（作物遗传育种专业论文）胁迫诱导棉花microrna的差异表达分析.pdf

山东农业大学博士学位论文 1 摘 要 microrna (mirna) 是一类内源性的、非编码单链小 rna。近年来研究发现， mirna 作为基因表达中的一类负调控子，不仅在植物新陈代谢、器官发育及组织分化 中起重要的作用，而且可以响应植物的生物和非生物逆境胁迫，在植物感受逆境胁迫 而做出适应性调整的过程中发挥着重要的作用。因此，对胁迫诱导 mirna 进行研究， 有助于探明植物逆境适应反应的“成因机理”以及 mirna 所介导的基因表达调控网 络，为提高转基因植物抵抗胁迫的能力提供新的途径。 本研究选用高盐和黄萎病两种代表性的环境胁迫（前者是非生物胁迫，后者是生 物胁迫）对棉花进行胁迫处理，利用生物信息学预测和实验验证相结合的方法，鉴定 了棉花中的 mirna，分析了胁迫诱导条件下棉花 mirna 的差异表达情况，初步探讨 了差异表达 mirna 在抗逆反应中所起的作用，为阐明棉花耐盐和抗黄萎病的调控途径 提供参考。本研究获得的主要结果如下： 1. 在 mirbase 数据库 (release 10.1) 中筛选出保守的植物 mirna 家族，并以它们 的序列作为“种子序列”应用于同源搜索 mirna 方法当中，在 est、gss 和 core- nucleotide数据库中搜索预测 mirna，从而改进 mirna计算机预测方法。 2. 利用改进的 mirna 计算机预测方法预测了棉花等作物中的 mirna。在预测的 得到的棉花 mirna 中，有 2个来自于 gss序列，3个来自于 core-nucleotide序列，其 余的 16 个来自于 est序列。 3. 利用 mirna芯片验证以上预测得到的棉花 mirna，芯片杂交结果显示其中 10 个属于可检测 mirna。利用荧光定量 pcr 检测了 mirna 在高盐胁迫条件下，两种棉 花品系（耐盐品系山农 91-11 和盐敏感品系鲁棉 6号）中的表达情况。结果显示：高盐 胁迫条件下，mir156a、mir156d、 mir156e 和 mir169 在耐盐品系山农 91-11 中表达 量下调，mir167a 和 mir399a 表达量上调，而 mir159在盐敏感品系鲁棉 6号中表达量 下调。 4. 利用生物信息学预测得到棉花 mirna 的靶基因共 23 个，利用荧光定量 pcr 检 测了 5 个靶基因的表达情况。结果显示：高盐胁迫条件下，spl3，rna helicase 和 hap2在耐盐品系山农 91-11 中表达量上调，而 arf8 和ghi.6739表达量下调。 胁迫诱导棉花 microrna的差异表达分析 2 5. 以陆地棉-冀棉 11（易感黄萎病）和海岛棉-海 7124（抗黄萎病）为研究材料， 分别建立了正常生长和黄萎病菌侵染条件下的四个小 rna 库，然后利用高通量 solexa 测序共获得 68 970 173 条小 rna 序列；结合生物信息学分析得到 215 个棉花 mirna；不同样本间小 rna 种类及数量差异显著，平均约有 40%的 unique srna 为 样本特有 srna。 6. 将四个小 rna 库中 mirna 数量归一化，比较 mirna 表达量的差异。结果显 示：在冀棉 11 中，38 个 mirna 在黄萎病菌侵染条件下表达量下调，15 个 mirna 表 达量上调；在海 7124 中，24 个 mirna 在黄萎病菌侵染条件下表达量下调，15 个 mirna 表达量上调。此外，在正常生长和黄萎病菌侵染条件下，分别有 54 个和 44 个 mirna 在两种棉花材料之间表达量有显著差异。生物信息学预测得到了 63 个 mirna 的靶基因共 161个，其中与胁迫、信号转导和防御密切相关的靶 mrna序列共 25个。 关键词： microrna； 盐胁迫；黄萎病；棉花；靶基因盐胁迫；黄萎病；棉花；靶基因 山东农业大学博士学位论文 3 abstract micrornas (mirnas) are a class of small, endogenously non-coding rnas that are recently found to be negative regulators of gene expression in eukaryotic organisms. plant mirnas play key roles in a wide range of biological processes, including meristem cell identity, organ polarity, and developmental timing as well as in response or tolerance to biotic and abiotic stress. thus, the research on stress-regulated mirnas could help us gain a better understanding the mechanism and the pathway of gene regulation in plant tolerance to stress, and provide new information for transgenic breeding. cotton (gossypium hirsutum l) is the foremost fiber crop in the world. however, litter is known for the stress-regulated mirnas in cotton. in this study, the cotton plants treated with high salt stress and infected verticillium dahliae were used as materials. using bioinfomatic approach and experimental technology, the stress-regulated mirnas and their targets were identified in cotton. the profiling of these mirnas lay the foundation for further investigating their functional mechanism in the regulation of stress-defence responses, and the main results were as follows: 1. in plants, 42 conserved mirna families were sorted out from the mirbase database (release 10.1). their sequences were used as references in homology-research method for mirna prediction. in addition, est, gss and core-nucleotide sequences were used as the mirna sources to advance the method for mirna prediction. 2. using the advanced method, we predicted new mirnas in cotton, tomato and wheat. of the predicted mirnas in cotton, two were from gss sequences; three were from core- nucleotide sequences; the remaining sixteen were from est sequences. 3. mirna microarray was used to confirm the predicted mirnas in cotton. the results showed that 10 mirna families had signal. using rt-pcr, the profiling of these mirnas was investigated in shannong91-11 (salt-tolerant cultivar) and lumian6 (salt-sensitive cultivar). the result showed that mir156a, mir156d, mir156e and mir169 were down- regulated by salt stress in shannong91-11, while mir167a and mir399a were up-regulated; only mir159 were down-regulated by salt stress in lumian-6. 4. using bioinfomatic approach, 23 target gens were predicted. their profiling was further investigated and showed that spl3，rna helicase and hap2 were up-regulated by salt stress in shannong91-11, while arf8 and ghi.6739 were down-regulated. 胁迫诱导棉花 microrna的差异表达分析 4 5. four small rna libraries were constructed from mocked and infected roots of two cotton cultured species which are with different verticillium wilt tolerance (hai-7124, g. barbadense l., a verticillium-tolerant cultivar, and yimian-11, g.ossypium hirsutum l. a verticillium-sensitive cultivar). a total of 68, 970, 173 alignable small rna reads were obtained by high-throughput sequencing technology. following a set of strict filtering criteria, a total of 215 mirnas were detected. the fractions of small rnas were substantially different between libraries. the sample-specific tags accounted for about 40% of all unique sequence reads in each one of the four libraries. 6. the expression abundance of mirnas in data sets was analyzed by counting the number of transcripts per million (tpm) clean tags in libraries. the results showed that 38 mirnas were up-regulated in yimian-11 in response to verticillium infection, while 15 mirnas were down-regulated; 24 mirnas were down-regulated in hai-7124 in response to verticillium infection, while 15 mirnas were up-regulated. in addition, there were 54 and 44 mirnas with a genotype-specific expression under mocked and infected conditions, respectively. using bioinfomatic approach, 161 target gens were predicted for the 63 mirnas. of them, 25 mrnas were involved in stress response, resistance and signaling conduction. key words: microrna; salt stress; verticillium wilt; cotton; target gene 符 号 说 明 aba: abscisic acid, 脱落酸 bp: base pair, 碱基对 cdna: complementary dna, 互补 dna ctab: cetyltrimethylammol/lonium bromide, 十六烷基三乙基溴化铵 dcl1: dicer-like 1, dicer-类蛋白 1 ddh2o: distilledant deionized water, 重蒸水 depc: diethyl pyrocarbonate, 焦碳酸二乙酯 dna: deoxyribonucleic acid, 脱氧核糖核酸 dntp: deocyribonucleoside triphosphate, 脱氧核糖核苷三磷酸 eb: ethidium bromide, 溴化乙锭 edta: ethylene diamine tetraacetic acid, 乙二胺四乙酸 igr: intergenic region, 基因间隔区 mfe: minimal free energies, 折叠自由能 mirna: microrna, 微小 rna mrna: message rna, 信使 rna na3po4: sodium phosphate, 磷酸钠 naoac: sodium acetate, 醋酸钠 nt: nucleotide, 核苷酸 orf: opening frame, 开放阅读框架 page: poly acrylamide gel electrophoresis , 聚丙烯酰胺凝胶电泳 pbs: phosphate buffer, 磷酸缓冲液 pcr: polymerase chain reaction, 聚合酶链式反应 pre-mirna: mirna precursor , mirna前体 pri-mirna: primary mirna transcript, mirna 初级转录本 pvp: polyvinylpyrrolidone, 聚乙烯吡咯烷酮 ptgs: post-transcriptional gene silencing, 转录后基因沉默 risc: rna-induced silencing complex, rna诱导的沉默复合体 rnai: rna interfering, rna干扰 rnase a: ribonuclease a, 核糖核酸酶 a rpm: revolutions per minute, 转/分钟 rt-pcr: reverse transcriptative pcr, 反转录 pcr sds: sodium dodecyl sulfate, 十二烷基硫酸钠 te: tris.hcl, edta buffer, tris.hcl, edta缓冲液 tris: ttrishydryxymethy laminomethane, 三羟甲基氨基甲烷 5-race: 5-rapid amplification of cdna ends , 5 末端 cdna 快速扩增 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所取得 的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个人或集 体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同意学 校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子版，允许论 文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存 论文和汇编本学位论文，同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文 收录到中国学位论文全文数据库，并向社会公众提供信息服务。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名： 的 导 师 签 名： 的 日 期： 的 山东农业大学博士学位论文 5 1 引 言 1 引 言 microrna (mirna) 是近年来发现的一类内源性的非编码单链小分子 rna (carrington and ambros, 2003)。大部分 mirna 由 20-25 个核苷酸组成，可以和上游或 下游的序列不完全或完全配对形成茎环结构 (achard, et al., 2004, jones, 2002)。最早发 现的 mirna 是线虫中的 let-7和 lin-4 (lee, et al., 1993)，此后大量的 mirna 在动物和 植物中被发现和克隆。目前，mirna数据库 mirbase中 (release 17：2011年 4月) 已 登记了 46 个物种 3362 条植物 mirna 序列及相关信息(http:/microrna.sanger.ac.uk)。 随 着现代生物技术和分子生物学的发展，当前 mirna 的发现数量呈指数增长，对 mirna 的生物合成，调控机制以及功能分析有了更深入的认识。很多植物 mirna 序 列高度保守并呈现出独特的表达时序性、组织及发育特异性或逆境特异性。mirna 作 为基因表达中的一类负调控子，主要在转录后水平上通过介导目标 mrna 的切割或抑 制翻译来调节植物基因的表达 (schwab, et al., 2005)，在植物新陈代谢、组织生长、器 官发育及分化、细胞程序性凋亡中起重要作用 (jover-gil, et al., 2005, willmann and poethig, 2007)。此外，mirna 还可以响应植物生物及非生物逆境胁迫，在植物感受逆 境胁迫而做出适应性调整的过程中发挥着重要的作用 。 1.1 mirna 的产生的产生 植物 mirna 的生物合成过程包括转录、加工成熟和功能复合体装配 3 个主要步 骤。 （一）mirna转录 植物 mirna 通常由非编码的核基因转录而来，其基因通常以单拷贝形式存在, 多 定位于基因之间的间隔区 (intergenicregion，igr)，也有一些处于已知基因的内含子区 域 (kim and kim, 2007)。有报道对这些 mirna基因转录起始位点上游的 800 nt 进行生 物信息学分析，发现存在大量已知的转录因子结合域 (megraw, et al., 2006)。植物 mirna 基因由 ii 型 rna 聚合酶转录形成具有 5 帽子和 3-polya 尾的初级转录本，称 为 primary mirnas (pri-mirnas) (lee, et al., 2004)。大部分植物的 pri-mirna都是由腺 苷酸开头，并位于一个保守的 tata-box 序列的下游 40 nt 处 (bartel, 2004)。 （二）加工过程 胁迫诱导棉花 microrna的差异表达分析 6 由于植物中没有 drosha 同源物，植物 mirna 的成熟加工过程是由一种核内的 dicer 酶类似物 (dicer-like1，dcl1)，在 hyl1 蛋白的协助下通过两个步骤剪切生成 (kurihara and watanabe, 2004)。首先，pri-mirna 在核内加工成约 60200 nt 的具有发 卡环结构的前体 (pre-mirnas) (kim, 2005)。随后，pre-mirna 被植物体内的 exportin- 5 的同源蛋白 (hasty，hst) 识别 3 端的二核苷酸突出信号而被转运到细胞质中 (bartel, 2004; lee et al., 2004)，之后，被剪切成约 21-24 nt 长的 mirna：mirna*双链 复合体 (kurihara and watanabe, 2004)。 dicer 酶是内切核酸酶 rnaseiii 家族中特异识别双链 rna 的家族成员，它能以一 种 atp 依赖的方式逐步切割双链 rna 或 rna 茎环结构，产生 19-21bp 的双链切割产 物，每个片段的 3端都有 2 个碱基突出 (kurihara, et al., 2006, kurihara and watanabe, 2004)。dicer 酶含有一个解旋酶、结构域、富含谷氨酸区、一个 paz 结构域、piwi 区、rnaseiii 和 dsrna 结合区。在 paz 结构域，具有异常的 ob 折叠结构，其与核酸 的亲和性比较弱但很持久 (kolb, et al., 2005)。dicer 在催化过程中以二聚体的形式出 现，其催化结构域在 dsrna 上反平行排列，形成 4 个活性位点，但只有两侧的 2 个位 点有内切核酸酶活性 (schauer, 2002)。dicer酶是通过 paz结构域与 pre-mirna之间的 相互作用而行使切割功能的 (lingel and sattler, 2005)。研究发现，拟南芥中有 4 个 dicer 同源物基因 (tijsterman and plasterk, 2004)，但只有 dcl1 是 mirna 加工所必须 的，其它 dicer 同源物 (dcl2、dcl3 和 dcl4) 的突变体并不影响大部分 mirna的积 累 (lee, et al., 2004)。在 dcl1 功能失活的拟南芥突变体中，pri-mirna 高水平积累 (ye, et al., 2007)，而 mirna 的积累极度减少，随后表现出多向性的发育缺陷 (xie, et al., 2003)，并且 dcl1 功能全部失活会导致胚胎发育的致死突变 (schauer, 2002)。植物 pre-mirna 的加工过程还需要另外两个蛋白酶：hyponastic leaves1 (hyl1) 和 serrate (se)。hyl1 属于一类双链 rna 结合蛋白，与 mirna:mirna*互补双链的 形成密切相关 (vazquez, et al., 2004)。hyl1 和 dcl1 可组装成类似于小 rna 加工复 合体(micro-processor) 的结构。hyl1 功能失活的突变体中，pri-mirna 的积累量增 加，而 pre-mirna 的含量降低，同时许多 mirna 的积累减少，说明 hyl1 是 pre- mirna 由 pri-mirna 加工过程的必要成分 (dong, et al., 2008, pouch-pelissier, et al., 2008)。se 编码一个 c2h2 型锌指蛋白，它可以通过促进 mir165/166 的积累来控制叶 片极性发育 (grigg, et al., 2005)。se 突变体中 pri-mirna 过度积累，并且 se 可以与 山东农业大学博士学位论文 7 hyl1 相互作用，说明 se 在许多 mirna 的生成过程中都扮演着重要角色 (lobbes, et al., 2006)。 植物 mirna 在 dicer 加工之后存在甲基化现象，由 hen1 作为转甲基酶负责完成 (boutet, et al., 2003)。对 mirna 途径中的不同底物 (pre-mirna，mirna/mirna*二聚 体，mirna*和 mirna) 进行转甲基酶分析发现，只有 mirna/mirna*二聚体能被 hen1 专一甲基化 (yu, et al., 2005)，并且许多不同的 mirna/mirna*二聚体都是 hen1 的底物 (park, et al., 2002)，说明 hen1 是一个普遍的、不依赖序列特异性的 mirna 甲基转移酶。hen1 识别的底物具有典型的特征：mirna/mirna*二聚体的 3 末端必须具备 2nt 突出、2-oh 和 3-oh，其中 2-oh 是被 hen1 专一甲基化的作用底 物，并且只有 2124 nt 的二聚体被甲基化的效率最高 (boutet, et al., 2003)。 （三）功能复合体装配 甲基化后的 mirna/mirna*二聚体由解旋酶(helicase)解开。由于 mirna: mirna*的两条链是不完全配对的，mirna 链上靠近 5端有一个不与 mirna*链相应 位置配对的小突起，这个小突起显著地减弱了 mirna 链 5端的稳定性 (chan and slack, 2006)。成熟 mirna 的产生总是趋向于选择 5端更不稳定的链，mirna 单链会与 ago等蛋白形成 risc (rna-induced silencing complex) 复合体后行使功能，而星号链 则被降解掉 (vaucheret, et al., 2004)。ago蛋白家族是沉默复合体中的主要成员，该蛋 白含有非常保守的 paz 结构域和一个类似于 rna 酶 h 的 piwi 结构域 (song, et al., 2007)。paz区有单链 rna结合活性，也可以和双链 rna 3端突出结构结合 (song, et al., 2003)。piwi 结构域具有核酸内切酶活性，能介导 ago 蛋白与 dicer 相互作用 (jover-gil, et al., 2005)。 1.2 mirna 的作用方式的作用方式 植物 mirna 介导的靶基因（靶 mrna）调控机制可以是对靶 mrna 的剪切或对 靶 mrna 翻译的阻遏，这主要取决于植物 mirna 与其靶 mrna 的序列互补的程度 (axtell, et al., 2007)。一般来说，mirna 与靶 mrna 完全互补或接近完全互补时，则 会切割 mrna；若植物 mirna 与靶 mrna 不完全互补，则抑制它的翻译 (axtell and bartel, 2005)。与哺乳动物 mirna 作用方式不同，植物 mirna 介导的靶 mrna 剪切 是其主要作用方式 (bartel, 2004)。在 mirna 切割过程中，mirna 5端的 28 位残基 是与靶 mrna 互补 的核心元件，第 1011 位核苷酸残基配对的靶 mrna 的 orf区是 胁迫诱导棉花 microrna的差异表达分析 8 mirna 的切割位点 (schwab, et al., 2005)。切割后，mirna 会继续识别并切割其他靶 基因。在抑制翻译作用方式中，mirna 主要作用位点为靶 mrna 的 3utr 区，通过 改变靶 mrna 上核糖体密度或特异降解新合成的多肽链来达到抑制靶 mrna 翻译的目 的。有些植物 mirna 虽然与靶序列高度互补，但有时也会以后一种作用方式实现对靶 基因的调控，如植物中的 mir172 与其靶序列 ap2 mrna 高度互补，却没有检测到 ap2 mrna 水平的降低，而是引起了 ap2 蛋白表达的抑制 (aukerman and sakai, 2003)。以上这两种作用机制是最早发现且熟知的。除此之外，mirna 也可能存在其他 的调控机制，如可以调控靶 mrna 的定位或稳定性, 或通过目标染色体位点的甲基化 在转录水平上发挥作用。pns 刊载的 mirna 可能通过对靶基因“快速脱腺甘酸化 (acceleranted deadenylation)”实现降低蛋白质的合成，意味着植物 mirna 或许存在更 多的调控机制 (ricci, et al., 2011; wu, et al., 2006)。 1.3 与植物生长发育相关的与植物生长发育相关的 mirna 植物 mirna 的靶基因大多是编码参与生长发育调控和细胞分化的转录因子，另外 还有一些参与代谢过程的调控蛋白 (zhang, et al., 2007)。在 dcl1、hyl1、hen1 这些突变 体中，伴随着 mirna 积累量的减少，植株表现出多向性的发育缺陷，表明 mirna 在 植物生长发育进程中发挥着非常重要的功能 (vaucheret, et al., 2004)。 1.3.1 mirna 参与植物开花及花器官发育参与植物开花及花器官发育 目前普遍认为花器官的形成是由 abc模型中的同源异型基因所调控 (jack, 2004)。 ap2 (apetala2) 类转录因子是 abc 模型中 a 类基因中的一员。mir172 通过作用于 包括 ap2、toe1、toe2、gl15 等在内的 ap2 转录因子编码基因，在植物发育过程中 起到控制植物开花时间、花器官发育、花器官决定及发育阶段转变等重要作用 (shigyo, et al., 2006)。ap2 类转录因子基因功能缺失分析表明，ap2 类转录因子为花器官抑制 物。发育早期由 mir172 介导的 ap2 基因下调表达能缓解 ap2 类转录因子对花器官的 抑制，促进开花 (zhao, et al., 2007)。通过过量表达 mir172研究发现，随着 mir172表 达量的升高，植株体内 ap2 蛋白水平降低，植株表现开花提前及花瓣缺失、萼片转变 成心皮等花器官发育缺陷，与 ap2 突变体的花的表型类似 (aukerman and sakai, 2003, chen, 2004)。过量表达抗 mir172 的 ap2 基因会导致雄蕊增多、花器官分生组织无限 扩展及花器官发育模式障碍 (mlotshwa, et al., 2006)。此外，另一种 ap2 类转录因子 smz 也是 mir172 的靶基因, 过量表达抗 mir172 的 smz 基因的拟南芥植株长期维持营 山东农业大学博士学位论文 9 养生长 (mathieu, et al., 2009)。wu 等 (2006) 研究发现 mir156也参与到花发育和阶段转 换当中，它通过对其靶基因 spl9 的调控，作用于 mir172b 的转录过程，从而调节 mir172 的表达，因此可以说，mir156 和 mir172 两者共同作用控制植物营养生长向生 殖生长的转变。 拟南芥 mir164 家族有 3 个成员，它们的靶基因均是 nac familiy 转录因子，包括 cup-shaped cotyle、cuc1 和 cuc2 (laufs, et al., 2004)。在胚胎发育时期，它们在 两片子叶的交界处以及生长后期的各轮花器官的交界处富集，并在植物组织器官边界 的建成和茎端分生组织的形成过程中有着重要的作用 (ooka, et al., 2003)。cuc1 和 cuc2 能够阻止花萼和雄蕊的融合，使植物形成正常形态和数目的花萼和雄蕊 (raman, et al., 2008)。对拟南芥花器官突变体 (eep1) 的研究中发现，mir164c 发生突变而失去功 能，从而导致开花早期长出多余花瓣 (baker, et al., 2005)，说明 mir164c 正是通过控制 cuc1 和 cuc2 在体内的浓度来控制花瓣的数目 (mallory, et al., 2004)。 此外，mir159 和 mir167 也在花的起始和花器官的建成中起着重要作用。mir159 的靶基因是两个 myb 家族的转录因子 (myb33 和 myb65)，同属于 leafy 家族。过 量表达 mir159 能够引起 leafy 基因表达水平降低，使拟南芥在短日照下开花延迟， 影响雄蕊花粉囊的发育(achard, et al., 2004)。mir167 能降解生长素应答因子 arf8 mrna，同时抑制 arf6 mrna的翻译 (wu, et al., 2006)。通过构建 35s:mir167b转基 因体系发现，转基因植株的 4 轮花器官均产生了缺陷：花丝不正常变短、花粉囊不能 释放花粉，花粉粒不能正常发育 (ru, et al., 2006)。 1.3.2 mirna 对植物叶和茎发育的影响对植物叶和茎发育的影响 mir156 是一个非常保守的 mirna 家族，在苔藓、蕨类以及高等植物中都存在 (jack, 2004)。过量表达 mir156 能使拟南芥的叶片数目增加上百倍，并且开花时间出现 延迟 (wu and poethig, 2006)。在玉米中，异时性 (heterochrony) 基因 corngrass1(cg1)编 码的就是 mir156，其表达量升高后，玉米的分蘖增加，植株变矮 (chuck, et al., 2007)。金鱼草中的 cincinnata (cin) 在叶片的形态建成中能够调控细胞的分裂。 cin作为 tcp家族中的一员，受到 mir319/jaw的调控 (palatnik, et al., 2003)。过量表达 mir319/jaw 会降低 tcp 基因的转录水平，同时导致拟南芥叶片褶皱，而过量表达抗 mir319/jaw 的 tcp2 却能够完全恢复 mir319/jaw 过量表达的表型 (schommer, et al., 2008)。 胁迫诱导棉花 microrna的差异表达分析 10 hd-zipiii (classiii homeodomain-leucine zipper) 基因是叶腹向发育的关键基因， 它们在叶的腹面表达, 并在转录后受到 mirna 的调控 (bowman, 2004)。phabulosa (phb)、phavoluta (phv) 和 revoluta (rev) 基因都编码 hd-zipiii 蛋白, 这些基 因都有一段与 mir165/166 互补的序列，并且它们的显性突变都破坏了 mirna 的结合 位点 (bao, et al., 2004)。rolled leaf1-original (rld1-o) 是 rev的同源基因。在玉米中的 不完全显性卷叶突变体中, 由于 rld1-o 与 mir166的匹配序列中发生了一个单核苷酸突 变 (ga)，导致 mir166 不能正常切割 rld1-o mrna，使得 rld1编码的蛋白在叶背面 持续表达，从而引起叶片向腹面卷曲 (juarez, et al., 2004)。在研究芸苔属作物叶卷曲的 表观遗传调控机制中，采用比较基因组学和遗传学的方法研究了双链 rna 结合蛋白 hyl1 和 bcplh 及其 mirna 对叶片发育的调控作用，表明 hyl1 基因调控 mir165/166的生物合成，引起叶片近远轴极性的丧失 (xu, et al., 2007)。对植物极性建 成的分子机理的研究表明，转录后基因沉默途径与转录因子 as1/as2 途径共同抑制 mir165/166，从而促进叶片近轴面分化 (ueno, et al., 2007)。拟南芥 serrate (se) 基因 编码锌指环蛋白，它通过调控 mir166 的合成来影响 hd-zipiii 家族的 phb 基因的表 达。se基因突变后能破坏 mir165/166的生物合成，从而导致分生组织增大和叶片腹向 化 (yang, et al., 2006)，可见 mirna对 hd-zipiii 的调控也有助于协调 sam 的表达和叶 原基的分化。 1.3.3 mirna 对根发育的影响对根发育的影响 生长素 (auxin) 在植物发育和对外界环境应答的过程中扮演重要角色，它参与的 许多反应都是由生长素应答因子 (auxin response factors，arf) 介导的 (liscum and reed, 2002)。生长素应答因子与一种调控蛋白（aux/iaa) 形成异源二聚体后共同调控 生长素信号途径中的下游基因，从而调控植物的生长发育 (tam, et al., 2000)。目前， 已知许多 arf 家族的成员都是 mirna 的靶基因。arf10、arf16 和 arf17 是 mir160 的靶基因 (rhoades, et al., 2002)。抑制 mir160 表达能够提高 arf17 mrna 的表达水 平，改变受生长素诱导的 gh3 类基因的表达，其中 ydk1/gh3.2 和 gn3.3 的 mrna表 达量增加，gh3.5 和 dfl1/gh3.6 的 mrna 表达量减少，它们均编码生长素结合蛋白 (joglekar, et al., 2007)。这些基因表达量的变化使植物产生明显的发育缺陷，表明了 mir160介导 arf17 mrna调控的重要性，同时也说明了 arf17 是 gh3 类生长素早期 反应基因的调控子 (teichmann, et al., 2008)。arf6和 arf8 是 mir167的靶基因。在水 山东农业大学博士学位论文 11 稻中，建立了生长素-mir167-arf8-osgh3.2 的调控模式 (yang, et al., 2006)。arf3 和 arf4被证实是反式作用 sirna 的靶基因 (williams, et al., 2005)。 植物根冠细胞由根分生区末端的干细胞分化而来，它的形成受生长素信号的调 控。在拟南芥中，mir160 通过负调控生长素应答因子 arf10、arf16 和 arf17 的表 达而控制根冠细胞的形成 (mallory, et al., 2005)。过量表达 mir160 或 arf10、arf16 双突变都会造成拟南芥根尖呈瘤状并失去重力感应性，根分生区末端的干细胞分化受 到阻遏；失去 mir160 对 afr16 表达的调控，则会导致拟南芥呈多向性生长，表 明 mir160 对 arf 基因的正常表达和准确定位的调控作用对根冠细胞的形成有重要的 作用 (wang, et al., 2005)。拟南芥侧根的生长也受 mirna的调控。mir164的靶基因是 5 个 nam/ataf/cuc (nac) 基因，其中包括传递生长素信号对侧根的成熟有重要作用 的转录因子 nac1 (kim, et al., 2009, laufs, et al., 2004)。mir164 可以裂解 nac1 mrna，减少 nac1 蛋白的表达量。nac1 mrna 中与 mir164 配对的碱基发生突变或 者 mir164 表达受阻遏都会导致拟南芥侧根增生 (guo, et al., 2005)。在 mir164 的两个 t-dna插入突变体 (mir164a 和 mir164b) 中，nac1 表达水平上升，侧根数量也明显增 多；相反，在野生植株中过表达 mir164 则会导致 nac1 mrna 和侧根数量的减少 (guo, et al., 2005; sieber, et al., 2007)。 1.3.4 mirna 参与发育时序调控及其它调控作用参与发育时序调控及其它调控作用 前面提到的 mir172 除了能调控 ap2 影响花器官的分化形成以外，它还调控着其 它几个 ap2-like 基因，如 toe1、toe2、toe3、smz 和 snz。其中 toe1 和 toe2 两 个基因可以抑制植物由营养生长向生殖生长的转变 (aukerman and sakai, 2003)。过量 表达 snz 或者 smz，也可以引起晚花的表型，但是具体调控机理还需要进一步研究。 同样作为 mir172 靶基因的 ap2-like 基因 glossy15，是玉米中控制从营养生长到生殖 生长的关键基因 (lee, et al., 2010)。glossy15 活性的增高不仅使幼叶增多，而且还会 延缓生殖发育。mir172 对 glossy15 转录水平进行负调控，从而促进玉米幼叶向成熟 叶转变 (lauter, et al., 2005)。此外，一些与 mirna 生成途径相关的一些重要基因 (hst、ago7、rdr6 和 sgs) 也影响植物由营养生长向生殖生长的转变（许振华等, 2010）。 生长素在植物发育和对外界环境应答的过程中扮演着重要的角色，它参与的许多 反应都是由生长素应答因子介导的 (liscum and reed, 2002)。除了前面提到的 mir160 所调控的 arf10、 arf16 和 arf17 之外，arf6 和 arf8 也是 mirna 的靶基因 (wu, 胁迫诱导棉花 microrna的差异表达分析 12 et al., 2006)。在水稻中存在生长素-mir167-arf8-osgh3.2 的调控模式 (yang, et al., 2006)。植物体内 mir159 水平受 ga 调节，mir159 作用于靶基因 gamyb 转录因子， 参与 ga 启动的花器官分生组织决定基因 leafy 的激活，调节短日照植物开花时间和 花药的发育 (allen, et al., 2007) 。同时 mir159还受脱落酸 (aba) 诱导表达，通过作用 于两个 myb 转录因子基因 myb33 和 myb101 对调控种子萌发起重要作用 (reyes and chua, 2007)。liu等 (2009) 研究发现 mir159、 mir394的表达受 eth调节；mir166 和 mir319 表达受 ga 调节；mir172 和 mir319 的表达受 ck 调节；mir167 和 mir413 的 表达受 aba调节，但这些 mirna参与激素的信号传导途径及作