（环境工程专业论文）铅存在极限条件下水体生物膜中抗性菌的培养和筛选.pdf

大连理工大学硕士学位论文 摘要 随着城市人口的剧增、工业进程的加快，重金属污染物通过各种途径进入水体，破 坏生态环境、危害人体健康。 本课题以大连经济技术开发区某水质净化厂的活性污泥接种培养的生物膜中微生物 菌群作为研究对象，基于生物膜对水体中污染物具有的吸附或富集作用，选用不同培养 基，对生物膜中的微生物菌群在铅存在极限条件下进行驯化，从中筛选、纯化优势菌 株。将优势菌株作铅吸附能力的对比实验，从中得到高耐受性、高吸附性的优势菌株。 通过1 6 sr d n a 测序与n c b i 数据库资源对比，分析其同源性，鉴定高效菌株的菌属。 其中1 d 菌株与已知的粘质沙蓄氏菌属( s e r r a t i a 懈c e s c e r z $ ) 同源，4 d 菌株与已知的克 雷伯氏菌属( k l e b s i e l l a ) 同源。并两者分别与些来源于生物样品的未命名菌株同源。研 究表明其生化特征与相应菌属符合。将其应用于含铅废水的处理，纯菌株生物膜、两者 兼育生物膜对铅、c o d 的去除率大于9 0 ，而未经驯化的生物膜对铅、c o d 的去除率 仅在5 0 6 0 。 本课题的主要工作： ( 1 ) 采用4 种培养基，在铅存在极限条件下进行菌群的平行逐级驯化。结果表明铅 浓度逐增情况下，4 种培养基中菌群的生长基本处于稳定的状态，菌群具有了高耐受能 力。 ( 2 ) 将驯化过的茵群采用常规稀释法和平板纯培养法纯化单菌株，得到的菌群具有 不同的形状、大小、颜色、生长速度的菌落特征，表明驯化时生长环境对菌群微生物的 生长存在着不同程度的影响。在革兰氏染色的实验中，菌群以革兰氏阴性菌为主，也验 证了铅的存在使得菌群微生物向着革兰氏阴性的方向迁移。经逐步纯化从4 种培养基中 麸计分离4 0 个菌株。通过对其进行铅吸附能力的比较，得到4 株具有高耐受性、高吸 附性能的单菌株，其中吸附能力分别为1 f2 3 7 2 m g g 菌体；2 g3 2 6 6 m g g 菌体；3 b 6 1 0 峙，1 0 8 个菌体；4 d3 4 5 m g g 菌体。 再用电化学方法进行铅吸附量测定的复筛，最终确定耐受性、吸附性高的优势菌株 4 1 ) 。 ( 3 ) 将4 d 和具有很强的环境适应能力、较强的生长能力的l d 菌株通过1 6 sr d n a 测序与n c b i 数据库中具有同源性的1 6 sr d n a 序列进行对比( b l a s t ) ，确定优势菌株 铅存在极限条件下水体生物膜年抗性菌的培养和筛选 的种属。初步断定l d 为粘质沙雷氏菌属( s e r r a t i am a r c e s c e n s ) 、4 d 为克雷伯氏菌属 ( k l e b s i e l l a ) 。目前粘质沙雷氏菌属、克雷伯氏菌属均未被应用于铅相关的研究中。 ( 4 ) 对所筛选的优势菌株单菌育膜、两者兼育生物膜与未进行驯化的生物膜作含铅 废水的处理。优势菌株单菌种育膜与混合生物膜对实际污水处理8 天以上，铅、c o d 的去除率在均在9 0 0 , 以上，而未经驯化的生物膜对铅、c o d 的去除率仅在5 0 一嘲。 本课题的创新点： ( 1 ) 研究并总结了自然水体生物膜中微生物菌群驯化及优势菌株筛选的较为成熟和 简洁的方法。 ( 2 ) 得到极限条件下对铅具有高吸附性、高耐受性的优势菌株。 ( 3 ) 采用生物技术手段对菌种进行菌属鉴定。目前并未发现所属的粘质沙雷氏菌 属、克雷伯氏菌属用于铅的相关研究。 ( 4 ) 优势菌株单菌种育膜与两者兼育生物膜对铅、c o d 的去除率均在9 0 * o 以上，为 用新型微生物吸附剂去除废水中的重金属的实际应用提供基本实践和理论依据。若能将 其应用于构建基因工程菌当中，将对环境中重金属污染的治理具有广阔前景。 关键词：生物膜铅驯化筛选菌株1 6 sr d n a 序列分析 大连理工大学硕士学位论文 d o m e s t i c a t i o na n d s c r e e n i n go f a d s o r p t i o np b 2 + s t r a i ni nb i o f d m a b s t r a c t w 岫m ed e v e l o p m e n to fs c i e n c ea n dt e c h n o l o g y t h en e g a t i v e - i n f l u e n c eo ft h ep r o g r e s si s b e i n gm o r ea n dm o r es l r o n g , e s p e e i a l l yt h ep r o b l e mo fp o l l u t i o n a n dt h ea d v e n to fm a n y p r o b l e m s , s u c ha st h ep o l l u t i o no f h e a v ym e t a l si nn a t u r ew a t e rb o d y , i sl e a d i n gt ou n b a l a n c i n g o f e c o l o g i c a le n v i r o n m e n ta n dh a r m i n g t oh e a l t h yo f h u m a n b e i n g d o m i n a n tb a c t e r i ai nb i o f i l mw e r es t u d i e di nt h ea c t i v e ds l u d g eo fs e w a g ed i s p o s a lf a c t o r y w h i c hi nd a f t 锄e c o n o m i ca n dt e c h n i q u ed e v e l o p m e n tz o n e 1 1 1 i ss t u d yw a sf o c u s e do n r e m o v e do f l o w e rc o n c e n t r a t i o no f h e a v ym e t a li o n sw h i c hi sd i 岱c u l tt oe a r l yo u tb yc h e m i c a l m e a s u r e s d u et ot h eh i g hs u r f a c er e a c t i v i t ya n dl a r g es u r f a c ea r e a s ，b i o f i l mi nt h ea q u a t i c e n v i r o n m e n t si sa b l et oa d s o r bande n r i c ha l lk i n d so f p o l l u t a n t s i nt h ee x p e r i m e n t s , t o l e r a n c eo fm i c m o g a n i s mi nb i o r l mw a si n c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o no fp 旷i nd i f f e r e n tc u l t u r em e d i u m t h e4 0s t r a i n sw e r ei s o l a t e df r o m d o m e s t i c a t e db a c t e r i a c o m p a r e dt oa d s o r p t i o no fp b z + , 4 ds t r a i nh a dh i g ht o l e r a n c ea n d a b s o r b a b i l i t ya n d1 ds t r a i nh a dh i 曲s u r r o u n d i n g sa d a p t a b i l i t y b yt h ea n a l y s i so f1 6 sr d n a ， s p e c i e sw e r ei d e n t i f i e d ，c o m p a r e dw i t ht h en c b id a t a b a s e , 1 6 sr d n as e q u e n c et o1 di ss i m i l a r t o t h a t o f s e r r a t i a m a r e e s e c e r l s a n d1 6 sr i ) n as e q u e n c e o f 4 d i ss i m i l a r t o t h a t o f k l e b s i e l l a a t t h es a m et i m e 1 6 sr d n ao ft h et w os t r a i n , s e q u e n c e sa r es i m i l a rt os e q u e n c e so fw h i c hw e r e i s o l a t e df r o ms o m eu n n a m e ds t r a i ne n v i r o n m e n ts a m p l e s u pt od a t e s e r r a d a 埔n x 昌c e r i sa n d k l e b s i e l l a w e r e n o ta p p l i e d i n t h ea d s o r p t i o no f p b z + p r a c t i c a l i t y , t h ea d s o r p t i o no f p b 8 0 f 4 d b i o i l ma n dm i x e db i o f i l mw e r e9 c i ，a n dt h a to f u n d o m e s t i c a t i o nb i o f i l mw a so n l y5 0 6 0 i n n o v a t i o n sa l ea sf o l l o w s ：( a ) mm e t h o do f d o m e s t i c a t i o na n ds c r e e n i n gf o rd o m e s t i c a t e d b a c t e r i aw a sa b t a i n e d d o m i n a n tb a c t e r i aw i t hh i 出t o l e r a n c ea n da b s o r b a b i l i t yw a sa b t a i n e d ( c ) b ym em e t h o d so f m o l e c u l a r b i o l o g i c a lt e c h n o l o g y ，s p e c i e sw e r ei d e n t i f i e d ( d ) p r a c t i c a l i t y ， t h ea d s o r p t i o no f p 酽+ o f 4 db i o f i l ma n dm i x e db i o f i l mw e r e9 0 刀1 ee x p e r i m e n t a lr e s u l tp l a y saf u n d a m e n t a lr o l ei nt h ef b l m e rr e s e a r c ho f t h eb i o s o r p t i o no f h e a v ym e t a li o n si nn a t u r a lw a t e r a n db u i l d - u po f g e n e t i ce n g i n e e r i n g k e yw o r d s ：b i o f i l m ；l e a d ；d o m e s t i c a t i o n ；s c r e e n i n g ；s t r a i n ；1 6 sr d n aa n a l y s i s ； m 独创性说明 作者郑重声明：本硕士学位论文是我个人在导师指导下进行的研究 工作及取得研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得 大连理工大学或其他单位的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作 的同志对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢 意。 作者签名：蟒日期i 递出_ 大连理工大学硕士学位论文 大连理工大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解“大连理工大学硕士、博士学位论文版权使用 规定”，同意大连理工大学保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连理工大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，也可采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论 文。 作者签名： 导师签名 邀互笃： 8 3 大连理工大学硕士学位论文 1 前言 1 1 重金属废水的危害 随着科学技术的进步，全球经济化的迅速发展，城市人口的剧增，工业进程的加 快，含重金属的污染物通过各种途径进入水体，造成水体严重污染。其来源可谓十分广 泛，主要来源于工业废水：电镀、采矿、化工等部门；来自矿山排水、废石场淋浸水、 选矿厂尾矿排水、有色金属冶炼厂除尘排水、有色金属加工厂酸洗水、电镀厂镀件洗涤 水、钢铁厂酸洗排水，以及电解、农药、医药、油漆、颜料等工业的废水。我国工业废 水中重金属的排放量达几千吨。目前人类生存的环境中含重金属离子的废水不论从数量 上还是种类上都大大增加了，其存在形态随不同生产种类而异，差异很大【”。 重金属，特别是汞、镉、铅、铬等具有显著和生物毒性，众多研究表明其危害性是 空前的闭。含重金属离子的废水造成海产品的产量下降、农作物的减产、林业的衰退、 土地的破坏、各种生物无法适应这么严重的重金属废水的污染而濒于灭绝、食物链被严 重破坏、导致大气和水环境质量的进一步恶化、环境也失去平衡，对人类生存与生命也 岌岌可危例。 重金属废水形成特点：( 1 ) 除被悬浮物带走的外，会因吸附沉淀作用而富集于排污 口附近的底泥中，成为长期的次生污染源；( 2 ) 水中各种无机配位体( 氯离子、硫酸离 子、氢氧离子等) 和有机配位体( 腐蚀质等) 会与其生成络合物或螯合物，导致重金属有 更大的水溶解度而使已进入底泥的重金属又可能重新释放出来；( 3 ) 重金属的价态不 同，其活性与毒性不同，其形态又随p h 和氧化还原条件而转化。 对于重金属废水的危害已成为全人类共同攻克的一个重大课题。随着今后经济社会 的发展，人口的剧增，各种资源结构调整及自然灾害损毁等，可利用的水资源将进一步 减少。迄今为止，无论是国内或国外，对重金属废水的治理仍不够完善和彻底，远未消 除重金属废水对环境造成的污染。因而如何有效地控制及治理水源中重金属的污染，改 良水体质量，将成为生态环境保护工作中十分重要的一项内容。我们应当越来越多地投 入更多的精力来探索重金属废水危害的探究和治理方案，这将成为人们不可回避的工 作。 铅存在极限条件下水体生物膜中抗性菌的培养和筛选 1 1 铅离子的毒性 铅主要来源为采矿、冶金、电镀、燃煤、陶瓷和玻璃制造等工业活动，以及含铅汽 油、含铅油漆和涂料、含铅水管的使用等，全世界平均每年排放铅为5 0 0 万吨。 1 9 7 0 前后，最重要的人为污染源是含铅汽油的燃烧 4 1 ，但目前含铅汽油仅占全世 界用量的2 0 n ，即使含铅汽油中铅的含量降到无铅的程度( o 0 1 3 9 l ) ，通过燃烧汽 油进入大气的铅每年仍然有6 0 0 0 t 。从熔炉中释放的铅与通过含铅汽油的燃烧所释放的 量相当，总共占人为污染源的8 0 。分析海水中的铅发现，随着水深的增加铅的浓度急 剧减少，说明海水中铅主要来自大气的输入1 6 j ，环境中的铅化合物主要以粉尘和气溶胶 状态从呼吸道进入人体，呼吸道对铅的吸收率大约为4 0 ，而消化道对其的吸收率为 7 - 1 0 0 o 刀。 铅对生物体产生的毒性具有长期性和持久性嗍，亲硫重金属元素铅等与人体组织某 些酶的巯基( s h ) 有特别大的亲合力，能抑制酶的活性以及细胞的氧化还原反应，从而 抑制蛋白质的合成，缩短红细胞寿命，诱发血浆质脂过氧化物增高，造成小细胞贫血， 引起周围神经功能障碍，大脑麻痹，神经迟钝，严重时可致死。 铅在人体血液中可形成可溶性磷酸氢铅或甘油磷酸铅，随血液循环被组织吸收而分 布于肝、肾、脾、肺、脑中，最后由软组织中转移到骨骼中形成不溶性的磷酸铅沉淀下 来，当这种吸收的铅的平衡被打破之后其毒性就对人体的造血系统、神经系统和肾脏、 心血管系统、生殖系统、肾脏的破坏以及致癌、致突变、致畸型等作用也可能发生 9 1 。 特别是对儿童的智力、发育等方方面面有着不同的作用与影响，从胎儿的时候就已经从 母体的胎盘中吸收并有影响了，儿童长期接触低浓度的铅，可导致其行为功能的改变， 常见的有模拟学习困难，空间综合能力下降、运动失调、多动、易冲动、注意力下降、 侵袭性增加、智力下降等【卅1 ”。 因此，如何处理好铅在废水中的含量以及改变其存在形态，将是本世纪科研课题的 重大项目。 1 3 重金属的处理方法 目前，针对重金属废水的危害性，处理技术的方法多种多样，大体可归纳为中和沉 淀法、化学沉淀法、氧化还原法、气浮法、电解法、蒸发和凝固法、离子交换法、吸附 法等物理法、化学法、物理化学法、生物法和高效集成法。然而随着科学技术的发展与 人类社会的进步，一些传统的处理方法已不适应现代的节奏，当用于处理低浓度的重金 2 大连理工大学硕士学位论文 属废水时，往往操作费用和原材料成本相对过高，经济上不合算【埽l 。同时由于处理后产 生的固体废物与废液处理更为困难，因此说这些方法从现代工业角度来看并不实用。 与传统的废水处理方法相比，生物技术的广泛应用使得越来越多的人关注微生物群 体形成的生物膜来改善环境的污染，生物吸附技术以其高效、成本低廉的优点引起人们 极大的兴趣。而且目前的研究多集中在利用活体及非活体微生物吸附重金属【1 9 - 2 4 1 。 利用微生物吸附重金属具有显著的优势：( 1 ) 在低浓度下，金属可以被选择性去除； ( 2 ) 对钙镁离子吸附量少；( 3 ) 处理效率高；( 4 ) p h 和温度条件范围宽：( 5 ) 投资小，运行 费用低；( 6 ) 可有效地回收一些贵重金属。 因此最具发展前途的微生物法已逐渐地成为发展的趋势方向，其经济、快速、无二 次污染的处理方法与手段将成为新时代科学研究的新课题。 1 4 自然水体中生物膜 生物膜( b i o f i l m ) 有人又称其为表面附着物或称附着生物、生物附着物( 生物结 垢) 等。一般指天然水体中有机的、无机的以及微生物的颗粒物表面覆盖的一层附着 物，其中含有铁、锰氧化物等有机矿物质以及多种微生物及其胞外聚合物，普遍存在于 河流、湖泊、湿地环境中的岩石、表层沉积物、悬浮颗粒物的表面。 由于生物膜具有较大的比表面积，对污染物具有显著的吸附活性p s i ，因此，生物膜 对重金属离子有明显的吸附及富集作用1 2 6 - 2 7 , 3 1 - 3 2 ，对于持久性有机污染物可以通过膜上 细胞和颗粒物的脱附和吸附作用进行有选择性地吸收和新陈代谢作用嘲。 生物膜法是与活性污泥法并列的一种污水好氧生物处理技术。其实质是使细菌等微 生物和原生动物、后生动物等微型动物附着在滤料或某些载体上生长繁育，并形成膜状 生物污泥一生物膜。污水与生物膜接触，污水中的有机污染物，作为营养物质，被生 物膜上的微生物所的摄取，污水得到净化，微生物自身也得到繁衍增殖。生物膜法主要 有早期的生物滤池( 普通生物滤池、高负荷生物滤池、塔式生物滤池) 和后来发展的生物 转盘、生物流化床、生物接触氧化法等，以及最新发展的曝气生物滤池工艺。 与活性污泥法相比，生物膜法的主要优点有：不产生污泥膨胀膨胀问题：产生的污 泥量较少；抗冲击负荷的能力较强；运行管理较方便、动力消耗较少t 2 9 1 。 生物滤池是自然界土壤自诤的人工强化模拟，最早于1 8 9 3 年出现在英国，1 9 0 0 年 以后开始应用于污水处理实践。但早期的普通生物滤池存在负荷低、占地大、易堵塞等 问题。后来在普通生物滤池的基础上提高负荷，形成了高负荷生物滤池。2 0 世纪5 0 年 代，在原民主德国出现了塔式生物滤池，进一步解决了普通生物滤池占地大的i a - i 题。 3 铅存在极限条件下水体生物膜中抗性菌的培养和筛选 生物转盘是2 0 世纪6 0 年代由原联邦德国斯图加特工业大学p o p e l 教授和h a r t m a n 教授开发的一种污水生物处理技术。生物转盘由许多平行排列浸没在一个水槽( 氧化槽) 中的塑料圆盘( 盘片) 组成。盘片的盘面近一半浸没在污水水面以下，盘片上生长着生物 膜。其工作原理与生物滤池基本相同，随着盘片的转动，盘片上的生物膜实现了在污水 中的吸附有机物和在空气中氧化分解有机物的交替净化过程。它避免了生物滤池滤料的 堵塞，但存在基建投资高、占地面积大等问题。 流化床是用于化工领域的一项工艺，从2 0 世纪7 0 年代初期开始，些国家将这一 技术应用于污水生物处理领域，形成了生物流化床。流化床是以砂、活性炭、焦炭一类 的较小的惰性颗粒为载体充填在床内，自下而上流动的污水使载体呈流化状态，依靠载 体表面附若的生物膜，使污水得到净化。该工艺具有处理效率高、处理效果好、占地少 等特点。 s c h o r e r 和e i s e l e p o l 在研究河流生物膜富集盈、c u 和p b 时发现，生物膜能够强烈 地富集水中的污染物。 董德明等【3 1 】对在不同自然水体中培养的生物膜进行的研究中也发现，生物膜对水中 的z n 、c u 和c d 等重金属均有明显的富集作用。 y a r r o wm n e l s o n 和l e o n a r dw l i o n l 3 2 研究了b u r k h o l d a r i ac e p a c i a1 7 6 1 6 生物膜对 铅的吸附，在b u r k h o l d a r i ac e p a c i a1 7 6 1 6 生物膜中，胞外聚合物对铅吸附的贡献比细胞 大得多，细胞和胞外聚合物的吸附都可用单朗缪尔吸附模型描述。 a l e x i ss t e m p k = t d n d 3 】等考察了附着在州u 2 0 3 单晶体上的b u r k h o l d e r i ac e p a e i a 生物 膜对p b 2 + 的生物矿化和吸附。a l y s o ni t w i l s o n 等嗍在实验室模拟生物膜上铁、锰、铝 氧化物和有机质对铅的吸附，并在此基础上发展了一个用以量化铅吸附和p n 关联的模 型，进而发展了一个加和模型用以预测p b 在自然生物膜上的吸附。 许华夏等【3 5 】研究了生物膜对重金属镉的吸附与去除作用，试验结果表明，生物膜对 重金属镉有较强的去除作用，1 2 小时内，3 0 p p m 以下的镉可去除8 5 以上。镉浓度不 同，对生物膜去除c o d 影响不同，影响程度与镉浓度呈正相关镉对生物膜呼吸活性 的影响也随镉浓度的不同而各异，低浓度镉有激活作用，高浓度镉有抑制作用 y o s h i t a k es u z u k i 等口q 用附着着生物膜的活性炭处理含有少量有机污染物、少量重 金属和大量钠盐的电镀工业污水处理厂出水，5 0 的有机物和8 0 的铜、3 0 的铬被去 除，重金属被生物膜吸附，有机物被生物降解和部分吸附。 j a s c o t t 和a m k a r a n j k a r 【2 8 】用固定在颗粒活性炭上的生物膜去除水中的金属离 子，考察了溶液和生物膜培养液的p h 和温度对金属吸附的影响，并对影响原因进行了 4 大连理工大学硕士学位论文 解释。溶液p h 降低，金属吸附量下降，他们认为这是因为生物吸附包括细胞表面的吸 附和胞外聚合物的吸附，溶液p h 降低，细胞表面和胞外聚合物带正电，阻止了带正电 的金属离子络合，质子化水平的改变影响金属与c o o h 和o h 等官能团的结合。生 物膜培养液的初始p h ，在碱性范围内对金属吸附的影响很小，在酸性范围内，p a 降 低，金属吸附减少，这是因为在中性或弱碱性，细胞能产生最高浓度的聚合物。溶液温 度从5 c 升高到3 0 ，金属吸附只提高1 0 ，表明生物膜活性炭吸附，主要是物理吸 附，不是代谢活动。生物膜培养液温度从5 c 升高到1 5 ( 2 ，c a 吸附提高3 0 ，1 5 c 升 高到2 5 ，c d 吸附提高1 9 。这是因为温度升高，代谢活动提高，产生了更多的细胞 和胞外聚合物。 目前，关于生物膜中微生物群的研究主要集中生物膜对重金属的消除，以及生物膜 不同化学组分对重金属吸附作用的研究，而对生物膜中的微生物群本身进行耐受性、特 异性、功能性的驯化与筛选、并将筛选的高效菌株进行实际应用的研究还很少，而此类 研究的深入对利用生物膜处理重金属在实际领域的应用又具有基础性的作用，对探索如 何提高处理重金属有机废水效率将具有重要的理论意义和应用价值。 1 5 生物膜中的微生物 自然界中的大多数微生物组织是以附着状态而不是游离状态存在于生长环境中叨， 是自然界产生地球化学变化的主要因素之一。 数十年以来，随着重金属微生物吸附的广泛研究，生物膜中具有吸附作用的微生物 越来越多的被科研人员研究，目前可归纳为：( 1 ) 细菌：枯草杆菌、地衣芽袍杆菌、球衣 菌等；( 2 ) 真菌：酵母菌、白腐真菌、产黄青霉、龟裂链霉菌等；( 3 ) 藻类：褐藻、鱼腥 藻、轮藻、小球藻等。 微生物个体小，分部普遍，表面积大，新陈代谢活动速率极高，并且具有灵敏的速 率反应性、遗传适应性、潜在的快速生长速率以及专属的酶和营养物的多样性，这使得 微生物成为生物圈循环的动力因子，并能为生物圈的其他寄居者提供基本的营养物质， 维持它们的生存。 在土壤、沉积物、海洋、河流、湖泊、地下水中，微生物进行的活动对环境质量和 农业生产都有重要的影响阅。微生物在地球生态系统的物质循环过程中起着“天然环境 卫士”的作用，几乎能降解或转化环境中的存在的各种天然物质，一旦有新的物质出 现，它们能通过自发或诱导逐步生产新的酶系，从而具备新的代谢功自妒8 】。 5 铅存在极限条件下水体生物膜中抗性茵的培养和筛选 1 6 生物膜消除重金属离子的机理 由于生物膜是一种混合微生物群体，因此生物膜消除重金属离子的机理也随之十分 复杂。包括生物膜中微生物对重金属的吸附、胞外聚合物对重金属的吸附和生物膜的整 体作用。 微生物吸附金属离子的过程主要有两个阶段，第一个阶段是被动吸附过程【3 5 1 ( 表 面络合、离子交换、氧化还原等) ，即金属离子在细胞表面的吸附，同时还包括，另一 阶段是活体细胞的主动吸附明，即细胞表面吸附的金属离子与细胞表面的某些酶相结 合而转移至细胞内，包括传输和沉积。 胞外聚合物 4 s 4 0 是生物膜的主要成分，主要来源于细胞内分泌、细胞自溶和从废水 中吸附得来。胞外聚合物中所含多糖的种类较多，厌氧菌产生的胞外多糖主要是由鼠李 糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖组成。胞外多糖含有多种功能团，如羧基、羟基和磷酸基， 这些基团对不同类型离子表现了强烈的亲和性。在负电性的胞外聚合物中，金属离子可 以起到架桥的作用。例如铬可以与胞外聚合物相互作用，导致胞外聚合物结构交化，并 且在絮凝物中形成疏水性区域。胞外聚合物主要由多糖和蛋白质构成，多糖和蛋白质上 的带负电的官能团如丙酮酰基、磷酰基、羟基、琥珀酰基和糖酰基等，能与金属产生强 烈络合作用。因此生物膜能提供一个高局部金属浓度、高二氧化碳浓度、适宜的p h 的 微环境，更加有利于金属沉淀。 1 7 微生物对重金属的吸附 许多微生物具有较高的重金属吸附能力。目前，在实验室以两种方式进行生物吸附 实验，一种是天然的菌体，一神是固定化细胞。 天然的菌体机械强度低、密度低、颗粒小，金属离子回收时必须使用连续搅拌罐反 应器，在吸附金属后又必须使用过滤、沉淀、离心的方法从溶液中分离菌体。这一过程 成本高、效率低。而生物吸附剂用于处理废水和回收金属，它必须容易从接触装置中运 输或分离，且必须具有良好的物理和化学稳定性。为了这些原因，必须将菌体固定化或 颗粒化。 固定化技术主要有以下几种：( 1 ) 吸附法：可分为物理吸附法和离子吸附法两种。前 者使用具有高度吸附能力的硅胶、活性碳、多孔玻璃、石英砂和纤维素等吸附剂将微生 物细胞吸附到表面上使之固定化。后者中细胞在解离状态下可因离子键合作用而固着于 带有相异电荷的离子交换剂上。( 2 ) 共价结合法：是微生物细胞表面上官能团( 如氨基、 梭基、疏基、轻基、咪哇基和酚基等) 和固相支持物表面的反应基团之间形成化学共价 6 大连理工大学硕士学位论文 键连接，从而成为固定化细胞。( 3 ) 交联法：主要是使微生物细胞与带有两个以上的多功 能团试剂进行交联反应，在它们之间形成共价键，从而把微生物细胞固定。与结合法一 样，都是靠化学结合的方法使微生物细胞固定化，但结合法所采用的载体是非水溶性 的。( 4 ) 包埋法：是微生物细胞固定化最常用的方法。例如可以利用工业发酵后剩下的芽 抱杆菌菌体吸附各种重金属，首先用碱处理菌体，以便增加吸附重金属的能力，然后通 过化学交联法固定这些细胞，固定化的芽抱杆菌对重金属的吸附没有选择性，可以去除 污水中的c d 、c r 、c u 、h g 、n i 、p b 、u 和z n ，去除率可达到9 9 刘月英【5 1 1 等人进行了固定化地衣芽抱杆菌r 0 8 吸附p d ”的研究，采用了四种不同 的包埋法( p v a 海藻酸钠包埋法、海藻酸钠包埋法、琼脂包埋法、明胶包埋法) 对地 衣芽抱杆菌进行了固定化。通过对不同的固定化方法的比较，选择了开孔聚乙烯醇法。 用聚乙烯醇作为菌体的固定化载体，具有强度高、化学稳定性好、抗微生物分解性能 强、成本低等优点，但成型性差。在p v a 中加入海藻酸钠，则可增强p v a 凝胶的成球能 力，而且形成的凝胶颗粒强度高、凝胶性能好。用该法制备的固定化菌体，吸附p d 的 能力仍比其他二种方法制备的固定化菌体的吸附能力强。 尹华等 5 2 1 进行的红螺菌r - 0 4 对重金属c u 2 + 、n i 2 + 和c r 6 + 的吸附行为的实验表明，菌 体分别在含1 0 5 0 m g lc u 2 + 、n p 和c r 6 + 的培养液中培养9 6 h ，最高吸附率分别为 9 8 9 9 6 、9 0 9 6 和8 4 ：且菌体对c r 6 + 的还原率均达9 9 5 以上。a r a ni n c h a r o e n s a k d i 和p i s s o p a r a t j a h a r d 5 3 1 的研究表明，藻青菌a p h a n o t h e c eh a l o p h y t i c a 对锌的最大吸附容量达到 1 3 3 m g g 。吴泪网等研究了白腐真菌对铅的吸附，研究表明，在最佳吸附条件下吸附 1 6 h ，吸附量最大可达i 0 8 4 m 魄。四种淡水藻类o s c i l l a t o r i al i m n e 疗c a ，a n a b a e n a s p i r o i d e s ，e u d o r i n ae l e g a n s 和c h l o r e l l av u l g c u i s 对铜、镉、铅都有较大的吸附容量。 部分菌属对污水中的有机物和有毒物质有很强的降解能力，在污水处理过程中的重 金属吸附发挥着重要的作用，不仅利用其进行生物监测，还可以观察河流的污染程度。 如果能以优势菌种在污水( 尤其是工业污水) 来去除或回收重金属离子，可谓一举两得， 具有重要的开发利用价值。余晨兴1 5 5 】等以球衣菌吸附重金属离子为研究方向，通过采用 富集培养，结合平板划线、涂布等手段成功地从活性污泥中分离筛选到一株具有重金属 离子吸附能力的球衣菌，并研究了重金属离子的耐受及其吸附工艺条件，同时采用电镜 和红外光谱分析等手段对其吸附机理进行了初步的研究。 7 铅存在极限条件下水体生物膜中抗性菌的培养和筛选 1 8 重金属离子对生物体系的影响 虽然许多微生物对重金属都存在吸附作用，但由于重金属对生物的毒害作用，使得 微生物的生长和繁殖都受到不同程度的影响。 重金属离子对活性污泥系统性能的影响，主要表现为处理能力下降，其原因是重金 属离子对活性污泥中的原生生物和细菌的毒性，导致污泥容积指数不同程度的改变，出 水的b o d s c o d 大幅度减少。实验发现f 矿、五1 2 + 浓度小于4 0 m g l 时，对c o d 的去 除能力影响非常小：而当p b 2 + 、cd ：2 + 、c r 2 , - 大于4 0 m g l 时，其出水的c o d 的去除率就 下降5 0 2 兰右州。 在重金属离子对土壤的研究中。发现重金属能强烈地影响土壤微生物的群落发布， 改变土壤微生态。且微生物的数量明显下降。目前的研究多处于属以上的水平。对于细 菌，g 茵一般比g + 更能耐受重金属污染，导致土壤中细菌群落向前者迁移田】。 1 9 微生物的研究方法 通常在进行微生物实验时，混合菌群的研究只能从定性的角度进行整体的研究，不 能具体地说明混合菌群中单一菌株的性质与作用，因此在进行微生物的一般研究时都会 对混合菌群进行单一的菌株的分离纯化。 菌体的分离纯化的一般方法口8 】包括连续稀释法滴定和分离细菌菌落、平板划线分离 单菌落法等获得单一的菌落。进而对单一的菌株进行迸一步的性质研究。 传统的细菌系统分类法主要依据其形态、生理生化特此、抗原性、生态特征等进行 表型分类，但存在表达不稳定、敏感性不高等问题。从6 0 年代至今，分子遗传学分类 法嘲日趋成熟和完善，主要包括d n a 碱基组成测定、核酸杂交、1 6 sr d n a 测序、r e p p c r 指纹图分析、g + c m 0 1 、质粒图谱分析等直接对细菌染色体d n a 或质粒d n a 进行分 析，目前已广泛用于微生物鉴定m 1 中。 其中1 6 sr d n a 测序方法，结合完整的数据库，可以快速准确地对微生物进行分类 鉴定，确定其在为生物进化中的位置，它己成为微生物分类学中的重要方法。 因此本实验中采取了1 6 sr d n a 测序方法与生理生化实验对照的方法对菌株进行进 一步的研究。 t 1 0 本课题的研究意义及内容 目前，生物膜法处理废水在对重金属离子的去除中遇到了很多障碍。故人们对生物 膜去除重金属的作用机理、环境因素影响的研究，特别是构建高效复合生物膜等研究成 为生物膜法处理重金属废水的热点。在生物膜微生物菌群处理重金属废水时，由于重金 8 - 大连理工大学硕士学位论文 属的毒害，导致部分耐受性差的微生物死亡，影响生物膜的处理效果，因此对生物膜中 的微生物群进行耐受性、特异性、功能性的驯化与筛选，得到对重金属离子高耐受性、 高吸附的菌株是面对我们的新课题。 对于该课题国内外主要集中于动胶菌属、节杆菌属、丝状菌属、酵母菌和藻类等， 用人为培养的纯菌种应用于重金属废水处理实验当中，了解和调整微生物的吸附能力， 强调人为选择微生物进行重金属废水处理方法，对环境保护有一定的理论依据和应用价 值。例如余晨兴【5 5 】等将球衣菌对铅离子的耐受性及其吸附能力作了相应研究。赵玉清、 张万筠等在利用壳聚糖复合物对污水中重金属离子的吸附研究基础唧侧上，研究了生物 膜对污水中铅离子吸附的影响，并提出嗜铅菌的驯化与纯化的课题。 本论文以大连经济技术开发区某水质净化厂的活性污泥接种培养的生物膜中微生物 群作为研究对象，基于生物膜对水体中污染物具有的吸附或富集作用，选用不同培养 基，对生物膜中的微生物菌群在铅存在极限条件下，人为逐渐增加不同培养基中铅离子 浓度进行驯化，从中筛选、纯化优势菌株。将优势菌株作铅吸附能力的对比实验，从中 得到高耐受性、高吸附牲的优势菌株。透过1 6 sr d n a 禊8 序并与n c b i 数据库资源对 比，分析其同源性，鉴定高效菌株的菌属。再将所纯化的优势菌株应用于含铅废水的处 理，对比纯菌株生物膜、两者兼育生物膜和未经驯化的生物膜对铅、c o d 的去除率。 研究目标：探索利用自然水体生物膜培养、驯化、纯化嗜铅菌的有效方法，及嗜铅 菌在处理含铅废水中的应用。 9 铬存在极限条件下水体生物膜中抗性菌的培养和筛选 2 i 实验仪器设备和试剂 2 i i 实验仪器设备 表2 1 实验中使用的主要仪鼯设备 2 i 2 实验材料 2 1 2 1 生物膜的培养 生物膜来源：开发区某水质净化厂二沉池的活性污泥 生物膜载体：自制圆盘呢绒丝( 5 0 m m ) 容器：2 5 lp v c 白桶 辅助设备：恒温加热棒、多嘴曝气泵 人工废水( 鲋。) ：葡萄糖o 4 9 ；( n i - h h s 0 40 2 9 ；f e s 0 4o o l g ；m g s 0 4o 0 0 4 9 k h 2 p 0 40 0 1 4 9 1 7 l 】- 2 1 2 2 培养基 n a 通用培养基( g l ) ：牛肉膏3 9 ；葡萄糖1 0 9 ；蛋白胨5 9 ；酵母膏l g ； 口h 8 7 0 ； 1 0 大连理工大学硕士学位论文 驯化用n o 1 培养基( g l ) ：牛肉膏3g 蛋白胨1 0 9 , n a c i5 9 ： p n - 7 o - 7 - 2 ： 驯化用n o 2 培养基( g l ) ：可溶性淀粉2 0 9 ；k n 0 3l g ：n a c l 0 5 9 ； k 2 h p 0 40 5 9 ；m g s 0 4o 5 9 ；f e s 0 40 0 1 9 ：p h7 o - 7 2 ： 驯化用n o 3 培养基( g 几) ：n a n 0 32 9 ：k c l0 5 9 ；k 2 h p 0 4l g ：m g s 0 40 5 9 ； f e s 0 40 0 1 9 ：蔗糖3 0 9 ； 驯化用卜b 4 培养基( g 几) ：葡萄糖4 9 ；蛋白胨5 9 ；酵母膏l g ；甘油1 0 9 ： p h _ 7 o ： 以上培养基的灭菌条件均为：1 2 1 ( 2 ，2 0 m i n r 硎。 2 1 3 主要试剂 表2 2 实验中使用的化学试剂。 h 铅存在极限条件下水体生物膜中抗性菌的培养和筛选 2 2 实验方法 2 2 1 生物膜的培养方法 选择大连经济技术开发区某水质净化厂二沉池的活性污泥，用自来水清洗三次，沉 降弃上清。将一定量( 2 0 m l ) 的清洗过的污泥倒入2 1 l 人工废水中，使其固定在自制 圆盘呢绒丝生物膜载体上，使用电恒温加热棒调节水温为平均2 8 。c ，用多嘴曝气泵进 行间歇有氧培养，培养成膜时间为1 8 天。 驯化用茵量的确定：先在培养的生物膜上用载玻片刮取含有生物膜的混合液，大约 1 0 m l ，离心分离后用去离子水清洗三次，充分取出液体后称重，用1 0 m l 去离子水溶解 并测量o d 6 0 0 ，以确定菌量。 生物膜中活菌数量的确定：用上述获得的菌群，采用常规稀释法稀释至1 0 - 5 。- 7 , 各 取1 0 0pl 菌液用涂布棒作圆周运动将培养液涂布均匀于n a 通用培养基平板上，标号 1 0 5 、i o - 6 、i o - 7 ，于2 8 c ，2 4 h 培养。记录菌落数，以确定活菌比例。 计算每毫升生物膜菌悬液中活菌别硐： 细菌细胞数m i = 1 0 菌落数稀释倍数 2 2 2 铅存在条件下菌群的驯化方法 将2 2 1 节得到的菌群水溶液分别置于标记为n o 1 、n o 2 、n o 3 、n o 4 的培养基中 进行培养，具体步骤如下： 1 ) 准备n o 1 、n o 2 、n o 3 、n o 4 四种液体培养基各9 瓶( 3 5 m u 瓶) 。 2 ) 分别调整每种培养基中铅离子浓度依次为：0 s n o l l 、2 0 p s n o l l 、5 0 岫l l 、 8 0 $ u - n o l l 、1 0 0 1 u n o l l 、1 5 0 p m o l l 、2 0 0 1 n n o l l 、2 5 0 1 x r n o l l 、3 0 0 9 m o l l ，然后至于高 压蒸汽灭菌锅中灭菌备用。 3 ) 用移液枪吸取生物膜菌群溶液，加入到2 ) 中铅离子浓度为0 n o l l 的4 种液 体培养基中，在2 8 恒温振荡环境下培养2 4 h 。用o d 6 0 0 法确定不同铅离子浓度下菌群 的生长情况。 4 ) 取3 ) 中培养后的4 种新鲜培养液，加入到2 ) 中铅离子浓度为2 0 ”i n o l l 的4 种液体培养基中，在2 8 c 恒温振荡环境下培养2 4 1 1 。用o d 6 0 0 法测定菌群的生长情况， 以确定驯化效果。 5 ) 以此类推直至铅离子浓度达到3 0 0 p m o l l 。用o d 6 0 0 法测定菌群的生长情况，以 确定驯化效果。 1 2 大连理工大学硕士学位论文 2 3 结果与分析 2 3 1 生物膜的生长情况 生物膜培养初期生长较为缓慢，约3 - 5 天后，生长速度开始增加，生物膜逐渐满足 后续实验的要求。 2 , 3 2 菌群驯化实验的结果 驯化用的菌群约0 , 1 6 9 ，2 6 7 1 0 9 m l 。 平板菌落计数：稀释至1 0 - 7 平板