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文档简介

实验四醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质,一、目的,二、原理,电泳是指带电粒子在电场中向着与其电性相反的电极移动的现象。蛋白质是两性电解质。在pH小于其等电点的溶液中，蛋白质为阳离子，在电场中向负极移动。在pH大于其,1、了解电泳分离蛋白质的一般原理。2、掌握醋酸纤维薄膜电泳分离蛋白质技术。,1,等电点的溶液中，蛋白质为阴离子，在电场中向正极移动。血清中含有多种蛋白质，它们所具有的可解离基团不同，在同一pH值的缓冲液中所带净电荷不同，因此在电场中移动的速度也就不同，故可利用电泳法将它们分离。,本实验以醋酸纤维薄膜作为支持物，于浸有缓冲液的薄膜一端加微量血清，膜两端连接于缓冲液。所用缓冲液的pH为8.6，大于血清中各种蛋白质的等电点。因此，各种蛋白质皆带负电荷，在电场中向正极方向泳,2,动，因泳动速度不同而被分离。从正极端起，依次为清蛋白、1-、2-、-和-球蛋白，将蛋白质染色后，可按染色区带位置进行定性观察，也可对各条色带进行定量测定。,正常人血清醋酸纤维薄膜电泳示意图1为清蛋白，2，3，4，5分别1-，2-，-及-球蛋白，6为点样原点。,3,1、准备：（1）浸泡：取8cm2cm醋酸纤维薄膜条一张，浸入pH8.6的巴比妥-巴比妥钠缓冲液中，浸泡约30min，完全浸透后，用镊子轻轻取出，夹在滤纸中吸去多余的缓冲液，然后无光泽面向上平放在干净滤纸上。（2）点样：用玻棒醮取少许血清，均匀地涂在载玻片的一端截面上（玻片宽度应小于膜条），然后在距膜条一端1.5cm处轻轻落下并随即提起。加样应力求均匀（可先在普通滤纸上练习点样几次），要求在膜条上点上细条状的血清样品。,三、操作,4,1.5cm,6.5cm,（）,（）,（3）上槽：将点好样的膜条，无光泽面向下，平悬于电泳槽支架的滤纸桥上，两端紧贴在滤纸桥上，点样端置于负极，（把膜条摆平拉直后）盖好电泳槽盖，平衡10min。,5,2电泳：,待膜条浸润后，接通电源，调节电压至160V，电泳4560min。,3、染色与漂洗：,电泳完毕后，切断电源。用镊子取出膜条浸于氨基黑10B染色液中浸染510min。取出后用漂洗液浸洗45次，每次约5min，直至背景无色为止，再浸于蒸馏水中，最后将膜条夹于滤纸中吸干，至此可得电泳图谱。,四、结果,将电泳图谱贴在实验报告中。,6,试剂和器材1.试剂：（1）血清：人血清或动物血清；（2）pH8.6巴比妥-巴比妥钠缓冲液：称取巴比妥钠12.76g和巴比妥1.66g，溶于蒸溜水，定容至1000mL。（3）染色液：称取氨基黑10B0.5g，加蒸溜水40mL，甲醇50mL和冰醋酸10mL，混匀即可。（4）漂洗液：取95乙醇45mL，冰醋酸5mL和蒸溜
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