电化学生物传感技术用于单碱基突变与蛋白质的检测_硕士学位论文（pdf格式可编辑）.pdf

，。， 一 y 硕l j 学位论文 摘要 高效快捷的核酸与蛋白质检测对于环境监测、食品工程、生物医学及临床疾 病的诊断有着非常重要的意义。电化学生物传感技术由于灵敏度高、选择性好、 所需仪器简单、成本低等优点，是当前科学研究中普遍使用的检测方法之一。在 核酸和蛋白质检测研究中，利用核酸分子杂交、免疫分析、小分子与蛋白质间的 特异性亲和作用提高了检测的选择性。同时用电化学活性物质和纳米材料作为检 测标记物，可大大提高检测灵敏度。本文基于此，发展了几种检测核酸和蛋白质 的化学生物传感技术： ( 1 ) 建立了一种基于S l 核酸酶切割反应，二茂铁作为电活性标记物的电化 学生物传感体系，用于单碱基突变的检测( 第2 章) 。首先，对检测探针3 端进 行二茂铁标记，并分别与正常型和突变型目标链杂交，形成3 末端不完全互补序 列( 突出末端) 和完全互补序列。接着应用S l 酶对双链突出末端的切割作用，使 和正常型目标链杂交的检测链上的二茂铁游离，而和突变型目标链杂交的检测链 依然保持二茂铁的标记。最后检测链和组装在金电极表面的捕获探针杂交，从电 化学信号的强弱实现对单碱基突变的检测。 ( 2 ) 进一步利用核酸酶( 核酸外切酶I ) 的切割作用和二茂铁作为电活性物 质的信号转换作用，建立一种核酸末端保护分析方法，用于研究小分子和蛋白质 的特异性结合作用，进而对相关蛋白质实现有效检测( 第3 章) 。首先，在检测 核酸链5 端标记二茂铁，另3 端标记生物素。接着，当链霉亲和素存在时，检测 核酸链和链霉亲和素特异性结合，由于空间位阻较大，加入的核酸外切酶不能对 该检测链进行切割。最后，检测链在电极上被捕获产生电化学信号。 ( 3 ) 构建了一种基于磷脂修饰多壁碳纳米管M W N T s ( P L M W N T s ) 作为信 号调控物质的电化学免疫传感技术( 第4 章) 。首先，通过非共价键作用在M W N T s 表面修饰磷脂分子，用磷脂分子末端的氨基共价交联肿瘤标志物前列腺特异性抗 原( P S A ) 的单克隆抗体( M A b ) ，得到M W N T s M A b 复合物。接着，通过磁分 离免疫夹心反应收集该P L M W N T s 复合物。最后，沉积到十八烷基硫醇绝缘膜修 饰的电极表面的M W N T s 改变了电极表面的性质，产生了电化学信号。技术实现 了对P S A 的高灵敏、高特异性检测，响应动态范围为5p g m L 到1 0 0n g m L ，检 测限为3p g m L ，并测定了实际样品。 关键词：电化学生物传感技术；免疫传感器；D N A 传感器；单碱基突变：蛋白质； 碳纳米管；核酸酶；小分子 I l r I U 化学# 物传感技术用f 甲碱旌突变j 蛋l ，J 质的柃测 - _ _ - - _ _ I l _ I I - _ _ - - _ l - I - _ I I I I _ l _ l _ _ - l l - l - l l I _ l _ _ - _ - l - I _ - l _ _ I I _ I A b s t r a c t I t So fg r e a ts i g n i f i c a n c et oe s t a b l i s hr a p i da n de f f i c i e n td e t e c t i o nt e c h n i q u e so f n u c l e i ca c i d sa n dp r o t e i n si ne n v i r o n m e n t a lm o n i t o r i n g ，f o o de n g i n e e r i n g ，b i o m e d i c a l r e s e a r c h e sa n dc l i n i c a ld i a g n o s i s E l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s i n gt e c h n o l o g i e s ，b e c a u s eo f h i g hs e n s i t i v i t y ，s i m p l ei m p l e m e n t a t i o n ，a n dl o wc o s t ，i sc u r r e n t l yw i d e l yu s e di n s c i e n t i f i cr e s e a r c h e s I nn u c l e i ca c i d sa n dp r o t e i n sd e t e c t i o n ，t h eu s eo fn u c l e i ca c i d h y b r i d i z a t i o n ，i m m u n o r e a c t i o na n ds m a l lm o l e c u l e p r o t e i ni n t e r a c t i o no f f e r sd e s i r a b l e 。s e l e c t i v i t yf o rt h ea s s a y s M e a n w h i l e ，t h ea p p l i c a t i o n so fe l e c t r o a c t i v em a t e r i a l sa n d n a n o m a t e r i a l sa ss i g n a l r e p o r t e r sh a sp r o v i d e de n o r m o u sp o s s i b i l i t i e so fs e n s i t i v i t y e n h a n c e m e n t E l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r sf o rn u c l e i ca c i d sa n dp r o t e i n sh a v eb e e n d e v e l o p e di nt h ep r e s e n tt h e s i s ： ( 1 ) B a s e do nS1n u c l e a s e c l e a v a g e ，a ne l e c t r o c h e m i c a ls e n s o rf o rt h es i n g l eb a s e m u t a t i o nd e t e c t i o ni Sc o n s t r u c t e dw i t hf e r r o c e n ea sa ne l e c t r o a c t i v el a b l ei nC h a p t e r 2 D e t e c t i o np r o b ew i t hf e r r o c e n e ( F c ) t a ga tt h e3 e n dh y b r i d sw i t h w i l d t y p ea n dm u t a n t t a r g e t ，f o r m i n gn o n c o m p l e m e n t a r ya n dc o m p l e m e n t a r ys e q u e n c er e s p e c t i v e l ya tt h e 3 e n d S1n u c l e a s ec u t st h eF ct a ga t n o n c o m p l e m e n t a r yh y b r i d s ，b u th o l d si t a t c o m p l e m e n t a r yh y b r i d s A f t e rd e n a t u r a t i o n ，o n l yF c r e s e r v e dd e t e c t i o np r o b ec a p t u r e d b yg o l de l e c t r o d ec a nr e s p o n s ee l e c t r o c h e m i c a ls i g n a l ，l e a d i n gt ot h er e c o g n i t i o no f s i n g l eb a s em u t a t i o n ( 2 ) W i t ht h eu n i q u ei n t e r a c t i o n ( a f f i n i t y ) b e t w e e ns m a l lo r g a n i cm o l e c u l e sa n d t h e i rp r o t e i nr e c e p t o r s ，as i n g l e - s t r a n d e dD N A ( s s D N A ) t e r m i n a l l yt e t h e r e dt oas m a l l m o l e c u l ei sp r o t e c t e df r o mt h ed e g r a d a t i o nb ye x o n u c l e a s eI ( E x oI ) i nt h ep r e s e n c eo f s p e c i f i cp r o t e i n S u c ha nE x oIa p p l i e ds s D N At e r m i n a lp r o t e c t i o na s s a yi se s t a b l i s h e d i nC h a p t e r3 As s D N A ( d e t e c t i o n p r o b e ) i sl a b l e db yF ca tt h e5 e n da n db i o t i na tt h e 3 e n d ，t h en e w c o m i n gs t r e p t a v i d i nc o n n e c t sw i t hb i o t i n ，r e s u l t i n g l a r g es t e r i c ， a v o i d i n gt h ed e g r a d a t i o no fE x oI T h i ss s D N Ai st h e nc a p t u r e db yt h ef i x e dp r o b eo n t h eg o l de l e c t r o d ea n de l e c t r o c h e m i c a lr e s p o n s ew i l lb eo b t a i n e d ( 3 ) A ne l e c t r o c h e m i c a li m m u n o s e n s i n gt e c h n o l o g yi s d e v e l o p e db a s e d o n p h o s p h o l i p i d m o d i f i e dM W N T s ( P L M W N T s ) a sas i g n a lr e g u l a t o ri nC h a p t e r4 M W N T si sm o d i f i e dw i t hp h o s p h o l i p i dw h i c hi Sc r o s s 1 i n k e dt ot h em o n o c l o n a l a n t i b o d y ( M A b ) o ft u m o rm a r k e rp r o s t a t es p e c i f i ca n t i g e n ( P S A ) A f t e rt h es a n d w i c h r e a c t i o n ，M W N T s M A bi Sc o l l e c t e do nt h ee l e t r o d em o d i f i e dw i t ho c t a d e c y lm e r c a p t a n 1 1 1 硕I j 学位论文 b ym a g n e t i cs e p a r a t i o n T h ed e p o s i t e dc o n d u c t i v eM W N T s a l t e rt h ee l e c t r i c a ls i t u a t i o n o nt h ee l e c t r o d e ，a n dt h e np r o d u c ee l e c t r o c h e m i c a ls i g n a lt ot h ed y n a m i cr a n g eo f5 p g m Lt o10 0n g m Lo fP S A w i t hl o wd e t e c t i o nl i m i t ( 3p g m L ) T h i st e c h n o l o g ya l s o i si d e a l l yr e s p o n s e dt ot h er e a ls a m p l e K e yW o r d s ：E l e c t r o c h e m i c a lB i o s e n s i n g ；I m m u n o s e n s o r ；D N AS e n s o r ；S i n g l eB a s e M u t a t i o n ；P r o t e i n ；C a r b o nN a n o t u b e s ( C N T s ) ；N u c l e a s e ；S m a l l M o l e c u l e I V L l 化学生物传感技术用j ：t 争碱堆突，燕j 篮I l 质的榆测 目录 学位论文原创性声明与学位论文版权使用授权书I 摘要I I A b s t r a c t I I I 第1 章绪论l 1 1 电化学生物传感器的工作原理1 1 2 电化学生物传感器的分类l 1 2 1 电化学酶传感器：一2 1 2 2 电化学免疫传感器2 1 2 3 电化学D N A 传感器4 1 3 电化学生物传感器的检测方法一6 1 3 1 伏安法一6 1 3 2 电化学交流阻抗法7 1 3 3 计时电位法7 1 4 电化学生物传感器灵敏度的提高7 1 4 1 碳纳米管( C N T s ) 的性质一8 1 4 2 基于碳纳米管信号增强的电化学生物传感器一8 1 5 本研究工作的构想一9 第2 章基于酶切反应的电化学单碱基突变检测一9 2 1 前言9 2 2 实验部分一9 2 2 1 试剂及仪器一9 2 2 2 探针的设计及反应条件的选择1 0 2 2 3 金电极的处理及捕获探针在金电极上的组装1 0 2 2 4 二茂铁修饰氨基标记的核酸链1 0 2 2 5 目标链杂交反应1 1 2 2 6 酶切反应1 1 2 2 7 捕获杂交反应及电化学检测1 l 2 3 结果与讨论1 l 2 3 1 基于酶切反应的电化学单碱基突变检测方法的原理1 l 2 3 2 传感模型的电流响应1 2 2 3 3 传感模型的交流阻抗1 4 V 2 3 5 检测探针的工作曲线1 5 2 4 小结15 第3 章核酸末端保护电化学分析方法检测与小分子结合的蛋白质1 7 3 1 前言1 7 3 2 实验部分1 7 3 2 1 试剂与仪器1 7 3 2 2 硫辛酸和二茂铁甲酸分别标记捕获探针和检测探针1 8 3 2 3 捕获探针在金电极上的组装1 8 3 2 4 核酸末端保护分析反应1 8 3 2 5 固柑表面杂交及电化学检测- 1 9 3 3 结果与讨论1 9 3 3 1 核酸末端保护电化学分析方法检测与小分子结合的蛋白质的原理1 9 3 3 2 传感器的电化学响应1 9 3 3 3 传感体系的交流阻抗特性一2 0 3 3 4 毛细管电泳和凝胶电泳分析2 2 3 3 5 传感体系在不同扫描速率下的电化学行为一2 3 3 3 6 反应条件的优化2 4 3 3 7 核酸末端保护分析的特异性2 5 3 3 8 工作曲线2 5 3 4 小结2 7 第4 章磷脂修饰碳纳米管信号调控电化学免疫分析2 8 4 1 前言2 8 4 2 实验部分2 8 4 2 1 试剂与仪器2 8 4 2 2 电极表面的处理及修饰2 9 4 2 3 磷脂非共价修饰M W N T s 2 9 4 2 4M W N T s M A b l 复合物的制备3 0 4 2 5M B M A b 2 复合物的制备3 0 4 2 6 免疫分析及电化学检测3 1 4 3 结果与讨论31 4 3 1 磷脂修饰碳纳米管信号调控磁分离电化学免疫分析的基本原理3 l 4 3 2 免疫传感技术分析的电化学响应3 2 4 3 3 交流阻抗谱法表征不同阶段电极表面情况3 3 4 3 4 经过不同处理后电极表面的电化学响应3 3 V I U 化学乍物传感技术用j 二单碱桀突变。j 蛋l J 质的检测 4 3 5S E M 对不同处理阶段电极表面形貌的表征3 4 4 3 6 均相免疫复合物的T E M 表征3 5 4 3 7D M F 处理免疫复合物的表征3 6 4 3 8 工作曲线3 7 4 3 9 免疫分析的干扰实验3 8 4 3 1 0 实际样品检测3 8 4 4 ，J 、结4 0 结论4l 参考文献4 2 致 射5 0 V n 硕l + 学位论文 第1 章绪论 现代科学发展及应用使众多的学科互相交叉、渗透，以探求事物的本质为共 同目标。对生物分子的快速、高灵敏分析检测及其相互作用的研究是分析科学研 究的重大目标。生物传感技术的发展为检测生物分子提供了新思路，为生命科学 和相关领域的研究和实践提供了新方法。生物传感技术是依据生物活性物质对某 种物质具有特定的选择性或者作用力，将作用力的大小转换为可读信号来判断特 定物质的浓度。通常情况下，生物传感器由两个主要部分组成，即生物识别元件 和换能器。生物识别元件能将生物化学反应的信息( 通常为分析物的浓度) 转译 为具有一定灵敏度的化学或物理输出信号；换能器是将生物识别系统输出的信号 进行转换【2 】。根据可以检测到的信号来看，目前常用的有电化学、光学、热、压电、 表面声波技术和质量分析几种方法。其中，电化学方法由于灵敏度高、易微型化、 快速、所需仪器简便等，是一种较理想的生物传感方法。随着人类基因组计划的 完成和蛋白组学研究的深入开展及纳米技术的快速发展和成熟，电化学生物传感 器的研究进入了一个崭新的发展阶段，可在分子和原子水平上探讨电化学界面的 组成和结构，实现实时、现场、活体甚至单分子检测。 1 1 电化学生物传感器的工作原理 电化学生物传感器是电极( 固体电极、离子选择性电极、气敏电极等) 作为固定 载体和信号转换平台，生物敏感物质固定在电极上，通过生物分子间的特异性识 别作用将目标分子与其反应信号变成可以测量的电信号，如电容、电流、电位、 电导率等，实现对目标分析物的定量或定性检测。该敏感物质可以为酶、抗原、 抗体、核酸、细胞、组织、微生物等。 1 2 电化学生物传感器的分类 根据固定在电极上的生物敏感物质的种类，可将电化学生物传感器分为电化 学酶传感器、电化学免疫传感器、电化学D N A 传感器、超分子传感器、细胞传感 器、微生物传感器和组织传感器等。根据检测信号的不同，可分为电容性型传感 器、电流型传感器、电位型传感器等。以下重点介绍电化学酶传感器、电化学免 疫传感器、电化学D N A 传感器三种。 1 2 1 电化学酶传感器 电化学酶传感器，亦酶电极，是以酶作为分子识别元件固定在电极上形成换 乜化学生物f 感技术用十单碱基突变j 蛋 J 质的榆测 能系统。由于酶具有高效的催化作用和高度的专一性，酶促反应产生的电势 或电流信号在一定条件下和被测底物的浓度呈线性关系。第一代酶电极是1 9 6 2 年 C l a r k T M 等人首先提出的在氧化还原基础上检测酶的底物。第二代酶电极是利用人 为加入电子媒介体即化学修饰层来促进电子传递，降低工作电势，排除其他电活 性物质的干扰【4 一】。第三代酶电极是通过酶在电极上的直接电催化来实现的，即所 谓的无试剂传感器 8 q o l 。 酶作为电化学生物传感器的敏感膜固定在电极上，常见的固定方法如吸附法、 组合法、包埋法、交联法、共价键合法等以保持酶固有的性质和酶电极的稳定性、 选择性和灵敏度，使酶电极具有研究和应用价值【1 1 。2 1 。对酶电极的固定方法和酶 本身的改进使对酶电极得到了进一步的发展。 1 2 2 电化学免疫传感器 免疫传感技术是将抗体抗原之间的特异性免疫反应和灵敏的传感技术结合 在一起发展起来的一种分析技术。电化学免疫传感技术是免疫传感技术研究最早、 最多、较成熟的一个分支，结合各种电分析技术，如溶出伏安法、脉冲伏安法、 脉冲差分法等，使检测更灵敏、更实用。 1 2 2 1 电化学免疫传感器的工作原理 电化学免疫传感器的工作原理是以免疫反应为基础，将生物反应信号转换成 可测量的电信号，并通过基础电极将其导出，根据信号的大小实现目标分析物( 抗 体、抗原、半抗原、药物、蛋白质、激素、毒物等) 的测定。 1 2 2 2 电化学免疫传感器的分类 一、根据抗原抗体间的免疫反应方式的不同，电化学免疫传感器可以分为两 种：基于竞争法和基于夹心法的电化学免疫传感器。 竞争法是指标记抗原( A g * ) 和非标记抗原( A g ) 共同竞争与抗体的特异性 反应【1 3 - 1 4 】： A g ( 待测物) + A b = A g A b A g * ( 定量加入) + A b = A g * A b 抗体固定在电极表面，加入待测物和一定量的已标记的抗原后，未标记的抗 原和已标记的抗原之间竞争结合抗体提供的特异性位点。通过检测电极表面的标 记物所产生的信号，得到待测抗原的浓度。由于加入的已标记的抗原浓度是固定 当待测抗原含浓度越高时，能够竞争结合到电极表面上的标记抗原越少，所 最终检测到的标记物产生的信号大小与待测抗原浓度成反比关系。 夹心法是将捕获抗体、抗原和检测抗体结合在一起，形成一种捕获抗体抗原 抗体的夹心式复合物，也称“三明治式结合物15 啪】。其过程为：先将捕获抗 硕f ：学位论文 体( A b ) 固定在基础电极表面，加入的待测抗原由于特异性反应而被捕获到电极 表面上。然后洗去游离抗原，加入带有已标记的检测抗体( A b * ) ，使之与抗原继 续反应，在电极表面形成夹心式复合物： A b + A g 工A b 木= A b - A g - A b 木 通过检测夹心复合物上标记物所产生的信号的大小，得到待测抗原的浓度， 信号大小与待测抗原浓度成正比关系。 二、根据检测信号的种类可将电化学免疫传感器分为电位型免疫技术器、电 流型( 安倍型) 免疫传感器、电容型免疫传感器以及电导型免疫传感器。目前电 流型免疫传感器的研究最为成熟，应用最为广泛。以下重点介绍下电流型免疫传 感器。 电流型免疫传感器是在恒定电压的条件下，通过测量识别分子在传感器表面 发生的氧化还原反应所产生的电流大小，实现对目标分析物的检测，通常电流大 小与待分析物的浓度呈正比。该类传感技术一般包含两个步骤：一是通过夹心法 或者竞争法将标记物结合在传感器表面，经过清洗或者分离除去非特异性吸附； 二是通过催化反应或者氧化还原反应检测免疫反应引起的电流变化。目前，电流 型免疫传感方法均需辅助反应来实现免疫结合的表达，即对某一免疫反应物进行 标记。 1 2 2 3 电化学免疫传感器的标记物 常用的标记物有生物酶，如碱性磷酸酶( A L P ) 和辣根过氧化酶( H R P ) 、乳 酸脱氧酶、葡萄糖氧化酶、青霉素酰化酶和尿素水解酶等，及电化学活性物质， 如二茂铁、硝基雌三醇、D T P A 、对氨基酚及衍生物、聚苯胺及金属离子( 汞离子、 铟离子等) 。 以酶为标记物的电化学免疫传感技术是将酶交联在抗体( 或抗原) 上后采用 竞争法或者夹心法进行温育反应，然后进行电化学检测。首先将抗体( 或抗原) 固定在传感器表面，加入抗原( 或抗体) 进行温育反应形成免疫复合物，洗去过 量的或未反应的抗原( 或抗体) ，采用夹心法或者竞争法使加入的酶标抗体( 或 抗原) 与传感器表面抗原( 或抗体) 结合，洗去游离酶标抗体( 或抗原) ，最后 加入底物，结合在传感器表面的标记酶催化底物产生电活性物质，测得体系的电 信号变化与酶的活性成正比，间接得出待测抗原( 或抗体) 的含量。 以电活性物质作为标记物的电化学免疫传感技术，其原理和以酶作标记物的 相似。首先将电活性物质标记与抗体( 抗原) 上，再通过竞争法或夹心法将结合 物标记在电极上，测得电化学信号以达到检测目的。 1 2 3 电化学D N A 传感器 核酸，尤其脱氧核糖核酸( d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ，D N A ) 的检测与研究，对遗传 乜化学生物传感技术用j 二甲碱堆突变j 篮 1 质的榆测 疾病诊断与预防、环境监测、药物研究、法医鉴定及食品检验等多方面具有重大 的意义。电化学D N A 传感器是近年来发展起来的一种新型的生物传感器，为在分 子水平上认识了解生命物质之间的反应和特性提供了新气象。它将目的D N A 转换 为电信号，本身具有灵敏度高、成本低、易操作、简单化、并能与其它仪器兼容 的特点，因而发展非常迅速【17 1 。 1 2 3 1 电化学D N A 传感器的工作原理 电化学D N A 传感器的工作原理是将D N A 探针( 通常为单链D N A 和寡聚核苷 酸) 固定在电极表面，在适当的温度、p H 、离子强度下，D N A 探针分子能与靶序 列选择性地杂交，形成双链D N A ( d s D N A ) ，导致电极表面结构发生改变，这种 杂交前后结构的差异通过一电活性杂交指示剂来识别，由电极作为信号传导器导 出信号。通过检测导出的电信号来实现靶序列( 或特定基因) 的检测。 1 2 3 2D N A 探针的固定 电化学D N A 传感器的实用性和性能的优良首先要从探针的固定开始考虑，探 针在电极表面的分布、密度及方向对传感器的性能有很大的影响。常见的固定方 法有： ( 1 ) 化学吸附法D N A 片段很容易在电极表面发生吸附，热变性的单链D N A ( s s D N A ) 分子能强烈地吸附于汞电极表面，质子化的D N A 亦如此，而s s D N A 分子发生电还原反应后的还原产物的吸附能力为最强【l 引。用于该法固定的电极材 料有硝化纤维、尼龙膜、聚苯乙烯、金属氧化物表面或碳碳糊传感器。此方法比 较简单，但是稳定性不够，容易脱附。 ( 2 ) 包埋法D N A 探针通过其磷酸骨架与硅溶胶二氧化钛珠上的二氧化硅单 层结合，然后将该珠混合物分散在碳粉和石蜡油中做成碳糊电极，该电极的表面 可以不断更新，因此可以保证电极表面上有新的杂交探针，从而重复实用【l9 1 。 ( 3 ) 共价键固定法这种固定化方法首先要在电极表面修饰上一些易与D N A 探针产生共价键的活性官能团如氨基、羧基等从而将D N A 片段修饰在电极表面 1 2 叭，利用D N A 的构象变化增加杂交效率。此方法虽然稳定性好，但是操作过程较 为复杂。 ( 4 ) 自组装法根据分子的自组装作用，在电极表面形成高度有序的s s D N A 单分子层。通常是利用巯基化合物修饰D N A 后再通过A u S 键组装于金电极的表 面形成单分子层【2 1 1 。该方法制备的固定探针表面结构高度有序、稳定性好、易于 发生杂交反应，但对巯基修饰的D N A 的纯度要求较高，分离提纯操作较烦琐。 ( 5 ) 化学免疫法在电极表面固定亲合素，利用生物素与亲合素之间特异性亲 合力的作用，使其与末端标记有生物素的D N A 结合，从而将D N A 固定于电极表面 【2 2 1 。用该法制备的传感器特异性较好，杂交后的电极可重复使用，在电化学生物 传感器中倍受重视。 硕I 学位沦文 1 2 3 3 电化学D N A 传感器的杂交指示剂 电活性的杂交指示剂有过渡金属络合物离子、抗肿瘤药物、小分子染料和荧 光试剂等，都能与单链D N A ( s s D N A ) 和双链D N A ( d s D N A ) 中的磷酸骨架或碱 基以不同的作用被吸附到电极表面，导致电活性指示剂在电极表面的浓度增加， 通过检测它们的电活性来检测电流，提高检测灵敏度。另外细胞色素C 和酶，如 辣根过氧化酶( H R P ) 、葡萄糖氧化酶( G O D ) 、碱性磷酸酶( A L P ) 也作为电 化学D N A 传感器中信号的识别物2 3 。2 5 】。酶具有较强的催化性能，它能高效地催化 底物发生反应，当标记了酶的s s D N A 与电极表面的s s D N A 互补，发生杂交反应 后，相当于在电极表面修饰了一层酶，通过测定酶底物的变化量可以间接测定待 测D N A 的浓度。 1 2 3 4 电化学D N A 传感器的选择性 电极表面D N A 的杂交遵循碱基配对原则，具有极高的选择性。但是电极表面 发生的是固相反应，反应速率相对于在液相中的小了很多。溶液中离子强度、温 读、黏度、助杂交剂、杂交时间以及探针序列的长度均对传感器的选择性产生了 影响【26 1 。通常有两种主要的方法用来提高传感器的选择性：一是基于探针D N A 的 选择，比如肽核酸( P N A ) 可显著改变杂交选择性，及杂交条件的控制( 特别是 温度) 2 7 l ；二是通过区别完全配对与单碱基错配之间电子传递性质的差异【2 8 1 。 1 3 电化学生物传感器的检测方法 电化学生物传感器构建成以后，通过适当的测量方法来获取传感器的相关信 息是十分必要的，目前根据电化学检测方法的类别可分为伏安法、电化学交流阻 抗法、计时电位法等。 1 3 1 伏安法 伏安法是指用恒定面积的固体或者悬汞电极为工作电极，测量电流随电势的 变化而变化的方法。其中，循环伏安法是在工作电极和参比电极之间加上对称的 周期性变化相反的三角波，扫描过程可以是单圈的也可以是多圈的，得到氧化还 原电流与施加电位的关系图。从循环伏安曲线的波形、氧化电流和还原电流的数 值及比值、峰电位等可以判断电极反应机理【2 9 1 。循环伏安法可用于可逆的电极过 程，也可以用于不可逆或准可逆的电极过程以及各种伴随反应的过程。循环伏安 法作为最重要的电化学检测方法之一，能提供关于反应过程的大量信息，且操作 方便快捷，图谱解析直观，在许多研究领域被广泛应用，尤其是电化学和电分析 化学研究最重要、最基本的方法。 但是循环伏安法的检测限对于通常的分析应用来说并不是足够的低，一般只 有1 0 一m o l L 。改变加载电位的波形或者响应函数可提高方法的灵敏度，常见的有 乜化学生物传感技术用于币碱堆突变j 蛋 J 质的榆测 交流循环伏安法( A C V ) 【3 0 1 、示差脉冲伏安法( D P V ) 3 1 1 、方波伏安法( S W V ) 3 2 1 和线性扫描伏安法( L S V ) 【3 3 1 。其中，S W V 是新发展起来的一种技术，可使 用较快的扫描速率。D P V 灵敏度很高，可达到1 0 罐m o l L 的检测限，对量少的生 物样品检测最为实用。 1 3 2 电化学交流阻抗法 电化学交流阻抗法是利用小幅度交流电压或电流对电极的扰动，进行电化学 测试的方法。近年来快速发展起来的，常用来检测修饰有生物分子的电极界面的 生物学反应特性的电化学技术，具有良好的界面表征作用 3 4 , 3 5 】。从获得的交流阻抗 数据，可以根据电极的摸拟等效电路，计算相应的电极反应参数。若将不同频率 交流阻抗的虚数部分对其实数部分作图，可得虚、实阻抗( 分别对应于电极的电 容和电阻) 随频率变化的电化学阻抗谱( e l e c t r o c h e m i c a li m p e d a n c es p e c t r u m ；E I S ) 或交流阻抗复数平面图。 E I S 的微小振幅正弦电压或电流不会对生物大分子造成干扰，敏感性高，使 其有可能成为一种推测电极反应动力学机制的良好手段，能将生物传感技术与其 他检测技术互补，具有广阔的应用前景。目前，交流阻抗分析方法已在各种传感器 中被广泛应用。 1 3 3 计时电位法 计时电位法是一种通过控制流过电极上的恒定电流来测定电极的电极电势随 时间的变化进行电化学和电分析的方法。主要用来研究电极表面吸附现象，并定 量地测定电活性物质( 或称去极剂) 或表面活性物质在电极表面吸附量的电化学 分析法。与C V 和方波伏安法相比，该方法对于单组分的测定能获得很高的灵敏 度和有效的背景补偿，且所需仪器简单，但是受双电层充电的影响较大，不适宜 对多组分体系和分步反应的数据处理。 实验测定时一般采用三电极系统：电化学检测池中的对电极( 一般为铂电极) 、 参比电极( 一般为饱和甘汞电极) 、工作电极( 即生物分子修饰的电极) 。 1 4 电化学生物传感器灵敏度的提高 电化学生物传感器因其操作简单方便、快捷、灵敏、专一等优点，在生物医 学、环境监测和食品工程等领域的应用越来越广泛，成为临床诊断和病情分析等 的重要工具。但由于生物分子结构固有的不稳定性，使生物传感器的实用化存在 着一定局限。发展新型的电化学生物检测技术，提高检测方法的灵敏度、准确性 已成为电化学生物传感器的发展趋势。最有效且最常用的方法是通过某些物质具 有信号放大功能来增强检测信号从而提高分析灵敏度，主要包括两种：基于酶的 信号放大技术和基于纳米材料的信号放大技术。基于酶的信号放大技术依赖于生 硕l j 学位论文 物体内产生的生物催化剂，它能有效地催化相应的底物发生化学反应，产生强的 分析信号1 3 6 - 3 8 1 。基于纳米材料的信号放大技术是利用纳米材料独特的性质来放大 生物分子的检测信号【3 吼4 。 本小节将主要介绍基于碳纳米管( C N T s ) 的信号放大技术。 1 4 1 碳纳米管( C N T s ) 的性质 纳米材料由于尺寸小、表面状态特殊，具有许多不同于微观粒子和宏观物体 的特性，比如量子尺寸效应、表面效应、体积效应和宏观量子隧道效应等基本特 性，使其区别于常规材料，呈现优良的电学性质和良好的生物亲合性。 碳纳米管( C N T s ) 除了具有纳米材料的基本性质外，还具有一些其特殊结构 决定的一些特殊的性质【4 2 , 4 3 】。1 ) 抗压、抗拉的力学性质。C C 共价键结合形成六 边形网格的管壁使C N T s 有极高的轴向拉伸强度。2 ) 独特的电学性质。量子限域 效应使电子轴向运动表现出独特的电学性质，结构不同的C N T s 导电性会有显著 差异。3 ) 强大的场发射特性。良好的导电性和大的载流能力，可承受较大的场发 射电流的冲击。4 ) 电化学性质。较好的化学稳定性、导电性和大的比表面积，使 C N T s 适合用作固定材料和修饰材料。 1 4 2 基于碳纳米管信号增强的电化学生物传感器 将碳纳米管独特的性质用于电化学生物传感器研究中，使传感器的应用更加 广泛、高效。在电化学生物传感器中，碳纳米管常被用作：1 ) 生物分子的固定材 料，增加了生物分子在其表面的负载量，良好的生物相容性保持了固定在其表面 的生物分子的活性，提高了生物传感器的稳定性，延长了使用寿命 4 4 , 4 5 】。2 ) 电极 的修饰材料，加快了电化学反应过程中电子传递的速率，提高了传感器的灵敏度 和检测范围 4 6 - 4 8 】。3 ) 场效应晶体管中的沟道材料，单壁碳纳米管( S W N T s ) 的场 效应和生物分子间特异的识别功结合起来用于生物分析检测实现了S W N T s 场效 应晶体管生物传感器的集成化、微型化等，便于生物分子的实时分析检测【4 9 5 们。 1 5 本研究工作的构想 现代医学研究发现很多遗传疾病的发生与碱基突变有关，部分癌症的产生及 小分子如药物分子的代谢和蛋白质也密切相关，通过这几方面文献的阅读和当前 检测技术的了解，拟用电化学的方法建立基于酶切反应的单碱基突变检测和蛋白 质检测的生物传感体系。另外利用小分子和蛋白质之间的特异性作用实现对相关 蛋白质的检测分析。围绕这些思路开展了以下几方面的研究工作： ( 1 ) 依照碱基配对原则和S 1 核酸酶对不互补序列的切割作用，建立一种用 二茂铁作为电活性标记物的电化学生物传感体系，用于单碱基突变的检测。S 1 核 酸酶对不完全互补的标有二茂铁的末端进行切割，在电极上没有信号产生，但对 U 化学生物传感技术用+ F 甲碱基突变j 蛋 J 质的榆测 互补的二茂铁标记的末端没有影响，在电极上被捕获产生电化学信号。 ( 2 ) 利用核酸外切酶的切割反应，对核酸进行末端保护，依据蛋白质与小分 子的特异性结合作用建立相关蛋白质的电化学检测方法。标记有小分子的核酸链 与蛋白质特异性结合后使核酸链免于核酸外切酶的切割降解，在电极表面被捕获 产生可读信号。 ( 3 ) 由于碳纳米管具有良好的电学性质，用磷脂修饰的多壁碳纳米管 ( M W N T s ) 作为电化学信号调控物质对肿瘤标记性抗原进行磁分离电化学免疫分 析。修饰M W N T s 的磷脂交联上抗体与抗原发生夹心反应后，经磁分离后沉积后 绝缘膜修饰的电极表面，实现了信号转换。 硕卜学化论文 第2 章基于酶切反应的电化学单碱基突变检测 2 1 前言 据报道每1 0 0 3 0 0 个碱基对中就会发生单碱基突变【5 1 1 。单碱基的检测在研究 人类的起源、进化和群体遗传学特征，及遗传疾病的分子基础研究、临床诊断与 预防等方面提供了科学基础和解决手段。生物技术的研究成果为单碱基突变的检 测提供了广阔的途径。从原理上讲这些方法可分为三大类：一是基于单碱基错配 引起化学环境或者二级机构的变化【5 2 。5 4 】；二是通过精确的温度控制来考察杂交体 系的热力学，比如杂交自由能5 5 , 5 6 】和熔链温度【5 7 彤】；三是通过酶参与的化学反应， 比如聚合酶作用的等位基因延伸【6 0 , 6 1 】，核酸内切酶切害- I J 6 2 , 6 3 】，及连接酶作用的等 位基因连接【6 4 。6 6 1 。每种方法都有明显的优势，也有交叉点。针对单碱基突变的检 测方法的建立和研究正在也将进行下去。 利用酶进行基因识别的方法中，由于酶的高忠实性和高效性，可以很方便地 对错配碱基进行延伸、连接、