（计算机应用技术专业论文）磁分离酶免疫测试仪的软硬件设计.pdf

摘要 摘要 磁分离酶免疫分析测试仪主要用于对人体内分泌激素进行检测，根据 激素指标的差异，为医生确定病人病情提供科学依据。目前，酶免仪已经 成为医疗机构进行临床诊断所必需的医疗仪器之一。本论文以小型酶免仪 器的研发过程为主要内容，提出了完整可行的系统设计方案。 本文首先介绍了仪器的系统结构与工作原理，着重讲述了酶免测试仪 的电子学部分设计。在酶免测试仪的电子学设计中包括硬件和软件两部分， 从硬件角度来看酶免测试仪输入输出量多，对数据的处理量大，除了实现 对仪器的实时操作外，还要对当前测试杯的多路模拟信号进行实时数据采 集。根据以上特点，系统的硬件设计选用高性能f l a s h 型单片机芯片 a t 8 9 c 5 5 作为核心控制器，简化了系统结构，同时提高了仪器的可靠性和 稳定性。仪器的数据采集部分包括前端的光电转换、放大电路和对数运算 部分。系统选用1 4 - b i t 高精度模拟数字转换芯片i c l 7 1 3 5 ，采用独特的串 行数据连接方式，数据采集可靠准确，符合仪器设计要求。 其次，本文介绍了仪器软件部分的设计，软件采用汇编语言编写。软 件结合仪器选用的支持中文输出的液晶显示器和打印机，设计了中文用户 操作界面，更方便国内用户使用，软件系统运行稳定可靠。 最后，本文还为酶免测试仪测定建立了一个数据处理的模型，用于解 决测试中由于试剂特性而产生的非线性问题。这个模型采用四参数非线性 拟合方法，用数学分析的方法处理拟合过程，得到符合实际情况的曲线方 程。该模型经实际验证算法稳定、结果可靠正确。 关键词酶免测试仪；单片机；模数转换；非线性数据处理 北京工业大学工学硕士学位论文 a b s t r a c t t h em a g n e t i cs e p a r a t ee n z y m ei m m u n o a s s a yt e s ti n s t r u m e n ti sm a i n l y a p p l i e dt od e t e c tt h ei n c r e t i o nh o r m o n eo fh u m a nb o d y o nt h eb a s i so fi n d e x d i s c r e p a n c y ，i to f f e r ss c i e n c ef o u n d a t i o nf o rt h es t a t eo fa ni l l n e s s a tp r e s e n t ， t h i sa p p a r a t u sh a sb e c o m eo n eo ft h ee s s e n t i a lm e d i c a li n s t r u m e n t sf o rc l i n i c a l d i a g n o s i s i nm e d i c a lt r e a t m e n t o r g a n s a s t h ep r i n c i p l ec o n t e n t ，t h i s d i s s e r t a t i o ni n t r o d u c e sa p r o c e s so fd e v e l o p m e n to ft h es m a l l s c a l ea p p a r a t u s ， a l s op u t sf o r w a r dac o m p l e t ea n df e a s i b l es y s t e md e s i g ns c h e m e f i r s ti n t r o d u c i n gt h es y s t e mc o n f i g u r a t i o na n dw o r kp r i n c i p l e ，t h i sa r t i c l e e m p h a t i c a l l yn a r r a t e st h ep a r to fe l e c t r o n i cd e s i g no ft h ee n z y m ei m m u n o a s s a y t e s ti n s t r u m e n t t h ee l e c t r o n i cd e s i g ni n c l u d e sh a r d w a r ep a r ta n ds o f t w a r ep a r t f r o mt h ep o i n to fv i e wo fh a r d w a r e ，t h ee n z y m ei m m u n o a s s a yt e s ti n s t r u m e n t h a sag r e a td e a lo fi n p u ta n do u t p u tw i t hal o to fd a t ap r o c e s s i n g i na d d i t i o nt o r e a l i z i n gs o l i dh o u ro p e r a t i o no nt h ea p p a r a t u s ，s o l i dh o u rd a t ac o l l e c t i o nw i l l b eh a n d l e di nt h em u l t i p l e xc i r c u i ta n a l o gs i g n a l so ft h ep r e s e n tt e s tc u p a c c o r d i n gt ot h ea b o v ec h a r a c t e r i s t i c ，t h eh a r d w a r ed e s i g no ft h es y s t e m c h o o s e sh i g hp e r f o r m a n c ef l a s h - p a t t e r ns i n g l e - c h i pc o r ea t 8 9 c 5 5a st h ec o r e c o n t r o l ，i ts i m p l i f i e ss y s t e mc o n f i g u r a t i o n ，m o r e o v e r , r a i s e st h ed e p e n d a b l e w i t hs t a b i l i t yo ft h ei n s t r u m e n t t h ed a t a - c o l l e c t i o np a r to ft h ei n s t r u m e n t i n c l u d e st h eh e a dp h o t o e l e c t r i cc o n v e r s i o n t h ea m p l i f i e de l e c t r i cc i r c u i ta n d t h el o g a r i t h mc a l c u l a t i o np a r t t h es y s t e mc h o o s e st ou s et h e1 4 - b i th i 【g h a c c u r a c ya dc o n v e r s i o nc o r ei c l 7 1 3 5 ，a n da d o p t st h eu n i q u es e r i e sd a t a c o n j u n c t i o nm e t h o d t h ed a t ai sc o l l e c t e dr e l i a b l ya n da c c u r a t e l y ，a c c o r d e d w i t ht h ed e m a n do ft h ea p p a r a t u sd e s i g n n e x t ，t h i sd i s c o u r s er e c o m m e n d st h ec o n f i g u r a t i o no ft h es o f t w a r ep a r t t h es o f t w a r ea d o p t sw r i t i n gw i t ha s s e m b l el a n g u a g e c o m b i n e dw i t ht h e l i q u i dc r y s t a ld i s p l a y e ra n dp r i n t e rs u p p o r t i n gc h i n e s eo u t p u t ，t h es o f t w a r e d e s i g n st h ec h i n e s ec u s t o m e ro p e r a t i o ni n t e r f a c e ，w h i c hm a k e st h es y s t e m m o r ec o n v e n i e n tf o rl o c a lc o n s u m e r sa n dt h es o f t w a r es y s t e ms t 曲l ea n d r e l i a b l e 摘要 f i n a l l y ，t h i sp a p e ra l s os e t su pad a t ap r o c e s s i n gm o d e l ，w h i c hi sa p p l i e d t os o l v et h ec r e a t e dn o n l i n e a rp r o b l e m so w i n gt ot h er e a g e n tn a t u r e ，f o rt h e d e t e r m i n a t i o no ft h ee n z y m ei m m u n o a s s a yt e s ti n s t r u m e n t t h i sm o d e la d o p t s f o u r - p a r a m e t e rn o n l i n e a rd a t ap r o c e s s i n gm o d e l ，i td e a l sd a t ap r o c e s s i n g c o u r s e 、) i r i t hm a t h e m a t i c sa n a l y s i sm e t h o d a n do b t a i n st h es q u a r ed i s t a n c ei n c u r v em a t c h e dw i t ht h ea c t u a lc i r c u m s t a n c e t h i sm o d e lg a i n sas t a b l e a r i t h m e t i cm e t h o d ，ac o r r e c ta n dr e l i a b l er e s u l tt h r o u g ht h ea c t u a lv e r i f i c a t i o n k e yw o r d s t h ee n z y m ei m m u n o a s s a yt e s ti n s t r u m e n t ；s i n g l e c h i p ；a d e o n v e r s i o n ；n o n l i n e a rd a t ap r o c e s s i n g h i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得北京工业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 签名： 矗i 挺： 日期：坐：全：l 关于论文使用授权的说明 本人完全了解北京工业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部 分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 签名： 矗l 趣导师签名：豸经鎏轾，日期：丝堑：9 ：l 第1 章绪论 第1 章绪论 1 1 磁分离酶免疫分析测定仪概述 人体体液中的各种生化指标包括血糖、血脂、肝功、免疫球蛋白、内 分泌激素等【j 。当人体某些肌体组织发生病变时，病人体液中的生化指标 将会与正常人出现差异，医生参考这些生化指标确定病人病情。因此生化 指标的分析已成为现代医疗检测的重要手段，检测生化类指标的分析仪器 已经成为医疗机构临床诊断的必用仪器。光学分析方法具有灵敏度高、选 择性好、用途广等优点，在分析化学领域得到了广泛应用。利用分光光度 法进行定性和定量分析工作，具有分析精度高，分析速度快，分析试样用 量少，不会改变试样的物理和化学特性等优点，目前在医疗领域得到广泛 应用，实现这种分析方法的仪器一般都称为分光光度计。磁酶免分析测定 仪是基于物质对光的选择性吸收而开发的一种分析仪器。分光光度法是大 多数分析仪所采用的一种检测方法【5 4 l ，它基于朗伯一比尔定律基础之上建 立起来的一种常用的分析方法。其原理是：单色器将光源发出的复色光分 成单色光，特定波长的单色光通过盛有样品溶液的比色皿，单色光被吸收 的强度与样品溶液浓度和光通过的距离成正比，光电转换器将透射光转换 为电信号后经信号处理系统处理，得到样品溶液的浓度。原理图如图1 - l 所示。 比光 色电 池 叶 转 换 光源 图i - 1 分光光度计原理示意图 f i g u r e l 一1p r i n c i p l eo fs p e c t r o p h o t o m e t e rg r a p h 内分泌免疫分析作为生化分析的分支之一，同其他生化分析方法一样， 北京工业大学工学硕士学位论文 临床实验室检验方法历经手工操作、半自动分析和全自动分析过程。最初 是利用分光光度计系统，样品前处理、加样、清洗、温育、比色、数据处 理等操作都由人手工操作完成。在七十至八十年代，国内大量配备了6 5 5 、 7 2 1 等初级分光光度计，其使用极不方便，而且测量结果随意性大无法准 确地提供诊断数据。随着科学技术的不断发展，医疗机构需要检测速度更 快，自动化程度和精度更高的专门用于内分泌激素检验的分光光度计，即 磁分离酶免疫分析测定仪。按自动化程度分析仪可分为半自动和全自动酶 免疫分析仪。半自动磁分离酶免疫分析仪是采用比色杯，系统测量吸光度 以及激素浓度的计算、检验结果报告的打印都是自动完成的。半自动磁酶 免疫分析仪具有价廉及维护方便等优点，目前在国内得到广泛应用。全自 动磁酶免分析仪将样本处理过程中的取样、加试剂、混匀、温育反应、清 洗、检测及结果计算等步骤的部分或全都由仪器来完成，使一个分析项目 的全部或大部分过程按预定的程序自动完成，可对多个样品按统一方式连 续处理或对一个样品进行多个项目同时检测。 1 2 国内外发展状况 1 9 7 1 年e n g v a l l 和p e r l m a n n 建立了固相酶免疫测定方法( e l i s a ) i s - 1 0 】， 这种非放射标记免疫测定在临床检验特别是感染性疾病的诊断中取得了广 泛应用。但是仪器技术一直发展缓慢，长期使用纯手工方法检测。由于其 反应过程与一般的生化测定无异，因此后来使用生化分析仪进行直接测试。 上世纪八十年代才开始出现专用的测试仪器。进入九十年代后，随着科学 技术的发展，一些技术难题被攻克，各国都相继推出了种类繁多、性能优 良专业化的酶免分析测定仪。如美国s y v a 公司推出自动分析仪称为e t s ， 使用葡萄糖磷酸脱氢酶，敏感度为1 0 - 9 m o l l ，校正曲线为六点非线性曲 线，用分光光度法进行测定，在国外应用较广。德国宝灵曼、法国 b i o m e r i e u x 、罗氏公司、瑞士s e r o n o 、美国d y n e x 等公司都相继研制成功 酶免疫分析测试仪，并且经过不断的技术改进，在分析精度和检验速度等 方面不断提高，标记酶的种类也不断在增加，性能也越来越好。下面介绍 两种在国外具有代表性的产品：法国生物梅里埃公司的v i d a s 和罗氏公 司的c o b a sc o r ei i 自动分析仪【1 1 。13 1 。v i d a s 全自动酶免疫测定系统是由 法国生梅里埃公司生产的碱性磷酸酶标记抗原或抗体，用固相管作为固相 2 第1 章绪论 载体的管式固相酶免疫测定系统。它由检测系统和电脑数据处理系统组成。 检测系统有5 个测试仓，每个仓有6 个通道，用预防各种试剂条，互不干 扰，可同时进行不同项目的测试。每小时最多可进行9 0 个测试，急诊试验 和常规试验都可随到随作。它的全部测试过程在试剂条和固相管内进行， 无交叉污染。试剂条随用随取，有条形码识别系统，用于识别标记试剂条。 整个操作过程由电脑控制自动进行，是个很好的测定系统。罗氏公司于 1 9 9 5 年推出其改进型全自动酶免疫分析系统c o b a sc o r ei i ，具有1 8 个测 试通道，软件用户界面采用视窗n t 版本。c o b a sc o r ei i 是以聚苯乙烯小 珠为固相，将表面经过特殊处理的小珠包被抗原或抗体，再加入待测物经 过反应、清洗和显色反应后，显色反应液在6 5 0 n m 通过比色读取吸光度值， 换算成被测物浓度。c o b a sc o r ei i 采用了罗氏全自动生化分析系统特有的 三维进样和金标试剂的样品和试剂格架的方式，其特点是在仪器运行过程 中，不仅可以随机进样品，而且可以随机进试剂，随机改变上机的测定项 目。另外根据酶免在实际操作中的特殊要求，专门设计了精巧的机械部件 来全自动完成这些步骤。光学系统采用卤素灯，4 9 2 n m 和6 5 0 n m 双波长， 每小时最高输出1 5 0 个测试结果。当前酶免疫分析测定仪主要有两个发展 方向，一方面仪器向全自动大型化发展，一台仪器的功能越来越全，可完 成过一个甚至多个实验室的检测能力。另一方面向小型化半自动化发展， 操作越来越简便，价格也便宜，可满足大多数中小用户的需求。 目前我国使用的酶免仪器大都是半自动化产品，英文界面，基本都是 进口的，国内生产厂家不多。由于全自动产品系统结构复杂，涉及光、机、 电、算、液路、温控、酶免疫分析等多方面综合技术，酶免疫反应过程比 普通的生化反应过程复杂得多，控制时序要求严格，对运行可靠性和精度 要求高，再加上国内有些技术条件还不具备，短期内还不会有成功的研制。 因此国内的酶免疫分析测定仪的市场基本为国外公司所占领。 1 3 研究的内容、意义和论文的安排 1 3 1 课题来源及意义 近来随着医学的发展，医疗机构对免疫学指标检测的需求越来越迫切， 而已配备测试仪的医疗机构用的都是进1 2 1 仪器，国内企业大多做国外厂商 3 北京工业大学工学硕士学位论文 的代理，很少有自己开发和生产仪器的。而进口仪器人机对话界面都是英 文的，这对英文不熟悉的操作者来说比较吃力，因此必须加快研制国产新 型适用的酶免测试仪，这不仅可满足国内的需求，节省外汇，还可降低使 用单位的成本。国外厂商为追求高利润，主要精力放在全自动和高端仪器 的研发上，在半自动仪器方面生产和销售的仪器还是十来年前开发的，仪 器技术和功能都已落后于时代，因此研制新型半自动仪还有望超越国外厂 商占领国外市场，而且通过仪器的研制有助于全面了解和掌握酶免疫方法 学，为研制全自动仪器做好准备工作。本论文就是结合半自动磁分离酶联 免疫分析测定仪的研制与开发项目完成的，详细对开发过程予以论述。 1 3 。2 研究内容和论文安排 磁分离酶联免疫测试仪的研制涉及光学、电子、数学及计算机等学科， 仪器由硬件和软件两部分构成，硬件部分包括光路、光电传感器和电路等 部分，软件部分包括显示及人机对话部分，打印部分，数据采集部分和数 据处理部分以及管理维护等部分。本论文主要设计和实现了电路部分和软 件部分。仪器主要完成数据采集、对数据的分析处理、得出测量结果和报 告打印等功能。 本文共分5 章，第1 章是绪论，主要是介绍酶免测试仪的发展历史和 目前国内外酶免仪器的发展情况，并介绍课题的来源、意义及论文的安排； 第2 章介绍磁分离酶联免疫测试仪的工作原理和仪器的功能、结构；第3 章是仪器电路部分的设计，包括微处理电路和数据采集电路部分的设计； 第4 章是软件的设计和调试，主要完成仪器各功能软件的设计和调试；第 5 章实验和实验结果分析，通过对各个部分和整体进行针对性的实验，对 实验数据进行分析，达到总结和提高的作用：最后部分是结论，这是对整 个论文工作的总结。 4 第2 章磁分离酶联免疫测试仪原理 第2 章磁分离酶联免疫测试仪原理 2 1 酶免测试仪原理 酶免测试仪是属于光学式分析仪器，当前分光光度法是大多数生化类 分析所采用的对化学物质进行测定的方法。它是基于不同分子结构的物质 对光的选择性吸收而建立起来的方法，属于分子吸收光谱分析。本项目采 用分光光度法，它是以比尔定律为理论基础的。 2 1 1 比尔定律 分光光度法的依据是朗伯比尔定律1 4 以6 1 。朗伯比尔定律原理是当特定 波长的单色光通过溶液时，其吸收强度与溶质浓度和光通过的距离成正比。 布格( b o u g u e r ) 和朗伯( l a m b e r t ) 先后在1 7 2 9 年和1 7 6 0 年阐明光辐射强度 和吸收层厚度的关系，1 8 5 2 年比尔( b e e r ) 又提出光辐射强度和吸收物浓度 也具有类似的关系；布格朗伯比尔定律的数学表达式为： a = l o g ( 1 0 一l t ) = l o g ( 1 t ) = e b c ( 2 - 1 ) 其中： 彳一一光通过介质被介质吸收的吸光度 卜一透射光强与入射光强之比即透光率i “i o 厅一一入射光强度 j 卜_ 一透射光强度 p 一一介质摩尔吸光系数( m l m o l - 1 c m 1 ) r 一吸收物的摩尔浓度( m o m 1 ) b - - 一吸收层厚度( e r a ) 当待测样品是一种均匀分布的溶液，它与入射光的作用仅限于吸收过 程，而不会发生荧光、散射和光化学现象，并且在吸收过程中溶液各物质 无相互作用，各物质的吸光度具有加合性，这样的条件完全符合比尔定律。 其含义为：特定波长的单色光通过溶液时，单色光被吸收的强度与溶液中 吸收物浓度和光通过的距离成正比。此定律广泛的应用于紫外- 可见光一红 5 北京工业大学工学硕士学位论文 外光谱区吸收测量，实际应用时，研究吸收与物质浓度的关系更为重要， 因此在习惯上简称比尔定律。 当波长和吸收池光程一定时，透光率t 与浓度的函数关系用图表示， 可得到指数关系曲线，而吸光度与浓度成线性关系如图2 1 所示。由此可 见引入吸光度概念，对于用分光光度法做成分的定量测定极为方便，也便 于研究分光光度法的准确度和精密度。 t 皤) 图2 - 1 吸光度、透光率与浓度的关系 f i g u r e 2 1a b s o r b a n c ed i a p h a n e i t ya n dc o n c e n t r a t i o ng r a p h 应当注意的是，在公式中有一个摩尔吸光系数s ，它是一个与波长、 溶剂和温度有关的参数，而与吸收物质的浓度和吸收池的光程无关。只有 在 为常数时，溶液浓度与吸光度才呈线性关系。因此必须保证环境温度 的稳定。摩尔吸光系数直接用于比较已知分子量的不同物质的吸收。 2 1 2 磁分离酶免测试仪的测量原理 磁分离酶免测试仪采用三波长测定的方法，测试中采用碱性磷酸酶作 为酶标，反应产物为酚酞。酶联免疫反应结束时，液体显桃红色，因此磁 分离酶免测试仪是单色试样测试。根据光谱分析原理5 5 0 h m 波长对该颜色 变化吸收率最大，测得的吸光度最大。4 9 2 n m 波长对桃红色的吸收率是 5 5 0 h m 波长测定的五分之一。而且液体显色越深，对光的吸收率越大，甚 至会超过光度计的线性测定范围。标本浓度越高时，溶液的颜色就越深， 当超过5 5 0 h m 波长光电检测器的线性测定范围时，5 5 0 n m 波长就不能准确 测出它的吸光度，而此时4 9 2 n m 波长光电检测器还远没有超出线性测定范 6 第2 章磁分离酶联免疫测试仪原理 围，仍可以准确测定。将4 9 2 n m 波长测定结果乘以5 倍即相当于溶液在 5 5 0 n m 上的吸收率，使得仪器的吸光度测试范围达到1 0 以上，大大超过 一般分光光度计的测定范围。仪器选用的第三个波长是6 3 0 n t o ，显色溶液 在这个波长的光吸收率为零，是显色溶液的本底波长。由于仪器采用比色 杯测试，所以不同的形状、不同材料的比色杯，在光路系统测试中会对吸 收率产生不同的影响，同时擦痕、手印、小泡沫、液体污浊物等因素都会 对吸收率的测试产生影响。经研究，这些不良影响因素在很大光程范围内 都产生一样的光吸收率，不会呈现出峰值吸收特性，即在不同波长其吸光 度相同。如用6 3 0 h m 、5 5 0 n m 及4 9 2 n m 等波长测试时，所产生的影响都是 相同的，因此仪器的光路设计采用三波长同时测定。由于在5 5 0 n m 、4 9 2 n m 、 6 3 0 h m 三个波长上千扰因素产生的吸收率是一个等量，而溶液颜色在 6 3 0 n t o 波长吸收率是零，因此将5 5 0 h m 的吸收率减去6 3 0 h m 的吸收率， 其效果相当于减去了5 5 0 h m 光谱测试中杂物的影响。这样设计的光路消除 了干扰因素的影响，克服了大多数酶免测试仪都难以解决的缺点。本课题 仪器的光路采用了另一项独特设计，采用异形比色杯，然后用一个机械结 构控制比色杯的插入角度和方向，确保测试光程保持不变，从而保证了测 试的精确性和重复性。这样设计降低了对比色杯的要求，可以不使用专用 光学玻璃材料，在保证精度的同时降低了使用成本，有利于项目的推广。 2 2 磁分离酶免测试仪的组成 大多数分光光度计所用的波长范围是从3 4 0 h m 到8 0 0 n m ，属于紫外光 到可见光范围。典型的分光光度计是由光源、单色器、样品室、检测器及 信号放大处理等电子学系统组成，按光路结构的不同可分为前分光和后分 光类型，图2 2 采用的是前分光，即分光后再入射到比色杯。图2 3 采用 的是后分光，即光源发射的复合光先通过比色杯，然后再经单色器分光。 由于前分光式的分光光度计中是由单色光通过比色杯，所以没有其他波长 单色光的干扰。其缺点是不能同时完成多波长测试，而且测试速度慢。对 于后分光式的分光光度计，由于光先通过比色杯，再由单色器分光，所以 可同时完成多波长测试，测试速度快。本仪器的光度测量采用后分光技术， 光源发出的光经准直镜( 凸透镜) 产生平行光，经过比色杯，再由聚光镜将 光聚焦在入射孔上，经分光镜分光进入单色器，最后落在光电探测器上。 7 北京工业大学工学硕士学位论文 测量不同波长探测器的电流值，就可以知道当前比色杯中溶液对不同波长 的吸光度。 2 2 1 光源 作为磁分离酶免测试仪的光源应满足以下条件： 1 、在仪器的工作波段范围内提供连续辐射，即光源可以发射连续光谱， 以便于记录一个完全的吸收光谱； 2 、光源发射的辐射能量必须具有足够的强度，能量随波长的变化尽可 能小； 3 、具有较好的稳定性和有较长的使用寿命。 图2 - 2 前分光结构 f i g u r e 2 2f r o n t a lp r i s m a t i cg r a p h 图2 - 3 后分光结构 f i g u r e 2 - 3h i n d e rp r i s m a t i cg r a p h 本仪器光源选用溴钨灯，卤钨灯被广泛用作可见光谱的光源，这类灯 具有较大的发光强度和较长的使用寿命，符合本仪器的要求。卤钨灯是在 早先使用的钨灯基础上改进而成。钨灯在作为可见光源使用时，由于寿命 较短，因此在钨灯中加入卤素，卤素与蒸发到灯壁上的钨反应，生成气态 卤化物，它使灯壁保持透明；同时，生成的卤化物向灯泡中心扩散，在高 温区灯丝附近分解，抑制了钨的蒸发。这种卤钨灯在发光强度和使用寿命 方面都比普通钨灯大得多，因此得到广泛应用。 2 2 2 准直和聚焦装置 目前大多数分光光度计光路的准直和聚焦元件多采用具有消色差特 8 第2 章磁分离酶联免疫测试仪原理 性和聚焦性能好的球面透镜，这种透镜用玻璃或石英研磨而成，透光率高 而且比较耐用，使用这种元件组成光路结构简单，生产方便且成本低。 2 2 3 单色器 磁分离酶免测试仪采用的光源是发射宽波段范围的连续辐射，但是在 实际使用中希望采用单色光或窄带，这是由于采用窄带辐射才可能将彼此 非常接近的吸收带分开，采用窄带才可以在最大吸后波长处进行测试，从 而提高测量的灵敏度，在进行定量分析时，采用窄带才能更好的遵守比尔 定律。因此需要采用合适的器件将复合光分解为窄带或单色光，单色器就 是将光源辐射的复合光分解为所需波长的单色光的器件，单色器安装在不 透光的暗盒中。单色器可以使用棱镜和光栅，也可以使用滤光片来做。 本仪器使用滤光片1 1 7 d 8 】作为单色器，滤光片是一种简单而又廉价的波 长选择器，它的作用是选择性的透过一定波长范围的光。滤光片的滤光特 性用最大透光波长和谱带的半宽度来描述。最大透光波长是指在该波长处 辐射有最大透光率，谱带的半宽度是指最大透光率的一半处的谱带的波长 范围。谱带半宽度越小单色光的纯度越高。以下几种滤光片是比较常用的： 截止滤光片，这种滤光片使波段一侧的光能够全部或大部分透过，而 另一侧波段的光则不能透过或仅有极小一部分透过。在仪器中通常用于消 减杂散光或不需要的波长的光。 校正滤光片，又称为标准滤光片，这种滤光片用于校正分光光度计波 长标度和吸光度标度，用于校正波长标度的滤光片如钬玻璃滤光片；而用 于校正吸光度标度的滤光片是精密制造的，在特定波长具有恒定吸光度的 滤光片，因而又称为标准滤光片。 中性滤光片，又叫做中性密度滤光片，这种滤光片对一定范围的不同 波长的光具有相同的吸光度。将金属或碳黑浮于明胶中就可制成子宫性滤 光片，中性滤光片在仪器中一般用来使光束强度均匀减弱，作为衰减片用。 干涉滤光片，利用光的干涉原理以获得狭窄光谱谱带的器件，通常由 多块玻璃之间附着两层或多层金属膜构成，干涉滤光片的优点是透射光的 波长范围窄，透光率高，投射光的波长决定于各金属膜之间的距离，多层 干涉滤光片由5 层以上的膜组成，有效带宽可达8 r i m ，目前可制成紫外到 红外光谱区的各种光谱带的干涉滤光片。本项目采用干涉滤光片，由5 层 9 北京工业大学工学硕士学位论文 l l i 膜构成，具有较好的波长选择特性。 2 2 4 检测器 检测器的主要作用是当收到光的照射时，吸收光子能量后将之转化成 可测量的物理量，如光敏二极管的电流等。现在大多数检测器产生的都是 电流，检测器产生的信号与射入检测器的辐射能量有定量关系，检测器的 噪声是指没有输入时检测器产生的信号。一个性能优良的检测器应具备对 弱辐射能有较高灵敏度，产生的电信号易于放大，噪声低，对一定的波段 范围的辐射产生稳定而又快速的响应等特性。仪器常用的光电传感器【1 9 。2 】 主要是光电倍增管和硅光电池，下面就这两种光电传感器予以讨论。 光电倍增管是在普通光电管中引入具有二次电子发射特性的倍增电极 组合而成。当有辐射照射光阴极时，产生的电子受到第一级倍增电极正电 位作用，加速并撞击到该电极上，产生二次电子发射，这些电子在第二级 倍增电极作用下又被加速并撞击到阳极上，产生二次电子发射，这种状态 继续下去，经多级放大后的电子最后收集到阳极上。由于光倍增管的光电 流逐级倍增，所以适合弱辐射能的检测。光电倍增管对电源稳定度的要求 很高，光电倍增管不能守强光照射，否则电极疲劳，灵敏度下降。 硅光电池检测器是在硅片上形成的反向偏置的p n 结构成的，反向偏 置产生阻挡层，使结的导电性降低到接近于零。这种硅二极管n 区受到光 照射时，产生空穴和电子，空穴扩散通过阻挡层到达p 区后湮灭，由此引 起电子空穴对的产生和复合，导致导电性增强，其大小与光强成正比。本 仪器根据工作原理选用的是硅光电池，其灵敏度和线性范围完全可以满足 仪器的要求。 2 2 5 信号放大及处理系统 磁分离酶免仪器的信号放大及处理系统包括前置放大电路、数据处理 系统、结果显示打印等。光电传感器的输出信号非常弱，而且像光电倍增 管和硅光电池等传感器都是输出电流信号，所以前置放大电路要同时完成 小信号放大和电流与电压转换两项任务。放大后的信号经数模转换采样后 送入单片机进行处理计算，结果以打印和数显输出，采用打印显示时，吸 收方程图谱、测试和结果情况都可打印出来，从而提高了仪器的自动化水 平和测量精度。 l o 第2 章磁分离酶联免疫测试仪原理 2 3 酶免测试仪的性能指标 磁酶免测试仪的主要性能指标有以下各项：波长范围及精度、吸光度 测试的重复性、吸光度测试的精度和线性度及仪器测试的噪声等。 2 3 1 波长范围及波长精度 由2 1 2 节的介绍可知，使用磁分离酶免疫测试仪进行测定时需使用 5 5 0 n t o 、4 9 2 n m 、6 3 0 h m 三个波长，因此本仪器需要提供这三个波长的单 色光。波长精度是指仪器实际输出波长域所设计的波长参数的符合程度， 可以用两者之差来衡量其准确性。由于分光光度计定量分析测试依靠在一 定波长上测量吸收值来完成的，所以波长误差对吸光度测定精度影响较大。 根据生化测试的要求和本仪器的实践，波长相对误差在+ 2 n m 是可以接受 的，是可以满足免疫分析的要求。分光光度计的波长标定通常采用具有已 精确测定有准确波长值的发射线或吸收峰的基准物质。如采用低压汞灯的 发射线为基准扫描峰值波长来测定仪器的波长精度。 2 3 2 吸光度测试的重复性 仪器的吸光度测试重复性是指同一操作者在一次试验中连续重复测定 某一个吸收峰值的吸光度之差，该差值越小，说明仪器吸光度测试重复性 越好。本项目对吸光度重复性要求为： 1 ) 吸光度为o 1 0 3 时，标准差不大于o 0 8 ： 2 ) 吸光度为0 3 2 时，c v 2 。 其中标准差为测量值与均值误差的均方根；c v 值是标准差除以均值得 到的结果f 2 3 。5 1 。 2 3 3 吸光度测试的精度和线性度 吸光度测试的精度是指仪器在吸收峰值上读出的吸光度与已知真实的 吸光度之间的偏差，该偏差越小，说明吸光度测试精度越好。吸光度测试 线性度是指仪器测量系统对于比色溶液的吸收率与仪器的测定值之间符合 线性关系的程度，线性度越好，表明仪器越能准确反映测试溶液浓度的变 化。 要检验仪器的精度和线性度，就需要有标准样品。自分光光度计投入 北京工业大学工学硕士学位论文 1 1 | 使用以来，已出版了许多测定方法和参考标准，其中美国国家标准局出版 的刊物和文献中已给出了很多测试方法，得到应用较多的是滤光片法和标 准溶液法，本项目采用滤光片法。分光光度计中测得的吸光度是一个相对 值，采用适当的标准溶液，按一定的比例稀释成若干份不同浓度的测试液， 在选定的波长上逐份进行测定，可得到一组吸光度值，根据这组吸光度值 运算出的浓度值和标准浓度值的差值就可确定仪器的精度和线性度。本项 目对精度和线性度的要求是： 1 ) 吸光度为0 1 - 0 3 时，标准差不大于0 0 8 ； 2 ) 吸光度为0 3 2 时，c v 2 。 2 3 4 噪声 仪器测试的噪声是信号随时间无规则的变化。降低仪器的噪声主要方 法是减少整个接收放大系统的噪声水平，如选用高灵敏低噪音的传感器件， 选用低噪声的放大器及在线路设计中采用避免引入噪声的措施等。本仪器 对噪声的测试，主要是通过在一个小时内，每隔一个固定的时间就测试一 次同一个吸光度的样本，吸光度变化不大于o 0 8 即为可接受的水平。 2 4 本章小结 本章首先对仪器的工作原理和仪器的结构进行了讨论，并较详细的介 绍了仪器的光路，该光路具有结构简单、可靠稳定、调试简单方便等优点。 除此之外，对仪器的性能参数进行了探讨，根据系统的要求和同类仪器的 检测标准及有关技术文献，制定了本项目的参数要求。按照该参数要求设 计的仪器是完全可以满足实际需要的。 第3 章仪器电路的设计 第3 章仪器电路的设计 磁分离酶联免疫分析仪的仪器电路包括硅光电池输出信号放大电路、 波长选择电路、对数运算电路、a d 运算电路、控制电路、结果显示及打 印输出电路等。 图3 1 是磁分离酶联免疫分析仪的仪器电路的框图，光源发出的复色 光经过凸透镜准直后照射比色池中的被测样品，复色光中的某一波段的单 色光被样本溶液吸收，透射光经聚焦后，又经分光片分光进入滤光片被分 成单色光。硅光电池感受器将三个波长的光强信号转换成电流信号，电流 信号与照射到硅光电池的光强信号成正比。电流信号经信号放大电路转换 为电压信号，一个波长的电压信号作为参考信号输入对数电路，由微控制 器控制的模拟开关选择另两路波长信号中的一路输出信号进入对数电路与 参考信号进行对数运算后，经a d 转换后变成微控制器可以处理的数字信 号。图3 2 为数据采集电路原理图( 包括信号放大电路、波长选择电路、 a d 运算电路、对数运算电路和电源电路等) ，图3 8 为单片机电路原理图 ( 包括控制电路、结果显示及打印输出电路等) 。 图3 - 1 仪器电路框图 f i g u r e 3 1i n s t r u m e n t a lc i r c u i tg r a p h 1 3 北京工业大学工学硕士学位论文 图3 - 2 数据采集电路原理图 f i g u r e 3 2d a t ap r o c e s s i n gc i r c u i tg r a p h 3 1 前置放大电路 由于光电检测二极管输出的电流信号非常弱，需要将其放大并转换为 电压信号。由技术指标吸光度为1 a b s 时误差为2 ，吸光度为2 a b s 时误 差为2 ，后者对电子学系统要求更高。硅光电二极管的暗电流和前置放 大器的失调电流等都是影响分光测试仪性能指标的重要因素。若调节对数 放大器使之线性误差在2 以内，则得到在对数放大器前噪声、失调等误 差应在万分之四以内，实验测得在4 9 2 n m 时硅光二极管信号最弱，样品吸 光度为2 a b s 时信号为2 0 0 n a 左右。因此选择信号放大器的失调电流应为 2 0 0 h a 的万分之四，即8 0 p a 。前置放大电路的运算放大器【2 6 。8 1 经筛选最 终选择了a d 5 4 9 芯片2 9 d o i ，表3 1 比较详细的列出了其技术参数： 1 4 第3 章仪器电路的设计 表3 - ia d 5 4 9 技术指标 t a h i e 3 一la d 5 4 9c h a r a c t e r i s t i c m o d e la d 5 4 9 j a d 5 4 9 ka d 5 4 9 lu n i m i nt y pm a xm i nt y pm a x m i nt y pm a x t i n p u tb l a sc u r r e n t e i t h e rl n p u t , v m = 0 v 1 5 02 5 07 51 0 04 06 0f a e i t h e ri n p u t ，v c m = - j ：1 0 v 1 5 02 5 07 51 0 04 0 6 0 f a i n p u t0 f f s e t v o m g e o 51 o 0 1 5o 2 5 0 3o 5m v l n i t i a lo f r s c t 1 9o 4o 9m v o f f s e ta tt “ i n p u tv o l t a g e r a n o e 士2 0士2 0士2 0v d i f 证r e n t i a l - 1 0+ l o1 0+ l o1 0+ 1 0v c o m m o n m o d ev o l t a g e p o w e rs u p p l y r a t e dp e r f o r m a n c e 士1 5士1 5士1 5v o p e r a t i n g5士1 8士5士1 8士5士1 8v t e m p e r a t u r er a n g e o p e r a t i n g ， r a t e d0 + 7 00+ 7 00+ 7 0 p e r f o r m a n c es t o r a g e6 5+ 1 5 0- 6 5+ 1 5 06 5+ 1 5 0 a d 5 4 9 输入失调电流最大为2 5 0 f a ，具有高增益、高输入阻抗、低输 出阻抗等特性的精密运算放大器。信号放大电路原理图如图3 - 3 所示。 放大器接成反向放大器结构，这个结构是典型的将小电流信号转换成 能够测量的电压信号的负反馈电路结构，负反馈的主要作用是保证放大器 输出的稳定性，使其输出结果具有可测性。其原理是来自光电二极管的电 流信号i i 。输入到放大器的复输入端2 脚，由于出现“虚地”，输出端6 脚 的电压相当于r f 的电位差，根据欧姆定律，得 v 0 2 - l 零尸一l t 越 1 5 ( 3 - 1 ) 北京工业大学工学硕士学位论文 式中： 如一一输入电流 矗一一反馈电流 西一一反馈电阻 一一输出电压 图3 - 3 信号放大电路原理图 f i g u r e 3 3s i g n a lp r o c e s s i n gc i r c u i tg r a p h 因此放大器输出电压与输入电流成正比，由于r f 值可调节到很大，因 而可方便地测量微小电流。电容c 容量较小，用于滤除高频干扰。 3 2 对数运算电路 由比尔定律可知，特定波长的单色光通过溶液，其吸收强度与溶液浓 度和光通过的距离