病原生物学.pdf

病原生物学 病原生物学 实 验 指 导 实 验 指 导 上海交通大学医学院 病原生物学教学实验室 2006.1 上海交通大学医学院 病原生物学教学实验室 2006.1 2 目 录 目 录 第一部分 医学微生物学实验 第一部分 医学微生物学实验 微生物学实验的目的与要求4 微生物实验室生物安全与规则5 实验一 细菌的形态与结构7 实验二 细菌的形态及外界因素对细菌的影响14 实验三 细菌的变异性29 实验四 细菌的致病性与宿主天然免疫力32 实验五 病原性球菌36 实验六 肠道杆菌42 实验七 厌氧性细菌46 实验八 棒状杆菌与分枝杆菌50 实验九 其他微生物52 实验十 病毒的形态学诊断和培养方法 58 实验十一 病毒的血清学试验68 第二部分 人体寄生虫学实验 第二部分 人体寄生虫学实验 实验注意事项76 人体寄生虫标本类别77 人体寄生虫感染诊断方法78 线虫 似蚓蛔线虫（蛔虫）79 十二指肠钩口线虫和美洲板口线虫（钩虫）81 蠕形住肠线虫（蛲虫）84 毛首鞭形线虫（鞭虫）85 3 班氏吴策线虫和马来布鲁线虫（丝虫）86 旋毛形线虫（旋毛虫）88 粪类圆线虫89 吸虫 华枝睾吸虫（肝吸虫）90 布氏姜片吸虫（姜片虫）92 卫氏并殖吸虫（肺吸虫）93 日本裂体吸虫（日本血吸虫）及其它血吸虫95 绦虫 链状带绦虫（猪带绦虫）和肥胖带绦虫（牛带绦虫）99 细粒棘球绦虫（包生绦虫）101 多房棘球绦虫101 微小膜壳绦虫（短膜壳绦虫）102 曼氏迭宫绦虫103 原虫 溶组织内阿米巴（痢疾阿米巴）104 蓝氏贾第鞭毛虫106 阴道毛滴虫107 疟原虫108 杜氏利什曼原虫111 刚地弓形虫112 微小隐孢子虫113 医学昆虫114 附录 常见人体寄生虫的致病及其实验诊断方法117 人体常见寄生虫卵的鉴别119 4 复习思考题120 第一部分 医学微生物学实验 第一部分 医学微生物学实验 微生物学实验目的与要求 微生物学实验目的与要求 实验课是医学微生物学教学过程中的重要环节。 医学微生物学实验的目的，在于使学生加深和巩固对讲课内容的理解和体会， 并在掌握系统理论知识的基础上，使学生学会及掌握医学微生物学的基本操作，为 今后有关疾病的检查，传染病诊断与科学研究打下良好基础。 实验形式基本上分为教师示教、学生自己操作及录像教学三种示教主要引证 理论，使学生对有关理论能有感性认识和更深入的理解；操作则通过对各项实验的 具体实践和反复练习，使学生能较熟悉地掌握涂片染色、分离接种，稀释方法等基 本操作技能，录像教学则为上述两方面的充实和补足，并可开拓学生视野。 在微生物学整个实验过程中，应严格贯彻“无菌概念”的培养和训练。 为了提高实验课的效果，要求学生在实验前后做到下列数点： 1每次实验前务必作好复习，明确实验目的、内容、操作中注意点及其理论依 据等，避免或减少错误的发生。 2在实验过程中，要坚持严肃性、严格性与严密性。对操作的实验，应遵照实 验指导所列步骤，依次进行，边操作边进行积极思考；对示教的实验也要仔细观察， 并联系有关理论；对录像要认真地看和听，把握其主要内容、操作流程及某些重要 细节。实验中亦须注意科学地分配和运用时间。 3实验结果必须真实地记录下来，然后进行分析，得出结论。遇有和理论不符 的结果时，应尽量探讨其原因，训练自己的科学思维能力，实验完成后，要写出实 验报告。 5 微生物实验室生物安全与规则 微生物实验室生物安全与规则 生物安全是指人们对有动物、植物、微生物，尤其是微生物等生物体给人类和 自然环境可能造成不安的防范。其主要包括科学研究、科学开发生产和应用中，经 遗传修饰的生物体和危险的病原体等可能对人类的健康、 生存环境造成的危害等等。 一、实验室生物安全的重要性 一、实验室生物安全的重要性 人类自从发现微生物以来，在诊断和实验研究中被微生物感染的病例就时有 报道，而就此丧身的也大有人在，就是知名的细菌学家也难例外（如研究立克次体 的美国科学家 Richetts、发现黄热病病毒的日本学者野口） 。 尤其是近年来，随着生物、医疗、卫生事业的迅速发展，在科研工作，生产 等工作中，危险生物等对人类的健康、生存环境造成的危害问题也日益突出，如在 病原体研究方面，近年来实验室获得性感染事件时有发生，多达几千例，同时，工 作人员的病原微生物感染率要比普通人群高 5-7 倍。在 SARS 研究中，新加坡、我国 台湾省及北京中国疾病预防控制中心病毒研究所 SARS 病毒的泄漏或处置不当造成 了严重的后果。所有这一切，使我们认识到加强生物安全（即加强采取避免危险生 物因子造成实验室人员暴露、向实验室外扩散并导致危害的综合措施）的重要性。 同时，也引起了我国有关部门的高度重视，为了加强和规范这方面的工作，国家质 量监督检验检疫总局于 2004 年发布了二个重要的国家标准，即 GB 194892004 实 验室生物安全通用要求和 GB 503462004 生物安全实验室建筑技术规范，并分别 于 2004 年 10 月和 2004 年 9 月开始实施。 二、微生物学实验室规则 二、微生物学实验室规则 在进行微生物学实验时，必需遵守实验室生物安全通用要求，因此，进实验必 须遵循下列规则： (一)书包、衣物等勿放在实验台上，必须的文具、实验指导、笔记等亦要和操 作部位远离。 (二)进实验室穿上实习衣，离室时脱下，要反折。 (三)实验室内要保持安静、有秩序，不得高声谈话或随便走动，以免影响他人 实验。 (四)实验室内禁止饮食，吸烟和用嘴湿润钢笔或标签等，也不要以手抚摸头、 面等部位。 (五)若发生割破手指等事故，应立即报告指导教师，进行预防处理。 1 皮肤破伤： 先除尽异物， 用蒸馏水或生理盐水洗净后， 涂以碘酒或消毒酒精。 2烧伤：涂以凡士林油、5鞣酸或 2%苦味酸。 6 3菌液流洒桌面：倾倒适量碘伏或新洁而灭等消毒剂于污染桌面，让其浸泡数 分钟后抹去。若手上沽有活菌。亦应用上述消毒液消毒，再以肥皂及水洗刷之。 6严防火灾：如发生火灾苗子应沉着处理，切勿慌张，立即关闭电闸、煤气阀 门；如系酒精、乙醚、汽抽等火种，切忌用水，可撒泼大量沙土等扑灭火苗。 (六)吸过菌液的吸管、毛细滴管、用过的玻片等，要投入指定的含有消毒剂的 容器中，不得放在桌上，亦不可冲洗于水槽内。待消毒或废弃物品必须放在指定地 点。 (七)爱护公物，节约使用实验材料。器材如有损坏，应立即向指导教师报告， 听候处理。 (八)实验完毕，整理桌面，需培养的物品要放人孵育箱；打扫干净实验室；关 好水电煤气等；洗手后离室。 7 实验一实验一 细菌的形态与结构细菌的形态与结构 细菌是微生物中种类繁多、分布广泛的一类单细胞原核生物。细菌细胞的结构 除细胞核处基本上与高等植物细胞构造相似。具有细胞壁及原生质，原生质是由胞 浆、胞浆膜、核质所组成。有些细菌还具有鞭毛、荚膜、芽胞、菌毛等特殊结构。 在通常情况下细菌的形态可分为球菌、 杆菌、 螺菌(或弧菌)三类。 细菌的体积很微小， 以微米(m)作为测量单位。各类细菌菌体大小不一。化脓性球菌的直径一般在 0.81.2m；肠道杆菌为 23m0.51m；弧菌约为 13m0.30.6m。当 细菌所处的环境条件发生改变时，细菌的形态和大小等特点均可能发生变化。 由于细菌的体积微小，而且无色透明，因此，在细菌的形态学过程中，必须借 助于显微镜以及适当的染色，才能比较清楚地进行观察。 目目 的的 （）熟悉细菌的基本形态和特殊结构的镜下特点。 （二）掌握无菌操作、油镜使用方法、革兰染色法并了解其在医学实践中的意义。 内内 容容 （一）光学显微镜的构造及应用（复习） （二）观察细菌各种形态及特殊结构的染色玻片（示教） （三）革兰(Gram)染色法（操作） 一、 普通光学显微镜 显微镜是研究微生物学的重要工具之一，根据不同的研究目的和要求，分别选 用普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜或电子显微镜等，在 细菌形态研究方面，以普通光学显微镜（简称显微镜）最为常用。 （一）显微镜的构造（图 1） 显微镜的构造分为光学和机械两部分。 1光学部分 （1）接物镜：该镜头下端接近被检物体，为显微镜上的主要光学装置。由多块 透镜组成。一般显微镜具有 34 个接物镜，分成干燥系和油镜两组：干燥系又按放 大倍数分为低倍镜和高倍镜。各接物镜放大率由其外形辨认，镜头长度越大，镜片 口径越小，放大倍数愈大；反之，放大倍数愈小。油镜头的下缘，一般刻有一圈黑 线。此外，各接物镜上刻有其它标志，如低倍镜：10(放大倍数)，N.A. (numerical aperure，孔径数)0.25；高倍镜：40，N.A. 0.65;油镜：100，N.A. 1. 30。 （2）接目镜：重要的光学部分之一，安装在镜筒上端，和镜检者的眼腈接近。 接目镜由二块透镜组成，其上刻有放大倍数，常用的为 5（5 倍） 、10（10 倍） 8 和 15（15 倍） 。为便于指出物象，常在镜中装黑色细丝一条，作为指针。 （3）集光器：位于载物台下方的次台上，由数个透镜组成。能上下移动，调节 并集聚由反光镜反射来的光线，使集中于载物玻片上。 （4）反光镜：装在显微镜的最下方，有平凹两面，可自由转动方向，将光线反 至集光器。 2机械部分 （1）镜筒：在显微镜前方，是一个金属制的空心圆筒，光线可从此通过。 （2）镜臂：在镜筒后面，呈圆弧形。便于显微镜搬移，并为将镜筒倾斜时的握 持部。 （3）镜座：是显微镜的底邰，呈马蹄形用以支持全镜。 （4） 回转板； 装在镜筒下端， 有 34 个圆孔， 供安装不同放大率的接物镜之用， 根据需要，回转板可以转动，借以调换物镜。 （5）倾斜关节：介于镜臂和镜座间，为镜筒作前后变位的支持点。 （6）调节器：在镜台后方两侧、分粗细两种。粗调节器在镜与镜臂之间，可使 镜筒较大距离地升降。细调节器位于粗调节器下方，可以精确地调节距离；每转一 周，可使镜筒升降 100m；有的在细调节器螺旋上附有刻度，每一小格刻度相当于 2m。 （7）载物台(镜台)： 在镜筒下方， 呈方形或圆形， 用以载放被检物体。 中央有孔， 可以透光。台上装有一副弹簧夹，镜检时可以固定标本片。有的载物台上装有标本 推进器，捻转螺旋，能使标本前后左右移动。 （8）光圈(虹彩)：在集光器下方，可以任意开闭，用以调节射入集光线的多寡。 （9）次台：位于鼓物台下，供安装集光器及光圈用。 (二)显镜镜的使用法 1使用显微镜时，必须端坐，凳和桌的高低要配合适宜。显微镜应直立桌上， 勿将镜臂弯曲。因在微生物学实验时，大多使用油镜或直接检查不染色的活菌悬液。 图 1-1 普通光学显微镜 接目镜接目镜 镜臂镜臂 调节器调节器 载物台载物台 镜座镜座 镜筒镜筒 回转板回转板 接物镜接物镜 反光镜反光镜 集光器集光器 光圈光圈 支柱支柱 9 若载物台倾斜，油滴或菌液将流溢，影响观察或造成污染。 2显微镜不能采用直接阳光作光源，因其光线过强，不易看清；且反射热有损 光学装置，以间接日光为佳。在光线灰暗的白昼或夜晚，可采用青色或蓝色灯光， 应在集光器下加放一块蓝色玻璃片，或在灯光和显微镜间置一盛有蓝色硫酸钢溶液 和球形烧瓶，以滤去黄光。以天然光为光源时，用反射镜的平面，采用人工灯光时， 宜用其凹面。 3 转移反光镜， 使光线集中于集光器。 根据需要， 上下移动集光器和缩放光圈， 以获得最适光度。一般油镜检查染色标本时，光度宜强，可将光圈开足，聚光器上 升至与载物台相干；低倍镜或高倍镜观察未染色标本时，应适当地缩小光圈，下降 集光器，使光度减弱；否则光线过强，反不易窥见。 4将标本放在载物台上；用弹簧夹或标本推进器固定，移置欲检部分于接物镜 下。 5先用低倍镜找出标本的视野，再换用高倍镜或油镜观察。 6使用油镜时，先用香柏油（cedar oil） （或以松香、蓖麻油混合液潜代）一滴 于标本的待检部位。眼睛从镜筒侧面看着，将粗调节作顺时针方向援缓转动，使镜 筒渐渐下降，直至油镜头漫没于油内（下降的程度是使油镜的透镜面几乎和标本片 接触，但两者切勿相碰） 。然后后移目至接目镜，一面观察，一面再将粗调节器作逆 时针方向缓缓地转动，获得模糊物象时，换用细调节器转动至物象清晰为止。调节 时千万不可使用强力将镜头任意下降，以致压碎玻片，或甚至将油镜头损坏。 使用油镜时，须加香柏油的原理是由于油镜的透镜很小。自标本玻片透过的光 线，因介质密度（从载物玻片至空气，再进入油镜）不同，有些光线折射或全反射， 就不能进人透镜，至使射入的光线较少，物象显现不清。若在油与载物玻片间加人 和玻璃折射率（n=1.52）相仿的香柏油（n=1. 515） ，则通过的光线不致有所损失， 进入透镜的光量既多，视野的亮度也相对增强（图 1-2） 。此外，加用香柏油后，尚 能增加孔径数，提高显镜镜的分辨率。 7由低倍镜换用高倍镜观察时，可转动回转板，将高倍镜移至镜筒下，再略行 调节即可。若直接使用高倍镜，亦须和使用油镜相同，先以眼睛从侧面看着镜筒下 10 降至镜头将触及标本时，再移至接目镜，以粗、细调节器调节之。 8观察时如发现有黑影或异物，可先转动接目镜，若该物随之亦转，则在接目 镜中；如不随着转动，可移动标本片，若随之移动，则在片上；否则，即在接物镜 上。 9显微镜放大率的计算法有数种，精确计算法是以 M 表示放大倍数，D 表示 明视距离(指从眼球的水晶体到放大的虚像之间的距离)，A 表示镜筒长度，f1 表示 物镜的焦距， f2 表示目镜的焦距，则得下列公式： 21ff AD M = 设某显微镜的高倍镜焦距为 4 毫米，接目镜焦距为 25 毫米，镜筒长 160 毫米， 则此显微镜的放大率为： 倍400 254 250160 = =M 若镜筒长度不变，显微镜的放大倍数即为接目镜和接物镜的各单独放大率的乘 积。如使用的接目镜为 10 倍，接物镜为 100 倍，则： M=接目镜放大率接物镜放大率=10100=1000 倍 普通光学显微镜一般能将物体放大 10002500 倍。 10观察标本时，应练习两眼同时睁开。以左眼窥镜，右眼写字、绘图，这样 可减少疲劳。开始不习惯，可用一手掩目，但被遮盖的右眼不要闭上，以后再逐渐 将手移去。经多次练习，可渐成自然。 （三）显微镜的维护 1显微镜是贵重的精密仪器，使用时要加以爱惜，切勿随意拆散玩弄。 2接物镜和接目镜必须保持清洁。油镜用毕，应即以擦镜纸或软绸(不能用布 类或普通的纸张)拭去香柏油。如油已干，或透镜模糊不清，可沾少许二甲苯擦净， 并随后用于的擦镜纸或软绸拭去二甲苯，否则用以粘固透镜的胶质物质易被二甲苯 空气 折光率 1.0 玻璃 折光率 1.52 香柏油 折光率 1.515 图 1-2 油镜加香柏油的原理 11 溶解，日久后镜片将移位或脱落。 3强酸、强碱、氧仿，酒精、乙醚等都能去漆或损坏机件，需注意不使接触机 件。 4显微镜用毕，擦净油镜后，将各物镜转成八字形；集光器稍下降，以免接物 镜与集光器相碰受损。然后放人镜箱，或境外加盖塑料防尘罩。 5显微镜放置的地方要干燥，以防止透镜发霉，但亦要避免阳光的直接照射。 二、细菌正常形态的观察二、细菌正常形态的观察(示教示教) 【材料】 1球菌示教片：葡萄球菌。 2杆菌示教片：变形杆菌。 3螺形菌示教片：弧菌(霍乱弧菌)。 【方法】 使用显微镜的油镜，观察上述细菌，比较各菌的形态、大小、排列。 三、细菌特殊结构的观察三、细菌特殊结构的观察(示教示教) 【材料】 细菌特殊结构示教片 【方法】 1有芽胞的破伤风梭菌，用革兰染色法染色。芽胞膨大，在菌体一末端，未染 上颜色，在有一圆空泡样结构。菌体细长呈紫色。 2有荚膜的肺炎双球菌，用 Hiss 氏染色法或碳酸复红染色法。菌体成紫色或 红色，成双排列，钝端相对，尖端相背。菌体周围有一圈淡紫色或无色的区域为荚 膜。 3有鞭毛的变形杆菌，用鞭毛染色法染色，菌体及鞭毛呈红色，为周鞭毛。观 察细菌鞭毛时要注意寻找观察单个菌体的鞭毛形态。 四、革兰染色法四、革兰染色法(操作操作) 【材料】 1菌种：葡萄球菌、变形杆菌的琼脂斜面 1824 小时培养物。 2染色液：结晶紫染液、卢戈(Lugol)碘液，95%酒精、稀释复红。 【方法】 1细菌涂片标本的制作 (1) 涂片： 取一接种环生理盐水放于载玻片的一端， 挑取少许变形杆菌或葡萄球菌 培养物与盐水混匀，涂布成直径约 1 厘米的涂片(若采用液体培养物，生理盐水可勿 12 加，直接采取 12 环菌液即可)，涂片应薄而均匀。接种环采菌后，必须再通过火 焰灭菌后，才能放回原处。 (2) 干燥：涂片最好放室温中，待其自然干燥必要时可将标本面向上，断断续续 地在微火高处借热收干，切勿紧靠火焰，以免标本烤枯，影响检视。 (3) 固定：手执玻片的一端(即涂有标本的远端)标本面向上，在火焰外层较快地来 回通过三次，约 23 秒钟，以玻片反面触及皮肤，以不觉过分地烫为度。放置待冷 后，进行染色。固定的目的在于杀死细菌；使菌体与玻片的粘附较牢；以及改变对 染料的通透性，因活的细胞一般不让许多染料进入细胞内。 2染色步骤 (1) 在同一张载玻片上分别制作葡萄球菌及变形杆菌涂片，干燥后，经火焰固定。 (2) 待冷，滴加结晶紫染液于涂片，1 分钟后水洗，并将片上积水轻轻洒净。 (3) 加卢戈碘液，1 分钟后水洗，并将片上积水洒净。 (4) 加 95%酒精数滴于涂片上，频频摇晃 35 秒后，斜持玻片，使酒精流去。再 滴加酒精如此重复 23 次，直至流下的酒精无色或稍呈淡紫色为止（约 30 秒钟） 。 水洗。轻轻洒净片上积水。 (5)以稀释复红复染 30 秒钟后，水洗，待干或用吸水纸印干，油镜捡视。 附录：附录： 1接种针、接种环(图 1-3)；接种针(或称铂金针)系用铂金丝或电炉丝制成，长 67cm。 接种环(或称铂金耳)系接种针的针端弯成直径约为 34mm 小圆环而成。 接种针或接种环均安装固定在下段带有铝质或铜质接种棒上。接种针与接种环是微 生物学中用以采取、接种、分离细菌的必备工具。在使用前后均应在火焰上烧红灭 菌，用毕插放架上，不可随意乱放，以免灼焦桌面或其它物件。 2采取菌液法(图 1-4)：左手拇指、食指和中指握持盛装培养物的试管底部， 右手拇指及食指转动棉塞，便于拔出。右手拇指、食指和中指握持接种环(似执铅笔 样)在火焰中烧红灭菌，欲伸入试管内的接种棒金属部分(约长 510cm，视试管长度 而定)也必须快速地通过火焰 23 次，以杀灭该段金属表面的微生物。以右手掌及小 指挟持并移去棉塞，管口通过火焰灭菌后，将已冷却的接种环伸入试管，沾取一环 菌液后退出，注意带菌的接种环易碰撞试管内壁或管口。置菌液于培养基或载玻片 上后，即将接种环上剩余菌液在火焰上灭菌，烧灼时，先将近环处的接种丝置于火 焰中，使热导向接种环，等环上菌液渐渐烤干后，再将接种环以垂直方向于火焰中 烧红灭菌，不要直接将环烧灼，尤其环上尚有菌膜存在时，更宜注意，否则菌液因 突然受热，而爆裂四溅，有传染的危险。接种环灭菌后，放在架上，试管口重新通 过火焰灭菌后，塞好棉塞，将菌液管放回试管架。整个取菌程序均应在近火焰的环 图 1-3 接种环（上）和接种针（下） 13 境中进行。 3革兰染色液配制 (1)结晶紫染液：结晶紫 14 克，溶于 95酒精 100 毫升中，制成饱和液。取其 20 毫升与 1草酸铵水溶液 80 毫升混合即成。 (2)稀释复红液：碱性复红 4 克，溶于 95酒精 100 毫升中，制成饱和液，再取 其 10 毫升与 5%石碳酸溶液 90 毫升混匀， 配制成石碳酸复红染液， 取石碳酸复红染 液 10 毫升加入 90 毫升蒸馏水中即成。 (3)卢戈(Lugol)碘液：碘化钾 2 克，溶于 100 毫升蒸馏水中，再加碘 1 克，徐徐 加蒸馏水至 300 毫升即成。 4特殊结构染色法 (1)鞭毛染色法(魏曦张颖悟法) 染液：甲液：饱和明矾液 2 毫升，5石碳酸 5 毫升，20鞣酸液 2 毫升，相 互混合；乙液：碱性复红或结晶紫酒精饱和液。使用前，将甲液 9 份，乙液 1 份混 合后过滤，一般过滤后放置至第三天使用最佳。 染法：染色钻果的优劣和涂片制备过程有密切关系。先将有鞭毛细菌每日在 肉汤培养基中转种一次，共 7 次。然后取琼脂斜面培养基，先吸出培养基内的凝结 水，换以无菌生理盐水 2 毫升，再接种一接种环菌液至琼脂斜面与液体界面部份。 再自该部向上划线。37孵育 716 小时，以接种环从该交界处取出一环菌液，轻 轻放在盛有 34 毫升蒸馏水的小碟表面，令菌自由分散，浮在液体表面，静置 45 分钟。再用接种环从上述液面轻轻挑取一环菌液，放在高度洁净无油的玻片上，切 勿研磨或振动，置 37孵育箱内让其自干，不能以火焰固定。滴加染液 1/21 分钟 后，水洗，干后镜检，菌体及鞭毛呈红色或紫色。 (2)荚膜染色法(Hiss 氏法) 染液；结晶紫饱和酒精溶液，20%硫酸铜水溶液。 染法：制作有荚膜细菌涂片，空气中干燥后，经热固定，滴加结晶紫染液， 在弱火上略加热，使冒蒸汽为止。再用 20%硫酸铜液将涂片上的染液洗去，此时切 勿再用水洗，以吸水纸吸干后镜检。菌体及背景均呈紫色，菌体周围有一圈淡紫色 或无色的荚膜。 图 1-4 采取菌液法 14 实验二实验二 细菌生理及外界因素对细菌的影响细菌生理及外界因素对细菌的影响 目目 的的 （一） 掌握细菌的分离培养技术及纯种移种法。 掌握常用热力灭菌法及紫外线消毒灭菌法。 （二） 熟悉细菌各种生长现象及细菌代谢产物及物理消毒法。 （三） 了解细菌的常用培养基及生物因素对细菌的影响。 内内 容容 （一） 基础培养基的制备（自学） ，细菌移种（部分示教及操作） （二） 细菌生长现象（示教） （三） 分离培养方法琼脂平板划线法（操作） （四） 细菌代谢产物的检查（操作及部份示教） （五） 常用物理消毒方法（操作） （六） 生物因素对细菌的影响（示教） 一、基础培养基制备及细菌移种一、基础培养基制备及细菌移种 （一） 基础培养基制备 1肉汤培养基：肉汤培养基常用瘦牛肉制成，如无牛肉用牛肉膏代替。 【材料】 牛肉、氯化钠、蛋白胨、氢氧化钠、蒸馏水。 【方法】 称除去筋膜无油脂的瘦牛肉 500 克，用绞肉机绞碎后加水 1000 毫升，搅拌 15 均匀后放置搪瓷锅内，置冰箱过夜，除去液面上的浮油并使牛肉的水溶性养料充分 地渗透出来。 次日取出，煮沸 30 分钟，用纱布过滤，肉渣中液体应尽量挤净。 肉汤中加蛋白胨 10 克，氯化钠 5g，搅拌加热使完全溶解，并用蒸馏水补足 至 1000 毫升。 冷至 50左右，用氢氧化钠校正 pH 至 7.6 左右。 酸碱度调整后，加热 10 分钟，使肉汤中部分蛋白质及磷酸盐等因加碱与再 度加热的影响，而重新凝固沉淀。滤纸过滤，补足失水。重新调整酸碱度。 分装于烧瓶或试管， 瓶口或管口加棉塞， 包扎后置高压蒸汽灭菌器材内， 121 蒸汽灭菌 1520 分钟。冷却，贴好标签，置于燥凉处备用。 注：如用牛肉膏制备肉汤培养基，配方如下： 牛肉膏 0.5g 蛋白胨 1g 氯化钠 0.5g 蒸馏水 100ml 以上各种成份混合加热溶解后，即可调整 pH，分装灭菌待用。 2肉汤琼脂固体培养基制备 加 23 克琼脂至 100 毫升肉汤培养基内。加热融化，过滤，补足失水，分装于 试管中。高压蒸汽灭菌后，趁热将试管斜置，冷凝后即成琼脂斜面培养基。或待冷 至 5060，以无菌操作倾入灭菌的培养皿中，冷凝后即成琼脂平板。 3肉汤琼脂半固体培养基制备 加入琼脂 0.35 克至 100 毫升 pH7.8 的肉汤中，加热融化后，用脱脂棉过滤， 补足失水。 分装于小试管 (10100 毫米)，每管 3 毫升。高压蒸汽下 121灭菌 1520 分钟后直立冷凝即成。 （二）纯种细菌接种法 1斜面培养基接种法（示教） 【材料】 （1）菌种：大肠杆菌琼脂斜面 1824 小时培养物。 图 2-1 制作琼脂平板法 16 （2）培养基：琼脂斜面培养基。 【方法】 （1）左手拇指、食指、中指及无名指分别握持菌种与待接种的培养基管（图 2 2） ，使菌种管位左，培养基管位右，斜面部均应向上，勿成水平，以免管底凝结 水浸润在培养基表面甚至沾湿棉塞。 （2）右手拇指和食指分别转动两管棉塞，以便接种时易于拔取。 （3）右手执持接种环（姿势与握铅笔似） ，在火焰中烧红灭菌，欲伸入试管内 的接种杆部分亦要迅速通过火焰 23 次以烧去其表面的杂菌。灭菌过的接种环要握 持手中，勿再碰及它物。 （4）以右手手掌与小指，小指与无名指分别拔取并挟持两管棉塞，将两管管口 迅速通过火焰数次灭菌。 （5）以灭菌并已冷却的接种环伸入菌种管，从斜面上挑取菌苔少许。退出菌种 管，再伸进待接种的培养基管，自斜面底轻轻向顶蜿蜒划线或在斜面作上下涂布， 慎勿划破培养基表面（图 23） 。沾菌的接种环，进出试管时，均不应触及试管内 壁。 （6）接种毕，重新烧红接种环灭菌后放下。两管管口迅速通过火焰 23 次，塞 回棉塞并以右手拇、食两指分别将两管棉塞转进至原来位置。37孵育 1824 小时 后观察生长情况。 图 2-2 斜面培养基接种法 17 2液体培养基接种法(示教) 【材料】 （1）菌种：大肠杆菌琼脂斜面 1824 小时培养物。 （2）培养基：肉汤培养基。 【方法】 （1）如斜面培养基接种法握持菌种管及待接种的肉汤管。 （2） 接种环灭菌冷却后， 伸入菌种管挑取少量菌苔退出菌种管， 再伸入肉汤管。 在接近液面的管壁上轻轻磨研，再沾少许肉汤调和，使菌混合于肉汤中（图 24） 。 （3）接种完毕，接种环重行灭菌后放下。塞好棉塞，37孵育 1824 小时后观 察生长情况。 3穿刺接种法(半固体接种法)示教 【材料】 （1）菌种：大肠杆菌琼脂斜面 1824 小时培养物。 （2）培养基：半固体琼脂培养基。 【方法】 （1） 如斜面培养基接种法握持菌种管及待接种的半固体琼脂培养基。 （2）右手握接种针，灭菌冷却后，以针挑取菌苔。垂直刺入半固体琼脂培养的 中心直至接近（但勿触及）试管底，然后循原路退出（图 25） 。 二、细菌的生长现象(示教) 二、细菌的生长现象(示教) 【材料】 1菌种： 大肠杆菌琼脂斜面 1824 小时培养物 枯草杆菌琼脂斜面 1824 小时培养物 图2-3斜面培养基蜿蜒划线法 （左） 及上下涂带法 （右） 图 2-4 液体培养基接种法 图 2-5 半固琼脂培养基接种法 18 甲型链球菌血琼脂斜面 1824 小时培养物 变形杆菌琼脂斜面 1824 小时培养物 痢疾杆菌琼脂斜面 1824 小时培养物 2培养基 普通肉汤培养基、血清肉汤培养基 琼脂平板、琼脂斜面、半固体培养基 【方法】 1将大肠杆菌、枯草杆菌分别接种于 2 支普通肉汤培养基；甲型链球菌接种 于血清肉汤培养基，37孵育 1824 小时后取出，观察结果。 2将变形杆菌、痢疾杆菌分别接种于 2 支半固体培养 37孵育 1824 小时 后取出，观察结果。 3 将大肠杆菌接种于琼脂平板及琼脂斜面培养基， 37孵育 1824 小时后取 出，观察结果。 三、分离培养法 板划线法(操作) 三、分离培养法 板划线法(操作) 【材料】 （1）菌种：葡萄球菌和大肠杆菌的混合菌液。 （2）培养基：琼脂平板。 【方法】 1 烧灼接种环，待冷（约等待 1 分钟左右） ，取一接种环混合菌液。 2 左手抓握琼脂平板培养基(皿盖留在桌上)，使尽量直立，以免空气中杂菌 落入，并靠近火焰周围。右手握持沾菌的接种环在琼脂平板上端来回划线，涂成一 薄膜(约占平板总面积的 110)。 划线时使接种环面与平板表面成 3040 度角轻轻接 触，以腕力在平板表面作轻快的滑移动作，接种环不应嵌进培养基内。 3 烧灼接种环，以杀灭环上留剩的菌液。待冷（环是否冷却？可先在平板培 养基的边缘空白处接触一下，若琼脂溶化表示尚未冷却，宜再稍等复试之）将环通 过薄膜处作连续划线（约占平板的 1516） ，划毕再用火焰灭菌。冷后作同样的 划线，共计 45 次（图 2-6、7） 。 4 划线完毕，将琼脂平板培养基覆盖皿盖，并在培养皿底玻璃面，用记号笔 注明接种菌名，接种者姓名及班级、日期等(以后凡接种的培养皿、试管等，均要照 此要求，用记号笔注明)。将培养皿倒置放进孵育箱培养，这样可避免培养过程中凝 结水自皿盖滴下，冲散菌落。 5 37孵育 24 小时后取出，观察琼脂平板表面生长的各种菌落，注意其大 小、形状、边缘、表面结构、透明度、颜色等性状。 19 四、细菌代谢产物的检查四、细菌代谢产物的检查 (一)单糖发酵试验(示教) 【原理】 不同细菌具有不同的糖分解酶，故分解各种糖后的产物也不相同，有的产酸， 有的尚有气体形成，借此可鉴别各种细菌。单糖发酵试验在肠道病原菌的鉴定中尤 其重要。 单糖发酵管是将葡萄糖、乳糖或麦芽糖等加入蛋白胨水培养基内，使其最终浓 度为 0.751，并加入一定量的指示剂及一只小倒管。接种细菌并孵育一定时间后， 若该菌具有分解某种糖的酶，分解产酸就会使指示剂变色。如指示剂为酸性复红则 变为红色；溴甲酚紫则呈黄色。若有气体形成，则小倒管内有气泡集聚。 【材料】 1菌种；大肠杆菌、伤寒杆菌、金黄色葡萄球菌琼脂斜面。 2培养基：乳糖发酵管。 【方法】 将大肠杆菌、伤寒杆菌、金黄色葡萄球菌分别接种于 3 支乳糖发酵管，37孵 育 1824 小时，取出观察并记录结果。 (二) (VogesProskauer)试验 (操作) 【原理】 VP 试验可鉴别大肠杆菌和产气杆菌。 两菌在糖代谢中， 分解葡萄糖后都能产生 丙酮酸；丙酮酸进一步分解形成甲酸、乙酸、乳酸等。产气杆菌并可使丙酮酸脱羧 变为中性的乙酰甲基甲醇，在碱性环境下被空气中氧气氧化为二乙酰，后者与蛋白 胨中精氨酸所含的胍基起作用，生成红色化合物，此为 VP 试验阳性。在试验中加 入-萘酚，可加速这个反应。大肠杆菌不能将丙酮酸脱羧故 VP 阴性。 2CH3COCOOH（丙酮酸） CH3COCHOHCH3（乙酰甲基甲醇） 图 2-6 平板划线法 图 2-7 孵育后菌落的分布情况法 20 CH3COCHOHCH3 CH3COCOCH3（二乙酰） NH2 NCCH3 CH3COCOCH3 HNC （胍） NHC （红色化合 物）2H2O NH2 NCCH3 【材料】 1菌种：大肠杆菌、产气杆菌斜面 1824 小时培养物。 2培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基。 340KOH 溶液(含 0.3肌酸)、6-萘酚酒精溶液，毛细吸管。 【方法】 1分别接种大肠杆菌、产气杆菌于 2 支葡萄糖蛋白胨水培养基中。 237孵育 48 小时后取出分别加入 1 毫升 KOH 和-萘酚溶液，摇匀。静 置桌上 515 分钟内出现红色者，为阳性反应。 (三) 甲基红(MR)试验 (操作) 【原理】 本试验可鉴别大肠杆菌和产气杆菌。产气杆菌能将两分子的丙酮酸脱羧生成 一分子的中性乙酰甲基甲醇，故培养物中形成酸类较少，pH 值在 5.4 以上。因此加 入指示剂甲基红(Methyl Red)后，呈现桔黄色，此为甲基红试验阴性。而大肠杆菌分 解丙酮酸，产生酸类较多，pH 在 4.5 或更低，故甲基红呈现红色（阳性） 。 【材料】 1菌种：大肠杆菌、产气杆菌斜面 1824 小时培养物。 2培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基 3甲基红 【方法】 1分别接种大肠杆菌、产气杆菌于 2 支葡萄糖蛋白胨水培养基中。 237孵育 23 天取出，分别滴加甲基红试剂 23 滴后立即观察。阳性者呈 红色，阴性者呈黄色。 (四) 枸橼酸盐利用试验 (操作) 【原理】 枸橼酸盐培养基中仅含无机盐及唯一有机物枸橼酸盐一般细菌能利用磷酸二 氢铵作氮源，但不一定能分解枸橼酸盐取得碳源，因此根据能否利用枸橼酸盐可鉴 别不同细菌。产气杆菌可以利用枸橼酸盐作为碳源，就能在本培养基上生长，形成 菌落。且分解后，有碱性的碳酸盐生成，使培养基的 pH 值（原在 7.0 以下）升高， 转为碱性，则溴麝香草酚蓝指示剂由绿色变为深蓝色。大肠杆菌不能分解枸橼酸盐， 得不到碳源，不能生长，指示剂也就不会变色，培养基仍为原来绿色。 -2H +KOH 21 【材料】 1菌种：大肠杆菌、产气杆菌斜面 1824 小时培养物。 2培养基：枸橼酸盐培养基 【方法】 1分别接种大肠杆菌、产气杆菌于 2 支枸橼酸盐培养基上。 237孵育 24 小时后观察。有菌苔出现，培养基颜色变为深蓝色者，是为 枸橼酸盐利用试验阳性。 (五) 吲哚 (Indol) 试验 (操作) 【原理】 有些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚(靛基质)。吲哚无 色不能直接察见， 加入对二甲基氨基苯甲醛试剂(吲哚试剂)， 作用后能形成红色的玫 瑰吲哚，则被肉眼所识别。 【材料】 1 菌种：大肠杆菌、产气杆菌斜面 1824 小时培养物。 2培养基：蛋白胨水培养基。 3试剂：吲哚试剂、乙醚。 【方法】 1分别接种大肠杆菌、产气杆菌于 2 支蛋白胨水培养基中。 237孵育 48 小时后取出，每管加 23 滴吲哚试剂于液面上，在接触面呈玫 瑰红色(环状)者为阳性；仍呈黄色者为阴性。若颜色不明显，可加 45 滴乙醚至培 养物中，摇匀，使乙醚分散至培养物中。将培养物静置桌上，待乙醚小滴上升至培 养物液面后，再加吲哚试剂，这样，若培养液内有吲哚存在，就可被取而集中在乙 醚层中，遇到试剂后颜色反应较明显。 (六) 尿素分解试验 (示教) 【原理】 有的细菌具有尿素酶，能分解尿素形成大量的氨，使培养基 pH 值上升而变成 碱性，使酚红指示剂呈现红色，是为阳性反应。 【材料】 1菌种：变形杆菌、痢疾杆菌斜面 1824 小时培养物。 2培养基：尿素培养基。 【方法】 1分别接种变形杆菌、痢疾杆菌于尿素培养基中。 237孵育 1824 小时后观察结果。 (七) 硫化氢试验 (示教) 【原理】 某些细菌能分解培养基中胱氨酸等含硫氨基酸，生成硫化氢。硫化氢遇铁(如硫 酸亚铁)或铅离子，则形成黑褐色的硫化亚铁(或硫化铅)沉淀物，黑色沉淀物愈多， 表示生成的硫化氢量愈多，硫化氢试验用的培养基中含有硫代硫酸钠，它是一种还 22 原剂，能保持还原环境，使形成的硫化氢不再被氧化。 【材料】 1菌种：大肠杆菌，变形杆菌的琼脂斜面 1824 小时培养物。 2培养基：醋酸铅培养基。 【方法】 1分别穿刺接种大肠杆菌、变形杆菌于醋酸铅培养基中。 237孵育 24 小时后观察结果。 五、常用灭菌器及滤菌器（录像）五、常用灭菌器及滤菌器（录像） （一） 高压蒸气灭菌器 1构造：高压蒸气灭菌器（图 28）是一个双层的金属圆筒，两层之间盛水。 外层坚厚，其上或前方有金属厚盖。盖旁附有螺旋，借以紧闭盖门，使蒸气不能外 溢。因而随着蒸气压力升高，其温度亦相应增高。它们之间的关系如下表： 不同蒸气压力能达到的温度 蒸 气 压 力 磅平方吋 公斤平方厘米 (温度) 5 8 10 15 20 25 30 O35 056 O70 105 140 175 210 1088 113O 1156 1213 1262 1304 1346 高压蒸汽灭菌器上装有排气阀门、安全活塞，以调节器内蒸汽。有温度计及压 力表，以示内部的温度和压力。器内装有带孔的金属搁板，用以放置欲灭菌物件。 2 加水至器内，放入被灭菌物件。将器盖上，螺旋转紧使之密闭。器下用煤气 或电等加热，同时开排气阀门，使器内冷气完全逸出，否则压力表上所示压力并非 全部是蒸气压力，器内不能达到理想温度，灭菌将不完全，器内温度和冷气排除量 的关系见下表。 高压蒸汽灭菌内温度与空气排除量的关系 压力表上所示 能 达 到 的 温 度 （） 压 力 (磅平方吋) 空气完 全排除 空气 2/3 排 除 空气 1/2 排 除 空气 1/3 排 除 空气全 未排除 23 5 10 15 20 25 30 109 115 121 126 130 135 100 109 115 121 126 130 94 105 112 118 124 128 90 100 109 115 121 126 72 90 100 109 115 12l 待空气全部排出，关闭排气阀继续加热，待压力表渐升至所需磅数(一般 是 15 磅)，减少炉火，维持 1520 分钟。若采用蒸汽加热，则可直接将蒸汽通 入灭菌器内，至所需温度即可(图 12)。灭菌时间到达后，停止加热或关闭蒸汽， 待压力逐渐自行降至零时，徐徐打开排气阀，排除余气、开盖取物。切不可在压 力尚未降低时突然打开排气阀门，放气减压。因为这样，将使瓶内液体等冲出外 溢。 高压蒸汽灭菌为最可靠方法，凡耐高热潮湿的物件，如培养基、生理盐水、 衣服、纱布、棉花等敷料、玻璃器材、传染性脏物及细菌培养物等都可应用本法 消毒灭菌。 （二）阿诺(Arnold)流动蒸汽灭菌器 1构造：阿诺流动蒸汽灭菌器(图 29)的构造象一般的蒸笼，上端插入温 度计。先加水于双层的金属锅内，锅底下加热。因双层间水的容量不大，容易煮 沸而形成蒸汽，使器内温度上升至 100。蒸汽通经中央圆筒直至灭菌器内的被 消毒物件。多余的蒸汽自器的隙缝逸出。遇及温度低于 100的外壳时，重新凝 结成水， 返回于水锅内， 这样可以不需经常加水。 另一形式的流动蒸汽灭菌器(图 210)是以金属板或石棉板制成圆筒形或长方形箱， 底层盛水， 其上有 12 层带 孔金属隔板，借以放置消毒物件。箱顶或旁侧有进水漏斗和排水龙头。 图 28 高压蒸气灭菌器 1、 压力表 2、 金属外壳 3、 灭菌室 4、 安全活塞 5、 排气门 6、 蒸汽通入管 7、 蒸汽放出管 24 2用法：向锅内加水至略低于搁板下面，再将欲灭菌物件放入器内搁板上。 点火加热以产生蒸汽，使锅内温度达 100并维持 30 分钟左右，在普通大气压 下，蒸汽温度不会超过 100，细菌繁殖体一般可被杀死，但不能杀灭芽胞。所 以，使用流动蒸汽灭菌，往往须按灭菌的性质进行间歇灭菌，每日一次，连续三 次。本法用于不耐高温的糖类、马铃薯、牛奶等培养基的灭菌。 （三）干热灭菌器(烤箱) 3构造：干热灭菌器(图 211)是由双层铁板制成的长方形金属箱，外壁 内层装有隔热的石棉板， 底下放置大型火炉，或在箱壁中装置电热线圈或煤气管 道，上有数孔，安插温度计及供空气节流通用。箱前有铁门及玻璃门，箱内有金 属板架数层。电热烤箱的前下方装有温度调节器，可以保持所需的温度。 4用法：将培养皿、吸管、试管等玻璃器材包装后放入箱内，闭门加热。 当温度上升至 160170，保持 2 小时到达时间后，停止加热，等温度自然下 降至 40以下，方可开门取物。否则冷气突然进入，易引起玻璃炸裂，且热空 气外溢，往往会灼伤取物者的皮肤。一般吸管、试管、培养皿、凡士林、液体石 蜡等用本法灭菌。 (四)滤菌器：滤菌器由孔径极小（一般孔径在 0.10-1 微米之间，常用 0.22 微米孔径的过滤膜即可达到除菌的目的），能阻挡细菌通过的石棉、醋酸纤维膜 或玻璃细砂等制成。种类多，常用的有： 1塑料滤器：由塑料制成，中间滤膜为醋酸纤微膜，多为一次使用。 2不锈钢滤器：由不锈钢制成，中间可根据需要安装石棉滤板或醋酸纤维 滤膜等，同时，在过滤时还可以