（生物医学工程专业论文）活版印刷生物芯片原位合成系统研究.pdf

a b s t r a ct i ng e n o m i c se r ae s p e c i a l l yi nt h ep o s t g e n o m i c s ，i th a sb e e na n i m p o r t a n ts u b je c th o wt of i n do u tt h ef u n c t i o no fa l lk i n d so fg e n e sf r o m m a s s i v eg e n ei n f o r m a t i o n d a t a b i o c h i p ，r i s i n g i n 9 0 ，i s an e w t e c h n o l o g yt h a tc a nd e t e c th u n d r e d so fg e n ei nt h es a m et i m e b i o c h i p t e c h n o l o g y ，i n c l u d i n gc h i pf a b r i c a t i o n ，h y b r i d i z a t i o na n ds i g n a ld e t e c t i o n ， i s w i d e l ya p p l i e di nt h ef i e l d s o fg e n ee x p r e s s i o n ，g e n em u t a t i o n ， p o l y m o r p h i s ma n dn e wd r u gd i s c o v e r y t h e r e f o r e ，t h em e t h o da n d i n s t r u m e n to ff a b r i c a t i n gb i o c h i pi st h ep r i m a r yp r o b l e mi nt h er e s e a r c h o fr e l a t e dt e c h n o l o g y an o v e lm a c h i n ef o ri ns i t us y n t h e s i so fb i o c h i p w a sd e v e l o p e db a s e do nt h ep r i n c i p l eo f t y p o g r a p h yp r i n t i n gi nt h i sp a p e r , w h o s e p u r p o s ei st of a b r i c a t em e d i a l o wd e n s i t yd n am i c r o a r r a y t h ef r i e n d l yt o u c h s e n s i t i v es c r e e nh u m a n m a c h i n ei n t e r f a c e ( h m i ) w a sd e s i g n e dt o m a n i p u l a t et h ea p p a r a t u s t h ep r o g r a m m a b l el o g i c c o n t r o l l e rw a se m p l o y e dt oc o n t r o lo p e r a t i o ns t e p si n v o l v i n gi nb i o c h i p s y n t h e s i s ，i n c l u d i n gl o c a t i n ga n di m p r i n t i n g ，a n dd e l i v e r i n gt h es p e c i f i c l i q u i d t h es t r u c t u r eo fm a c h i n ei sd e s c r i b e dh e r ei nd e t a i l ，c o n s i s t i n go f p l a t f o r mf o ri m p r i n t i n g ，p r e c i s i o np r i n t i n gs t e n c i l ，o n e - w a yp o s i t i o n i n g d e v i c e ，m a n i p u l a t o r , a n dl i q u i d & g a sd e l i v e r ys y s t e ma n dc o n t r o ls y s t e m t h e a c c u r a c yo fm a c h i n ew a st e s t e db yu s i n gt h r e e - c o o r d i n a t e d m e a s u r e m e n ti n s t r u m e n t ：t h e p o s i t i o n i n ga c c u r a c y i s2 8 4 g m ， r e p e a t a b i l i t ya c c u r a c yo fp r i n t i n g16g m t h et e s t i n gr e s u l t ss h o wt h a tt h e a c c u r a c yo ft h em a c h i n ei sg o o de n o u g ht om e e tt h ed e m a n do fi ns i t u s y n t h e s i so fb i o c h i pb a s e do nt h ep r i n c i p l eo ft y p o g r a p h yp r i n t i n g t h ec o s to ff a b r i c a t i n gag e n ec h i pw i l ll a r g e l yd e c r e a s ew h e nu s i n g t h i si n s t r u m e n t ，b e c a u s em a s kp r e p a r a t i o ni nt h et r a d i t i o n a lm e t h o do f g e n ec h i pi n - s i t es y n t h e s i si sa v o i d e d 4 3 2f e a t u r e sw i l lb es y n t h e s i z e do n ag l a s ss u b s t r a t eo f7 5m m 2 5m m t h e r e f o r e ，i ti sh o p e f u lt of i l lt h e g a po fm e d i a l o wg e n ec h i pa n dm a k et h ef o u n d a t i o nf o rs p r e a d i n ga n d a p p l y i n gb i o c h i pi nc h i n a k e yw o r d s t y p o g r a p h yp r i n t i n g ，i n - s i t us y n t h e s i s ，b i o c h i p ， i l s y n t h e s i z e r 原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的 地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包 含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共 同工作的同志对本研究所作的贡献均己在论文中作了明确的说明。 作者签名：厶写篷垄望日期：j 堡乒年上月碰日 学位论文版权使用授权书 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有 权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允 许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内 容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科 学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库， 并通过网络向社会公众提供信息服务。 作者繇啦翮签勉碜期：肆年上月单日 硕士学位论文第一章绪论 1 1 生物芯片厦技术 第一章绪论 生物芯片是指通过微加工和微电子技术在固相基质表面构建微型生物化学 分析系统，以实现对细胞、蛋白质、核酸以及其他生物分子等进行准确、快速、 高通量检测，是一种多参数的生物传感器。它的本质特征是利用微电子、微机械、 化学、物理以及计算机技术，将生命科学研究中的样品检测、分析过程实现连续 化、集成化、微型化。芯片上集成了大量密集排列的分子微阵列或分析元件，能 够在短时间内分析大量的生物分子，快速准确地获取样品中的生物信息，检测效 率是传统检测手段的成百上千倍。 生物芯片技术被认为是继2 0 世纪大规模集成电路之后的又一次具有深远意 义的科学技术革命。生物芯片技术主要包括芯片的制各、杂交与检测。针对实际 应用，例如禽流感病毒诊断与鉴别【1 】。如图1 1 所示，首先在文库中查找对应病 毒的基因序列。然后利用a r m y d e s i g n e r 等软件进行探针设计，制作所需的芯片 阵列；接着进行样品的提取与纯化，一般从细胞中提取m r n a ，然后进行逆转 录得到e d n a ，进行p c r 扩增，从而得到大量杂交所需样品，并对样品进行纯 化和荧光标记等操作：第三步即样品与生物芯片在杂交炉中进行杂交；最后对杂 交后的玻璃载片在激光共聚焦荧光扫描仪进行信号检测，得到芯片的荧光扫描 图，结合生物信息学内容，便可得知动物或人体细胞中是否携带禽流感病毒。 一mk 。、。毯漆； ，b 0 秽 m a 鋈罄毒甏乎 圈；赢遵。赢。臣 镕譬l 嚣捌器i 自 盛l l _ 4 “”“嚣；i i l 黄蚶一檀蝴* 雯舅臣 目卜i 基因芯片应用于禽流感病的实验i 程 硕十学位论文第一章绪论 1 2 生物芯片的分类 自从1 9 9 1 年f o d o r 等人提出d n a 芯片的概念后，近年来以d n a 芯片为代 表的生物芯片技术得到了迅猛的发展，已有多种不同种类和功用的芯片问世，而 且已经在生命科学研究中发挥重要作用。目前常见的生物芯片分为三大类：即基 因芯片、蛋白质芯片、芯片实验室( 1 a b o n c h i p ) 。最近又出现了细胞芯片、组织 芯片、糖芯片以及其他类型生物芯片等。 1 2 1 基因芯片 基因芯片( g e n e c h i p ) y 称d n a 芯片、d n a 微阵y 1 ( d n a m i c r o a r r a y ) ，是生物 芯片技术中发展最成熟以及最先进入应用和实现商品化的领域。基因芯片是基于 核酸互补杂交原理研制的。和r 常所说的计算机芯片非常相似，只是在固相基质 上高度集成的不是半导体，而是成千上万的呈网格状密集排列的基因探针。待分 析样品通过与芯片中已知碱基顺序的d n a 片段互不杂交，从而确定样品中的核 酸序列和性质，对基因表达的量及其特性进行分析。目前，比较成熟的产品有检 测基因突变的基因芯片和检测基因表达水平的基因表达谱芯片。 根据功能，基因芯片可分为基因表达谱芯片和d n a 测序芯片两类。基因表 达谱可以将克隆的成千上万个基因特异的探针或其c d n a 片段固定在一块d n a 芯片上，对来源于不同的个体、组织、细胞周期、发育阶段、分化阶段、病变、 刺激下的细胞内m r n a 或反转录后产生的c d n a 进行检测，从而对这些基因表 达的个体特异性、组织特异性、发育阶段特异性、分化阶段特异性，病变特异性 进行综合的分析和判断，迅速将某个或某几个基因与疾病联系起来，极大地加快 这些基因功能的确定，同时可进一步研究基因与基因相互作用的关系。d n a 测 序芯片则是基于杂交测序发展起来的。其原理是任何线性状的单链d n a 或r n a 序列均可分解成一系列碱基数固定、错落而重叠的寡核苷酸亚序列，如能把原序 列所有这些亚序列全部检测出来，就可据此重新组建出原序列。 根据基因芯片所用探针的类型不同，可分为c d n a 微阵列芯片和寡核苷酸芯 片两大类。根据应用领域不同可将制备的基因芯片称为各种专用型芯片，如毒理 学芯片、病毒检测芯片( 肝炎病毒检测芯片) 、表达谱芯片、诊断芯片、指纹图谱 芯片、测序芯片等。 1 2 2 蛋白质芯片 蛋白质芯片【2 ( p r o t e i nc h i p ) 与基因芯片的原理相似。不同之处有两点：一是 芯片上固定的分子是蛋白质，如抗原或抗体等；二是检测的原理是依据蛋白质分 子之间、蛋白质与核酸、蛋白质与其他分子质之间的相互作用 3 】。蛋白质芯片技 2 硕+ 学位论文第一章绪论 术出现较晚，尚处于发展初期，但是进展很快。目前发展相当成熟的蛋白质芯片 有抗原芯片、抗体芯片和细胞因子芯片等。中国也已经研制出丙型肝炎病毒( h c v ) 多抗体检测蛋白质芯片和肿瘤抗原筛选和检测蛋白质芯片，并获得了国家认可的 新药证书。 最近，蛋白质芯片研究不断取得重大进展。2 0 0 1 年7 月s c i e n c e 杂志报道了 酵母蛋白质组芯片，这是目前为止第一个包括一种生物几乎全部蛋白质分子的高 密度蛋白质芯片【4 】。 由于蛋白质在生命活动中是重要的功能性生物大分子，而且随着后基因组时 代的到来以及蛋白质组学研究的深入开展，可以预料，蛋白质芯片将成为生物芯 片技术研究和开发的重点和核心，有望发展成为生物芯片技术的主流。相信，不 久将会有更多类型的蛋白质芯片，包括含更高等生物甚至人类蛋白质组的蛋白质 芯片研制成功，并成功应用于生物医学基础研究和疾病诊断领域。 1 2 3 芯片实验室 芯片实验室( 1 a b o n a c h i p ) 是将样品制备、生化反应以及检测分析等过程集成 化形成的微型分析系统。现在已有由加热器、微泵、微阀、微流量控制器、微电 极、电子化学和电子发光探测器等组成的芯片实验室问世，并出现了将生化反应、 样品制备、检测和分析等部分集成的生物芯片。例如，可以将样品制备和聚合酶 链反应( p c r ) 同在一块微型芯片上完成。g e n el o g i c 公司设计制造了一种生物芯 片，可以从待检测样品中分离出d n a 或r n a ，并对其进行荧光标记，然后当样 品流过固定栅栏状微通道内的寡核苷酸探针时便可捕获与之互补的靶核酸序列， 应用特殊检测设备即可实现对杂交结果的检测与分析。这种芯片由于寡核苷酸探 针具有较大的吸附表面积，可以很灵敏地检测到稀有基因的变化。同时，由于该 芯片设计的微通道具有浓缩和富集作用，所以可以加速杂交反应，缩短测试时间， 从而降低测试成本。 由于技术上的一系列难题，以及应用过程中的复杂性和市场接受程度的限 制，目前，真正意义上的芯片实验室进入应用阶段还存在相当困难。但无论如何， 芯片实验室是生物芯片技术中的主流方向之一，是生物芯片技术发展的最终目 标。 1 2 4 组织芯片 组织芯片的概念于1 9 9 8 年有k o n o n e n 等首次提出【5 】。组织芯片技术可以看 成是基因芯片技术的发展与延伸，与细胞芯片、蛋白质芯片一样，属于一种特殊 形成的生物芯片技术。经过几年的发展，组织芯片技术成为生物芯片技术的一个 重要研究和开发领域。 3 硕十学位论文 第一章绪论 组织芯片是将成百上千个不同个体的组织标本按预先设计或研究需要排列 在一张载玻片上所形成的组织微阵列【6 】。组织芯片是一种高通量，多样本的分析 工具，它使科研人员第一次有可能同时对几百甚至上千种正常或疾病以及发展不 同阶段的自然病理生理状态下的组织样本，同时针对某一个或多个特定基因及表 达产物进行系统研究。组织芯片技术可以与d n a 、r n a 、蛋白质、抗体等研究 技术结合，也可以和传统的病理学技术、组织化学以及免疫组化技术相结合，在 基因、基因转录和蛋白质功能等3 个层次上进行多维研究。组织芯片的出现，为 医学病理学以及分子流行病学提供了一种高通量、大样本以及快速的分子水平的 分析工具；同时又克j e t 传统病理学方法、基因芯片和蛋白质芯片技术中存在的 某些缺陷，使人类第一次能够有效利用成百上千份自然或处于疾病状态下的组织 标本，分别在基因、基因转录和相关表达产物生物学功能等多个水平上进行一系 统研究。这对人类功能基因组学研究，特别是对基因和蛋白质与疾病发生发展关 系、疾病相关基因功能验证、新药开发与筛选、疾病分子诊断、治疗过程的追踪 和愈后等方面具有实际意义和广阔的市场前景i ”。图l - 2 所示是用于诊断乳腺癌 的组织芯片。 m i 口o a r r a yp a n e l d i s p l a y n 00o 毒口0000 o e a0 审0 审0 0000 霾 co 固0000000 o o00o0 毒000 s 00000000o r 0000oo0oo e 0000oooo ”e “擎：，。；。 图卜2 乳腺癌诊断组织芯片 1 2 5 细胞芯片 细胞芯片技术于2 0 0 1 年由美国麻省理工学院0 d m 的z l a u d d i n 和s a b s m t l 等 人首先发明嘲。细胞芯片技术实际上是一种高通量的基因反向转染技术n 其原 理是，首先将不同的d n a 探针点在玻璃片上，做成d n a 微阵列芯片，接着用 脂质体转染方法处理该d n a 微阵列芯片，然后在脂质体处理的d n a 微阵列上 培养哺乳动物细胞；点在芯片上的d n a 在转染试剂的作用下原位转染哺乳动物 细胞，在d n a 微阵列的每一个d n a 样品点的相同位置形成了转染该d n a 的细 胞集群，细胞因获得了外源d n a 而获得了新的表型。这样，有d n a 芯片制成 了由不同性状纲胞组成的细胞微阵列芯片。它可用于药物的高通量筛选和功能验 硕十学位论文第一章绪论 证，确定药物作用靶点，寻找能改变细胞生理状态的基因产物等研究领域。 1 3 生物芯片的应用 生物芯片技术的出现和发展引起国际上的广泛关注和重视。随着世界各国逐 渐重视并加大对生物芯片研发的投入，以生物芯片为核心的相关生物技术产业正 在全球崛起。美国f o r t u n e 杂志曾经载文指出，在2 0 世纪科技史上有两件事情影 响深远。一是微电子芯片，它是计算机和许多家电的心脏，改变了人们的经济和 文化生活，并进入每一个家庭。二是生物芯片，它将改变生命科学的研究方式， 革新医学诊断和治疗的模式，并将极大地提高人1 ：3 素质和健康水平d o q 2 】。如果说 2 0 实际属于微电子芯片，那么2 1 世纪就是生物芯片的时代。生物芯片有望成为 2 0 世纪以来科技史上继微电子芯片后的又一项具有重要影响的技术革命。生物 芯片技术在疾病诊断、生物学和基础医学研究、司法鉴定、环境监测、农作物良 种选育、新药开发以及国防航天等广泛领域中有着广泛的应用前景，并有可能从 根本上改变目前生物学和生物技术的观念和效率。文献 1 3 对生物芯片在各个领 域的应用作了相当全面的介绍，本文仅介绍其中几个领域的应用。 1 3 1 疾病诊断 生物芯片在感染性疾病、遗传性疾病和恶性肿瘤等疾病的临床诊断方面显示 出独特的优势。具体表现在，生物芯片可以在一张芯片上同时对多个病人进行多 种疾病的检测，无需机体免疫应答反应期，能实现早期诊断，待测样品用量小： 能特异性检测病原微生物的亚型及变异；可实现从系统、器官、组织和细胞层次 转变到d n a 、r n a 蛋白质及其相互作用上了解疾病的发生、发展过程，这些特 点使得医务人员在短时间内可以掌握大量的疾病诊断信息，有助于医生在短时间 内找到正确的治疗措施。特别是，肿瘤和遗传性疾病发生的一个根本原因是由于 遗传物质发生变化，检测基因突变对于阐明肿瘤及遗传病的分子机制、疾病早期 诊断具有重要意义。 另一方面，生物芯片在肝炎病毒检测方面具有重要的应用前景。目前已发现 数十种病毒可引起肝炎性损害，检测其相应的免疫标志物在人体中的存在和含 量，对病因诊断与治疗意义重大。最新发展的蛋白质芯片技术，其原理类似于常 规的酶联免疫反应原理，即将特异性抗原或抗体固定于载体，待测样品按比例稀 释后与其上的抗原或抗体进行反应，再加入荧光标记的抗原或抗体，用计算机软 件对荧光信号进行分析，即可获得准确的定性或定量结果，一张芯片上可以分布 上千万个抗原或抗体，并能标记多种荧光素，能实现病毒的快速和高通量检测， 5 硕十学位论文第一章绪论 且可进行病毒的血清学分型。 1 3 2 基因突变检测 伴随着人类基因组计划的完成，越来越多的疾病相关基因已被克隆。研究发 现，多种遗传病、肿瘤和遗传易感性疾病几乎都由基因突变引起。基因突变检测 对遗传病诊断、肿瘤发病机制及基因功能等研究具有重要的意义和临床应用价 值。基因突变的形式有很多，人类基因组中常见的有点突变、基因缺失、扩增、 插入、重复、倒位等，基因芯片技术作为一种基因结构分析及基因表达研究技术， 它的出现使突变检测变得程序化和规模化。它主要通过多元杂交，分析杂交差异 部分来判定是否有突变，基因芯片可同时进行一种基因多位点、多种基因位点突 变检测，因此具有信息量大、敏感性高、检测速度快等特点。目前主要通过合成 检测特定位点的所有可能探针，如果是检测位点突变，通常将分别为a 、g 、c 、 t 的构成的检测位点的核苷酸的探针做成芯片，如果与荧光标记的被检测位点样 品杂交，根据芯片上各个探针杂交的荧光强度，判断出被检测位点的核苷酸。 1 3 3 药物筛选 生物芯片技术具有的高通量、大规模、平行性等特点可以用于新药的筛选。 基因芯片在药物靶标的发现、多靶位同步高通量药物筛选、药物作用分子机理、 药物活性及毒性评价方面有其他方法无可比拟的优势。它可以从基因水平解释药 物的作用机理，可以用基因芯片分析用药前后机体不同组织、器官基因表达的差 异，为新药作用的靶目标研究以及抑制这些靶目标试剂和药物的合成提供指导， 研究各种药物对不同基因的作用，从而在剂量和成分搭配上做到更加精确。可以 预测，在不久的将来，药品说明书上的适用症和禁忌症都会改为适用基因型和禁 忌基因型，使得药品可以针对不同个体的不同疾病，真正实现疗效更佳、副作用 更小的目的。 生物芯片也可以应用在药物靶点的发现与药物作用机制研究中。药物靶点发 现与药物作用机制研究是生物芯片技术在药物研发中应用最广泛的一个领域。使 用基因芯片可以对感兴趣的基因或生物体整个基因组的基因表达谱进行测定。在 现代药物研究与开发中，筛选、发现和选择合适的药物靶点是药物开发的第一步， 也是药物筛选及药物定向合成的关键因素之一。严重威胁人类健康的心脑血管疾 病、恶性肿瘤、老年痴呆症和一些代谢紊乱疾病都是多因素作用的结果，往往不 能归结于单一因素的变化。现在生物医学研究表明，生命是一个极其复杂的网络 系统，人类疾病的发生和发展涉及生命活动网络中的诸多复杂环节。应用生物芯 片技术可以从疾病以及药物等二维水平上对生物体的多个参量同时进行研究，以 发掘药物靶点并同时获得大量信息，为现代新药研究和丌发提供重要手段。基因 6 硕+ 学位论文第一章绪论 芯片在大规模药物筛选的应用可减少和甚至省略大量的动物试验，从而使药物开 发周期缩短，大大降低开发成本：同时，对于不良反应而排除的药物，可进行重 新评估。有可能寻找到可适用的患者群，对医疗个性化的实现有重要的基础和现 实意义【1 4 】。 1 3 4 毒理学研究 对药物进行毒性评价，是药物筛选过程中一个十分重要的环节。现在毒理学 研究中多采用以鼠为模型，通过动物实验来确定药物的潜在毒性。这些方法需要 使用大剂量的药物，花几年时间，费用相当大。生物芯片技术可将药物毒性与基 因表达特征联系起来，通过基因表达的分析便可确定药物毒性，使得药物毒性在 临床试验前得到确认。用生物芯片可以在一个实验中同时对成千上万个基因的表 达情况进行分析，为研究化学或药物分子对生物系统的作用提供新的线索。生物 芯片技术可对单个或多个有害物质进行分析，确定化学物质在低剂量条件下的毒 性，分析、推断有毒物质对不同生物的毒性。如果不同类型的有毒物质所对应的 基因表达具有特征性的规律，那么，通过比较对照样品和有毒物质的基因表达谱， 便可对各种不同的有毒物质进行分类，并在此基础上通过进一步建立合适的生物 模型系统，便可通过基因表达谱变化来反映药物对生物体的毒性作用。 1 3 5 药物基因组学研究 药物基因组学是近l o 年来兴起的一门新兴学科，是在基因组学的基础上研 究个体对不同药物反应的差异，以便针对不同的个体基因型定制药物，从而使药 物的药效得到充分发挥，而使药物不良反应减到最小。药物基因组学对现代药物 研究的一个重要转变是药物进入临床试验前，药物基因组学可以通过先导化合物 对基因多态性的影响挑选最具可药性的先导物，从而降低由于药效的不稳定在相 继的临床试验中导致的失败概率。在i 期临床试验中，通过个体基因型可以预见 基因多态性造成的药物代谢动力学差异。由于药物作用靶蛋白质的差异反映在基 因多态性上，因此在i i 期临床试验中，由个体基因型可以预见多态性造成的药 效差异，可以知道i i i 期临床试验。一旦发现一种可以导致药物作用差异的蛋白， 其他与之相关的蛋白可作为潜在的药物作用靶。将生物芯片技术应用于药物基因 组学，可以加速药物基因组学的发展，主要是利用基因芯片技术进行基因功能及 多态性的研究，以确认与药物效应及药物吸收、代谢、排泄等相关的基因，并查 明这些基因的多态性；同时，利用药物基因组学的研究成果，结合基因芯片技术， 可将人类基因型分群，以实现药物基因组学研究的目的和价值。从这两面足以看 到生物芯片技术在药物基因组学研究中的重要地位。 此外，基因芯片技术可以自动、快速地检测那些可以影响药物效应的基因和 7 硕士学位论文第章绪论 决定个人对药物毒性敏感性的基因。 1 4 生物芯片的制备方法 目前报道的生物芯片制备方法种类较多，尤其是基因芯片的制各。基因芯片 的制备方法根据是否事先合成寡核苷酸，大体上可以分为原位合成法( i ns l t u s y n t h e s i s ) 和合成后点样法，前者有时被称为在片合成法，后者也称为合成后交联 ( p o s t - s y n t h e t i ca t t a c h m e n t ) 、离片合成法。 1 4 1 原位合成法 目前报道的生物芯片制备方法种类较多，尤其是基因芯片的制各，大体上可 以分为原位合成法和合成后微点样法。原位合成是目前合成高密度寡核苷酸芯片 最为成功的方法，主要有光引导原位合成法、原位喷印合成法、微电子刻蚀合成 法、光敏抗蚀层合成法、分子印章法队及活版印刷法等【”剖。 f 1 1 光引导原位合成法 光引导原位合成寡核苷酸芯片的方法有a 母m a 时x 公司的f o d o r 等人提出 2 1 1 ，他们把核酸人工合成中普遍使用的固相合成技术与在半导体硅片上制作微型 电路的光刻掩模技术相结合，并使用一种新型含光敏化学保护基的d n a 合成试 d 。矗；墓咖j f r - 督哪 i ：竖。 ；趣：2 k ， f r i 呵 ：j 出。 j ：i 叠 - 2 滥 图i - 38 光引导合成法制备d n a 芯片流程；b 光源、掩模厦微阵列示意圈 图片濂自文献【2 2 】 剂，用光脱保护法直接在基片上合成寡核苷酸阵列瞄捌。光引导台成法制各d n a 芯片的具体过程如图1 _ 3 所示：首先在玻璃基片表面连接一层手臂分子，并修饰 上光敏保护基团：当光线通过掩模照射固体表面时，受光照处脱保护基团，分子 硕士学位论文第一章绪论 暴露出插性羟基；同时，采用固相合成法将核苷酸单体的一端( 5 端) 活化，另一 端与光敏保护基相连，然后将其加到玻片表面便与基片表面的活性羟基发生偶联 反应。设计不同的掩模，利用光照进行反应，基片上便一层一层连接上探针分子， 最后得到所需的寡核苷酸微阵列。当所需的寡核苷酸均合成完毕，对玻璃基片进 行光照以去除所有保护基团。 ( 2 ) 原位喷印合成法【批q 压电印刷法主要是美国加州i c y e f h a r - m a c e u t i c a l s 公司和p r o t o g c n 公司所采 用，是由b l a n c h a r d 和h o o d 提出其原理与喷墨打印相似，不过芯片喷心头和 墨盒有多个，墨盒中装的是4 种碱基液体而不是碳粉。合成时整个喷印头利用三 维精密移动系统在芯片上移动，根据芯片上不同位点的序列需要将特定的碱基喷 印到芯片的特定位置。该技术采用的化学原理和传统的d n a 固相合成一致，因 此不需要特殊制各的化学试剂。 ( 3 ) 微电子刻蚀合成法【撇q 微电子刻蚀技术主要利用集成电路工艺中的氧化、蒸发、溅射、光刻、腐蚀 等一系列技术预先构建阵列小坑，这些小坑即为d n a 反应池。然后在小坑内包 被氨基硅烷或多聚赖氨酸，使其带上j 下电荷，以吸附带负电的碱基。合成时按探 针上的预定碱基种类，将芯片浸入该种类的碱基溶液中，每浸入一次，即增加一 个碱基。重复操作就可合成所需要的探针。 ( 4 ) 光敏抗蚀层合成法”0 9 】 光敏抗蚀层合成法也称为光刻胶保护合成法，是i b m 公司研发成功。该方 嘲蠡再离产 正群并戚慑护 叫? ? j | ? 叫 l 划 r 川一、 w 零雾帅 儡鞋一层碱基 - 。1 ：i i 4 ；一! 二一一 图卜4 光敏抗仕层d 合成技术原理示意图 罱鞠 硕士学位论文 第一章绪论 法利用微电子光敏抗蚀层工艺进行高密度基因芯片的制各。实际上它是在光敏保 护基团上的改进，采用普通磷酸二酯法d n a 合成试剂，通过光敏保护层进行选 择性脱保护和偶联反应。如图1 - 4 所示，首先在玻璃基片上组装一层连接分子， 接着在基片上涂抹上一层光敏抗蚀层( 也叫光刻胶) ，利用光刻显影把需要进行碱 基合成的区域暴露出来，进行脱保护从而露出羟基，然后用标准d n a 试剂法在 去脱保护的核苷酸5 羟基上合成一个碱基。经过偶联、氧化、戴帽、脱保护和 清洗，不断重复以上步骤，按照设计的d n a 序列，就可构建不同密度不同序列 的寡核苷酸芯片。 ( 5 ) 分子印章法 3 0 - 3 w 分子印章法是由东南大学吴健雄实验室提出的，其原理如图1 5 所示。他们 成功地应用该方法制各出高密度d n a 芯片，并设计和构建了高定位精度的分子 a b c d 田l 一5 分子印章法原理示意履印章制备与压印反应图 a ：玻璃板上潦捧光刻胶；b ：光剐得母板图案；c ：p d m s 印章制备；d ：p m s 印章： e ：潦抹反应漓：f ：印章上反应物与玻璃基片压印接触井反应；g ：反应分子与基片键合 硕士学位论文第一章绪论 印章法d n a 芯片制各系统。该方法首先根据所需制各的寡核昔酸微阵列设计一 组不同图形的有凹凸的印章，然后根据预先的设计将不同的碱基单体涂布在不同 的印章表面，再依次压印基片表面。利用可以自动进行清洗、脱保护、氧化和封 闭等化学反应的液体流动池，按照设计的序列进行原位d n a 合成。每次压印后， 基片表面的化学基团被重新激活，准备进入下一次压印，从而在基片表面的活性 基团上连接新的化学基团。通过一系列可控的压印过程，最终得到所需的寡核苷 酸微阵列。 1 4 2 合成后点样涪 合成后微点样技术比原位合成简单，利用手工或自动点样装置将预先制各好 的寡核苷酸或e d n a 样品点在经特殊处理的玻璃片或其它材料上即可，主要用于 诊断、检测病原体及其它特殊要求的中、低密度芯片的制各。机械微点样方式主 要有接触点样和非接触赜点两类。接触点样通过点样针完成，质地较为坚硬的针 头浸入样品中，蘸取适量液体后，针头与处理过的玻璃片接触时，就能将液体固 定在玻片表面。非接触喷点又分为两种，一是压电技术：采用压电晶体使液体从 孔中喷出；二是注射器螺线管技术，即通过高分辨率注射泵和微螺旋管阀门有机 结合对液滴进行精确控制 1 3 l 。如图1 6 所示是采用接触点样法合成寡核苷酸装 置。 囤1 _ 6 合成后微点样制备寡核苷酸芯片装王 1 5 课题研究背景及意义 目前d n a 芯片制各技术的发展呈两大趋势；其一是以a f f y m e t r i x 公司为代 表的向高密度、高通量、高度并行性基因芯片发展，试图把对应于人类所有基因 的相应探针都固定在一块芯片上，它的发展将对生命科学的基础与应用研究起到 硕十学位论文 第一章绪论 革命性的推动作用，并有可能在将来引发新的革命；另一种趋势是以n a n o g e n 公司为代表的过程集成化趋势，由于在实际临床诊断及军事、司法应用中，大多 数情况下并不需要高密度的d n a 微阵列，而是需要密度适中、但特别简单、灵 活、速度快、成本低、易于操作、质量可靠的芯片制备方法和技术。因而，发展 中、低密度的d n a 芯片可能有着很大的实际应用前景和巨大的潜在市场，并可 能取得重大的经济和社会效益。因此，无论是高密度，还是中、低密度基因芯片， 在生物检测、医学检验和疾病诊断、药物筛选以及基因序列分析等方面都有着重 要的意义【1 0 , 2 0 , 2 1 , 3 4 - 3 9 】。 另一方面，目前国内用于科学研究的大部分基因芯片都是从相关机构直接购 买，价格昂贵，平均每块芯片大概1 5 0 0 人民币。在实际应用中，往往需要采用 多块芯片进行检测才能得到有意义的数据结果，这在很大程度上加大了科学研究 或实际应用的成本。这也是国内生物芯片技术与应用普及速度较慢的其中一个重 要原因。少数科研单位能够采用手动的方式合成探针数较少的芯片，但合成坏境 条件相当严格，合成周期长，并不能满足实际的科研需求。还有一部分机构购买 了诸如d n a 合成仪的进口设备，价格亦非常昂贵，一旦仪器出现问题，维修不 方便，时间较长，从而降低它的使用效率。 因此，自主研发一套能够快速合成基因芯片、成本相对较低的设备仪器，具 有重大的现实意义，拥有广泛的市场空间。 1 6 论文的的主要研究工作 本文在活版印刷原位合成d n a 技术原理的基础上，提出活版印刷生物芯片 原位合成系统的设想，设计了整个硬件和机械系统；同时，采用横河p l c 控制 机械手的压印动作及液气传输系统的控制，用梯形图语言开发了系统的核心控制 程序，并设计了满足系统要求的触摸屏人机交互界面。 同时，提出了一种微流体自驱动原位压印合成生物芯片的新方法，该方法采 用的化学原理与传统的d n a 固相合成一致，在原位合成时采用真空纳米纤维管自 动驱动碱基单体的自下而上传输，结合计算机技术控制载玻片进行压印，依赖于 自动化设备和装置来实现芯片原位压印合成，采用该方法所制备的生物芯片密度 取决于纤维管直径大小以及压印头的定位精度，在现有条件下探针密度可达4 0 0 位点c m 2 。 第二章比较和分析了目前基因芯片合成的方法，着重阐述了活版印刷原位合 成生物芯片的原理，并对芯片的合成条件和环境进行了介绍；同时介绍了基片材 料及其选取。 硕十学位论文第一章绪论 第三章详细论述了活版印刷生物芯片原位合成仪的硬件平台构建，并对各个 组成部分的设计进行了探讨，包括压印平台、多功能反应池、机械手、运动控制 系统、液气传输系统设计以及触摸屏人机界面。 第四章详细阐述了活版印刷生物芯片原位合成仪的软件设计，包括p l c 控制 程序设计和触摸屏人机界面的开发。同时，在三坐标仪下测试了仪器的定位精度 和重复精度。 第五章对本课题的研究工作进行总结，并对以后的研究进行展望。 硕+ 学位论文第二章活版印刷原位合成基冈芯片原理 第二章活版印刷原位合成基因芯片原理 上一章中对生物芯片的制备方法做了基本介绍，本章中对各种方法的优缺点 和适用范围等方面进行比较分析，最终采用由东南大学和湖南工业大学课题组提 出的活版印刷原位合成寡核苷酸微阵列方法作为仪器的原理，并对该方法进行详 细介绍。 2 1基因芯片合成方法比较与分析 基因芯片的制备技术主要有原位合成法和直接点样法两种。点样法是指运用 各种方法( 打印、喷印等) 将预先合成的d n a 探针或e d n a 探针固定到玻片或其 它固体载片上形成微探针阵列。与原位合成法相比，点样法较简单，只需将预先 制备好的寡核苷酸或e d n a 等样品通过自动点样装置点于经特殊处理的玻璃片 或其它材料上即可。点样法又分为打印和喷印两种方法：其中打印法的优点是探 针密度相对较高，通常可打印2 5 0 0 个探针c m 2 ，缺点是定量准确性及重现性不 好，打印针容易堵塞，且使用寿命有限。喷印法的优点是定量准确，重现性好， 使用寿命长，其缺点是喷印的斑点大，因此探针密度低，通常只有4 0 0 位点c m 2 。 无论是采用打印或者喷印的方法，都需要事先大量地制备纯化、量化、分类p c r 产物。采用点样法制备密度基因芯片的过程中，当探针数量较大时，所需探针成 本也随着增加。例如，当2 0 目的探针数量达到1 0 0 0 条时，探针成本即在1 0 0 ， 0 0 0 元人民币左右。因而当探针数目较多时，这一技术无法与原位合成技术相比 拟，此外还有各种客观因素导致探针密度不均匀因而杂交信号不均匀的缺点。 原位合成是按照预先设计的碱基序列直接将探针合成在基片上，主要有光蚀 刻原位合成和喷印原位合成两种，目前只有美国a f f y m e t r i x 公司拥有的光脱保护 原位合成制备专利技术己实现基因芯片的规模化生产【2 1 1 ，但该技术主要不足之处 是特有的光脱保护方法需要制作一系列特定的光掩模，并且对不同的用户需求和 不同的基因芯片必须重新设计光掩，成本相当高，不适合小批量需求：此外，光 蚀刻法每步合成率较低，一般为9 5 左右，合成3 0n t 产率仅2 0 ，还需要特 殊的光脱保护试剂。 原位喷印合成技术采用的化学原理与传统的d n a 固相合成一致，因此无需 特殊制备的化学试剂，其原理与喷墨打印类似，不过芯片喷印头和墨盒有多个， 墨盒中装的是四种碱基等液体而不是碳粉。喷印头可在整个芯片上移动并根据芯 1 4 硕士学位论文 第二章活版印刷原位合成基因芯片原理 片上不同位点探针的序列需要将特定的碱基喷印在芯片上特定位置。喷印法每步 偶联率达9 9 以上台成3 0n i 产率可达7 4 ，从这个意义上说喷印法特异性 应比光刻法高。此外，它并不需特殊的合成试剂。 国内东南大学吴健雄实验室经过数年的努力，开发了分子印章接触压印 d n a 微阵列原位合成技术，完全采用现有最成熟的d n a 合成路线，可望降低成 本。但美中不足的是在掩模设计上和a f f y m e = t r i x 公司拥有的光脱保护原位合成制 各专利技术一样，针对不同的用户需求和不同的基因芯片，必须重新设计掩模。 本谋题组提出和研究了活版印刷原位合成中低密度基因芯片新方法，可望避 免现有原位合成方法中繁琐而昂贵的掩模制各过程及点样法中昂贵的探针修饰 或标记成本，针对不同用户需求只需重新排列印刷模版即可，易实现自动控制和 精确定位，合成速度快，在较短时间内就可快速印刷合成出探针分布均匀的大批 量基因芯片。但主要存在的缺陷就是模版的设计需要手动实现，过程繁琐。尤其 是当芯片密度较高时，手动排版不仅所需时间长，而且非常容易出错。 2 2 活版印刷原位合成基因芯片原理 寡核苷酸的固相合成方法主要有氢磷酸酯法、磷酸三酯法和亚磷酸酰胺法 三种，其中亚磷酸酰胺方法由于其高效和快速的偶联以及起始物质的稳定性而最 适合活版印刷法d n a 芯片制备。活版印刷法的原理是将具有微纳米通道的真空 实心材辩多孔材科 p 聚四氟乙烯 。淫萋产“ 幽 已警皇喜的 图2 - 1 活版印刷压即化学反应原理 台麻蓐x 层 纤维管或微颗粒作为印刷“活字”材料，构成一系列组合印刷模版，并将反应试 硕十学位论文第二章活版印刷原位合成基冈芯片原理 剂储存于这些组合印刷模版下，依靠毛细效应单体试剂能源源不断地传输到纤维 管或微颗粒压印尖端，这样保证了在压印合成时压印尖端富含单体试剂，并能与 基片充分接触而又不向周围扩散。每一张模版对应于种合成单体试剂，应用组 合化学原理循序压印到基片上进行化学偶联，最终得到所需的化合物微阵列。对 于d n a 微阵列来说，由于只有四种单体，每一层最多只需组合四张印刷模版， 这些微小纤维载体材料就象古代活版印刷中的“活字 一样，经过乙腈溶液浸泡、 漂洗就可以重复使用( 仅局限于同一单体间使用) ，针对不同的用户要求和不同的 芯片设计，只需要用机械手或手工重新排列组合印刷模版就可实现芯片快速印刷 制备 2 训。图2 1 所示简要说明了其合成原n ( n 中：寡核苷酸所含碱基个数为8 ， 而所合成的寡核苷酸微阵列点阵数为1 6 ，纯粹只是为了简单明了地说明原理) 。 2 3 基因芯片合成条件和环境 活版印刷法寡核苷酸微阵列的原位合成是遵循亚磷酸酰胺固相合成法，其合 成路径由偶联、封闭、氧化和脱d m t 四步反应构成个合成循环【4 0 , 4 i 】。活版印 刷法寡核苷酸的合成原理为：将亚磷酸酰胺第一步化学反应，即偶联反应由活版 偶联压印来完成，压印偶联反应是在手套箱中进行的。活版印刷法寡核苷酸微合 成属于在片合成，不存在后续纯化过程，因此，在研究中也省略封闭反应。而氧 化和脱保护反应在通风橱中进行。在压印偶联反应中，依靠聚四氟乙烯反应槽精 确定位，模版纤维管凸出尖端与玻璃载片接触，从而使核苷酸单体与玻璃载片上 的氨基发生偶联反应。偶联反应完成后，再进行氧化和脱d m t 反应，这样便完 成了一个循环；依次再完成其余多个合成循环。合成条件见表1 ：手套箱的环境 为0 2 1 0 1 0 巧，h 2 0 1 0 1 0 弓( 均为体积含量) 。 表2 - 1 寡核苷酸原位合成条件 1 6 硕士学位论文第二章活版印刷原位合成基冈芯片原理 2 4 基片及其类型 基片是用于连接、吸附大量生物分子的固相材料，也被称为载体。用于合成 生物芯片的载体一般除了能有效地固定靶标外，还必须满足靶标能在其表面与探 针进行杂交反应。这就要求基片表面应当具有各种不同的活性基因，使其能够与 各种生物分子连接。同时，为了得到高敏感性和高分辨率的荧光检测信号，制作 生物芯片的材料应具有良好的光学性质。除此之外，基片还必须具有相