（环境科学专业论文）基于16s+rdna水平的海洋厌氧活性菌株的分类学研究.pdf

人连交通人学i ：学硕f ：学何论文 f i l l im l a b s t r a c t t a x o n o m i cr e s e a r c ha b o u ta n a e r o b i ca c t i v i t yo fs t r a i n so fm a r i n e ，n o to n l yh e l p su st o e x p l o r et h em a r i n ee n v i r o n m e n to ft h er e s o u r c e s ，e x p a n d st h et y p e so fn e ws p e c i e sa n d q u a n t i t y ，b u ta l s oi st h en e c e s s a r yc o n d i t i o na b o u tt h es t u d yo fm a r i n ea n a e r o b ea n t i b i o t i c s t h e r ei sv a r i e t yo fm a r i n em i c r o o r g a n i s m si nt h eo c e a n b e c a u s eo ft h ed i v e r s i t yo ft h e l i v i n ge n v i r o n m e n t ，s u c ha sl i g h t ，o x y g e n ，p r e s s u r ea n do t h e rf a c t o r s ，m a r i n em i c r o o r g a n i s m s h a v et h ed i f f e r e n tm o r p h o l o g i c a ls t r u c t u r ea n dp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n s a n da b o u t8 0 a r e a n a e r o b i co n e s ，s u c ha sp h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i a ，s u l f a t e r e d u c i n g b a c t e r i a ，d e n i t r i f y i n g b a c t e r i a ，m e t h a n e p r o d u c i n gb a c t e r i a ，e t c t h ee n z y m a t i cs y s t e mo f m e t a b o l i s mi s b i g d i f f e r e n tb e t w e e nm a r i n ea e r o b i cm i c r o o r g a n i s m sa n da n a e r o b i co n e s i nt h e o r y ，t h e s e c o n d a r ym e t a b o l i t e sw i l lb eag r e a t e rd i f f e r e n c ew h i c hp r o d u c e db yd i f f e r e n tm e t a b o l i s m a n dd i f f e r e n tr e s p i r a t o r yp r o c e s s e s t h e r e f o r et h et a x o n o m yr e s e a r c ho ft h em a r i n ea n a e r o b i c m i c r o o r g a n i s m sh a st h ev i t a ls i g n i f i c a n c et ot h en e wa n t i b i o t i c ss c r e e n i n ga n dt h en e w m e d i c i n e sd e v e l o p m e n t i nt h i sp a p e r ，2 9s t r a i n so fm a r i n ea n a e r o b i cb a c t e r i aw e r ei s o l a t e df r o ms a m p l e s ，i n c l u d i n g 9s t r a i n so fm a r i n ep h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i a ，1 6s t r a i n so f m a r i n ed e n i t r i f y i n gb a c t e r i a ，4s t r a i n s o ft h em a r i n em a n g a n e s e o x i d i z i n gb a c t e r i a 5o ft h e mh a db e e ni d e n t i f i e db y16 sr d n a r e s u l t ss h o wt h a tt h ef i v es t r a i n sh a v es i g n i f i c a n td i f f e r e n c e si nm o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r s t h em a r i n eb a c t e r i u md n 7w a si d e n t i f i e da sp s e u d o m o n a ss t u t z e r fw h i c hh a st h eo b v i o u s i n h i b i t i o nt ob a c i l l u ss u b t i l i sa n dp s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a t h e r ei so n l y9 7 s i m i l a r i t y b e t w e e nm a r i n eb a c t e r i u md n 3 1 s1 6 sr d n aa n do t h e r si ng e n b a n k ，i th a sb e e ni d e n t i f i e d a san e ws p e c i e so f a l t e r o m o n a s k e yw o r d s ：a n a e r o b i cb a c t e r i a ：a n t i b a c t e r i a la c t i v i t y ；1 6 sr d n a ：i s o l a t i o na n d i d e n t i 6 c a t i o n i l 大连交通大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢及参考 文献的地方外，论文中不包含他人或集体已经发表或撰写过的研究成 果，也不包含为获得太整塞通太堂或其他教育机构的学位或证书而 使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在 论文中作了明确的说明并表示谢意。 本人完全意识到本声明的法律效力，申请学位论文与资料若有不 实之处，由本人承担一切相关责任。 学位论文作者签名： 讶殇伊 日期： 伊罗年6 月中日 大连交通大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解太整塞通太堂有关保护知识产权及保 留、使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的 知识产权单位属太整塞通太堂，本人保证毕业离校后，发表或使用 论文工作成果时署名单位仍然为太整塞通太堂。学校有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件及其电子文档，允许论文被查 阅和借阅。 本人授权太董交通太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入 中国科学技术信息研究所中国学位论文全文数据库等相关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论 文。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此规定) 学位论文作者签名：诌彬矿 日期：细爷万月吵日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 申子信箱： 导师签名： 魄砷 移军 年6 只乎b ， 电话： 邮编： 绪论 绪论 陆生微生物发酵产物一直是制药工业中抗生素的重要资源之一，然而由于研究历史 比较久，同时研究方法的落后和理论模型的陈旧，寻找新的种属的微生物或筛选新的活 性代诩 产物的难度越来越大，因而使新药的歹f 发面临挑战。寻找新的抗生素资源，人们 自然的把目光从陆地转向海洋。海洋是生命之源，人类物质资源的天然宝库。其生物量 约占地球生物总量的8 0 ，生物种类2 0 万种以上，蕴藏着丰富的药用资源。 由于海洋环境的特殊条件，使海洋微生物具有丰富的生物多样性，近年来的研究发 现海洋微生物及其代谢产物的活性成分具有化学结构的多样性，生物活性的多样性，高 生物活性，特殊作用机制等一些非常值得注意的特点。只本近年来对海洋微生物进行了 广泛研究，发现约有2 7 的海洋微生物具有抗菌活性。许多成分是陆地生物中不存在 的，这为人工合成抗菌药物提供了新颖的先导化合物。 在过去的十年中，通过微生物筛选来寻找抗菌素和其它具有医疗和保健价值的活性 化合物的丌发研究诈在迅速展开。许多具有新分子结构的抗菌、抗病毒化合物已被分离 和鉴定，其活性成分是多种多样的，包括萜烯脂肪酸、大环内酯类、醌类、肽类、生物 碱、醚类及杂环化合物等，其中有些成分的结构、性质已被阐明，也有许多尚未鉴定其 活性分子结构的微生物萃取物，用于预防和治疗水产养殖动物的病害。海洋微生物作为 个极其重要的，不可取代的具医药价值的生物活性物质的来源，其意义还在于所含生 物活性分子结构较简单的化合物可作为人工合成的模式，而所含大量的结构复杂的化合 物，人类目前尚无法合成，只能依赖从微生物细胞中提取。因此，用微生物发酵法的前 景非常广阔。 人选交通大学i 。学硕十学1 _ 奇：论文 第一章文献综述弟一早义陬综尬 在当今抗生素普遍应用的时代，社会和科学界对细菌的耐药性迅速出现显得措手不 及，因此迫切需要新类型的抗生素快速和持续的丌发，以适应细菌抗生素敏感性改变的 速度。 由于海洋环境的特殊条件，使海洋微生物具有丰富的生物多样性，近年来的研究发 现海洋微生物及其代谢产物的活性成分具有化学结构的多样性，生物活性的多样性，高 生物活性，特殊作崩机制等一些非常值得注意的特点。同本近年来对海洋微生物进行了 广泛研究，发现约有2 7 的海洋微生物具有抗菌活性。许多成分是陆地生物中不存在的， 这为人工合成抗生素提供了新颖的先导化合物。 1 1 海洋微生物的栖息地及其多样性 从多样性的观点来看，海洋生物的种类要比陆地生物多得多。微生物在海洋中的分 布极其广泛，有的生活在海水中，有的存在于一些海洋沉积物和海泥的表面，还有一部 分与海洋动、植物处于共生、共栖、寄生或附生的关系中。海洋微生物在海洋当中的分 布数量以海泥或海绵为最多，其中海绵当中微生物的含量可达4 0 。据估计海洋微生物 种类大约有1 0 0 2 0 0 万种，正常海水中微生物数量在1 0 6c f u m l 以下，动植物表面附 生的细菌数为1 0 4 1 0 6c f u g ，放线菌为7 7 1 0 3 - 5 2 1 0 4c f u g ，真菌数为5 4 1 0 4 - 3 1 1 0 5 c f u g 。海洋动物肠道细菌数为1 1 2 1 0 5 - 1 4 5 * 1 0 6c v t j g ，放线菌数为1 0 1 0 3 8 2 半1 0 3 c f u g ，真菌数为1 0 木1 0 3 | 2 1 * 1 0 4c f u g 。由于传统微生物培养法的局限和海底深部生 物圈生境的特殊性，从深海沉积物中分离培养得到的微生物数量非常有限，常常低于总 细胞计数的。尽管如此，这些分离到的菌株仍然代表了多样的微生物功能类群，包括需 氧氨化菌、硝酸盐还原菌、厌氧发酵异养菌、硫酸盐还原菌、产乙酸菌、产甲烷古菌、 嗜热的厌氧异养菌和厌氧十六烷氧化菌掣。 1 1 1 病毒 根据p r o c t o r 的研究，在海洋环境中，除含有寄生于藻类等动植物和微生物体内外的 病毒之外，还有大量自由存在的病毒【2 1 。在海洋真光层中病毒的数量较大，随深度的增 加其丰度逐渐减小，沿岸水中的病毒丰度高于外海，而在接近海底的水层中其丰度又有 所回升1 3j 。许多自由生活的海洋病毒比从海洋寄主分离的噬菌体和病毒要小。现推测这 些自由存在的海洋小病毒的来源有以下几种j 能性：这些天然的病毒原本就小于已培养 的噬蒲体、或属于二小型噬菌体成员、或属f 真核生物病毒、或由细菌产生的非侵染性颗 2 第一章文献综述 粒、或是病毒大小的有机无机胶体。山于受研究方法和手段的局限，有关结论尚需进一 步研究。 1 1 2 细菌 许多海洋细菌，包括蓝细菌，都归为真细菌。它们几乎都是单细胞的，为革兰氏阳 性和革兰氏阴性菌，但革兰氏阴性菌占到9 5 。以1 6 sr r n a 片断作探针，以f i s h 杂 交法对样品的微生物类群进行分析时发现主要为一些放线菌、g + c 低的革兰氏阳性菌、 b 和 r 亚门紫细菌、黄杆菌、绿硫细菌、绿非硫细菌，同时发现原来的研究当中低估了 革兰氏阳性菌的比例，而这些革兰氏阳性菌大多为放线菌【剞。w o e s ecr 将细菌规为1 2 大类群1 5 j 。 海洋微生物而吉，迄今为止，被发现和报道的细菌基本属于以下几个系统类群：变形 杆菌群( p r o t e o b a c t e r i a ) 、嗜纤维菌属黄色杆菌拟杆菌类群 ( c y t o p h a g a f l e x i b a c t e r - b a c t e r o i d e s ) 、蓝细菌群( c y a n o b a c t e r i a ) 、浮霉状菌- 衣原体群 ( p l a n c t o m y c s c h l a m y d i a ) 、螺旋体群( s p i r o c h e t e s )革兰氏阳性细菌群( g r a mp o s i t i v e b a c t e r i a ) 等系统类群。 1 1 3 古生菌 古生菌( 3 z 称古菌) 是存在于极端海洋环境当中的重要栖息者，代表了原核微生物的 一个主要分支，除与细菌在形态分化上存在区别外，还表现出独特的生理生化特性，如 在胞壁中缺少肽聚糖( 因而对b 一内酞胺类抗生素不敏感) ，具有醚连接而非醋连接的脂膜 等。古生菌是异源生物类群，包括白养菌和异养菌两种类型，多生活于极端环境中( 高 盐、高压、高温或极端p h 等、) 1 6 j ，但也发现古生菌也广泛地分布于大洋、近海、沿岸等 非极端的海洋环境中【7 】o 在海洋微型浮游生物中古菌广泛分布，水深1 0 0 米以下的含量 可达微型浮游生物中原核生物r r n a 的2 0 3 0 1 8 1 。 1 1 4 真核微生物 海洋真核微生物可分为三个大的类群：以光能自养方式营养生长的，如微藻；以吞食 有机物的方式进行化能异养，即吞噬作用，如原生动物；以吸收方式进行化能异养，此 为真菌的特征。目前许多海洋真核微生物已被人工培养。 3 人连交通人4 学l ：学硕卜学位论史 1 2 海洋微生物代谢产物的研究进展 1 2 1 抗菌活性的研究 1 9 6 6 年，b u r k h o l d e r l 9j 从海洋假单胞菌分离到抗生素硝吡咯菌素( p y r o l n i t r i n ) ，掀 丌了海洋微生物活性物质研究的序幕。 k e i s s l e r i e l l as py s 4 1 0 8 足从中国黄海沉积物中分离到的一株真菌，发酵液提纯得到 几种抗真菌次级代谢产物，其中一种聚酮类物质， j 有全新的碳骨架，并且湿示出了对 c a l b i c a n s ，t r i c o p h y t o nr u b r u m 和a n i g e r 这三种真菌具有很强的抑制作用1 1 0 】。 国内曾春民等j 从人亚湾分离到细菌种p s e u d o m o n a ss p 能产生化合物灵莴红素 ( p r o d i g i o s i n ) ，该色素可作为天然色素或抗菌素的丌发。 郑志成等1 1 2 】从厦门地区红树根际海泥中分离到一株链霉菌，该菌产生的抗生素 s 1 1 1 - 9 ，对革兰氏阴性菌和真菌具有抑制作用。 a n d e r s o n i ”l 等使用非选择性分离技术，从北太平洋海水中分离到一种能产生抗生素 和紫色素的色杆菌，这种化合物能抑制金黄色葡萄球菌。 ( 2 ) 海洋放线菌 海洋放线菌是活性物质的主要来源之一，由海洋放线菌中发现了一大批结构新颖、 生物活性独特的化合物。f e d e r i c as p o n g a 等对约4 0 0 0 0 株来自全球不同海域的海洋微生 物的研究结果表明：对于能产生活性物质的放线菌，3 1 属于链霉菌( s t r e p t o m y c e t e s ) ， 6 9 属于稀有放线菌。 ( 主要是小单胞菌属：m i c r o m o n o s p o r a s ) 2 0 0 4 年，o k a m i l l 4 l 研究小组首次从海泥样品中分离到一株可以产生抗肿瘤活性物质 的放线菌成紫硬块钦氏菌( c h a i n i ap u r o g e n a ) s s 一2 2 8 。2 0 0 5 年，o k a m i 研究小组又 从海泥中分离到一株链霉菌属s t e n j i m a r i e n s i s ，其产生的氨基糖苷类抗生素i s t a m y c i n s ， 对革兰氏阳性菌和阴性菌都有很强抑制作用。 t r i s c h m a n 等【1 5 1 分离到的链霉菌c n b 0 9 1 可产生一种新的二环肽s a l i a m i d ea 和b ， 具有新的缩酚酸肽( d e p s i p e p t i d e ) 骨架，能抑制所有革兰氏阳性菌。 我国福建海洋研究所黄维真等1 1 6 】从福建沿海底泥中分离到一株海洋放线菌一鲁特 格斯链霉一菌鼓浪屿亚种( s r u t g e r s e n s i ss u b s p g u l a n g y u n i n s i s ) ，这株耐盐、嗜碱放线菌能 够产生抗菌谱广、毒性低的抗菌物质m i n o b i o s a m i n e 和肌醇胺霉素等，对绿脓杆菌和一 些耐药性革兰氏阴性菌具有较强的活性。 ( 3 ) 海洋真菌 4 第一章文献综述 产活性物质的真菌分别来自a c r e m o n i u m ，a l t e r n a r i a ，a s p e r g i l l u s , c h a e t o m i u m c l a d o s p o r i u m ，g e o t r i c u m ，g l i o m a s t i x ，h u m i c o l a ，p a e c i l o m y c e s ，p e n i c i l l i u m ，p e s t a l o t i a ， p h o m a ，p l e c t o s p h a e r e l l a ，s c o p u l a r i o p s i s ，s t a c h y b o t r y s ，t r i c h o d e r m a 等属。 海洋真菌活性成分的研究自上世纪8 0 年代中期才开始有零星的报道，第一个报道的 海洋真菌抗生素为l e p t o s p h a e r i n o n u k i 等从海泥中分离得到一株真菌p e n i c i l l i u m s p n 11 5 5 0 1 ，得到一个抗菌代谢产物n 11 5 5 0 1 a o k u t a n i 等从印度洋中的真菌a s p e r g i l l u s s p 的培养液中分离到一株新型环缩二氨酸g l i o t o x i n ，它对s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ，b a c i l l u s s u b t i l l u s 具有抗菌活性月麦l i s ar a h b a k 从真菌a s p e r g i l l u si n s u l i c o l a 中发现一个对硝基 苯酸醋倍半萜i n s u l i c o l i d l l 7 l 。x u 等从佛罗罩达沿海采集到一株真菌，经鉴定为葡萄状穗 霉属的一个新种s a t c h y b o t a y ss p ，抑菌试验表明该菌培养液的粗提物同时具有抗细菌和 抗真菌活性。j a d u l c o 等从海绵n i p h a t e s o l e m d a 分离到一株真菌c u r v u l a r i al u n a t a ，得到3 个化合物：c y t o s k y r i na ，a b s c i s i ca c i d 和l u n a t i n ，它们对b a c i l l u ss u b r i l i s 、s t a p h y l o c o c c u s a u r e u s 和e s c h e r i c h i ac o l i 有抑制作用。a l b a u g h 等从我国深圳潮间带红树林分离到一株 海洋真菌h y p o x y l o no c e a n i c u m l l - 1 5 6 2 5 6 ，在其代谢物中分离到一种作用于真菌细胞壁， 合成新靶位的脂肽类抗菌物质1 5 g 2 5y ，能有效抑制植物和人类病原真菌的生长。l i u 等【1 8 l 在中国黄海海底沉积物中分离到丝状真菌k e i s s l e r i e l l as p y s 4 1 0 8 ，经培养后纯化锵 到化合物3 ，6 ，8 三羟基3 【3 ，5 二甲基2 羰基3 ( e ) 庚烯基】- 2 ，3 二氢萘1 ( 4 h 4 酮，对白色念珠菌、红色毛霉菌和黑曲霉菌有生长抑制作用。 近年来，国内也开始开展海洋真菌的研究。刘晨临等1 1 9 】从青岛侧花海葵和绿海葵体 分离到2 3 株真菌，并对其产生的抑菌活性物质进行了初步测试。从2 3 株真菌中筛选出 3 株有较好抗植物病原真菌活性的菌株，其中青1 1 1 的代谢产物对立枯丝核菌 r h i z o c t o n i as o l a n i 有较强的抑制作用。李淑彬等i2 0 l 从南海海泥中分离出一株编号为m 1 8 2 的霉菌，初步鉴定为青霉p e n i c i l l i w ns p ，该菌所产生的广谱抗生素m 1 8 2 a ，对细菌、 酵母真菌及丝状真菌均有抑制作用。 ( 4 ) 微藻 微藻同原生动物一样都是真核原生生物，属微生物范畴。微藻中的许多种属都报道 能产生生物活性物质。 p r a t t 等是最早从微藻巾分离抗生素的研究者，他们从小球藻c h l o r e l l a 中分离到小球 藻素( c h l o r e l l i n ) 脂肪酸混合物，此混合物具抗细菌和自身毒性的功能。h a n s e n 研究 发现马汉母褐胞藻o c h r o m o n a sm a l h a m e n s i s 中存在一种结构尚未鉴定清楚的叶绿素酯 ( c h l o r o p h y l l i d e s ) 抗生物质。p e s a n d o 研究表明h 本星杆藻a s t e r i o n e l li a p o n i c a 中产牛 的顺二十碳h 烯酸( c i s e i c o s a p e n t a e n o i ca c i d ) 的光氧化产物具极强的抗牛活性i s h i b a s h i 5 人造交通人学i ：学硕卜学位论丈 等从伪枝藻s c y t o n e m ap s e u d o h o f m a n n i 中分离的s c y t o p h y t i n a 具有广谱的抗真菌作用。 从褐囊藻p h a e o c y s t i s p o u c h e t i i 中分离到的丙烯酸( a c r y l i ca c i d ) ，对革兰氏阳性细菌、 酵母菌、曲霉菌等很有效的抗菌物质。s t a r r 等从夏威夷的蓝藻l y n g b y am a j u s c u l a 藻体 的甲醇提取物中发现有抗生素活性，对m i c r o c u c c u s p y o g e n e sv a t a u r e e u s ，m y c o b a c t e r i u m s m e g m a t i s 等有拮抗作用。 1 2 2 抗肿瘤活性的研究 海洋细菌是海洋微生物抗肿瘤活性物质的一个重要来源，主要集中在假单胞菌属、弧 菌属( v i b r i o ) 、微球菌属、芽孢卡r 荫属、肠卡l 蔺属( e n t e r u b a c r e r i u m ) 、交替单孢菌属 似i t e r o m o n a s ) 、链霉菌属、钦氏荫属、黄杆菌属和小单孢菌属( m i c r o m o n o s p o r a ) p 2 3 j 。 f e ! 是，自1 9 6 6 年b u r k h o l d e r 从海洋假单胞菌分离得到具抗癌作用的抗生素硝毗咯菌素 ( p y r o l i n t r i n ) 丌始，直到上个世纪木人们j 对海洋细菌的筛选、培养及代谢产物的研究重 视起来，以期从中得到新的特效抗癌药物。 1 9 8 3 年，u m e z a w a l 2 4 j 等就从海洋湿润黄杆菌( f l a v o b a c t e r i u mu l i g i n o s u m ) 的代谢产物 中得到一种杂多糖m a r i n a c t a n ，具有增强免疫活性、促进体液免疫和细胞免疫功能，对 小鼠肉瘤1 8 0 有明显抑制作用，还能抑制动物移植肿瘤，与化疗药物在抗肿瘤方面协同作 用，已作为治疗肿瘤的佐剂上市。 近几年又从海洋细菌中分离到多种抗肿瘤活性物质如新的异香豆素p m 9 4 1 2 8 1 2 5 j 、 赛可拉林( t h i o c o r a l i n e ) 和i b 9 6 2 1 2 1 2 6 j 等对肿瘤细胞p 3 8 8 、肺腺癌a 5 4 9 、结肠癌h t 2 9 及小鼠红白血病m e l 2 8 表现出很强的细胞毒性。大环内酯化合物m a c r o l a c t i n sa 是深海 底泥中一株革兰氏阳性细菌c 2 3 发酵产生的一种物质，对小鼠黑素瘤细胞b 1 6 f 1 0 的 i c 5 0 为3 5 , u g m l l 2 7 1 。醌环类抗生素k o s i n o s t a t i n 对人的骨髓性自血病u 9 3 7 细胞有明显 的细胞毒性0 c 5 0 为o 0 9 比m o l l ) ，并对2 种人类癌细胞具有抑制作用( i c 5 0 小于0 1 m o l l ) 1 2 8 1 。新萘醌类抗生素n e o m a r i n o n e l 2 9 j 在体外对h c t 1 1 6 有中等细胞毒性 0 c 5 0 = 0 8 m g l ) ，对6 0 个人类肿瘤细胞群i c 5 0 平均值为1 0 t m o l l 。f e n i c a l 研究组从 一种新的海洋放线菌分离出结构新颖的生物碱类化合物s e s b a n i m i d ea 和c ，对血癌细 胞l 1 2 1 的i c 5 0 达o 8n g m l 州，其中s a l i n o s p o r a m i d ea 对大肠癌细胞株h c t 1 1 6 肿瘤 细胞的i c 5 0 为1 1n g m l l 3 1 】，分离白海藻表面的细菌在含海水培养基中发酵能产生多糖 类化合物，对小鼠实体瘤具有抑制作用1 3 2 。 1 2 3 其他代谢产物的研究 ( 1 ) 酶 6 第一章文献综述 在海洋生态环境下，极端微生物的发现和研究，促进了新酶源的开发应用。海洋细菌 产生的酶常常具有特殊的理化性质，特别是在极端环境下的高活性和稳定性1 3 引。各国在 海洋蛋白酶领域都有较多的研究，其中以低温蛋白酶的研究最多。这些产蛋白酶海洋细 菌通常具有嗜低温的特性，有些海洋细菌适宜在偏碱性的条件下生长并产酶1 3 4 , 3 5j 。某些 高温蛋白酶的酶活性和热稳定性可随压力升高而提高，而且升压可以提高深海细菌某些 酶的产量【3 6 , 3 7 l 。另外，s u n o nl e e 等【3 8 1 从海洋交替假单胞菌( p s e u d o a l t e r o m o n a ss p ) a 2 8 分离出一种蛋白酶，还具有杀灭s c o s t a t u m n i e s 3 2 4 的活性。 王鹏等【3 9 】筛选到一株产岩藻多糖酶的海洋芽孢杆菌，可用于催化生产低分子质量的 岩藻多糖。医药上用于治疗消化不良、食欲不振的纤维素酶、脂肪酶【删也逐渐在海洋 细菌中寻求发现。日本科学家s u g a n o 等【4 1 l 较为系统地研究了海洋弧菌f i b r i o s p j t 0 1 0 7 的琼脂糖酶。杨承勇纠4 2 】从南海海水中分离到产几丁质酶的弧茵( v i b r i os p ) 。 此外新型碱性金属内肽酶、碱性磷酸酶、海藻解壁酶、葡萄糖降解酶、甘露聚糖酶、 过氧化物酶、褐藻胶裂解酶等各种酶类在海洋细菌中均有发现”3 刖j 。 ( 2 ) 酶抑制剂 在酶抑制剂研究这方面有突出贡献的是日本梅泽宾夫的工作，他们筛选了5 0 多种 酶抑制剂。c a t h e s t a t i n s 是海洋细菌产生的一种热稳定性的组织蛋白酶抑制剂，在治疗骨9 病等方面具有一定的应用前景【4 5 1 。d i o c t a t i n 是一种分离自放线菌的新型物质，对二肤酰： 氨基肤酶有抑制作用，可望用于治疗关节炎等疾病f 4 引。在海洋假单胞菌中，一种新型的 几丁质酶抑制剂也被发现。分离自日本油壶湾海水水样的一种交替单孢菌b 1 3 1 ，能产 生蛋白酶抑制剂m a r i n o s t a t i n s ，这是多组分的活性物质，研究结果表明m a r i n o s t a t i nc 活 性位点的氨基酸序列明显地不同于陆栖微生物产生的蛋白酶抑制剂。k o b a y a s h i 等1 4 7 j 从 一种黄杆菌( f l a v o b a c t e r i u ms p ) 中分离出f l a v o c r i s t a m i d e s a 和b ，其对真核d n a 复制酶， d n a 聚合酶a 显示出抑制活性。k o n o 等【4 8 j 从海洋细菌s a n k 7 1 8 9 6 的培养液中分离出 了一系列新的活性代谢物b 5 3 5 4 a 、b 和c ，均能抑制鞘氨醇激活酶，其i c 5 0 分别为2 1 、 5 8 、3 8 t m o l l 。此外半胱氨酸蛋白酶抑制剂b 1 3 7 1 a 和b 1 3 7 1 b 、新的内皮肽转化酶抑 制剂b 9 0 0 6 3 1 49 j 等诸多酶抑制剂都从海洋细菌培养液中分离得到。因此海洋细菌成为新 型酶抑i i l i i 筛选的一个重要来源。 ( 3 ) 多不饱和脂肪酸( p u f a ) 海洋多不饱6 1 1 1 肪酸( p o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d ，p u f a ) 的代表是二十碳五烯酸( e p a ) 和二十二碳六烯酸( d h a ) 。海洋细菌中的e p a 是磷脂型的，优于鱼类的中性脂质e p a ， 没有特殊的鱼腥味，因此从海洋细菌中获取e p a 和d h a 具有广阔的应用前景。 7 人连交通人i ：学硕卜学何论文 1 9 7 3 年，o l i v e r 等在海洋细菌中发现有多不饱和脂肪酸存在。1 9 7 7 年，j o h n s 等从 海洋的多形屈挠杆菌( f l e x i b a c t e r p o l y m o r p h u s ) 分离得到e p a ，证明了原核生物也具有合 成p u f a 的能力。目前发现的p u f a 产生菌全部是深海细菌和极地细菌。r o s s e l l o m o r a 1 5 0 j 通过5 s 和1 6 sr d n a 序列分析，确认这些海洋细菌为革兰氏阴性菌，分别属于： c o l w e l l i a 、希瓦氏菌( s h e w a n e l l a ) 、交替单胞菌、交替假单胞菌( p s e u d o a l t e r o m o n a s ) 和 f e r r i m o n a s 。其中c o l w e l l i a 和希瓦氏菌被认为是生产p u f a 的主要海洋细菌种属。y a z a w a f ”1 分离到的一株海洋细菌中，e p a 含量占总脂的2 4 4 0 ，占细胞干重的2 。王黎等 1 5 2 】从海鱼中分离到一株细菌w l - 1 0 2 1 ，其合成的p u f a 与美国产深海鱼油制品结构近似， p u f a 中的e p a 和d h a 含量较高。 ( 4 ) 其他活性物质 从海洋细菌中分离筛选的天然活性产物还有多糖、维生素、氨基酸等【5 3 】，如：m i k iw 等( 1 9 9 6 ) 从一种屈挠杆菌( f l e x i b a c t e rs p 1 分离出类胡萝卜素；方金瑞等( 1 9 9 6 ) 分离到类胡 萝卜素和b 胡萝卜素。 1 3 海洋厌氧活性菌株的研究 目前，由于技术难度问题，研究者关于海洋微生物的活性代谢产物几乎都是基于海 洋好氧微生物，在海洋中由于海水的存在，好氧微生物基本分布在靠近海岸线附近的潮 l 、日j 带和海水的浅表面。而绝大部分的微生物属于另一大类：厌氧微生物，它们广泛的分 布于海洋的各个角落。由于生活环境的多样性，厌氧微生物总类繁多、形态各异，并且 具有好氧微生物所不具备的生理代谢途径，理论上必然产生与之不同的次生代谢产物。 因此其作为海洋活性物质研究来源的潜力巨大。从公开报道的文献来看，海洋厌氧菌活 性化合物的研究仅限于海洋光合细菌，几乎不涉及到其他种群的海洋厌氧细菌。 同本在对海洋光合细菌的研究始于1 9 9 1 年，东京农业技术大学的j g r a n tb u r g e s s 等 1 5 4 j 从海洋中分离到2 0 0 株光合细菌。进一步的抗菌实验表明，其中两株对啤酒酵母菌有 明显的抑制作用。其代谢产物用有机溶剂提取后具有光谱抗菌活性，利用层析法对其代 谓 产物分离得到两个具有抗菌活性的化合物。这是首次发现海洋光合细菌具有光谱抗菌 的活性，同时海洋细菌的细胞内部也可产生抗生素。2 0 0 0 年，m e l o 等1 5 5 l 从光合细菌 c h r o m o b a c t e r i u mv i o l a c e u m 中提取出活性物质，进行药理活性检测，结果显示该粗提物 对v 7 9 纤维原细胞具有较高的毒性( c c 5 0 = 7 g l ) 。其原理是染色质浓缩和细胞核酸容 量的减少而导致v 7 9 纤维原细胞在形态上的变化。同时对白血病和淋巴瘤细胞细胞株具 有有效的抑制作用( i c 5 0 = 1 0 8 m ) ，后定名为紫色杆菌素。2 0 0 1 年，l e o n 等1 5 引，从热 带和哑热带的海洋中分离剑，株光合细菌c h r o m o b a c t e r i u mv i o l a c e u m ，用一系列的手段 8 第一章文献综述 对此菌株产生的紫色杆菌素进行抽提，过滤、萃取、结晶和高效液相色谱的方法进行纯 化，通过核磁共振、质谱分析、紫外和红外光谱手段对其结构进行解析，最终确定其分 子结 构为 3 - 1 ，2 - d i h y d r o 一5 一( 5 一h y d r o x y 一1 h i n d o l - 3 y 1 ) 一2 一o x o - 3 h p y r r o l - 3 - y l i d e n e 】 1 ，3 d i h y d r o 2 h i n d 0 1 2 1 。进一步研究表明紫色杆菌素对利什曼虫l e i s h m a n i a a m a z o n e n s i s 的抑制效果。原生动物l e i s h m a n i aa m a z o n e n s i s 可引起不同类型的疾病，如 皮肤传染病、黏膜与皮肤的传染病和内脏利什曼病等。但现在用于治愈此疾病的药物都 具有潜在的毒性。研究者通过测定紫色杆菌素的最小抑菌浓度值，同时与另一种治愈此 疾病的药物p e n t a m i d i n e 进行比较。虽然结果显示该菌素的最小抑菌浓度是治疗利什曼 虫病药物p e n t a m i d i n e 的1 0 倍，并且无毒，且不会引起肾、肝和心脏的不良反应，这个 发现对治疗该病有重大意义。随后，研究者们利用细胞形态观察、t r y p a nb l u e 染色和 m 丌等方法测试了紫色杆菌素的抗肿瘤活性，结果发现，此化合物对v e r o 、m a l 0 4 、 h e p 一2 、f r h k 4 细胞株、黑素瘤、m o l t 4 白血病、n c i h 4 6 0 肺癌和k m l 2 结肠癌细 胞株均有抑制作用1 5 7 。5 引。近几年，研究者发现光合细菌产生的生理活性物质具有很大的 应用价值。s a s a k ik 等【印】概述了光合细菌在医学领域的应用，此菌群能产生大量的生理 活性物质，包括v b l 2 辅酶q i o 、5 氨基乙酰丙酸( a l a ) 等等。其中a l a 已经被应 用于癌症、痤疮、髂骨损伤等疾病的诊断和治疗当中1 6 。此外，研究者从海洋光合细菌 提取的r n a 能作为提高免疫力和防止传染的辅助药物，也可以用于癌症治疗药物的输 送体系。而q i o 应用于心脏病的治疗已经有3 0 多年的历史【6 2 j ，其商业化生产丌始于2 5 年前。近几年发现辅酶q i o 具有增强心肌功能、抗休克、提高免疫力、改善细胞内呼吸 等多种生理功能，能够促进动物的生长，提高抗病能力，而且其商业产品已经在中国和日 本出现。辅酶q 1 0 的产量与氧化还原电位( o r p ) 矛h 光照有关，在厌氧光照下是好氧无光 时的两倍，所以光合细菌的应用能大大提高辅酶q 1 0 的产量。揭晶等1 6 3 j 概述了光合细 菌在农牧业、保健品、食物、医药等许多领域的应用。尤其指出，近年来，利用光合细 菌的代谢作用对中药进行生物技术处理，又开辟一新的研究领域，为现代新药的研究开 发，提供了一种全新的思路和方法，具有极大的研究价值【川。 1 4 海洋厌氧活性菌株分类学研究方法 近年来对于海洋微生物活性物质的研究越来越多，且文献报道活性菌株多集中于好 氧微生物，厌氧微生物中大多数也为海洋光合细菌，微生物种类较单一。构建具有抗菌 活性的海洋微生物资源库需要更广泛的筛选以扩大菌株的种类。光合作用过程中可以产 ，各种具有抗菌活性的次牛代谢产物，那么其他形式的能量代谢过程又如何? 比如硫酸 盐还原细菌、反硝化细菌、产甲烷荫等等，它们在代谢过程中会不会产生新颖的次生代 9 人迩变通人学i ：学硕十学f 节论文 谢产物? 海洋微生物多种多样，人类目前叮培养的不过1 1 6 5 l ，可供研究海洋活性物质 的少之又少，如何扩大研究范围是个亟待解决的问题。海洋厌氧菌活性菌株分类学研究 j 下是基于此目的。不断发现新的活性菌株，新的菌株类型，新的代谢方式，扩大研究对 象，4 能给活性化合物的研究打下一个坚实的基础。 海洋厌氧活性菌株分类学的研究目的是从不同海域的水样和泥样中，富集和分离到 一定数量的海洋厌氧菌或兼性厌氧菌，利用抗荫或抗肿瘤模型从中筛选出活性菌株，通 过对其1 6 sr d n a 的测序确定其分类学上的| 月属。海洋厌氧活性菌株分类学研究包括： 样品的采集方法、厌氧菌的分离方法、活性菌株的筛选方法、海洋厌氧菌细菌分类学。 1 4 1 样品的采集j ( 1 ) 水样的采集方法 水样采集的主要原则是水样必须具有足够的代表性，且必须不受任何意外的污染。 采样自，j 根据监测内容和监测项目的具体要求，选择适合的采样器和盛水器，要求采样器 具的材质化学性质稳定、容易清洗、瓶口容易密封。其次，确定采样总量( 分析用量和 备份用量) 。在运输过程中要注意盛水器应当妥善包装，以免它们的外部受到污染，特 别是水样瓶颈部和瓶塞，在运送过程中不应破损或丢失。为避免水样容器在运输过程中 因震动、碰撞而破损，最好将样品瓶装箱，并采用泡沫塑料减震或碰撞。需要冷藏、冷 冻的样品，须配备专用的冷藏、冷冻箱或车运送；条件不具备时，可采用隔热容器，并 加入足量的制冷剂达到冷藏、冷冻的要求。冷藏或冷冻能抑制微生物的活动，减缓物理 作用和化学反应速度。如将水样保存在2 2 左右的冷冻条件下，会显著提高水样中磷、 氮、硅化合物以及生化需氧量等监测项目的稳定性，并对后续分析测定无影响。 ( 2 ) 泥样的采集方法 底泥指水体沉积物。为了研究排入水体的污染物在底泥中的积累、分布、转化和迁 移的规律，需要采集底泥样品。水的流量和流速直接影响沉积物沉积的速度、厚度和颗 粒级配及其变化规律。受控制水体或受污染水域的沉积状况与自然条件下的不同。底泥 采样要考虑自然因素，也要考虑人为因素。海洋底泥采样一般与海洋地质调查或海洋综 合调查结合进行。采样点的布设随海洋调查的方式( 路线采样，面积采样) 而异。采样 方法有表层采样、拖网采样和柱状采样。小比例尺基础调