（植物学专业论文）无融合生殖龙须草ssr分析和遗传学研究.pdf

华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 摘要 龙须草( e u l a l i o p s i sb i n a t a ) 是多年生禾本科兼性无融合生殖植物，其无融合生 殖程度较高，胚和胚乳不需要受精能够自发形成，是利用无融合生殖固定禾谷类作 物杂种优势的潜在资源。开发有效的分子标记，寻找与其无减数胚囊形成、孤雌生 殖、胚乳自发产生等性状连锁的分子标记，是进一步研究其无融合生殖遗传和分子 机理的基础。本研究以来自中国5 个省1 2 个不同居群的龙须草为材料，从分子生物 学、细胞学、遗传学角度研究其无融合生殖特点。采用三种不同方法开发龙须草s s r 引物，并利用筛选的多态性s s r 引物和凡”d 引物同时对杂交f l 代分析，寻找不 同生殖方式的单株及与生殖方式连锁的分子标记。通过去雄、杂交等田间遗传学实 验和流式细胞仪对种子中胚和胚乳细胞倍性的检测，确定龙须草中有性生殖和无融 合生殖单株，为龙须草无融合生殖遗传机理的研究奠定基础。主要结果如下： 1 建立了适合龙须草的s s r 反应体系：2 x b u f f e r ：2 山；2 0m m o l lm g + ；0 2 m m o l ld n t p s ；o 3l u n o l ls s r 引物；8 0l a g 模板d n a 和0 5u t a q 酶。 2 通过锚定p c r 开发复合s s r 位点的方法，在设计的3 3 对引物中筛选到有效 扩增的引物1 3 对。引物开发效率大约3 6 。1 3 对引物中表现多态性的引物有6 对。 利用基因特异序列法得到多态性引物3 个。在使用的1 8 对近源物种引物中有8 3 的s s r 引物在供试的1 2 个居群龙须草中都有清晰的s s r 条带出现，其中1 0 对( 5 6 ) 引物表现出多态性。 3 使用所开发的多态性s s r 引物和r a p d 引物对广东星子与陕西山阳居群杂 交后代( f 1 代) 进行分子标记检测，结果在后代中发现了五种表现类型：与两亲本 相比有缺失带；双亲的互补带型；偏父本带型；偏母本带型；不同于亲本 的变异带型。这些结果揭示了龙须草杂交后代生殖方式以无融合生殖为主，呈现出 多样性的特点。 4 以直接套袋和去雄套袋作为对照，消除由于人工操作对结实率的影响。直接 套袋的结实率显著高于去雄套袋和去雄杂交的结实率。表明人工去雄影响子房发育， 降低了结实率。同时也说明人工去雄具有一定的可信度。去雄套袋较低的结实率说 明其中有专性无融合生殖发生。去雄杂交结实率显著高于去雄套袋结实率，说明假 受精或者有性生殖的发生促进了种子的形成，而花粉在其中发挥了重要作用。 5 利用流式细胞仪对广东星子和湖南衡阳居群内各单株自然结实种子进行检 无融合生殖龙须草s s r 分析和遗传学研究 测，结果显示星子1 4 、衡阳1 1 单株种子中胚与胚乳细胞的d n a 相对含量倍性比为 2 c ：3 c ，其它单株为2 c ：3 c ：4 c 。表明星子1 4 、衡阳l l 单株的种子可能来自有 性生殖，而其他单株的生殖方式则为兼性无融合生殖。 关键词：龙须草；无融合生殖；s s r ；锚定p c r ；r a p d 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 a b s t r a c t e u l a l i o p s i sb i n a t ai sav a l u a b l ea p o m i c t i cr e s o u r c ei ng r a m i n e a i no r d e r t os t u d yi t s a p o m i c t i cc h a r a c t e r i s t i c ，t w e l v ep o p u l a t i o n so fe b i n a t aw e r ea n a l y z e db ym o l e c u l a r b i o l o g y 、c y t o l o g y 、g e n e t i c s i ft h ef 1p r o g e n yp l a n t sc o u l db ee x a m i n e dt h r o u g hs s r a n dr a p d ，t h em o l e c u l a rm a r k e r st i g h t l yl i n k e dt oa p o r n i x e sa n dd i f f e r e n tr e p r o d u c t i o n p l a n t sm i g h tb eg o t m o r e o v e rc r o s s f e r t i l i z ea n df l o wc y t o m e t r yc a l lh e l pc o n f m n i n g t h em o d eo f r e p r o d u c t i o n t h er e s u l t sa r e 嬲f o l l o w s ： 1 e s t a b l i s h m e n to fs s r - p c rr e a c t i o ns y s t e mi ne b i n a t a ：2 x b u f f e r 2m ；2 0m m o l l l m 9 2 + ；0 2m m o l ld n t p s ；0 3i x m o l l s s rp r i m e r ；8 0 n gd n a 和0 5ut a q e n z y m e o 2 t h i r t e e np r i m e rp a i r sw e r ed e v e l o p e db ya n c h o r - p c rd e v e l o p i n gc o m p o u n ds s r s t h ed e v e l o p m e n te f f i c i e n c yi sa b o u t3 6 ，a n ds i xp r i m e rp a i r so ft h e s ew e r e p o l y m o r p h i co n e s t h e r ep o l y m o r p h i cp r i m e rp a i r sw e r ed e v e l o p e db a s e d o n s e a r c h i n gt h eg e n e ss e q u e n c e si np u b l i cd a t a b a s e s i na d d i t i o n , e i g h t e e ns s rp r i m e r p a i r ss e l e c t e df r o mt h er e l a t i v es p e c i e sw e r eu s e dt oa n a l y z e i ts h o w st h a to f8 3 p r i i n e rp a i r sh a dp r o d u c ti ne b i n a t a , a n d5 6 p r i m e rp a i r sp r e s e n t e dp o l y m o r p h i s m 3 t h e r ea r ef i v ed i f f e r e n tp r o g e n i e sw e r ed e t e c t e db ys s ra n dr a p d ：d e f i c i e n c y b a n d st op a r e n t s s u p p l e m e n tb a n d so fp a r e n t s t o w a r dt h em a t e r n a lb a n d s t o w a r dt h ep a t e r n a lb a n d s v a r i a t i o nw i t hp a r e n t sb a n d s 4 t h et r e a t m e n t so fd i r e c t b a g g i n ga n de m a s c u l a t i o n b a g g i n gw e r e 弱e x p e r i m e n t c o n t r 0 1 c o m p a r i n gt h es e e ds e t t i n go ft h ev a r i o u st r e a t m e n t s ，a n a l y s i ss u g g e s t e dt h a t t h e r ew e r es i g n i f i c a n td i f f e r e n t e ea m o n gt h es e e ds e t t i n go fd i f f e r e n tt r e a t m e n t s s o w ep r e s u m e dp o l l e nw a sn e c e s s a r yt os e e dt os o m ee x t e n t t oe b i n a t a ，t h ef r e q u e n c y o fa p o m i x i si sv e r yh i g h 5 u s i n gl e a v e so fs e e d i n g 舔c o n t r o l ，x i n g - z ia n dh e n g y a n gp o p u l a t i o n sw e r es c r e e n e d b yf l o wc y t o m e t r y a tl a s t , t w oi n d i v i d u a lp l a n t so f x i n g - z i l 4a n dh e n g - y a n g l lh a d t w op e a k s2 c ：3 c ，t h eo t h e r sh a dt h r e ep e a k s2 c ：3 c ：4 c s ox i n g - z il4a n d h e n g y a n g l1m i g h tc o m ef r o ms e x u a lr e p r o d u c t i o n 1 无融合生殖龙须草s s r 分析和遗传学研究 k e yw o r d s ：e u l a l i o p s i sb i n a t a ；a p o m i x i s ；s s r ；a n c h o r - p c r ；r a p d i v 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密 趸 如需保密，解密时间年 月 日 乜 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生挠5 ，l 司 帆伊妒年多月，7 日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全 部或部分内容，并授权中国科学技术信息研究所和北京万方数据股份有限公司将本人 学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并进行信息服务( 包括但不限于汇编、 复制、发行、信息网络传播等) ，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力 注：保密学位论文( 即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 文) 在解密后适用于本授权书 学位做作者擀：副同导师始纠胁 签名日期：m 伊y 年月7 日 签名日期：二“彩年易月7 日 o 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 1 刖置 1 1 课题的提出及研究的目的和意义 无融合生殖( a p o m i x i s ) 是指被子植物的胚珠不经过受精作用形成种子的生殖方 式。无融合生殖物种的胚主要是由未减数分裂的卵细胞或胚珠内的珠心或珠被细胞 发育而来。如果一个植株只产生同母本完全相同的后代，称为专性无融合生殖 ( o b l i g a t ea p o m i c t s ) ；但是大多数禾本科草类的无融合生殖是兼性无融合生殖，即植 株具有有性生殖和无融合生殖的特点，它们后代的生殖方式一部分同母本一样，而 另一部分则不同于母本( o z i a s ，2 0 0 6 ) 。7 0 年代以来，除应用细胞生物学和实验生物 学的方法继续深入研究具有代表性的几种牧草的无融合生殖和有性生殖机制外，无 融合生殖的分子遗传学和将无融合生殖特性向有性生殖作物转入也成为热门研究领 域( k o l t u n o we ta l ，1 9 9 5 ) 。一些有特色的无融合生殖物种如山柳菊( h e i r a c i u m ) 、摩 擦禾( t a r a s a c u m ) 、早熟禾( p o a p r a t e n s i s 三) 等植物已开始成为无融合生殖研究的模 式植物。而流式细胞仪检测、分子标记分析、原位杂交技术、基因剔除技术以及差 异显示技术等也越来越多的应用于无融合生殖的研究之中( 马三梅等，2 0 0 4 ) ，这不 仅简化了原有的研究程序而且可以使我们更深入的了解无融合生殖的遗传机制。 禾本科拟金茅属植物龙须草( e u l a l i o p s i sb i n a t a ) 是近年来新发现的无融合生殖 物种( 张友德等，1 9 9 6 ) 。作为一种优质的造纸原料和优良的水土保持植物，对其的研 究主要集中在形态结构、栽培管理、生态作用和造纸性能等方面( g u p t ae ta l ，1 9 8 4 ；王 清峰，1 9 9 3 ) 。近年来姚家玲、刘传虎等先后对其进行了细胞学、遗传学等方面的研 究，发现在龙须草胚囊发育过程中除了无孢子生殖细胞发育的无融合生殖胚囊外还 有少量有性生殖的正常胚囊，证明龙须草的生殖方式为兼性无融合生殖( 姚家玲等， 2 0 0 4 ；刘传虎等，2 0 0 6 ) 。但是目前在龙须草居群中还未确定真正的有性生殖单株，所 以能够寻找到与无减数分裂胚囊形成、孤雌生殖、胚乳自发产生等性状连锁的分子 标记是鉴定龙须草不同生殖方式的基础，同时这些研究也将加快无融合生殖相关基 因的分离。 为了更好的研究龙须草无融合生殖的遗传机理，寻找与无融合生殖、有性生殖 相关的分子标记，本研究在建立龙须草s s r ( s i m p l es e q u e n c er e p e a t s ) 分析体系的基 础上，通过三种不同的方法开发龙须草s s r 引物，并利用所开发s s r 引物和原有的 r a p d 引物对杂交后代进行亲缘关系的检测。同时通过流式细胞仪对种子倍性的测 无融合生殖龙须草s s r 分析和遗传学研究 定分析及对不同处理种子结实率的比较来辅助确定不同生殖方式的单株。 1 2 文献综述 1 2 1 龙须草研究现状 龙须草( e u a l i o p s i sb i n a t a ) 俗称蓑衣草、羊胡子草、羊草等，属禾本科( g r a m i n e a e ) 黍亚科( s u m f a mp a n i c o i d e a e n ) 甘蔗族( t r i bs a c c h a r e n e ) 楔颖草亚族( s u b t r i b a p o c o p i d i n a e ) 拟金茅属( e u l a l i o p s i sh o n d a ) 植物，系多年生高光效纤维草本植物，分 蘖能力很强( 耿以礼，1 9 6 5 ；刘亮，1 9 8 8 ) 。主要分布于印度、伊朗、菲律宾、越南、缅 甸等东南亚及中亚地区，中国也是龙须草的主要分布区之一。龙须草主要分布于我 国秦岭以南地区，湖北西北部，湖南南部、西南部，广西西南部、西部、西北部， 云南大部分地区，广东连洲地区，贵州的黔南、黔东南、黔西南及安顺、铜仁地区， 四川东部、东北部、南部，陕西汉中、安康地区及河南南阳地区广有分布( 刘亮，1 9 8 8 ) 。 龙须草作为一种优质的造纸原料、良好的编织材料和优良的水土保持植物( 陈之论， 1 9 9 0 ；张友德等，1 9 9 3 a ) 。8 0 年代后逐渐有人对其栽培管理、形态解剖、生理活性、 开花习性、及分蘖规律等进行了研究( 张友德等，1 9 9 3 b ) 。近年来，张友德、杨小菊 等对龙须草进行了初步的胚胎学研究，认为其成熟胚囊是4 细胞大黍型无孢子生殖 胚囊( 张友德等，1 9 9 6 ；杨小菊等，1 9 9 8 ) 。此后，姚家玲等( y a oj - le ta i ，2 0 0 7 ) 对龙须草 大孢子的发生，胚囊的起源、发生和发育，胚的起源，胚乳的产生等过程进行了系 统研究，得到了龙须草无融合生殖的细胞学证据，探明了龙须草胚和胚乳的发育可 以不经过受精而分别由卵细胞和极核自发分裂形成；并对龙须草的花粉发育过程进 行了观察，发现其雄性配子的发育过程类似于其它有性生殖的禾本科植物，最后形 成3 细胞型成熟花粉粒。利用a f l p 分子标记技术结合形态学观察和叶片纤维素含 量测定，姚家玲等( 姚家玲等，2 0 0 4 ) 将湖北武当、郧县、河南渐川、西峡、广西百色、 陕西洋县等四个省份9 个居群的龙须草划分为4 种类型；通过细胞学观察还发现在 不同类型间都有一定的有性生殖的胚囊发生。同时陈智慧等在龙须草花粉活性和结 实率与无融合生殖方式相关性研究中发现，龙须草花粉对其种子形成没有实质性贡 献，说明龙须草的无融合生殖程度较高( 陈智慧等，2 0 0 5 ) 。刘传虎则通过龙须草种子 根尖压片和花粉母细胞减数分裂行为的观察，确定了龙须草为异源四倍体物种，其 染色体数目为4 0 条( 刘传虎等，2 0 0 7 ) ，并且采用r a p d 分子标记分析将1 2 个居群的 龙须草聚类归为四种类型( 刘传虎等，2 0 0 6 ) 。随后旷乐等通过同源序列法在龙须草中 2 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 获得了与胚乳自发产生有关的f i e 基因片段，并且通过水稻f i e 基因设计探针检测 到其在龙须草胚胎发育中各个时期不同的表达水平( 旷乐等，2 0 0 7 ) 。 目前关于龙须草的研究结果表明，龙须草为异源四倍体的兼性无融合生殖植物， 并且不同居群无融合生殖程度不同，在居群中存在少量的有性生殖单株。但是对不 同单株的生殖类型还没有做迸一步的分析。只有在确定了各种生殖方式的单株后才 能更好的研究其无融合生殖的机理和遗传机制。 1 2 2 植物无融合生殖研究概况 1 2 2 1 植物无融合生殖的概念和类型 被子植物无融合生殖( a p o r a i x i s ) 是指不经过精卵融合而产生种子的一种特殊 生殖方式( 胡适宜，1 9 5 1 ) 。无融合生殖根据其胚囊内组织的起源不同分为：孢子体无 融合生殖和配子体无融合生殖两种类型。前者主要指由珠心或珠被细胞发育而来的 不定胚，后者则包括单倍体无融合生殖和二倍体无融合生殖两种类型。其中不定胚 主要发生在柑桔类植物中。单倍体无融合生殖包括三类：单倍体孤雌生殖、单倍体 孤雄生殖和无配子生殖，它们都是由减数分裂的胚囊发育而来的。二倍体无融合生 殖过程则未经过减数分裂的胚囊发育过程，主要有无孢子生殖和二倍体孢子生殖( 母 锡金等，2 0 0 1 ) 。现在所谓的“无融合生殖”一般是指二倍体无融合生殖，即专指发生 在被子植物胚珠中的不经过减数分裂和受精作用而产生胚的生殖方式( 孟金陵， 1 9 9 5 ；黄群策，1 9 9 9 ) 。 1 2 2 2 植物无融合生殖遗传学研究及发生机制分析 自从1 8 4 2 年，s m i t h 首次报道雌、雄异株的三稔菖属植物a c h o r n e ai l i c i f o l i a 不 经传粉产生种子的现象，至今对无融合生殖研究的1 6 0 多年的历史中，己在4 0 多个 科的4 0 0 多种被子植物中发现无融合生殖现象( 母锡金等，2 0 0 1 ) 。到目前已报道的禾 本科4 2 个属1 6 6 个种的植物中存在无融合生殖现象，其中3 2 个属1 0 2 个种属于无 孢子生殖( 黄群策，1 9 9 9 ) 。根据无融合生殖发生的程度有专性( o b l i g a t e ) 和兼性 ( f a c u l t a t i v e ) 之分( g a r m a ne ta l ，1 9 9 7 ) 。专性无融合生殖个体的后代都通过无融合生殖 产生，不需经过减数分裂和受精作用，其子代可以保持遗传的纯合性和稳定性。而 兼性无融合生殖个体同时具有有性生殖和无融合生殖能力，有性生殖胚囊和无融合 生殖胚囊在同一胚珠中和不同胚珠中共同发育，因此兼性无融合生殖个体的后代在 遗传上是不一致的，来自无融合生殖的后代是纯合的母本型，来自有性生殖的是杂 3 无融合生殖龙须草s s r 分析和遗传学研究 合体，其后代会发生性状和生殖方式的分离( a n o n y m o u s ，2 0 0 1 ) 。 在大多数遗传学研究中对配子体无融合生殖的研究已有较多报道，经典研究认 为大黍( p a n i c u mm a x i m u m ) ，毛莨( r a n u n c u l u sa u r i c o m u s ) 的无孢子生殖为显性单 基因遗传( 王志伟等，2 0 0 4 ) 。除此之外，许多科学家已经对多种物种的配子体无融合 生殖进行了遗传分析，除了单基因控制外，还有各种各样的报道，从两个位点到多 基因。目前认为无融合生殖是多因子构成的复合性状，它可划分为3 个主要因子： 缺少减数分裂或阻止减数分裂的因子；卵细胞在没有受精的条件下形成胚的因 子；促进胚乳自主发育或者假受精发育的因子( s a v i d a n , 2 0 0 0 ) 。不同物种的无融合 生殖可能存在不同的发生机制、不同的遗传控制，因此应当对每种无融合生殖物种 进行具体分析。所以对于无融合生殖机制的解释也就存在多种看法。比如，由于 存在无孢子生殖的特定基因组区( a p o s p o r y - s p e c i f i cg e n o m i cr e g i o n ，a s g r ) 而导致 了无融合生殖的发生；由于有性生殖发育过程中关键阶段的短路或脱调节产生无 融合生殖现象：由生殖方式不同的相关物种或两个生态型之间杂交而进行的基因 组冲突而产生的无融合生殖现象；由于同一祖先植物种发生了表观突变，而其基 因调节中表观遗传改变而产生的无融合生殖现象；由于存在超数染色质可能引起 蛋白质沉积作用影响大孢子发生中的基因表达，使得减数分裂消失产生无融合生殖 ( o z i a se ta l ，19 9 8 ；k o l t u n o we ta l ，2 0 0 3 ) 。 1 2 2 3 植物无融合生殖鉴别的传统方法 1 2 2 3 1 形态鉴别 最初人们对无融合生殖的发现和研究主要是以个体和群体的外部观察为基础的。 h a n n a ( 1 9 8 7 ) 提出了7 种可以初步确定无融合生殖的形态特征：( 1 ) 异花授粉植物 中产生整齐一致的后代或某些典型母体后代；( 2 ) 同一母本的不同f 1 代出现相同类 型；( 3 ) 两个性状截然不同的亲本杂交后其f 2 代不分离或分离很少；( 4 ) 用具有显 性标记基因亲本花粉给一个隐性亲本授粉，其杂交后代为隐性性状；( 5 ) 非整倍体、 三倍体、远源杂交或其他预期不育的植株，其种子育性很高；( 6 ) 非整倍体的染色 体数或结构上的杂合性稳定遗传；( 7 ) 一籽多胚现象、多柱头、- d , 花多胚珠及无 融合子房等( 高建伟等，2 0 0 0 ) 。 1 2 2 3 2 细胞胚胎学观察 在植物无融合生殖研究中，寻找目标物种的生殖特征往往是从胚胎学观察开始 的。通过观察其大孢子的发生、胚囊的起源与发育、胚的发生发育及胚乳的形成来 4 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 确定植物无融合生殖方式。比如无融合生殖的细胞学特征有：( 1 ) 无孢子生殖胚囊 往往起始于特化的珠心细胞；( 2 ) 大孢子母细胞细胞壁缺胼胝质，不出现联会、联 会复合体、中期i 和四分体。在批碱草属、摩擦禾属等植物的无融合生殖研究中， 这些可作为识别无融合生殖的有效工具( e l g i n e t a l ，1 9 9 2 ；l e b l a n ce ta l ，1 9 9 5 ) 。 1 2 2 4 分子生物学在无融合生殖研究中的应用 1 2 2 4 1 同工酶分析 同工酶技术，速度快，成本低，一次分析的样品多，而且检测的位点大多具有 多态性。a s s i e n a n ( 1 9 9 3 ) 用9 种同工酶研究大黍有性生殖和无融合生殖种的遗传 多样性，结果得到了1 6 个位点的多态性。由于同工酶标记揭示的遗传多态性较高， 可用于鉴别无融合生殖物种和无融合生殖的程度( s i e n a n ，1 9 9 3 ) 。 1 2 2 4 2d n a 分子标记 从19 9 3 年o z i a s 等利用分子标记研究植物无融合生殖之后，分子标记技术，例如： 随机扩增多态性d n a ( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ，r a p d ) 、限制性片段长 度多态性( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，r f l p ) 、扩增片段长度多态性 ( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m 触l p ) 、简单序列重复( s i m p l es e q u e n c e r e p e a t ，s s r ) 等已广泛用于无融合生殖的研究中。特别是一系列与无融合生殖有关的 特异片段的发现，为深入了解植物无融合生殖的遗传机制和分子机理增加了大量的 资料。 r a p d r a p d 是1 9 9 0 年由w i l l i a m s 等发明的，其方法是用随机序列的9 1 0 个核苷酸的 引物，对基因组d n a 进行p c r 扩增。多态性的产生可以i 扫d n a 序列中与互补寡聚核 苷酸引物中的一个碱基的差别形成( 阎隆飞等，1 9 9 9 ) 。b r a e a e c i a 等利用r a p d 技术将 早熟禾( p o ap r a t e n s i s ) 的无融合生殖后代与有性生殖后代区别开来( b r a e a c c i ae ta l ， 1 9 9 9 ) 。a r n h o l d t 等借助r a p d 有效鉴定了兼性无融合生殖植物贯叶连翘( h y p e r i c u m p e r f o r a t u m ) 的有性子代的百分率( a m h o l d te ta l ，2 0 0 1 ) 。o r i t m 贝u 在珍珠粟心n n i s e t u m g l a u c u m ) 与非洲狼尾草( 尸s q u a m u l a t u m ) 杂交后代中找到一个r a p d 标记与无融合生 殖的基因连锁( o r t i z e ta l ，1 9 9 9 ) 。 r f l p r f l p 是由于不同个体的等位基因之间碱基代换、重排、插入、缺失等引起的。 首先用限制性内切酶把基因组d n a 分子切成许多长短不同的片段。对于每一个 5 无融合生殖龙须草s s r 分析和遗传学研究 d n a 与限制性内切酶组合来说，所产生的片段是特异的。r f l p 提供了一个直接跟 踪重组期间染色体片段的方法。l e b l a n e 用r f l p 加以识别玉米与摩擦禾( t r i p s a c u m ) 杂交后代中的无融合生殖植株，发现了一个与二倍体孢子生殖紧密连锁的r f l p 标 记，并将这个标记定位在玉米第6 号染色体长臂末端( l e b l a n ec ，1 9 9 8 ) 。 a f l p a f l p 是v o s ( 1 9 9 5 ) 发明的专利技术。实质是r f l p 和r a p d 的结合。基本原理 主要是基于对限制性酶切片段的选择性扩增。基因组d n a 被限制性内切酶酶切后， 对限制性酶切片段进行扩增，扩增产物经过电泳检测比较谱带的差异。a m s e l l e m 等 对不同生态型的悬钩子属的四倍体植物( r u b u sa l c e i f o l i u s ) 进行a f l p 分析，结果因 为地理位置的不同，植株的生殖方式也就存在差异( a m s e l l e me ta l ，2 0 0 1 ) 。e s p i n o z a 等通过a f l p 技术在1 8 个不同生态型的百喜草( p a s p a l u mn o t a t u m ) 中检测到了兼性 无融合生殖和有性生殖的单株( e s p i n o z a e ta l ，2 0 0 6 ) 。 s s r s s r 标记也称微卫星( m i e r o s a t e l l i t e s ) 标记，是以1 6 个碱基为基本单元的串联 重复序列。因其具有高度的保守性和专一性，可以特异的定位于染色体的某一位置， 然后用两侧保守的d n a 序列互补的方式设计特定的引物对基因组d n a 进行p c r 扩 增。检测d n a 的多态性，即检测不同个体在每个微卫星座位上的遗传结构差别 ( b r o w ne ta l ，1 9 9 8 ) 。c a r l o s 就利用s s r 分析柑桔珠心苗中有性生殖个体和无融合生 殖个体的差异( c a r l o s ，2 0 0 0 ) 。r a d i m 就通过开发兼性无融合生殖蒲公英( t a r a x a c u m ) 的s s r 弓i 物分析不同生态型的遗传多样性水平，探索无融合生殖的进化机$ o ( r a d i m , 2 0 0 4 ) 。 1 2 2 4 3m r n a 差异显示技术 m r n a 差异显示技术不需要构建e d n a 文库，仅用少量的总r n a 就能合成相 应的第一条e d n a 链，然后进行p c r 扩增，通过分析扩增产物来研究基因表达的差 异。p h i l i p y ev i e l l e 等首次用m r n a 显示技术来研究狼尾草( p e n n i s e t u mc i l i a r e ) 无融 合生殖基因的表达。用2 0 个随机引物和2 个锚定引物得到了2 2 6 8 个2 0 0 - - 6 0 0 b p 的 扩增片段，对其中8 个有差异显示的d n a 扩增片段进行克隆测序，确定有2 个d n a 片段是无融合生殖个体特有的( v i e l l ee ta l ，1 9 9 6 ) 。c h e n1 a n - z h u a n g 等就从大黍 ( p a n i c u mm a x i m u m ) 的e d n a 文库中筛选出1 个在无融合生殖的花芽中特异表达的 e d n a 片段a 2 1 3 4 。序列分析说明它编码1 个由3 0 5 个氨基酸组成的分子量为3 4 2 6 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 k d 的蛋白质。这是第一个分离出来的与无融合生殖胚囊形成有关的c d n a ( z h u a n g c le t a l ，1 9 9 9 ) 。 1 2 2 5 兼性无融合生殖植物的不同后代类型 通过无融合生殖方式繁殖产生种子的专性无融合生殖植物很少见，几乎所有无 融合生殖植物存在着无融合生殖和有性生殖共存现象，也就是不同程度的保留着有 性生殖过程。因此，大部分无融合生殖植物属于兼性无融合生殖型。根据r u t i s h a u s e r 的命名方法( 1 9 4 8 ) ，减数的杂交种和未减数的杂交种分别属于b n 和b l l l 杂交种。 h a r l a n 和d e w e t ( 19 7 5 ) 将它们命名为n 十n 和2 n + n 杂交种。根据报道，兼性无融合生 殖植物的另一种后代类型是棚，或者称为多元单倍体个体，这些后代来源于未减 数卵细胞的单性生殖发育，其倍性低于亲本。配子体无融合生殖植物中一般雄配子 体的减数分裂和雄配子体功能都正常。有性生殖植物中也存在着未减数配子体形成 和未受精卵细胞单性发育的现象，但这类现象更频繁地发生于无融合生殖植物中 ( g r o s s n i k l a u s ，2 0 01 ；r i c h a r de ta l2 0 0 6 ) 。例如，橙花山柳菊( h i e r a c i u m a u r a n t i a c u m ) 和绿毛山柳菊( h i e r a c i u m p i l o s e l l a ) 单性生殖( 包括2 n + 0 和n 十。后代) 的发生率分别 为9 7 6 和9 8 o 。由于山柳菊属兼性无融合生殖植物，它能产生不同形式的分离( 减 数分裂) 和重组( 受精) ，因而不同后代类型的遗传率也就不同( k o l t u n o we ta l ，2 0 0 3 ) 。 1 3s s r 引物开发的研究进展 s s r ( s i m p l es e q u e n c er e p e a t s ) 是真核生物基因组中散布的大量串联重复序列。 s s r 引物是根据微卫星重复序列两端的保守序列设计，用来扩增重复序列本身，从 而揭示微卫星的的多态性。s s r 标记是一种共显性标记，呈孟德尔遗传，具有在基 因组之间广泛分布、多态性丰富等优点。现在已被广泛的应用于植物遗传多样性分 析、分子作图、基因定位和系谱分析等研究( l i m a e ta l ，2 0 0 4 ) 。但是在利用s s r 分析 的关键问题就是开发基因组中的s s r 两侧的引物序列。目前使用比较多的引物开发 方法主要有：基因组文库的构建、微卫星富集法、数据库搜集法、s s r p c r 及引物 的转移扩增等。 1 3 1 基因组文库的构建 开发s s r 引物最根本和最好的途径是构建一个目标物种的基因组文库，然后用 含有微卫星序列的探针与之杂交筛选文库，接着挑选阳性克隆测序，再根据s s r 两 端的侧翼序列设计引物，最后用该引物对相应的s s r 位点分析。传统的筛选s s r 位 7 无融合生殖龙须草s s r 分析和遗传学研究 点的基本步骤如下：提取所要研究物种的基因组d n a ；使用限制性内切酶，将 基因组d n a 切割成均匀的小片段；或者用超声波对基因组d n a 进行断裂。凝胶 电泳，回收大小约3 0 0 - - 5 0 0b p 的片段；将回收片段克隆，使用标记探针进行杂 交；筛选出含有重复序列的克隆；测序证实重复序列片段的存在；在重复序 列片段两端区域设计引物对，进行p c r 扩增；挑选出重复性好，具多态性的s s r 位点。现在所使用的大多数s s r 引物就是用寡核甘酸探针从基因组文库中分离鉴定 出来的( t o k u k oe ta l ，1 9 9 8 ) 。 1 3 2 微卫星富集法 为了提高s s r 克隆的得率，有人又提出了建立和筛选微卫星富集文库的方法。 富集的方法按照所用支持物的类型可以分为：( 1 ) 磁珠( 2 ) 尼龙膜。链霉亲和素是 一种与生物素有高度亲和力的蛋白，这种高度的亲和力允许对生物素标记的目标分 子进行快速和高效的分离。相互问作用的强度和稳定性使得d n a 操作，例如解链、 杂交和洗涤等不会影响d n a 在磁珠上的固定。因此链霉生物素包被的磁珠已经在 不同的富集方法中用来分离s s r 位点。f i s h e r 和b e c h m a n n 描述了一种富集的方法： 基因组d n a 用限制性酶消化后，连接到双链接头上。然后使其与生物素标记的s s r 寡核苷酸杂交。杂交体和链霉生物素包被的磁珠结合。经过洗涤，片段从磁珠上洗 下来。片段用接头作为引物进行p c r 扩增，扩增产物消化并且连接到质粒载体中， 然后转化大肠杆菌。选择阳性克隆测序( f i s h e re ta l ，1 9 9 8 ) 。 1 3 3 数据库搜索 随着在g e n b a n k 、e m b l 和d d b j 等公共数据库里登录的d n a 序列和e s t 序 列越来越多，用专门的s s r 分析软件一s s r h u n t e r 和s s ri t 搜索公共数据库以获得 含s s r 序列的方法开始被越来越多的人所采用。比如，玉米( s e n i o re ta 1 ，1 9 9 6 ) 、水 稻( c h e nx e ta l ，1 9 9 7 ) 、高梁( b r o w ne ta l ，1 9 9 6 ) 等的s s r 标记的分离。k a n t e t y 等分 析了大麦、玉米、水稻、高梁和小麦核酸数据库中的序列，对其中可以发展s s r 引 物的进行了分析( k a n t e t ye ta l ，2 0 0 2 ) 。g a o 等也从小麦的e s t 中分离出1 0 1 个新的 s s r 引物( g a ol fe ta l 。2 0 0 4 ) 。 1 3 4 基于is s r - p c r 的s s r 分离 z i e t k i e w i t c z 等发展起来的一种基于s s r 基础上的分子标记- i s s r ( i n t e r - s i m p l e s e q u e n c er e p e a t ) ，与s s r 标记相反，该法是直接利用s s r 序列为引物，用p c r 方法 8 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 扩增两个位于反向排列的间隔不太大的s s r 之间的序列。为增加特异性，设计引物 时在5 端和37 端分别引入1 - 4 个选择性碱基，引物长度1 6 1 8b p ，因此只有那些与锚 定的核苷酸匹配的位点才能被锚定，避免了s s r 在基因组上滑动而提高了p c r 扩 增的专一性，提高了实验结果的可重复性。一套i s s r 引物也可用于不同的物种 ( z i e t l d e w i t c ze ta l ，19 9 4 ) 。 f i s h e r 等采用( c t ) n 为核心序列，并在5 端锚定几个单核苷酸为引物，进行扩增 得到p c r 产物，把这些产物回收纯化并克隆，对其中1 5 个阳性克隆测序，发现1 3 个含有( c t ) n 重复，它们不仅存在于p c r 产物的两端，亦存在于p c r 产物的中间 ( f i s h e rp je ta l ，1 9 9 6 ) 。d a v i l a 等利用5 端锚定i s s r 引物扩增，对所得到的4 个多态 片段克隆测序，发现一个微卫星d n a 重复序列。然而将锚定i s s r 引物与随机引物 组合扩增，在回收、测序的3 0 个片段中，只找到一个含有较大重复数目的序列( d a v i l a e ta l ，1 9 9 9 ) 。利用i s s r 片段克隆，因其核心序列重复数目接近载体，一般情况下很 难设计出理想的s s r 引物，只能得到s s r 一端的引物，因此在对扩增产物测序，设 计引物后为了获得另一端的引物，应进行染色体步行和第二次克隆测序，设计出另 一端引物，便可获得一对完整的s s r 引物序列( v a r s h n e ye ta l ，2 0 0 5 ) 。 1 3 5 引物的转移性扩增 随着基因组计划研究的深入，人们发现在不同物种基因组之间存在一定程度的 相似性。物种间的遗传距离和s s r 两端序列的保守性决定了能否扩增出恰当的区域。 很多近缘物种引物用在目标物种上时都需要进行筛选。研究发现遗传距离越近的物 种更可能共用微卫星引物。v a r s h n e y 等发现大麦的s s r 引物可以在小麦、黑麦和水 稻中使用( v a r s h n e ye ta l ，2 0 0 5 ) 。m a l a y 研究高羊茅s s r 引物在近缘草类通用性时发 现在黑麦草中有4 6 的引物呈现多态性，在小麦和水稻中分别为3 9 和3 4 ( m a l a y e ta l ，2 0 0 4 ) 。引物跨越物种的有用程度可能与种间的亲缘关系的远近有关，但要确定 s s r 引物对在不同物种中的应用程度是很困难的。 1 3 6 锚定p c r 开发复合s s r 引物 近年来有不少的研究者也在尝试新的方法来开发目标物种的s s r 分子标记，其 中主要集中在两个方面：一是在基因组的特定区域开发s s r 分子标记( s h a p e ，e ta l ， 2 0 0 4 ) ，另一方面则通过减少引物合成的数目来节约开发成本( l i 姐e ta l ，2 0 0 4 ) 。这其 中一个重要的方法就是锚定p c r 的方法，它所开发的引物一条与边缘序列互补，另 9 无融合生殖龙须草s s r 分析和遗传学研究 外一条引物就是所使用的特定s s r 重复单元。从理论上说，这种方法只需要设计一 端的特定引物，而重复序列还可以在不同的引物对中同时使用，这将大大节约开发 成本。但是在使用锚定p c r 在基因组较复杂的小麦、松树中开发s s r 位点时扩增 效率较f l g ( l i a ne ta l ，2 0 0 7 ) 。采用锚定p c r 开发复