（生物医学工程专业论文）壳聚糖及其衍生物作为基因载体的生物安全性评价.pdf

中国协和医科大学中国医学科学院硕士学位论文 a b s t r a c t s i n c et h e b e g i n n i n g o f1 9 9 0 s ，l l a n o - s c i e n c ea n dt e c h n o l o g yg a i n e dr a p i d d e v e l o p m e n t , a n d h a sb e e nw i d e l ya p p l i e di nt h ea r e a so fe l e c t r o n i c s ，i n f o r m a t i o na n d c o m m u n i c a t i o n ，s e m i c o n d u c t o r ，b i o l o g ya n dm e d i c i n e m o r ea n dm o r ec o u n t r i e sh a v e b e e np u t t i n gh u g ei n v e s t m e n ti nt h er e s e a r c ha n dd e v e l o p m e n to fn a n o t e c h n o l o g yf o r t h ep u r p o s eo ft a k i n ga d v a n t a g eo ft h e o p p o r t u n i t i e sw h i c hc o u l db r i n gh u g e c o m m e r c i a lb e n e f i t s h o w e v e r , t h eb i o s a f e t yo f n a n o m a t e r i a l sh a sb e e nd r a w i n gi n c r e a s i n ga t t e n t i o no f s c i e n t i s t sa n de n v i r o n m e n t a lp r o t e c t i o no r g a n i z a t i o n p r e l i m i n a r ys t u d i e ss h o w e dt h a t s o m ek i n d so fn a n o s c a l em a t e r i a l sm i g h th a v en e g a t i v ei m p a c to nh u m a nb e i n g s g r e a t e re f f o r ti su r g e n t l yn e e d e do nt h ee v a l u a t i o no ft h eb i o - s a f e t yo fn a n o s c a l e m a t e r i a l sf o rt h eh e a l t h yd e v e l o p m e n to f n a n o t e c h n o l o g y o u rr e s e a r c h g r o u ph a sb e e nc o n d u c t i n gr e s e a r c h o nt h ec h i t o s a na n di t s d e r i v a t i v e sa sg e n ec a r r i e rf o rs e v e r a ly e a r s b a s e do no u rp r e v i o u ss t u d y , c h i t o s a n - d n an a n o p a r t i c l e s ，a r g i n i n e - m o d i f i e dc h i t o s a n d n an a n o p a r t i c l e s ，a n d n - a l k y l a t e dc h i t o s a n - d n an a n o p a r t i c l e sw e r es e l e c t e df o rt h ee v a l u a t i o no ft h e i r i m p a c to nt h ef u n c t i o no fm a c r o p h a g e s t h er e s e a r c hi n c l u d e st h ef o l l o w i n gt h r e e p a r t s 1 e n d o t o x i n f r e ep l a s m i dd n aw a sp r e p a r e da n du s e dt of o r mn a n o p a r t i c l e sw i t h c h i t o s a n ，a r g i n i n e m d i f i e dc h i t o s a n , a n dn - a l k y l a t e dc h i t o s a n , r e s p e c t i v e l y t h e n a n o p a r t i c l e sw e r ep r e p a r e db yc o a c e r v a t i o np r o c e s sa n dn pr a t i ow a s4 ：1 1 1 1 e n a n o p a r t i c l e sw c l - ec h a r a c t e r i z e dw i t ht r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p e ( t e m ) ，a t o m i cf o r c e m i c r o s c o p e ( a f m ) ，a n dd y n a m i cl i g h ts c a t t e r i n g ( d l s ) 。 2 t h em u r i n em o n o c y t e m a e r o p h a g ec e l ll i n er a w 2 6 4 7c e l l sw e r ei n c u b a t e d w i t ht h r e ek i n d so fn a n o p a r t i c l e sa tt h ec o n c e n t r a t i o no f0 1 ，l ，1 0a n d2 0g g m l ( b a s e do nt h ec o n t e n to f d n a ) t h ec y t o k i n e si l l6 ，i l - 6 ，i l - 1 0 ，i l - 1 2 ，a n dt n f 吨 i nt h ec e l lc u l t u r em e d i aa tl h , 6 h , 2 4 ha f t e rc o i n c u b a t i o nw g l - ea s s e s s e db y e n z y m e - l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ( e l i s a ) 1 1 l er e s u l t si n d i c a t e de x p o s u r eo f r a w 2 6 4 7r n a c r o p h a g et oc s - d n an a n o p a r t i c l e sa n dc s - a r g d n an a n o p a r t i c l e s d i d n te n h a n c et h es e c r e t i o no f c y t o k i n e si l 一1 1 3 ，i l - 6 ，i l - i o ，i l - 1 2 ，n 师一a ，e v e nw i t h t h eh i g h e s tc o n c e n t r a t i o n so fn a n o p a r t i c l e s ( 2 0 肛删i nt e r mo fd n a c o n t e n t ) u pt o 2 4h o u r s 3 1i i l ln a n o p a r t i c l e s ( 5 0 “g m 1 ) w e r ei n t r a p e r i t o n e a l l yi n j e c t e di n t os i xg r o u p so f m i c e ，t h ep e r i t o n e a lm a c r o p h a g e sw e r eh a r v e s t e da f t e r2 4 ha n ds u b s e q u e n t l y c o i n c u b a t e dw i t hf r e s h l yp r e p a r e dc h i c k e nr e db l o o dc e l l s ( c i m c ) f o r3 0 m i ni nv i t r o t h ep h a g o c y t i cr a t e ( p r ) a n dp h a g o c y t i ci n d e x ( p i ) w e r ec a l c u l a t e db yd i r e c tv i s u a l e n u m e r a t i o nu s i n gal i g h tm i c r o s c o p e t h ed a t ar e v e a l e dt h a tp h a g o c y t o s i so f p e r i t o n e a lm a e r o p h a g e sw e r en o ts i g n i f i c a n t l ya f f e c t e da f t e re x p o s u r et od n a 中国协和医科大学中国医学科学院硕士学位论文 k e yw o r d s ：c h i t o s a n , a r g i n i n e - m o d i f i e de h i t o s a n , n - a l k y l a t e d c h i t o s a n , n a n o p a r t i e l e s ，n o n - v i r a lg e n ec a r r i e r , b i o - s a f e t y 中国协和医科大学中国医学科学院硕士学位论文 第一章绪论 第一节纳米技术在各行业的应用成为研究的热点 1 纳米，纳米物质的概念 纳米( 啪) 是一个长度单位，1n m = l o 。m ，是一个氢原子直径的1 0 倍。纳米 物质一般被认为是直径在一到一百纳米的物质，处在原子簇和宏观物体交界的过 渡区域，是一种典型的介观系统。 当物质的特征尺寸进入到纳米的尺度时，原有的很多物理和化学性质会发生 巨大的改变，表现出特有的小尺寸效应、表面效应、量子效应等。 纳米科技是指在纳米尺度上制备、操作和研究物质，并对纳米尺寸物质独有 特性进行充分应用的科学和技术，它使人类认识和改造物质世界的手段和能力延 伸到原子和分子水平，其最终目标是利用原子、分子及物质在纳米尺度上表现出 来的新颖的物理、化学和生物学特性制造出具有特定功能的产品【l 2 1 。 2 纳米物质的特性 一般在宏观领域中，某种物质的理化特性与其尺度大小无关。而当物质尺寸 达到纳米量级时，会产生传统材料所不具备的特性，物质本身的许多固有特性均 发生质的变化，这种现象称为“纳米效应”。纳米材料具有如下特性：表面效应、 小尺寸效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应【3 】。 ( 1 ) 表面效应 纳米材料的表面效应是指纳米粒子的表面原子数与总原子数之比随粒径的 变小而急剧增大后所引起的性质上的变化。随着粒径变小，表面原子所占百分数 将会显著增加。当粒径降到l 舢时，表面原子数比例达到约9 0 以上，原子几乎 全部集中到纳米粒子表面。由于纳米粒子表面原子数增多，表面原子配位数不足 和高的表面能，使这些原子易与其它原子相结合而稳定下来，故具有很高的化学 活性。 ( 2 ) 小尺寸效应 由于颗粒尺寸变小所引起的宏观物理性质的变化称为小尺寸效应。对超微颗 粒而言，尺寸变小，比表面积增加，从而产生一系列新奇的性质。 特殊的光学性质：纳米金属的光吸收性显著增强。粒度越小，光反射率越 低。所有的金属在超微颗粒状态都呈现为黑色。尺寸越小，颜色愈黑。金属超微 颗粒对光的反射率通常可低于1 ，约几微米的厚度就能完全消光。相反，一些 非金属材料在接近纳米尺度时，出现反光现象。纳米t i 0 2 、纳米s i 0 2 、纳米a 1 2 0 3 中国协和医科大学中国医学科学院硕士学位论文 等对大气中的紫外光具有很强的吸收性。 热学性质的改变：固态物质超细微化后其熔点显著降低。当颗粒小于1 0 姗 量级时尤为显著。例如，金的常规熔点为1 0 6 4 ，当颗粒尺寸减, j q ! l j 2n m 时的 熔点仅为3 2 7 左右；银的常规熔点为6 7 0 ，而超微银颗粒的熔点可低于1 0 0 。 特殊的磁学性质：小尺寸的超微颗粒磁性与大块材料显著的不同，大块的 纯铁矫顽力约为8 0a m ，而当颗粒尺寸减d q ! i j 2 0n m 以下时，其矫顽力可增加l 千倍，当颗粒尺寸约小于6n m 时，其矫顽力反而降低到零，呈现出超顺磁性。 利用磁性超微颗粒具有高矫顽力的特性，己做成高贮存密度的磁记录磁粉，大量 应用于磁带、磁盘、磁卡等。利用超顺磁性，人们已将磁性超微颗粒制成用途广 泛的磁性液体。 特殊的力学性质：纳米材料的强度、硬度和韧性明显提高。纳米铜的强度 比常态提高5 倍，纳米金属比常态金属硬3 5 倍。纳米陶瓷材料具有良好的韧性， 因为纳米材料具有大的界面，界面的原子排列相当混乱，原子在外力变形的条件 下很容易迁移，因此表现出甚佳的韧性与一定的延展性。氟化钙纳米材料在室温 下可以大幅度弯曲而不断裂。 ( 3 ) 量子尺寸效应：对超微颗粒而言，大块材料中连续的能带将分裂为分立 的能级；能级间的间距随颗粒尺寸减小而增大。当热能、电场能或者磁场能比平 均的能级间距还小时，就会呈现一系列与宏观物体截然不同的反常特性，称之为 量子尺寸效应。例如，导电的金属在超微颗粒时可以变成绝缘体，比热亦会反常 变化，光谱线会产生向短波长方向的移动，这就是量子尺寸效应的宏观表现。 ( 4 ) 宏观量子隧道效应：微观粒子具有贯穿势垒的能力称为隧道效应，即微 小粒子在一定状态下能穿过物体，就像里面有了隧道可以通过的现象。一些宏观 物理量，如微颗粒的磁化强度、量子相干器件中的磁通量等亦显示出隧道效应， 它们可以穿越宏观系统的势垒而产生变化，称之为宏观量子隧道效应。 3 纳米技术在多个领域具有巨大应用前景 著名的诺贝尔化学奖获得者f e y n e m a n 在2 0 世纪6 0 年代【4 】曾预言：如果我 们对物体微小规模上的排列加以某种控制的话，我们就能使物体得到大量的异乎 寻常的特性，就会看到材料的性能产生丰富的变化。他所说的材料就是现在的纳 米材料。以纳米技术为代表的新经济主要包含以下两个部分的内容：纳米经济的 作用一方面是对传统工业的大规模改造，促进传统产业升级换代，使传统产业发 生脱胎换骨的飞跃：另一方面是新兴经济部分，为信息技术、生物技术等提供发 2 中国协和医科大学中国医学科学院硕士学位论文 展的硬件基础平台。当今科技的发展要求材料的超微化、智能化、元件的高集成、 高密度存储和超快传输等特性为纳米科技和纳米材料的应用提供了广阔的空间。 纳米材料以它奇异的特性，为传统产业的升级换代提供了新的机遇。下面从六个 方面简要地介绍纳米技术的应用及影响： ( 1 ) 纳米技术电子信息产业领域的应用在电子信息产业方面，运用纳 米结构材料所具有的各种量子化效应，通过适宜的纳米加工技术设计并制作具有 实用性的纳米量子器件及其集成电路。纳米技术的应用可以克服以强场效应、量 子隧穿效应等为代表的物理限制，以功耗、互联延迟、光刻等为代表的技术限制 和制造成本昂贵、用户难以承受的经济限制，制造出基于量子效应的新型纳米器 件和制备技术【6 j 。具有量子效应的纳米器件将提供不同于传统器件的全新功能， 从而产生出新的经济增长点，将会对信息产业和其他相关产业带来一场深刻的革 命。 ( 2 ) 纳米技术与新能源开发：纳米技术在能源的有效利用、储存和制造方 面具有潜在的巨大应用前景。纳米在能源领域中的应用成为新的关注点，特别是 纳米储氢技术已经成为重点项目【7 】，将极大促进安全高效的储氢材料、组件和系 统的开发。纳米太阳能电池材料、热电转换材料等也是新型能源材料的重要组成 部分和主要发展方向。运用纳米技术改善燃料电池技术，降低成本，提高可靠性 和寿命等等都将在解决2 1 世纪日益突出的能源危机问题上发挥重要作用，形成一 个新的经济增长点，具有巨大的市场容量。纳米能源技术的开发将在不同程度上 缓解我国能源的短缺状况，提高现有能源的使用效率，不仅是为我国，也为整个 世界的发展提供新的动力i o 】。 ( 3 ) 纳米技术与汽车工业：奔驰公司生产的e v b u s 纳米分子被碾压在两层玻 璃中间，形成一层防护膜，由于纳米粒子尺寸小于可见光的波长，可以反射太阳 光中的红外线，避免车厢内温度过高。科学家们构想将来在车身整个外表面喷涂 纳米材料的太阳能油漆，使整台汽车就像一个大太阳能电池，以此为车辆提供充 足的电能。太阳能油漆的工作原理是纳米材料分子吸收太阳光能量中放出的电 子，生成t i o z ，在电解液碘离子的作用下，负离子向阳极移动，从而形成电流。 纳米技术可以使燃料电池技术更加完美，纳米材料在室温条件下具有优异的储氢 能力，可以有效地分离燃料电池中的氢和氧。除了上面所说的纳米涂层、太阳能 油漆以及燃料电池之外，纳米技术在汽车工业上还有更大的应用空间：经纳米技 术处理的发动机部件有更好的耐磨性和传递能力；将含硅酸盐的纳米材料加入橡 胶内可以增加橡胶的疲劳极限，延长橡胶的使用寿命；使用纳米多孔净化装置可 以进一步有效净化尾气【l “。此外，采用纳米技术还可以制成多种具有特殊功能的 塑料制品：例如阻燃塑料能满足乘客座舱、线路、管路和其他需要阻燃设备对材 3 中国协和医科大学中国医学科学院硕士学位论文 料的要求：增强塑料可以替代金属材料、减轻车重，据美国预算，至l j 2 1 世纪3 0 年代汽车上4 0 的钢铁和金属材料要被轻质高强材料代替，这样可以节省汽油4 0 ，减少c 0 2 排放4 0 ，仅此一项就可为美国创造社会效益1 0 0 0 亿美元；抗紫外 线老化塑料适合制成暴露在外的车身塑料构件；抗菌塑料特别适用于制作公共汽 车内饰等等。可以相信，随着科学技术的不断发展，纳米技术在汽车工业中必将 发挥越来越重要的作用。 ( 4 ) 纳米技术与农业畜牧业：纳米技术可用于遗传育种，饲料化肥的加工 等方面 1 2 1 。纳米技术结合转基因技术在培育新品种方面取得了突破性的进展， 通过纳米技术先将d n a 染色体全部分解为单个基因，然后根据需要进行组装，转 基因整合成功率几乎可达1 0 0 。将饲料颗粒粉碎到纳米水平，就会具有较大的比 表面积和孔隙率，因而具有很强的吸附性和很高的活性，更易被消化和吸收。纳 米技术适合我国农业工程的发展，可以使部分领域产生彻底的变革，具有广阔的 应用前景。 ( 5 ) 纳米技术在环保领域的应用：在能源环保方面纳米材料能使燃油完全 燃烧而节油，在燃煤中加入纳米级助燃催化剂，可帮助煤充分燃烧，提高能源利 用率，防止有害气体产生。一些先进国家在汽车油箱、进气、进油管道上安装纳 米材料，使汽油、柴油节约6 1 4 ；用纳米技术改性的铅酸电池，其使用寿命 提高了1 倍以上，且大大提高了能量的转化效率；太阳能电池、镍氢电池、锂离 子电池和燃料电池中的工作电极、离子交换器等都开始采用纳米技术和纳米材 料，以期提高其能量转化效率和使用寿命。纳米碳管可以用作储氢材料，其储存 能力达n 4 以上，是稀土的两倍多，并可以做成燃料电池驱动汽车，有效避免了 因机动车尾气排放所造成的大气污染。在水净化和污水处理方面，纳米技术也有 不俗的表现，新型的纳米级净水剂具有很强的吸附能力，是普通净水剂的1 0 2 0 倍。通过纳米孔径的过滤装置，还能除去把水中的细菌，使水分子、矿物质以及 微量元素被保留下来，处理后即可以饮用【l ”。用光催化剂处理有机物污染过的 废水是最有效的处理手段，也是国内外研究的热点。纳米技术的出现为大气净化 提供了新的途径，其中，纳米技术对空气中2 0n m 和水中2 0 0n n 的污染物的清 除能力是其它技术不可替代的。 ( 6 ) 纳米技术在生物医学领域的应用：纳米医学是一个引起医学领域研究 者高度关注的十分活跃的新兴研究领域。纳米医学所关注的重要问题是在最基本 的生物水平上纳米尺度的人造物质与细胞及分子的相互作用，并利用纳米尺度物 质所特有的物理、化学性能，开发新型的生物材料、医疗器件、以及高效和高灵 敏度的检测、诊断和治疗技术。近年来纳米医学研究主要涉及药物( 基因) 靶向智 能运送系统、细胞和组织的再生与修复、单分子操纵技术和活体单细胞显微观测、 4 中国协和医科大学中国医学科学院硕士学位论文 植入性人工器官和医学器件、纳米生物传感器、高分辨率医学影像、以及在纳米 尺度上理解生命活动等方面。纳米技术在医药方面的具体应用详见第二节纳米技 术在医学领域的应用研究。 第二节纳米技术在医学领域的应用研究 纳米医学是利用纳米技术来解决医学问题的一门学科，可以用于医学的各个 领域，包括基于纳米技术的重大疾病预警、诊断和治疗。纳米粒子所具备的易于 被细胞摄取和可以跨越多种生物屏障的特性，是发展新型分子影像学技术、药物 和基因的高效靶向运送体系、疾病相关生物标志物分离与检测技术的关键要素利 用纳米技术可以提高中药的生物利用度，增强靶向性，达到缓释效果等。同时纳 米技术在再生医学方面也有不逊的表现，由清华大学材料系崔福斋教授课题组研 制成功的“纳米人工骨”已获得国家食品药品监督管理局的三类植入产品试生产 注册证，成为我国首个可以在市场上公开销售和应用的纳米医药产品。由于纳米 技术在肿瘤、心血管病、传染病等重大疾病的诊治方面所显示出来的广阔的应用 前景，因此近年来各国政府都相继大幅增加了对纳米医学研究的资助力度。美国、 德国、瑞士和日本等发达国家都已将纳米生物技术和纳米医药作为本国国家纳米 发展战略中的重要内容，我国的国家中长期科学和技术发展规划纲要也将纳 米科学和技术列为重大科学研究计划，其中纳米生物学和纳米医药占有很大比 重。纳米技术将带给医药学一场前所未有的技术革命，它将大幅度地提高人类健 康和保健水平。下面主要从药物和基因运载体系、重大疾病的诊治、组织工程三 个方面来介绍纳米技术在医学方面的应用和研究： ( 1 ) 纳米技术在药物和基因运载体系方面的应用：由于纳米粒子表现出易 于被细胞吸收和能够穿越多种生物屏障的性质，因此将药物或者基因与某种材料 复合制成纳米级颗粒，可以有效地提高药物和基因的运载效率，更易于进入靶组 织和靶细胞发挥功效，可以达到提高药效1 4 1 ，靶向输送【1 5 - 19 】和控缓释 2 0 - 2 1 】的效 果。 ( 2 ) 纳米技术应用于重大疾病的诊断和治疗：利用纳米技术特有的功效， 可以进一步提高癌症、心脏病、肺部疾病、血液病等疾病的早期诊断和治疗，从 而提高患者的生活质量和存活率 2 2 。6 j 。n i l t 于2 0 0 4 年9 月启动纳米癌症( c a n c e r n a n o t e c h n 0 1 0 9 yp l a n ) 计划，旨在研究在癌症防治中如何应用纳米技术，攻克癌 症治疗的难题，研究的主要技术包括可实现早期检测的新型造影剂和诊断试剂、 可以对治疗效果进行实时评价的系统、能够穿越生物屏障的多功能靶向识别的药 物运送载体、细胞发生病变的预警系统等。 中国协和医科大学中国医学科学院硕士学位论文 ( 3 ) 纳米技术在组织工程方面的应用：将纳米技术与组织工程技术相结合。 构建具有纳米拓扑结构的细胞生长支架也正在形成一个崭新的研究方向【2 饥。相 对于微米尺度，纳米尺度的拓扑结构与机体内细胞生长的自然环境更为相似。纳 米拓扑结构的构建有可能从分子和细胞水平上控制生物材料与细胞间的相互作 用，引发特异性细胞反应，对于组织再生与修复具有潜在的应用前景和重要意义。 这方面的研究内容涉及纳米拓扑结构的不同构建方法、纳米拓扑结构对细胞黏 附、增殖、分化、凋亡以及细胞外基质重建等行为的影响和机制等方面。例如， 用电纺的方法制成的丝素蛋白无纺膜支架，能够显著促进纤维母细胞、造骨细胞、 正常人角化细胞的黏附、发育、生长和分化。纳米骨模拟人体骨骼生成机制，具 有与骨骼类似的多孔结构，有利于自身血管及部分骨母细胞的侵入，促进新骨的 形成 2 8 - 2 9 j ，且因其既无生物活性，又无免疫活性，人体对其无明显排异反应。清 华大学研制的纳米骨，还可以根据不同部位骨骼生长的需要而制成不同硬度，且 与自身骨骼降解速度相一致，是修复儿童骨外伤及大段骨缺损的理想材料。 另外纳米技术在生物芯片，生物传感器和传统中医药等方面也显示出诱人的 应用前景和理论研究价值。 第三节纳米材料的安全性问题 由于纳米科学技术的飞速发展蕴藏着巨大的商机，因而成为当前各国投入最 多，发展最快的科学研究和技术开发领域之一。就在人们逐渐认识纳米科学技术 的优点和潜在的巨大市场的同时，对其生物安全性问题的担忧也在日益加大。在 欧洲和美国，科学家们发表了一项长期流行病学的研究成果【3 们。这项长达二十 多年的与大气颗粒物有关的流行病学研究结果发现：人的发病率和死亡率与他们 生活周围环境空气中大气颗粒物浓度和颗粒物尺寸密切相关。死亡率增加是由剂 量非常低的相对较小的颗粒物的增加引起的。伦敦一场大雾之后，两周内有4 0 0 0 多人突然死亡。科学分析结果显示，主要是空气中细小的纳米颗粒大量增加造成 的。 目前，细小颗粒导致疾病的发病率和死亡率增加的机理还不清楚。但是科学 家们推测，大气颗粒中数百纳米到数纳米的超细颗粒物具有特殊的生物机制，并 起关键的作用：它们对肺组织的沉积率很高；另一种推测是，小于1 0 0 舳的超 细颗粒可能直接作用于心脏，直接导致心血管疾病：也有人推测是它可以增加血 粘度和血的凝固能力，导致心血管疾病。由于1 0 0r l m 以下的物质正好是纳米科 学技术在努力发展的领域，因此，w h o 最近呼吁优先研究超细颗粒物，尤其是纳 米尺度颗粒物的生物机制。 6 中国协和医科大学中国医学科学院硕士学位论文 由于纳米材料具有特殊的物理化学性质，更容易进入机体和穿越各种生物屏 障。纳米颗粒在进入生命体后，它们与生命体相互作用所产生的化学特性和生物 活性与化学成分相同的常规物质有很大不同。具有许多特殊性质如表面效应，小 尺寸效应和量子尺寸效应的纳米颗粒进入生命体后，与生命体发生什么相互作 用? 表面活性很高的人工纳米颗粒对生命过程是否产生影响? 具有自组装能力 的纳米颗粒，对正常生命过程中的生物分子自组装会带来什么影响? 纳米量级的 微小颗粒，是否会穿越血脑屏障，进入大脑而影响大脑功能等等问题都还是未解 之谜。如果这些问题不解决，纳米医药的许多研究成果都将无法用于l 临床，纳米 的毒性和安全性问题是纳米医药研究面临的一个巨大挑战和纳米医药实现产业 化的关键瓶颈。 目前尽管对于纳米材料是否影响人体健康还没有非常明确的定论，但已有的 一些研究证据表明某些纳米材料表现出一定的细胞毒性，可诱导细胞的死亡，炎 症反应，改变基因的表达等。研究发现，尺寸小于1 0 0n l n 的磁性纳米颗粒进入 动物体内就会导致凝血现象聚集形成较大颗粒，堵塞血管，最后导致小鼠死亡 j 。美国罗切斯特大学的研究人员在实验鼠身上完成的实验显示，直径为3 5 姗 的碳纳米粒子被老鼠吸入后，能够迅速出现在大脑嗅球区，并不断堆积起来。科 学家还发现，在含有直径为2 0n l t l 的聚四氟乙烯塑料颗粒的空气中生活1 5 分钟 的实验鼠，大多数在随后的4 小时内死亡；而暴露在含有直径1 2 0n l t l 为聚四氟 乙烯塑料颗粒的空气中的对照组实验鼠则安然无恙。由毒理学家组成的研究小 组表示，经研究发现，吸入碳纳米管能导致肉芽瘤。美国三角公园研究院用气溶 胶吸入法研究纳米n 0 2 对小鼠、大鼠、豚鼠肺部的毒性，发现其可致肺部炎症、 颗粒在肺部严重沉积并清除困难 3 2 - 3 5 1 。 2 0 0 3 年4 月，s c i e n c e 首先发表文章讨论纳米材料与生物环境相互作用可能 产生的生物安全问题。随后，n a t u r e 和s c i e n c e 杂志在1 年内，先后4 次发表编 者文章，美国化学会，以及欧洲许多学术杂志也纷纷发表文章，与各个领域的科 学家们探讨纳米生物安全问题，尤其是纳米颗粒对人体健康、生存环境和社会安 全等方面是否存在潜在的负面影响。由于纳米科学的发展只有十几年的历史，人 们对其认识还不完全，因此对于各种纳米粒子的生物安全性评估研究急需加强。 第四节壳聚糖及其衍生物在基因运载体系中的应用 基因治疗是指将具有治疗作用的基因植入靶细胞以纠正或替代发生功能缺 陷的基因，从而使靶细胞恢复正常生物功能。它是从基因水平上对疾病进行干预， 从最根本上治疗疾病的一种医学技术，是人类在疾病治疗方面的一个重大突破。 7 中国协和医科大学中国医学科学院硕士学位论文 然而这样一种具有重大应用前景的医学技术在目前之所以还不能在临床得到推 广和应用，主要是因为尚未能实现安全、高效和靶向性的基因输送。裸露的质粒 d n a 在体外可以转染骨骼肌细胞1 3 6 、肝脏细胞 3 7 1 和肿瘤细胞邮l ，但在体内就会很 快被核酸酶降解掉【3 9 】。因此寻找安全有效的载体使d n a 免受核酸酶的降解，并将 d n a 选择性地运送到靶细胞就显得尤其关键。 基因输送载体大体上分为病毒和非病毒两类。以病毒作为基因输送载体是指 将病毒基因中编码致病因素的部分去除掉，以目标基因替代之。由于控制病毒进 入靶细胞，在细胞内的运输，以及编码病毒进入细胞核部分的基因还在病毒载体 上，所以病毒载体的突出优点就是有较高的靶基因表达效率。但同时也保留了一 些病毒的缺点，如可引发机体产生较强的免疫反应、可以随机地插入靶细胞的基 因组、可能会激活原癌基因从而引发肿瘤的发生等，并且大量制备过程非常复杂， 这些都成为病毒载体应用于临床的限制因素。特别是1 9 9 9 年基因治疗f i 每床试验 中出现首例运用腺病毒载体致人死亡事件后，更使人们对病毒载体的应用安全性 提出了质疑【4 们。非病毒载体主要有以下几种：脂质体，阳离子多聚物，重组蛋 白和无机的纳米粒子。脂质体也是目前研究较多的一种非病毒的载体，包括阳性， 中性，阴性脂质体。阳离子多聚物包括天然的阳离子多聚物如壳聚糖，胶原和人 工合成的阳离子多聚物如聚乙烯亚胺，聚丙烯亚胺树突状物，多聚赖氨酸等。 甲壳素是自然界中存在的第二大多聚糖，主要存在于水产甲壳类动物的外壳 和某些真菌的细胞壁，其化学名称为b ( 1 ，4 ) 一2 一乙酰氨基一2 一脱氧葡聚糖， 与自然界中存在最为丰富的多糖纤维素在结构上非常接近，只是二位上由羟基变 成了乙酰氨基。而壳聚糖是甲壳素部分脱乙酰基的产物，是葡糖胺和乙酰氨基葡 萄糖通过b ( 1 ，4 ) 糖苷键相连。壳聚糖的脱乙酰度反映了葡糖胺和乙酰氨基葡 萄糖的比例。壳聚糖分子含有两种活性基团：一个是在脱去乙酰基后形成的自由 氨基，另一个是羟基。通过在这些位点上进行相应修饰可以改善壳聚糖的生物学 性能。壳聚糖不溶于水和一般的有机溶剂，但能溶于大部分有机酸的水溶液而形 成一种玻璃状的胶状物。由于壳聚糖在p h 6 7 9 0s 。据此得到浓度 和反应时间的标准曲线为l g t = 2 6 6 3 2 6 + ( - 0 3 1 0 4 1 l g c ) 。 其中t 代表反应时间，c 代表内毒素的浓度，而通常1n gl p s 对应1 1 0e u 。 d n a 浓度为2 0 “g r u l 的溶液的反应时间为1 9 9 2s 和1 9 3 4s ，根据l g t = 2 6 6 3 2 6 + ( 一0 3 1 0 4 1l g c ) 标准曲线，求得溶液中内毒素的浓度为0 0 0 9 4e u m l ，相当 于o 0 0 0 4 7e u g g d n a ，其一百倍的稀释液的反映时间分别为 6 8 2 0s 和 6 8 2 0 s 。已经超出可以检测的最低限值。 第三节壳聚糖及其修饰物与d n a 形成的 纳米粒子的制备和表征 1 原料和仪器 壳聚糖( l o wm o l e c u l a rw e i g h t ) ：美国s i g m a 公司，l o wm o l e c u l a rw e i g h t ，浓度 为l 时在1 乙酸溶液中的粘度为2 0 2 0 0c p ，脱乙酰度7 5 8 5 ，分子量大约 在八万到十五万。 精氨酸修饰的壳聚糖和烷基化修饰的壳聚糖由天津大学杨建和朱敦烷协助完成 硫酸钠( 分析纯) ：天津市化学试剂三厂 醋酸( 分析纯) ：天津市化学试剂三厂 氢氧化钠( 分析纯) ：天津市化学试剂三厂 透射电子显微镜：s i m e n s ，德国 原子力显微镜：n a n o s c o p ei vs y s t e m ，i n c s a n t ab a b a r a ，c a ，美国 z e t a 电位测定仪：m a l v e mz e t a s i z e r2 0 0 0 ，英国 光子相关光谱：b r o o k h a v e n3 7 0 ，美国 2 实验方法 2 1 - 壳聚糖及其修饰物与d n a 纳米粒子的制各 将壳聚糖及其修饰物溶于ph 值为5 5 的醋酸，醋酸钠的缓冲液中，终浓度为 0 0 2 ，用直径为o 2 2 岫的滤膜过滤，置于4 冰箱保存。取1 0 0i t g d n a 溶 于l l l2 5m mn a 2 s 0 4 溶液中，取等体积的d n a 的溶液和壳聚糖及修饰物的溶 液，分别将二种溶液在5 0 一5 5 水浴中加热2 0m i n ，将此两管溶液快速混合， 振荡1m i l l ，得到载基因纳米粒子的混悬液( 见图1 ) 。 1 4 中国协和医科大学中国医学科学院硕士学位论文 叵巫亟巫习匝亟亟亟圃 5 5 水浴中预热2 0m i n 等体积快速混合高速搅拌 图1 纳米复合物的制各流程 2 2 透射电镜观察m ) 采用透射电镜来观察基因纳米粒子的形态。取新鲜制备的纳米复合物悬液少 许，滴在喷有碳粉的铜网上，用滤纸吸去多余的液体，在空气中晾干2 3m i l l ， 再经醋酸双氧铀负染色后在透射电镜下观察复合物的表面形态。 2 3 原子力显微镜观察( a l r m ) 在新剥离的云母片上滴加5u l 基因纳米粒子悬液，3 7 真空干燥，制备好 的样品放入洁净的玻璃平皿中。在原予力显微镜( n a n o s c o p ei vs y s t e m ，d i g i m l i n s t r u m e n t s ，i n c s a n t ab a b a r a ，c a ) 下，以接触模式观测其表面形貌。 2 4 基因纳米粒子粒径分布 采用动态光散射法( p c s ) 测定基因纳米粒子的粒径分布。 3 实验结果 3 1 透射电镜观察f r e m ) 图2 ，3 ，4 分别为透射电镜下观察到的n p 为4 ：l 的壳聚糖基因纳米粒子， 精氨酸修饰的壳聚糖基因纳米粒子，和烷基化修饰的壳聚糖基因纳米粒子的形 态。由图2 可以看到壳聚糖与d n a 通过静电相互作用缩合成不规则的球形，直 径大约在6 0 1 2 0a m 左右，表面凹凸不平。由图3 看到精氨酸修饰的壳聚糖与 d n a 也缩合成球形，直径在8 0 1 2 0 姗之间，较壳聚糖与d n a 复合成的纳米 粒子要更加均一，表面更光滑。由图4 可看到烷基化修饰的壳聚糖与d n a 形成 的纳米粒子复合物较前两者都大，直径在6 0 1 7 0n m 之间 中国协和医科大学中国医学科学院硕士学位论文 图2 壳聚糖与d n a 形成的纳米复合物透射电镜图 图3 精氨酸修饰的壳聚糖与d n a 形成的纳米复合物透射电镜图 1 6 中国协和医科大学中国医学科学院硕士学位论文 图4 十六烷基化修饰的壳聚糖与d n a 形成的纳米复合物透射电镜图 3 2 原子力显微镜观察( a f m ) 图5 ，6 ，7 分别为原子力显微镜下n p 为4 ：1 时壳聚糖基因纳米粒子，精氨 酸修饰的壳聚糖基因纳米粒子，和烷基化修饰的壳聚糖基因纳米粒子的形貌。从 图中可见三种纳米粒子的形态与在透射电镜下观察的结果相似，精氨酸修饰的壳 聚糖基因纳米粒子的表面更加圆滑，而烷基化修饰的壳聚糖基因纳米粒子粒径比 前两者更大。 1 7 中国协和医科大学中国医学科学院硕士学位论文 图5 壳聚糖与d n a 形成的纳米复合物原子力显微镜图 图6 精氨酸修饰的壳聚糖与d n a 形成的纳米复合物原子力显微镜图 1 8 中国协和医科大学中国医学科学院硕士学位论文 图7 烷基化修饰的壳聚糖与d n a 形成的纳米复合物原子力显微镜图 3 3 基因纳米粒子粒径分布 用动态光散射法测得，在此次实验中所用的壳聚糖与d n a 在n p 比4 ：1 时形成的纳米粒子，其平均粒径为1 1 5 6n n l ，粒径范围在7 4 1 4 1 3 6 2 8n n l ；精氨 酸修饰的壳聚糖与d n a 形成的纳米粒子其平均粒径为1 1 8 9n i i l ，粒径范围在 9 6 4 5 1 4 5 7 1n l n 之间；而十六烷基化与d n a 形成的纳米粒子得平均粒径为1 7 4 。8 h i l l ，粒径范围在9 2 8 3r i m - 2 1 4 7 3n n l 。与透射电镜和原子力显微镜的结果基本上 符合。 4 小结和讨论 本研究最主要的目的是观察壳聚糖及其修饰物与质粒d n a 所形成的纳米粒 子对于免疫细胞分泌细胞因子和吞噬能力的影响，质粒d n a 是在大肠杆菌中扩增 的，在质粒d n a 提取过程中需要裂解大肠杆菌菌体，此过程会释放大量的内毒素， 内毒素是一种很强的致热源，会引起机体产生发热反应，同时刺激体内多种免疫 细胞分泌细胞因子，是革兰氏阴性菌的致病因之一，为排除样品中的内毒素担扰， 保证研究结果的可靠性，必须要去除质粒d n a 中的大量内毒素，因此在本实验中 中国协和医科大学中国医学科学院硕士学位论文 采用了德国q i a g e n 公司的e n d o f r e ep l a