全( g e n e r a l l yr e g a r d e da ss a f e ，g r a s ) 的微生物，因此利用黑曲 霉发酵生产酶制剂具有安全、可靠和不产生毒素等优点；同时，鉴于微生物固态发酵的 设备简单、投资少、见效快、能耗少、成本低，保护环境，合理利用资源等优势。本课 题选用本实验室保臧的一株产酸性p 甘露聚糖酶的黑曲霉固态发酵菌l w - 1 菌株，对其 进行自然筛选、真空微波和e m s 复合诱变；并对所选突变菌株产b 甘露聚糖酶的耐酸 性和酸稳定性与原始菌l w - 1 进行比对，同时又对其固态发酵工艺条件进行优化，实现 了较全面、系统的研究。 本论文是在本实验室前辈们研究的基础上进行的，有很多的基础研究成果延续了前 辈们的经验和结论。本实验室关于a s p e r g i l l u sn i g e rl w - 1 菌株产p 甘露聚糖酶的研究成 果主要包括：a s p e r g i l l u sn i g e rl w 一1 产p 甘露聚糖酶三角瓶发酵工艺条件的研究； a s p e r g i l l u sn i g e rl w l 产p - 甘露聚糖酶粗酶酶学性质研究及酶的分离纯化；3 - 甘露聚糖 酶水解制备甘露低聚糖的研究。通过对l w 1 菌株产p 甘露聚糖酶粗酶酶学性质的研究， 证明了l w 1 菌株产p 一甘露聚糖酶粗酶液的最适反应p h 为3 5 ，且当p h 在2 5 7 0 范围 内具有较好的稳定性，证明了l w 1 菌株产p 甘露聚糖酶为酸性酶，可在动物胃液( p h 第一章绪论 2 5 ) 和肠道( p h5 5 ) 中均能保持较好的酶活性。这也为其在饲料工业中的广泛应用打 下基础。 1 4 课题研究内容 1 4 1 黑曲霉产酸性b 甘露聚糖酶菌株的诱变育种 从本实验室保藏的黑曲霉菌株中，经自然筛选，选出一株产酶较稳定的菌株作为诱 变出发菌株，通过真空微波和e m s 诱变相结合的方法进行诱变育种，并通过三角瓶固 态发酵培养基的筛选和传代培养，以获得高产酸性d 甘露聚糖酶的菌株。 1 4 2 黑曲霉产酸性b 一甘露聚糖酶的三角瓶固态发酵条件优化 通过单因素试验和正交试验实验设计，较全面、系统地研究发酵培养基组分( 碳源、 氮源、无机盐、魔芋粉、料水比、初始p h 等) 以及培养条件( 培养温度和时间等) 对 黑曲霉突变株的三角瓶固态发酵产酶的影响。最终经正交实验结果和数据分析，得出最 适于黑曲霉突变株的三角瓶固态发酵培养基配方和最适发酵条件。 1 4 3 黑曲霉产酸性d 甘露聚糖酶的曲盘固态发酵条件优化 根据前面三角瓶固态发酵条件优化所得最佳发酵培养基和最适发酵条件，对曲盘扩 大产酶的进程曲线进行研究，通过对曲盘发酵过程中曲料水分的变化，曲料中心温度变 化，曲料中还原糖含量、p h 和产酶酶活性的变化进行测定并作出进程曲线。根据进程 曲线，有目的、有计划的通过人为控制发酵过程参数，找出最适于黑曲霉突变株的曲盘 发酵条件，为进一步进行酸性p 一甘露聚糖酶的扩大发酵生产奠定基础。 9 江南人学硕十学位论文 第二章黑曲霉高产d 一甘露聚糖酶菌株的诱变育种 2 1 引言 微生物生长繁殖过程中存在着自然突变和人工诱发突变两中遗传变异方式，自然突 变的频率和产生对人类有用的正突变概率很小，不能满足人类生产发展的需要，所以迄 今为止，国内外发酵工业中所使用的生产菌种绝大部分是人工诱变选育出来的。人工诱 变育种根据所使用诱变剂的类别可分为物理诱变、化学诱变和生物诱变。其中，物理诱 变方法中最常用的是紫外线诱变、x 射线和丫射线这些诱变剂由于反复的被使用，已经 有很多生产菌种对其产生了耐受性，为此，许多研究者尝试丌发应用一些新型物理诱变 方法用于微生物诱变育种。将微波应用于微生物育种是近年来倍受青睐的新型物理诱变 方法。1 9 5 9 年，h e l l a r 和t i x e i r a 报道低能量的微波辐射能使哺乳动物的细胞和昆虫细 胞变异州；19 7 5 年，c u l k i n 等发现一定量的微波辐照可使大肠杆菌致死6 6 1 。但微波用 于微生物诱变是由1 9 7 6 1 9 7 8 东京大学的s a s a k i 等开始研究的，此后，国内外相继出现 有关报道【6 9 1 。 2 0 0 1 年，p a k h o m o v 掣6 9 】报道的微波生物效应研究的应用一文中指出微波对微生物 等生物的d n a 、蛋白质等的结构能产生很大的突变效应，并且在频率为2 4 5 0 m h z ( 家 用微波炉使用频率) 时效果最好。国内，2 0 0 1 年，李永泉【_ 7 1 】将微波应用于黑曲霉产木 聚糖酶高产菌的诱变，取得了良好的效果。2 0 0 6 年，童应凯7 2 3 等利用微波诱变选育黄 霉素高产菌效果显著。根据所见报道，在微波诱变过程中主要遇到的难题是微波的热效 应会导致菌株的高致死率，相应的微波非热效应的作用时间缩短，影响最终的实验效果。 为此本实验考虑到真空可以在一定程度上降低溶液的沸点，便选择了江南大学机械学院 自制的真空微波炉进行微波部分的诱变。 微波诱变用做微生物育种具有很多优点如操作简单方便、变异基因组小、诱变菌株 的世代周期短、易于培养分离、安全无毒性等。但微波诱变的随机性较大，导致菌体产 生正突变的概率较低。因此在一般的应用过程中，为了获得较好的突变株，常常和一些 化学诱变剂联合进行复合诱变。 目前，有关p 甘露聚糖酶产酶菌株诱变育种的研究报道较少，尤其是对高产菌株的 报道更少。因此，通过各种物理、化学方法对微生物进行诱变育种，以获取高产菌株， 已成为目前b 甘露聚糖酶研究中的重要内容。 2 2 材料与方法 2 2 1 出发菌株 黑曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) l w - 1 菌株，由江南大学医药学院生物化学与分子生物 学研究室筛选和保藏。 l o 第二章黑曲霉高产b 甘露聚糖酶菌株的诱变育种 2 2 2 主要仪器设备 分析天平( a b l0 4 n ) 和电子天平( p l 6 0 2 s )m e t t l e rt o l e d o 生化培养箱( l r h 2 5 0 a )