草莓新microRNA的RT-PCR鉴定及二级结构预测本科毕业论文

编号（学号）：154040060 毕 业 论 文 （ 2015 届本科） 题 目： 草莓新microRNA的RT-PCR鉴定及二级结构预测 学 院： 园 艺 学 院 专 业： 园 艺 姓 名： 鲁 晓 峰 指导教师： 李 贺 副教授 完成日期： 2015年 6 月 15 日毕业论文(设计)任务书论文(设计)题目草莓新microRNA的RT-PCR鉴定及二级结构预测下发任务日期2014年5月学生姓名鲁晓峰指导教师李 贺 副教授一. 论文（设计）主要内容本试验采取幼嫩叶片、成熟叶、匍匐茎、花托、萼片、幼果等器官，用RT-PCR方法验证15个miRNA在草莓不同组织中的表达并预测二级结构。二.论文（设计）的基本要求1.有关资料的收集：要求尽量收集第一手资料，资料要真实、可靠、有代表性。2 资料的整理与分析：要求条理清晰，数据分析详尽。3 查阅相关文献：要求贴近主题，有参考价值。4 认真撰写论文，字数在10000字以上。三.论文（设计）工作进度安排阶段论文（设计）各阶段名称日期1查阅文献2014.5-2014.72试验方法学习2014.6-2014.83试验阶段2014.9-2014.114重复试验阶段2014.12-2015.45整理试验结果2015.4-2015.56撰写毕业论文2015.5-2015.6备注：四.应收集的资料及主要参考文献（指导教师指定）1. Li H, Mao WJ, Liu W, Dai HY, Liu YX, Ma Y, Zhang ZH. 2013. Deep sequencing discovery of novel and conserved microRNAs in wild type and a white -flesh mutant strawberry. Planta, 238(4): 695-713.2. Li B, Duan H, Li J, Deng XW, Yin W, Xia X. 2013. Global identification of miRNAs and targets in Populus euphratica under salt stress. Plant Molecular Biology, 81(6):525-539.3. Han J, Li AY, Liu H , Wang XC, Zhao MZ, Korir NB, Korir NK, Wang C, Fang JG. 2014. Computational identification of microRNAs in the strawberry (Fragariaananassa) genome sequence and validation of their precise sequences by miR-RACE. Gene, 536(3): 151-162.4. Ge AJ, Shangguan LF, Zhang X, Dong QH, Han J, Liu H, Wang XC, Fang JG. 2013. Deep sequencing discovery of novel and conserved microRNAs in strawberry (Fragariaananassa). Physiologia Plantarum, 148(3): 387-396. 5. Dong QH, Han J, Yu HP , Wang C, Zhao MZ , Liu H, Ge AJ, Fang JG. 2012. Computational identification of microRNAs in strawberry expressed sequence tags and validation of their precise sequences by miR-RACE. Journal of Heredity, 103(2): 268-277.6. Varkonyi-Gasic E,Hellens R P.Hellens.Quantitative stem-loop RT-PCR for detection of microRNAsJ.Methods Mol Biol ,2011,744:145-1577. Xu F, Liu Q, Chen L, Kuang J, Walk T, Wang J, Liao H. 2013. Genome-wide identification of soybean microRNAs and their targets reveals their organ-specificity and responses to phosphate starvation. BMC Genomics, 14: 66.沈阳农业大学毕业论文（设计）选题审批表选题名称草莓新microRNA的RT-PCR鉴定及二级结构预测题目来源导师科研课题学号154040060姓名鲁晓峰专业园艺指导教师李贺职称副教授研 究内 容本试验采取幼嫩叶片、成熟叶、匍匐茎、花托、萼片、幼果等器官，用RT-PCR方法验证15个miRNA在草莓不同组织中的表达并预测二级结构。研 究计 划12014年4-5月，收集相关文献资料。22014年6-10月，试验前期准备。32014年10月-2015年4月，进行试验。42015年5-6月，进行数据分析和论文写作等工作。特 色草莓新microRNA的RT-PCR鉴定及二级结构预测指 导 教 师 意 见教 研 室 意 见学 院 意 见毕业论文（设计）指导记录学生姓名鲁晓峰专业园艺指导教师姓名李贺职称副教授本年度指导毕业生人数3论文（设计）题目草莓新microRNA的RT-PCR鉴定及二级结构预测指 导 过 程时间地点指导内容2014年4-月2014年5月2014年6-10月2014年11-3月2015年4月2015年5月2015年6月园艺主楼553园艺主楼553园艺主楼553后山基地13-15号棚后山基地13-15号棚园艺主楼553园艺主楼553确定选题、收集相关资料文献调研与综述进行相关文献资料的查阅方法及分析试验前的准备工作，包括草莓取样等进行试验，包括实验数据的具体整理、分析方法及相关图表的制作方法毕业论文初稿的内容及格式等指导形成论文初稿提交论文与答辩准备学生签字：年 月 日 指导教师签字：年 月 日教研室主任签字：年 月 日沈阳农业大学毕业论文（设计）考核表论文题目：草莓新microRNA的RT-PCR鉴定及二级结构预测姓名：鲁晓峰 学号：154040060 专业：园艺指导教师评语：指导教师（签字）： 年 月 日评阅人评审意见： 评阅人（签字）： 年 月 日成绩： 答辩委员会意见：主任委员（签字）： 年 月 日注：答辩委员会意见除填写简要评语、给出成绩外，还要提出是否授予学位的建议。沈阳农业大学学士学位论文目录中文摘要（关键词）1外文摘要（关键词）21前言31.1植物miRNA研究进展31.2草莓miRNA研究进展51.3本课题研究目的及意义52材料与方法62.1 植物材料62.2 主要试剂62.3 试验方法62.3.1 草莓组织总RNA提取62.3.2 RNA的质量及纯度检测62.3.3 草莓新miRNA的RT-PCR验证73结果与分析93.1 RNA的质量及完整性93.2 RNA的含量与纯度93.3 RT-PCR检测结果104 讨论13参考文献14致 谢17摘要草莓（Fragariaananassa Duch）是蔷薇科草莓属植物。众多研究数据显示miRNAs在植物生长发育过程中有重要生物学功能。本文用RT-PCR方法验证15个miRNA在草莓不同组织中的表达，进而为研究miRNA功能奠定基础，主要研究结果如下：经过多次RT-PCR扩增，最终在草莓嫩叶中检测出11个新miRNA，分别是miR-5、miR-6、miR-10、miR-11、miR-12、miR-13、miR-14、miR-16、miR-21、miR-29及miR-33；在成熟叶中检测到8个新miRNA，分别是miR-6、miR-10、miR-11、miR-12、miR-13、miR-14、miR-16及miR-33；在匍匐茎中检测到10个新miRNA，分别是miR-6、miR-7、miR-10、miR-11、miR-12、miR-13、miR-14、miR-16、miR-29及miR-33；在萼片中检测到12个新miRNA，分别是miR-5、miR-6、miR-7、miR-10、miR-11、miR-12、miR-13、miR-14、miR-16、miR-21、miR-29及miR-33；在花托中检测到10个新miRNA，分别是miR-6、miR-7、miR-10、miR-11、miR-12、miR-13、miR-14、miR-16、miR-29及miR-33；在幼果中检测到11个新miRNA，分别是miR-5、miR-6、miR-7、miR-10、miR-11、miR-12、miR-13、miR-14、miR-16、miR-29及miR-33。其中，6种器官都检测出的新miRNA有miR-6、miR-10、miR-11、miR-12、miR-13、miR-14、miR-16及miR-33。经测序表明，PCR扩增片段大小为75 bp，与预期目的片段一致。预测了8个miRNA的二级结构，其中miR-6、miR-10、miR-12、miR-13、miR-14、miR-33预测到一种茎环结构，miR-11有两种茎环结构，miR-16有3种茎环结构。miR-10、miR-11、miR-12、miR-13、miR-16、miR-33的成熟miRNA序列在3 端臂上，miR-6、miR-14成熟miRNA序列在5 端臂上。关键字：草莓；RT-PCR；二级结构1沈阳农业大学学士学位论文AbstractStrawberry (Fragariaananassa Duch) belongs to Rosaceae Fragaria. Many data show that miRNAs played important biological role during plant growth and development. In this paper, expression of 15 miRNAs in different tissues in cultivated strawberry were detected by RT-PCR method, which were meaningful for the study of miRNA function，the main results were as follows:By RT-PCR method,11 new miRNA were detected in strawberry young leaves finally,they were miR-5、miR-6、miR-10、miR-11、miR-12、miR-13、miR-14、miR-16、miR-21、miR-29 and miR-33;8 new miRNA were detected in mature leaves,they were miR-6、miR-10、miR-11、miR-12、miR-13、miR-14、miR-16 and miR-33;10 new miRNA were detected in stolons,they were miR-6、miR-7、miR-10、miR-11、miR-12、miR-13、miR-14、miR-16、miR-29 and miR-33;12 new miRNA were detected in sepals,they were miR-5、miR-6、miR-7、miR-10、miR-11、miR-12、miR-13、miR-14、miR-16、miR-21、miR-29 and miR-33;10 new miRNA were detected in torus,they were miR-6、miR-7、miR-10、miR-11、miR-12、miR-13、miR-14、miR-16、miR-29 and miR-33;11 new miRNA were detected in young fruit,they were miR-5、miR-6、miR-7、miR-10、miR-11、miR-12、miR-13、miR-14、miR-16、miR-29 and miR-33.MiR-6、miR-10、miR-11、miR-12、miR-13、miR-14、miR-16 and miR-33 were detected in all 6 organs.Sequencing date show that all amplification fragments were 75 bp,which were consistent with we have predicted.Second structure of 8 miRNA were predicted by mfold software.And miR-6、miR-10、miR-12、miR-13、miR-14、miR-33 each have only one stem-loop structure,miR-11have two stem-loop structure,miR-16have three stem-loop structure.miR-10、miR-11、miR-12、miR-13、miR-16、miR-33 mature miRNA were on the 3 side arm;while miR-6、miR-14 were on 5 side arm.Keywords: Fragariaananassa; RT-PCR;Two stage structure11前言1.1植物木质素研究进展1.1.1植物木质素发现1838年法国化学家和植物学家Payen等研究人员证明了木材是由纤维素和另一种物质构成的，提示了木质素存在的可能。20世纪初Klasson木质素定量法的发明、木质素起源于松柏醇学说提出、30年代木质素模型物研究方法的开发、40年代木质素醇解试验以及50年代的脱氢聚合实验等研究工作取得了非常大的成绩，到1980年木质素的结构基本研究清楚。大量研究显示木质素发挥着重要作用，木质素是高等植物细胞壁的重要组成成分之一，主要由3种单体聚合而成，在植物细胞的防护、分化、促进植物体水分运输具有重要作用。目前已经在园艺植物番茄1，苹果2，模式植物拟南芥3、水稻4，其他高等植物如小麦5、苔藓植物小立碗藓6及蕨类植物7等中发现了大量的miRNA。随着miRNA的发现及鉴定方法的发展，截止到2014年6月，发现的miRNA数量已达35828种，来自223个不同类型的物种，登录在公开的miRBase序列数据库中(http:/www.,mirbase.,org/)。1.1.2 植物木质素代谢检测及功能研究策略植物miRNA的检测方法近年来，miRNA检测的方法层出不穷，其优点也是各有千秋。Northern blotting是基于固相探针杂交的一种检测特异性RNA的技术。在变性的条件下将待检的miRNA样品按照分子量大小通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，然后将分离的miRNA样品按照在电泳谱的相对固定位置进行转膜，再用DNA探针进行杂交检测，得到miRNA表达差异。miRNA芯片是一种方便快速且自动化程度高的检测miRNA表达差异的新技术，是一种高通量和高敏感的检测方法，其优势在于能快速地检测出与芯片上固定探针互补的miRNA以及这些不同miRNA的表达差异谱8。但由于早期的Northern 印记杂交与miRNA 芯片灵敏度低，耗样量大，易受外界因素影响等特点，逐渐被反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）及高通量测序代替。高通量测序技术是在传统直接克隆测序法基础上发展起来的，又称深度测序，是传统测序技术的一次变革，一次可以对几十万到几百万条DNA分子进行测序，也可以对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析。全基因组范围内小分子RNA测序能准确识别miRNA的种类及数量，还可以分析其表达量，近年来已广泛运用到miRNA识别及检测上9-10。如利用高通量测序技术在玉米11，大豆12-13，大麦14，亚麻15全基因范围内发现大量miRNA参与植物生长发育调控。高通量测序也广泛用来分析与生物及非生物胁迫应答有关的miRNA16-17。反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）是利用特异性茎环引物将RNA的反成cDNA，再结合聚合酶链式扩增（PCR）技术，电泳检测PCR产物以检测miRNA的表达。RT-PCR是检测miRNA表达的最常用方法，简洁、快速，能够实现相对定量，是实时定量及半定量的常用方法，在拟南芥上已成功得到运用18。 miRNA功能研究策略对于miRNA功能研究原理依据基因沉默，存在两个方面：一是通过靶基因的过表达或沉默检测miRNA的表达，二是通过miRNA的过表达或缺失研究植物表型。但通过靶基因表达研究miRNA功能还需依靠生物信息学分析预测靶基因。近年来，amiRNA介导基因沉默在分子生物学得到广泛运用，其原理也基于miRNA过表达，主要是通过构建人工miRNA表达载体，使miRNA过表达或缺失，干扰基因沉默过程。amiRNA过表达载体是利用天然miRNA前体为骨架骨架，将成熟的miRNA序列替换为可以靶向任一基因的反义序列（antisense sequence），但是对于miRNA缺失性研究不多，自然界里很少有其缺失突变体。此外，还可以构建 miRNA 基因的过表达载体，通过转基因的方法进行转化植物试材，过表达miRNA以验证功能，这种方法在易于转化的植物中应用较广泛19。1.1.3植物木质素的生物学功能大量研究表明，miRNA通过上调或下调靶基因表达水平参与植物激素分泌与信号转导，影响植物器官的形态建成、生长发育、以及植物对外界环境胁迫因素的应答能力。植物激素是由植物自身代谢产生的一类微量有机物，从产生部位转移到作用部位，在极低的浓度下就有明显的生理效应的活性物质,常见的植物激素有生长素，细胞分裂素，乙烯，脱落酸，赤霉素及油菜素甾醇20等，均是有机小分子化合物，但生理效应复杂多样，对植物生长发育有重要调控作用21。Marin等22-23在分析拟南芥miR390、TAS3a及ARF家族基因之间的具体调控模式时发现miR390与其靶基因以反馈调节模式在侧根发育中有特殊的作用，miR390与TAS3a共表达，产生大量tasiRNA，tasiRNA作用于ARF家族ARF2/3/4三个基因，通过维持ARFs在适度水平，使生长素的合成水平达到一种平衡，从而促进侧根发育。其他的ARF基因如ARF16，ARF17受miR160调控，与根冠形成有关，ARF6，ARF8是miR167的靶基因，与花药及胚珠的发育有关。保守的miR319家族可以调控一些植物激素合成，影响信号转导，从而调节叶、花等器官的生长发育24。miR159能够调控赤霉素合成，在植物细胞内起着第二信使的作用。Reyes等发现，MYB33和MYB101两个转录因子受miR159的调控，影响脱落酸的合成。植物不同发育时期及不同器官内都有相应的miRNA参与调控。miR390通过TAS3基因靶向ARFs基因而影响叶、花、根等器官极性形态建成，这种调控网络在侧根发育过程有特殊作用。关于miRNA与园艺植物果实发育研究较少，Li等人研究发现草莓幸香25白色果肉突变体中，miR399表达量比其野生型低很多，分析miR399可能与果实糖含量呈负相关，高通量测序发现在其野生型及白色果肉突变体中有9个新miRNA表达存在差异，初步预测其与果实生长发育有关26。miR1857可以调控番茄红素 -环化酶（LYCb）基因，其表达量差异将影响番茄红素的积累从而影响果实颜色30。自然中的植物有时受到虫害，病菌及病毒的侵害等，这类胁迫称为生物胁迫。除此之外，外界因素如冷、热、干旱、盐度、重金属及养分等也会影响植物正常生长发育，称为非生物胁迫。非生物及生物胁迫都会影响植物生长，进而影响植物经济效益及观赏价值。越来越多数据显示，miRNA在参与各类生物及非生物胁迫应答中发挥重要作用。miR169在干旱条件下调控自身表达使植物适应不利环境27。张金梅等28对柑橘叶片进行4冷处理0.5h后，miR156、miR167a、miR167d及miR171表达都有上升趋势，随后mi156，miR171表达上调，miR167a与miR167d表达先上调，然后回升，两周后呈下降趋势，初步分析这四种miRNA与柑橘冷胁迫响应机制有关。病菌及病毒侵染是影响园艺植物产量及观赏价值的重要因子，研究miRNA与植物抗病害作用机制对于园艺产业的发展有重要理论意义。本课题组发现草莓微繁殖苗对白粉病抗性比普通苗低，同时miR390的表达量也大幅度下降，实时定量RT-PCR检测白粉病抗性强品种miR390表达量，结果显示它比白粉病抗性低的品种的表达量高出很多，miR390与靶基因TAS3差异表达分析显示miR390正调控TAS3表达，而在2005年，Allen等人已发现miR390间接调控ARF2/3/4的表达，所以推测草莓miR390也通过TAS3基因负调控ARF基因影响草莓对白粉病的抗性29。1.2草莓miRNA研究进展目前，国内外关于草莓miRNA的研究报道并不多，miRBase数据库中注册了大量园艺植物miRNA，如番木瓜（Carica papaya）81个，甘蓝（Brassica oleracea）11个，番茄（Solanum lycopersicum）110个，葡萄（Vitis vinifera）186个，苹果（Malus domestica）207个等，但是草莓的几乎没有，2009年以后miRNA研究进程迅速。李贺30用miRNA基因芯片技术，在栽培草莓丰香植株内检测到74个miRNA，其中有46个miRNA来自miRNA数据库，属于21个家族；Dong等31分析了森林草莓EST（序列标签）47890个序列，计算机识别出11个候选miRNA，来自5个家族，通过特异性5及3 miRNA RACE PCR和序列直接克隆法分析了栽培草莓甜查理（Sweet Charlie）5个候选miRNA（miR156a、miR159a、miR398、miR858及miR408a）精确序列，qRT-PCR发现它们在草莓生长期不同器官与组织中表达存在差异；Ge等32高通量测序检测出甜查理草莓153个已知miRNA及37个新miRNA，靶基因预测数据显示它们在生长发育及病害防御方面有重要作用；Han等33对森林草莓序列进行精确分析，预测出59个新miRNA，属于40个家族，特异性5及3 miRNA RACE PCR和序列直接克隆法在甜查理草莓中分析出34个miRNA精确序列，其中16个未见报道，qRT-PCR数据显示它们根、叶、茎、花、果实中表达存在差异，靶基因分析数据也显示它们与草莓生长发育有重要关系。草莓果实品质是影响草莓产业发展的重要因素，但是关于miRNA与果实发育及成熟的研究是有限的。草莓果实由瘦果及花托两部分构成，Nitsch34发现果实早期发育阶段，生长素能够促进瘦果及花托生长，Manning35检测到绿果期生长素在两者中达到峰值，随着果实成熟而下降。Li等人36研究发现草莓幸香白色果肉突变体中，miR399表达量比其野生型低很多，分析miR399可能与果实糖含量呈负相关，高通量测序发现在其野生型及白色果肉突变体中有9个新miRNA表达存在差异，初步预测其与果实生长发育有关。相对于模式植物拟南芥及水稻来说，草莓miRNA研究仍有很大发展空间，因此基于分子生物学理论的草莓育种及草莓果实生长发育研究前景广阔，对今后的草莓产业发展有重要指导意义。1.3本课题研究目的及意义草莓是蔷薇科草莓属植物。草莓果实风味酸甜，汁液多，外观漂亮，因而引起广大人们的青睐，栽培面积越来越广，因此草莓果实品质是影响草莓产业发展的重要因素，但是关于草莓miRNA的研究并不多。Shulaev等37对森林草莓（Fragaria vesca）基因组进行测序，现已被用作分子生物学和基因组研究的模型物种。Li等38利用高通量测序技术在幸香野生型及白色果肉突变体草莓中鉴定出来自27个家族的120个保守miRNA，33个新miRNA，其中9个新miRNA在两者中表达有差异，预测它们可能在草莓果实生长发育中起重要调控作用。本课题旨在用RT-PCR方法选择验证15个新miRNA在栽培草莓不同组织中的表达，进而可以对miRNA功能进行深入研究，预测二级结构，为以后草莓育种及丰产奠定基础。52材料与方法2.1 植物材料 植物试材：栽培草莓（F.ananassa）艳丽，栽培于沈阳农业大学草莓试验基地，常规栽培管理。采取幼嫩叶片、成熟叶、匍匐茎、花托、萼片、幼果等器官，液氮速冻后存于沈阳农业大学果树学科分子生物学实验室超低温冰箱中。2.2 主要试剂RNase-free DNase I（5 L-1）、RNase Inhibitor（40 L-1）、dNTPs（2.5 mmolL-1、10 mmolL-1）、AMV（5 L-1）、Ex Taq DNA聚合酶（5 L-1）、10Loading Buffer、Random 9 mers及Oligo d（T）18均购自TaKaRa公司；50bp Ladder DNA marker 购自北京天根生物技术有限公司。其它药品为国产分析纯。2.3 试验方法2.3.1 草莓组织总RNA提取参照Chang等(2009)的CTAB法，稍加改良后提取草莓组织。 1) 预热2% CTAB提取缓冲液600 L（2% CTAB 588 L，-巯基乙醇12 L）。2) 取草莓组织（约0.1 g）在液氮中研碎，迅速移入1.5 mL离心管中。加入预热的RNA提取缓冲液，65C水浴锅中保温20min（幼果15min），期间用力摇匀几次。3) 加入600 L 氯仿，用力摇匀5 min，10000 rpm离心10 min。4) 取上清液（约450 L）移入新的离心管，加入等体积的氯仿抽提，用力摇匀5 min，10000 rpm离心10 min。5) 取上清液（约300 L）移入新的离心管，加入1/4体积的10 M LiCl（75 L），颠倒混匀，-20C放置1 h（可过夜），10000 rpm离心10 min。6) 弃上清，加入360 L DEPC水，沉淀溶解后10000 rpm离心10 min。取出300L移入新的离心管，加入1 L RNase Inhibitor，Buffer 10 L，4 L RNase-free DNase I，轻轻混匀后于37C水浴4 h。7) 加入315 L氯仿，用力摇匀5 min，10000 rpm离心10 min。8) 取上清液（约200 L）加入1/10体积的3 M NaAc（pH =5.2，20 L），2.5倍体积冰冷的无水乙醇（-20 C存放，550 L），颠倒几次，混匀后20C放置30 min，10000 rpm离心10 min。9) 弃上清，用无水乙醇洗涤沉淀1次，在超净工作台上风干RNA 1 min，加入30 L DEPC水溶解沉淀备用。2.3.2 RNA的质量及纯度检测取1 L RNA 提取样品，加入10Loading Buffer 2 L。混匀后，用含EB（0.5 gmL-1）的1.0%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性。用核酸蛋白分析仪检测RNA 含量和质量，操作如下：先用超纯水调零，取1 L RNA 提取样品，然后将待测样品转入比色杯中，读取OD260 及OD260 / OD280 的两项数值。根据OD260值计算RNA含量，OD260 / OD280 比值代表核酸的纯度。OD260 / OD280 值在1.92.1之间时说明RNA提取样品纯度较好；OD260 / OD280 值小于1.8时说明RNA提取样品中蛋白杂质较多；OD260 / OD280 值大于2.2时说明RNA提取样品已经降解；OD260 / OD280 值小于2.0时说明RNA提取样品中有-巯基乙醇的残留。RNA 的终浓度为（gmL -1）=OD260稀释倍数40 gmL-1。2.3.3 草莓新miRNA的RT-PCR验证1）RT反应参照Lu等（2005）与Chen等（2005）的引物设计原则及方式，自行设计15种新miRNA的RT及PCR引物，委托于TaKaRa公司合成，引物序列见下表。反应在0.2 mL小PCR管中进行，体系如下： RNA5.0 L DEPC水7.0 L dNTP(10 mmolL-1)1.0 L RT引物1.0 L 混匀后65 变性5min，之后迅速置于冰上，继续加入： RNase Inhibitor1.0 L 5AMV Buffer4.0 L AMV反转录酶1.0 L 总体系20.0 L执行以下程序：16 30 min；20 30 s，42 30 s，50 1 s，60个循环；85 反应10 min 结束，最后4 保存。2） PCR反应反应程序如下： cDNA1.0 L dNTP(2.5 mmolL-1)1.0 L PCR 正义引物1.6 L PCR 反义引物1.6 L Ex Taq Buffer2.0 L Ex Taq 酶0.2 L 超纯水12.6 L 总体系20.0 L执行以下程序：95 10 min；55 2 min；95 1 s，65 1 min，35个循环；72 延伸5 min 结束，最后4 保存。PCR产物中加入10Loading Buffer 2 L，用2.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，条带与50 bp DNA Ladder Marker对照，紫外灯下观察拍照。表1 采用茎环引物鉴定miRNA的引物序列Table 1 Stem-loop RT primers and PCR primers for identifing miRNAs 名称序列（53）nameSequence(5 to 3)Fan-miR- 1stem-loop RT primerctcaactggttcgtggagtccggcaattcagttgagtccgccgaPCR primerForward: acactccagctgggcggaaactgg Fan-miR- 3stem-loop RT primerctcaactggtgtcgtggagtccggcaattcagttgagccgccaaaPCR primerForward: acactccagctgggcggaaaactgFan-miR- 4stem-loop RT primerctcaactggtgtcgtggaggtccggcaattcagttgagaatgcttcPCR primerForward: acactccagctgggtattggcagaFan-miR- 5stem-loop RT primerctcaactggtgtcgtggagtccggcaattcagttgagccgccgaaPCR primerForward: acactccagctgggcgaaaaactg Fan-miR- 6stem-loop RT primerctcaactggtgtcgtggagtccggcaattcagttgaggagcctttPCR primerForward: acactccagctgggttcgtgatct Fan-miR- 7stem-loop RT primerctcaactggtgtcgtggagtccggcaattcagttgaggccgccgaPCR primerForward: acactccagctgggcggaaactga Fan-miR- 10stem-loop RT primerctcaactggtgtcgtggagtccggcaattcagttgagatgctagtPCR primerForward: acactccagctgggcaggttgtga Fan-miR- 11stem-loop RT primeratcaactggtgtcgtggaggtccggcaattcagttgagccgccaaaPCR primerForward: acactccagctgggcggaaaacta Fan-miR- 12stem-loop RT primerctcaactggtgtcgtggagtccggcaattcagttgagttcgccaaPCR primerForward: acactccagctgggtttgaagtgg Fan-miR- 13stem-loop RT primerctcaactggtgtcgtggagtccggcaattcagttgagaagctagtPCR primerForward: acactccagctgggtgaacttatt Fan-miR- 14stem-loop RT primerctcaactggtgtcgtggagtccggcaattcagttgagaacagtcaPCR primerForward: acactccagctgggtctattcaaa Fan-miR- 16stem-loop RT primerctcaactggtgtcgtggagtccggcaattcagttgagccgccgaaPCR primerForward: acactccagctgggaggaaaactg Fan-miR- 21stem-loop RT primeratcaactggtgtcgtggaggtccggcaattcagttgagatccaactPCR primerForward: acactccagctgggaacaacaaga Fan-miR- 29stem-loop RT primeratcaactggtgtcgtggaggtccggcaattcagttgagctttgcggPCR primerForward: acactccagctgggtggaaaaaga Fan-miR- 33stem-loop RT primerctcaactggtgtcgtggagtccggcaattcagttgagatgccgatPCR primerForward: acactccagctgggtcatccaaca miR#universal reverse primer aactggtgtcgtggag3结果与分析 3.1 RNA的质量及完整性利用改良后的CTAB法成功提取了草莓幼嫩叶片、成熟叶片、匍匐茎、萼片、花托及幼果的RNA。经过酶解、多次抽提及洗涤后最终的RNA沉淀呈无色透明状态，溶于DEPC水后溶液无色透明，用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，结果如图1所示，完整的RNA电泳结果图呈现两条亮带，上面一条为28S带，下方的为18S带，两条带清晰明亮，28S带亮度为18S带的1.52.0倍，图中不包含DNA带（28S上方），最下方没有5S带，点样孔处干净，没有残留物质，说明RNA样品中没有残留DNA及其他蛋白、糖类杂质，没有降解。图1 草莓不同组织总RNA电泳图16分别代表：嫩叶，成熟叶，匍匐茎，萼片，花托，幼果Fig.1 The electrophoresis of total RNA extracted from different tissue in strawberry16: Represent Young leaves, Mature leaves, Stolons, Sepal, Torus, Young fruit, respectively3.2 RNA的含量与纯度取RNA样品1L检测RNA 含量与纯度，使用核酸蛋白分析仪分析检测样品浓度曲线，浓度高峰在260附近，证明RNA浓度与纯度好。读取OD260，OD280，OD260/OD280，OD260/OD230的数值，然后计算RNA的终浓度，根据OD260/OD280数值进一步评价RNA纯度。结果如表1所示，OD260/OD280 比值均在2.0左右，OD260/OD230 在2.212.25之间，说明RNA纯度较好，可以继续进行下一步实验。 表1 草莓RNA浓度和OD260/OD280比值Table 1 The concentration and OD260/OD280 value of RNA extracted from strawberry 样品SampleOD260OD280OD260/OD280OD260/OD230RNA浓度(ng/L)Concentration of RNA120.23010.2032.012.25808.1219.5939.7862.002.23783.7314.0846.9922.012.25563.3411.7745.8892.002.25471.3536.66518.1532.022.221466.6627.24013.5612.012.211089.63.3 RT-PCR检测结果经过多次RT-PCR扩增，最终在草莓嫩叶中检测出11个新miRNA，分别是miR-5、miR-6、miR-10、miR-11、miR-12、miR-13、miR-14、miR-16、miR-21、miR-29及miR-33，但miR-5与miR-21含非特异性条带。在成熟叶中检测到8个新miRNA，分别是miR-6、miR-10、miR-11、miR-12、miR-13、miR-14、miR-16及miR-33，而miR-16含非特异性条带。在匍匐茎中检测到10个新miRNA，分别是miR-6、miR-7、miR-10、miR-11、miR-12、miR-13、miR-14、miR-16、miR-29及miR-33，并且miR-13含非特异性条带。在萼片中检测到12个新miRNA，分别是miR-5、miR-6、miR-7、miR-10、miR-11、miR-12、miR-13、miR-14、miR-16、miR-21、miR-29及miR-33，其中miR-5、miR-7、miR-13及miR-21含非特异性条带。在花托中检测到10个新miRNA，分别是miR-6、miR-7、miR-10、miR-11、miR-12、miR-13、miR-14、miR-16、miR-29及miR-33。在幼果中检测到11个新miRNA，分别是miR-5、miR-6、miR-7、miR-10、miR-11、miR-12、miR-13、miR-14、miR-16、miR-29及miR-33，而miR-5含非特异性条带。各扩增产物条带的亮暗可能与相应miRNA的表达量有关系。其中，6种器官都检测出的新miRNA有miR-6、miR-10、miR-11、miR-12、miR-13、miR-14、miR-16及miR-33。经测序表明，PCR扩增片段大小为75 bp，与预期目的片段一致（图2）。图2 新miRNA在草莓不同组织表达检测结果图A：嫩