（环境工程专业论文）给水管网主体水细菌学研究.pdf

摘要 水，是人类赖以型存和发展的物质基础。饮用水更是关系到人类的生死存亡。 饮用水安全己成为全球性的重大战略问题。目前饮用水中主要风险还是微生物指 标，徵生物风险是急性的，主要由水中的致病菌造成感染。因此，本文对给水管 网中细菌多样t ! = 和致病菌的种属鉴定进行研究，为保障饮用水的安全输配提供技 术支持。 首先，在实验室建立了模拟给水管网，对选定的监测点进行连续的水质检测。 从长期的检测结果来看，温度对细菌总数测定结果的影响很大，水温还直接或间 接作用于影响细菌再生长的其他因素。细菌总数随管网余氯的消耗而增加。浊度、 p h 与细菌总数存在较好的正相关关系。t o c 与细菌总数呈一定的负相关关系。 其次，将先进的分子生物学技术引入管网水细菌多样性的研究，应用 p c r d g g e 技术，对饮用水细菌多样性进行研究。实验证明应用细菌1 6 s r d n a 序列分析方法，是一条可行的快速研究配水管网饮用水中微生物种群分布、变化 的技术路线。通过该方法，可以获得传统培养方法无法得到的菌株的情况，能够 更全面真实地反映饮用水微生态环境的面貌，对自来水企业保障饮用水的微生物 水质安全，保证人民的身体健康是很有帮助的。 再次，本文创新性地应用法国梅里埃公司的a p i 鉴定系统对给水管网中优势 菌和可疑菌进行了鉴定，利用环境扫描电镜对给水管网的生物膜进行了研究，证 明应用a p l 2 0 e 鉴定系统对给水管网中细菌种类的鉴定是可行的，并对鉴定结果 进行了细菌风险分析。这在给水管网微生物水质研究方面具有重要的意义，并为 控制管网水质微生物学污染的研究奠定了基础。 最后，分析了管网中微生物污染的可能原因，提出了控制管网水质污染、降 低微生物学风险、提高供水水质的有效措施。 关键词：给水管网微生物学指标16 s r r n a 序列分析p c r d g g ea p i a b s t r a c t w a t e ri st h em a t e r i a lb a s i so fh u m a n se x i s ta n dd e v e l o p m e n t d r i n k i n gw a t e r r e l a t e sh u m a n i t y sl i f ea n dh e a l t h d r i n k i n gw a t e rs a f e t yi sa g l o b a ls i g n i f i c a n ts t r a t e g y a t p r e s e n t ，m i c r o b i o l o g i c a l i n d e xi st h em a i nh a z a r di n d r i n k i n g w a t e r m i c r o b i o l o g i c a lh a z a r d sm a i n l yc a u s e db yp a t h o g e n i cb a c t e r i ai nw a t e ra r ea c u t e t h e d i v e r s i t yo fb a c t e r i ai nw a t e rd i s t r i b u t i o ns y s t e ma n di d e n t i f i c a t i o no fp a t h o g e n i c b a c t e r i ah a v eb e e nr e s e a r c h e db yt h i sp a p e r t h ew o r ka p p l i e st e c h n i q u es u p p o r tf o r g u a r a n t e ew a t e rs u p p l ys e c u r e f i r s t l y , as i m u l a t i v ed i s t r i b u t i o nn e t w o r ki se s t a b l i s h e di nt h el a b t h ew a t e r q u a l i t yo ft h es e l e c t e dm o n i t o r i n gp o i n t si sm o n i t o r e df o rl o n gt i m e i tc o m e st ot h e c o n c l u s i o nb yt h ea n a l y s i so ft h ee x p e r i m e n t a ld a t a w a t e rt e m p e r a t u r eh a sg r e a t i n f l u e n c eo nh p ca n da f f e c t so t h e rf a c t o r so fh p c d i r e c t l yo ri n d i r e c t l y t h ec h l o r i n e r e s i d u a li nw a t e ri su s u a l l yt ol i m i tb a c t e r i a lr e g r o w t h t h e r ea r ec o r r e l a t i o nb e t w e e n t u r b i d i t y , p ha n dh p c b u tt h ec o r r e l a t i o nb e t w e e nt o c a n dh p ci sn e g a t i v e s e c o n d l y , m o l e c u l a rb i o l o g i c a lt e c h n o l o g i e sa r ei n n o v a t i o n a l l yu s e di nt h es t u d y o fb a c t e r i a d i v e r s i t y i n d r i n k i n gw a t e r i t sp r o v e d t h a tm o l e c u l a r b i o l o g i c a l t e c h n o l o g i e sa r ef e a s i b l e b e c a u s ei ti su n n e c e s s a r yt oc u l t u r et h em i c r o o r g a n i s m sb y t r a d i t i o n a lm e t h o d s ，i tc a na v o i dt h es i t u a t i o no f l o s i n gt h em i c r o o r g a n i s m sd u r i n gt h e c u l t u r e i ti su s e f u lt op r o t e c tt h es e c u r i t yo fm i c r o b i o l o g yw a t e rq u a l i t y , a n dh e l p f u l f o re n s u r et h eh e a l t ho f p e o p l e t h i r d l y , t h i sp a p e ru s e st h ea p ir e a g e n tp i e c eo ff r a n c eb i o m e r i e u xc o m p a n y t o i d e n t i f yt h eb a c t e r i ai nt h ed i s t r i b u t i o nn e t w o r kf i r s t l y b i o f i l mi ss t u d i e du s i n g e n v i r o n m e n t a ls c a n n i n ge l e c t r o mm i c r o s c o p y ( e s e m ) t h i si sv e r yi m p o r t a n tf o r t h em i c r o b i o l o g yw a t e rq u a l i t yr e s e a r c ha n di t st h eb a s eo fm i c r o b i o l o g yw a t e r q u a l i t yc o n t a m i n a t i o nc o n t r 0 1 l a s t l y , t h ep r o b a b l ep o l l u t e dr e a s o n sa n dr i s ko fm i c r o b ea r ea n a l y z e d e f f e c t i v e m e a s u r e sa b o u th o wt oc o n t r o lt h ew a t e r q u a l i t yc o n t a m i n a t i o n ，r e d u c et h e m i c r o b i o l o g yr i s ka n di m p r o v et h ew a t e rq u a l i t yo ft h ed i s t r i b u t i o nn e t w o r ka l e b r o u g h tf o r w a r d k e yw o r d s ：d i s t r i b u t i o nn e t w o r k , m i c r o b i o l o g yp a r a m e t e r s , 16 sr i b o s o m er i b o s e n u c l e i ca c i da p p r o a c h ，p c r - d g g e ，a p i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得墨鲞态堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 佟了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：裰 签字园期：翔彩年多月d ，日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解苤鲞盘鲎有关保留、使用学位论文的规定。 特授权苤鲞盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 商黉家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签冬：夕蓦俊 签字日期：哆年多月f f 日 导师签名： 签字日期：膨研j 编“ 七力广 广、 第一章绪论 1 1 概述 1 1 1 饮用水卫生现状 第一章绪论弟一早 三：百t 匕 水，是人类赖以生存和发展的物质基础。水资源的不可替代性直接影响到人 类的生存和发展。其中，饮用水更是关系到人类的生死存亡。人们每天都要喝水， 但什么是健康、安全的饮用水却很少有人知道。随着现代化工业进程的进展，环 境污染物的数量和种类增加，加上目前自来水制水工艺存在的缺陷，均给人们饮 用水卫生安全带来了潜在的威胁。近年来，由于国际上一些地区和国家频繁发生 恶性事件，饮水安全和卫生问题引起了全球的关注，饮水安全已成为全球性的重 大战略性问题。世界卫生组织的调查表明：在发展中国家，各类疾病有8 0 是 因为饮用了不安全、不卫生的水而传播的，每年大约有2 0 0 0 万人死于饮用不卫 生的水，饮水安全问题严重地威胁着人类生命。 2 0 世纪7 0 年代，美国及荷兰的研究人员发现，水加氯后引起一系列氯的副 产物，于是国家有机物查勘测定机构于1 9 7 6 - - - 1 9 7 7 年调查了1 1 3 个城市，结果 显示t h m s 在饮用水中普遍存在，随后又发现了7 0 0 多种有机化合物，其中2 1 种具有致癌性，从而引起了对消毒剂及消毒副产物的重视。到8 0 年代，已在水 中发现2 2 2 1 种微量有机物，其中有的是致癌或可疑致癌物质。于是各国政府有 关部门和有关供水的研究、生产单位，均致力于有机物特别是微量有机物的测定、 形成机理、毒理探索以及处理对策和控制标准等一系列研究工作，所以专家称 2 0 世纪8 0 年代是有机物的年代。到了9 0 年代，微生物又成为健康风险更大的 污染因素。1 9 9 1 年1 月，拉丁美洲霍乱大流行，从一个国家蔓延到全洲，1 3 0 万 人生病，1 2 万人死亡，其中重要原因之一是氯的副产物不断形成导致消毒能力 削弱甚至完全丧失，而使各种微生物在管网中孳生繁殖。另外，据美国水协研究 基金的专题研究报告，1 9 9 1 年流行病调查结果，在所有年龄组，每人每年生肠 道病0 6 6 次，其中2 1 2 岁为0 8 4 次，而肠道病的3 5 是由于饮水引起的。 1 9 9 3 年4 月，美国密尔沃基市供水系统发生隐孢子虫事故，使该市超过1 5 0 万 居民受感染，4 0 3 万人生病，4 4 0 0 人住院，近百人死亡，其主要原因是管网水 中浊度偏高。当时美国水质标准对隐孢子虫尚无规定。该事件引起了很大震动。 据近年来统计，美国发生隐孢子虫事故1 0 次，英国2 1 次，加拿大4 次，日本1 次i l 】。受饮用水卫生状况影响，俄罗斯每年都发生很多肠道感染等疾病。2 0 0 4 第一章绪论 年俄联邦境内记录的7 l 起急性肠道感染中有1 9 起与饮用水卫生质量有关，因肠 道感染而患病的4 6 3 2 人中有1 7 1 5 人的发病原因是饮用了不符合卫生标准的水。 而2 0 0 4 年发生的2 2 起群体性甲型病毒性肝炎感染中就有1 7 起感染与饮用水有 关，占了全部感染的7 7 3 。 据一些资料报道，国外在自来水管网表面残留和冲洗下来的颗粒沉淀物上已 检出细菌种属达2 1 种。例如，a i l e m 等人发现在美国各个水厂的管网垢中，都 有大量的球菌、杆菌、双螺旋菌和藻类，具有铁细菌特点的螺旋茎的盖式铁柄杆 菌属也大量出现在水样和管壁上；l v a g y 和o l s s o n 还发现管网的服务年限和细菌 的密度之间有着某种关系。据估计，每增加l o 年服务期，管壁上异养菌的数量 就增一个倍数；另外，b a y 2 j 在1 9 9 3 年还发现在美国塔科马市的蓄水池中寄生于 水中生物的红虫幼虫数量在1 - 6 0 0 0 条m 2 之间，其中的虫卵和早龄期幼虫通过 净水管网系统出现在管网末梢( 用户水龙头) ，从而引起了公众较大范围的投诉。 美国的管网微生物污染如此严重，而我国自来水输配管道，尤其是陈旧老化管道 的污垢微生物污染程度更为严重。据有关资料统计，我国管网水的水质比出厂时 有害物指标均有提高，据统计，如浊度、铁、锰、铜、细菌总数等，管网出水口 比出厂分别增加了2 4 3 、2 1 8 3 、1 7 3 1 、3 3 6 4 和2 6 4 1 。 这一系列情况，引起各方重视和密切关注。美国著名教授d a n i e lo k u n 认为： “二次大战后发现水中存在合成有机物及消毒副产物引起我们关注，但今天水中 生物风险比化合物风险更严峻”。正因如此，美国供水协会( a w w a ) 的微生物专 家们将2 0 世纪9 0 年代称之为微生物的十年p j 。 1 1 2 饮用水中致病微生物 在1 9 7 6 - - 1 9 9 4 年间美国发生的4 1 4 次水质事故中，除少量原因不明者外， 8 4 1 的事故次数和9 9 2 的生病人数系微生物项目引起的。美国最近发生一 系列水质疾病，很多是在经过完全处理( 过滤和消毒) ，水质完全符合现行水质 标准的情况下发生的。美国疾病预防及控制中心估计，美国饮用水引起微生物疾 病而死亡的人数每年为9 0 0 - - 1 0 0 0 人，而其中超过2 5 与水传播疾病和供水管 网的水质恶化有关。可见，无论哪一个发达国家，经水厂净化后的水在通过复杂 庞大的管网系统输送到用户时，仍存有一部分有机物和游离氯结合形成致癌前体 物三卤甲烷，另一方面成为微生物再繁殖培养基，重新繁殖的微生物常年在输配 管道中形成生物膜，膜的老化和脱落又引起用户水的嗅和味、色度的增加，并且 这些管网上的微生物渐渐对消毒剂产生了抵抗力，不易被杀灭，更增加了终端自 来水微生物的数量，从而增加了饮用水的微生物风险。 微生物是水传播疾病的重要原因。水中的微生物安全，是确保水质安全的基 第一章绪论 础。水生病原微生物主要有三大类：细菌、病毒和原生动物。对健康危害较大的 水传性致病细菌为主要引起消化道传染病的肠道类致病菌。消化道致病性病毒也 是对人类健康危害较大的水传染性致病微生物，由于对病毒研究手段和检测技术 的局限性，很多肠道病毒在水中的存活力及对氯消毒的耐受力尚不清楚。贾第虫、 隐孢子虫等致病原生动物可引起的较大规模的水系传染病，这两种致病原生动 物，特别是隐孢子虫已经构成对饮用水微生物安全的主要威胁【4 j 。部分致病微生 物对人体健康造成的影响见表1 - 1 。 表1 1 部分致病微生物对人体健康造成的影响 病原体分类病菌疾病 志贺氏菌( s h i g e l l as p ) 痢疾 沙门氏菌( s a l m o n e l l as p ) 肠胃炎 沙门氏菌( s a l m o n e l l at y p h i ) 伤寒 霍乱弧茵( v i b r i o c h o l e r a e ) 霍乱 细菌 埃希氏大肠杆菌 多种肠胃疾病 ( e n t e r o p a t h o g e n i c - e s c h e r i c h i a c o l i ) 耶尔森氏茵( y e r s i n i as p ) 肠胃炎 c a m p y l o b a c t e r j e j u n i c a m p y l o b a c t e r i o s i s ( g a s t r o e n t e r i t i s ) 肝炎病毒( h e p a t i t i sav i r u s ) 传染性肝炎 诺沃克病毒( n o r w a l kv i n l ：s e s ) 急性肠胃炎 轮状病毒( r o t a v i r u s e s ) 急性肠胃炎 病毒 脊髓灰质炎病毒( p o l i o v i r u s e s ) 急性骨髓灰白质炎 柯萨奇病毒( c o x s a e k i ev i r u s e s ) 流感 艾柯病毒( e c h o v z r u s e s ) 流感 内阿类已属h i s t o l y i i c a ( e n t a m o e b a h i s t o l y t i c a ) 阿米巴病 原生 兰氏贾第鞭毛虫( g i a r d i al a m b l i a ) 肠胃炎 动物隐孢子虫( c r y p t o s p o r i d i u ms p ) 肠胃炎 b a l a n t i d i u mc o l i肠胃炎 蛔虫( a s c a r i ss p ) 蛔虫病 绦虫( t a e n i as p ) 绦虫病 寄生虫 线虫属( n e c a t o r a m e r w a n u s ) 钩口线虫病 鞭虫属( t r i c h u r i s t r i c h u r i a ) 鞭虫病 3 第。一章绪论 与化学污染物相比，水中病原体具有以下特征 5 1 ：病原体在水中的分布是离 散的，而不是均质的；病原体常成群结团，或吸附于水中的固体物质上，因此其 水中的平均浓度不能用以预测感染剂量；病原体的致病能力取决于其侵袭性和活 力，以及人的免疫力；一旦造成感染，病原体可在人体中繁殖，从而增加致病的 可能：病原体的剂量一反应关系不呈累积性。一般认为，人被感染传染病应具备 三个条件【6 】：有病原体的存在；具有一定的病原体浓度；易感染体以被感 染方式接触病原体。 1 1 3 水质标准中微生物指标 污染生活饮用水的微生物主要来自水源地的人畜粪便，还有医院排放的污水 以及腐烂的动物尸体等。水质标准中微生物指标非常关键，这是衡量水质是否安 全的首要指标。w h o 认为控制微生物污染是极其重要的，因为致病微生物危害 极大，它能够在同一时间使大量的饮用者染病。包括世界卫生组织和很多国家的 饮用水卫生标准，都将微生物指标放在第一位。与化学污染不同，致病微生物造 成的发病频度与其感染能力、毒性和人的个体免疫力密切相关；感染一旦发生， 致病微生物就可以借助宿主迅速繁殖。因此，对于致病微生物不存在“容忍下限” ( t o l e r a b l el o w e rl i m i t ) ，也就是说饮用水中不允许有任何致病微生物，这就要求 在水源选择、净水工艺、最后消毒和管网供水等环节必须保证消除水的微生物污 染，建立防止水系疾病的多道屏障。世界三大饮用水水质标准中微生物指标的确 定见附录1 。 我国原生活饮用水卫生标准中的微生物指标只有总大肠菌群和菌落总数两 项指标，新标准中增加的耐热大肠菌群( 粪大肠菌群) 和大肠埃希氏菌两项指标， 均属于对总大肠菌群指标的细化，如果按照标准规定的发酵法检出这两种微生物 或按照滤膜法监测超出限值，就说明生活饮用水受到微生物的污染。以上4 项微 生物指标都属于常规检验指标，还有两种原虫即贾第鞭毛虫和隐孢子虫，同属于 微生物指标，列入新标准的非常规检验项目，国外突发性肠道传染病的相关报道 中，很多都是由这两种原虫引发的。 1 2 细菌多样性的研究 用细菌群落的多样性指示环境污染，探索污染与细菌群落动态变化的关系等 离不开对细菌群落结构的描述。对环境中微生物种群的类型和数量进行及时和准 确的分析测定，在微生物生态研究中十分重要。但人类对大多数微生物种类的了 解和描述仍只是停留在非常初步的阶段。由于自然界中大部分的微生物类群的不 4 第一章绪论 可培养性，使得利用传统的依赖于微生物培养和纯种分离的技术来定量描述微生 物群落结构和多样性的重要参数( 如种的丰富度和平均度) 时受到严重制约。另 一个问题是，所有这些传统技术在培养过程中都不可避免地将微生物置于或多或 少偏离它们原来的小环境的、新的人为操纵的条件下，从而会改变有关微生物群 落原来的结构【7 1 ，准确地说是形成了与之并不完全相同的新的群落结构。而通过 形成平板菌落所必需的许多代的增殖后，微生物有机体还有可能会偏离原来自然 种群的生理习性，甚至有可能偏离它们原来的基因型组合。近年来，人们运用微 生物生物化学分类的一些生物标记，包括呼吸链泛醌、脂肪酸和核酸，来进行环 境样品中的微生物种群分析。其中，以1 6 sr r n a d n a 为基础的分子生物学技 术已成为普遍接受的方法，该技术主要利用不同微生物在1 6 s 核糖体r n a ( r r n a ) 及其基因( r d n a ) 序列上的差异来进行微生物种类的鉴定和定量分析。 细菌核糖体的核糖核酸( r i b o s o m er i b o s en u c l e i ca c i d ，r r n a ) 序列分析方法， 即r r n aa p p r o a c h 尤其是16 sr r n a 序列分析已成为一个分子指标，被应用于各 种微生物的遗传特征和分子差异的研究1 8 】，在环境生物技术已被应用于共生细菌 和古细菌( 其中包括医学上对病原菌的检测和鉴定) 、海洋微型浮游生物、固相 支持物上的微生物( 如b i o f i l m ) 、各种水体和土壤细菌等微生物样品的研究，并 发现了众多未知的新序列陟1 3 j 。 因此，将r r n a 技术与其它的分子技术以及特别是与传统的纯种培养方法相 结合，具有分析微生物多样性的巨大潜力。 1 3 课题的提出及研究意义 一般来说，常规氯消毒可有效杀灭引起消化道传染病的肠道类致病菌。因此， 传统的观念认为除出厂水p h 影响管道腐蚀外，只要能维持管网末梢余氯 0 0 5 m g l ，用户用水就是安全的。然而，自来水从出厂水到达用户的过程要经过 庞大的给水管网，虽然自来水出厂时已达到饮用水的卫生标准，但在管网中一方 面要发生一系列复杂的物理、化学、生物反应，另一方面由于管网的二次污染而 使水质降低，以至于到达用户时不能满足饮用水的卫生标准。 对给水管网中微生物种群的类型和数量进行及时和准确的分析测定可为饮 用水的安全卫生提供保障，但是检测水中所有的病原微生物是不切合实际的。实 用和可行的方法是检测既能指示粪便污染又能反映水处理和消毒效果的微生物。 常用的指示微生物是总大肠杆菌和粪大肠杆菌。但越来越多的国内外的研究成果 表明：总大肠菌群数并不足以反映病毒、原生动物和寄生虫的存在，许多微生物 对氯的敏感性较肠道细菌迟钝的多。实际上，仅满足水质标准也并未意味着饮用 第一章绪论 水的绝对安全。有一些细菌进入水体后不管能否复活，但在标准培养条件下不能 复原，如沙门氏菌属、弯曲杆菌属、埃希氏大肠菌属。有些细菌只要有适当的条 件就能在环境中繁殖，如气单胞菌属即使在有机营养物很低的情况下，也可在温 水中繁殖。假单胞菌属和军团菌也有此本领制。因此，以总大肠菌群数和粪大肠 菌群数作为卫生安全控制指标的科学性受到了挑战。而且，传统的微生物分析测 定方法，包括显微镜微生物形态观察、选择性培养基计数、纯种分离和生理生化 鉴定等，在环境样品研究中都存在一定的缺陷i l 引。因为微生物形态简单，缺乏明 显的外部特征；而依据生理生化特征对微生物进行分类鉴定，也因为大多数自然 环境中的微生物难于模拟其生长繁殖的真实条件，而不能获得纯培养l l 酬。因此， 不少研究者开始寻找可替代的指示微生物或可直接检测病原微生物的方法。 分子生物学的发展使得免疫学法和分子生物法在环境微生物学中的应用增 加了在自然界中( 如土壤和水) 病原体微生物含量较低的时候被检出的可能性。荧 光抗体( f l u o r e s c e n ta n t i b o d y ，f a ) 法可用于个别病原体如贾第鞭毛虫和隐孢子虫 的定性和定量的测试。聚合酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，简称p c r ) 检 测病原菌是通过扩增特定的d n a 序列实现的，不需对病原体进行培养，克服了 传统方法费时费力、灵敏度差的缺点，有助于检测到低含量的病原体微生物。 因此，本课题采用先进的分子生物学方法主要针对给水管网主体水中细菌的 再生长规律及影响因素、异养细菌种属的鉴定与变化规律以及微生物风险及对策 进行研究，能为水质微生物检测提供快速准确的方法，为采取有效措施抑制或减 缓饮用水中细菌再生长提供理论基础，降低管网水中的微生物风险，保证供水水 质。 1 4 国内外研究现状 发达国家对饮用水的微生物风险相当重视。近年来，美国等少数发达国家将 隐孢子虫、贾第鞭毛虫、军团菌、病毒等指标列为重要控制项目，要求对隐孢子 虫的去除率 l 9 2 ，对贾第鞭毛虫的去除率 l 9 3 ，对病毒去除率 l 9 4 ，并将浊 度也列入微生物学指标，对其数值的规定也从1 9 7 9 年o 5n 1 u 到现在的0 3 n t u 。日本虽不提对隐孢子虫的去除率指标，但要求滤后水浊度 0 i n t u 。英 国公布，要求贾第鞭毛虫及隐孢子虫均 1 个1 0 l 。荷兰政府为控制隐孢子虫的 风险到年万分之一，临时准则要求隐孢子虫 0 0 2 6 l 。我国2 0 0 5 年建设部颁布 的城市供水水质标准中微生物指标也新增了蓝氏贾第虫、隐孢子虫等易引起 腹痛等肠道疾病、一般消毒剂很难全部杀死的微生物的检测。 对饮用水中细菌的群落和种类鉴定，国内外学者都做了不少研究。目前， 6 第一章绪论 d n a 或r n a 序列差异及根据序列差异研制的各类分子标记系统己广泛用于遗 传学研究，使在分子水平上研究细菌群落结构成为可能。细菌1 6 sr r n a 序列己 用于揭示土壤或水体隐含的细菌遗传多样性和追踪各类病原细菌，将1 6 sr r n a 与限制性内切酶消化结合，获得的限制性片段长度多型性资料已广泛用于亲缘关 系分析，而细菌群落的多样性及动态变化关系可以指示环境污染，这些在实际应 用中都已经取得了一定的效果，但将该技术应用于给水管网中微生物种群分析的 相关报道还很少。 p c r 技术是一种体外核酸扩增技术，它对病原菌的检测具有简单、快速、灵 敏、特异等特点。自从1 9 9 0 年b e i 1 7 1 等首先将p c r 技术用于水中志贺氏菌和沙门 氏菌检验之后，许多学者将其用于水中多种细菌、病毒和寄生虫的检验，并取得 了较好的结果。现在p c r 扩增1 6 sr r n a 区间序列技术已被广泛用于各种细菌的 检测与鉴定，尤其与各种改进的p c r 产物检测方法结合使用，使检测范围更加广 泛。t s e n 【l8 】等通过选择大肠杆菌的1 6 sr r n a 片段进行p c r 扩增来检测水中的大 肠杆菌细胞。通过富集，可以达到le 。c o l ic e l l 1 0 0 m l 的检测限。马颖【1 9 】等人通 过设计对埃希氏大肠杆菌有特异性的引物，研究了基于p c r 技术检测饮用水中 大肠杆菌的方法。研究表明，该方法比较适用于检测经氯剂消毒或臭氧消毒的饮 用水中的大肠杆菌，检测结果与常规滤膜培养法有较好的一致性，且分析时间 短、反应灵敏。与此同时，由于p c r 所采用的是特异性d n a 的体外扩增，以往由 于处于休眠状态而无法培养的细菌同样可以被检测到，从而不会造成细菌数量 的过低估计。刘涛【2 0 】等从炼油厂废水中分离得到苯酚高效降解菌l 6 8 菌株，从形 态、生理生化以及1 6 sr d n a 同源性等指标分析鉴定其为b u r k h o l d e r i ac e p a c i a ( 洋 葱柏克霍尔德氏菌) 。e m i l i e l 2 l 】采用p c r d g g e ( p c r 变性梯度凝胶电泳) 方法检测 了河流中附着于生物膜上的微生物种群多样性。通过测序，生物膜上所附着的微 生物种类得到了准确而全面的反映，为监测河流生态环境提供了重要依据。 m u r r a y 2 2 i 等斥jp c r d g g e 的方法对s a n f r a n c i s c o 湾和t o m a l e s 湾的浮游细菌群落 组成进行分析，证实正是它们在细菌种群上的差异，导致两个海湾在多环芳烃代 谢能力上的差异。李志刚i i 2 j 等对水环境中存在的细菌进行群落结构分析。总之， 1 6 sr r n a 基因技术的发展方兴未艾，有望在分析环境生物多样性、揭示污染的 生物学效应和环境质量评价等环境科学研究领域得到广泛的应用。 1 5 本课题的主要研究内容 ( 1 ) 模拟实际给水管网建立实验室模拟管网，并设置水质监测点。 ( 2 ) 确定分析指标，通过现场和实验室化验分析，分析实验室模拟管网中 第一章绪论 水质指标的变化情况，研究管网中细菌再生长的现象。 ( 3 ) 在对实验数据进行系统分析的基础上，对管网中影响细菌总数的水质 指标进行分析，找出影响细菌再生长的关键因素。 ( 4 ) 应用p c r d g g e 方法对管网主体水中的细菌多样性进行初步研究。 ( 5 ) 利用a p i 快速鉴定系统结合环境扫描电镜方法对管网主体水中的细菌 进行鉴定。 本研究拟分三个阶段进行：第一阶段主要是查阅文献生物资料，确定课题， 制定试验方案，进行试验。通过对国内外水质资料的收集、整理与分析，确定了 研究内容，建立实验室模拟管网，通过实验来获取给水管网水质数据。所测的水 质指标主要包括温度、浊度、余氯、总氯、p h 、u v 2 5 4 、t o c 等理化常规指标， 流速、压力等水力学指标以及细菌总数( h p c ) 、大肠杆菌数等微生物学指标。 第二阶段主要是对第一阶段所获得的实验数据进行系统分析，研究各水质指 标在管网中的变化规律并确定管网中细菌与其他水质指标的相关关系，找出管网 中细菌再生长的控制因素。 第三阶段对管网主体水中的细菌多样性进行初步研究，对管网主体水中细菌 的种类进行鉴定分析，提出可能的预防或控制管网水质污染的有效措施，最终达 到提高供水安全可靠性的目的。 第二章模拟给水管网细菌再生长影响因素研究 第二章模拟给水管网细菌再生长影晌因素研究 自2 0 世纪3 0 年代末在经过加氯消毒的给水网中发现细菌生长以来，管网中细 菌繁殖及其引起的问题受到人们的关注。调查发现，管网中细菌的大量繁殖可加 剧管道腐蚀，产生铁锈和管垢，消耗水中溶解氧，提高水色和水的不良气味，增 大浊度和细菌平板计数，产生生物粘泥，为大型生物体和致病菌的出现、繁殖创 造条件，形成生物不稳定的水，甚至造成管道阻塞、爆管、断管等严重问题，直 接威胁净水厂运行和人民身体健康安全。 为了研究给水管网中的各种理化指标和水力条件对饮用水中细菌指标的影 响，以便及时准确的为控制饮用水细菌学水质提供充分可靠的信息，于2 0 0 6 年 7 月 - 2 0 0 7 年2 月间，对建立的模拟给水管网水质进行检测。模拟给水管网的水 箱两天清洗一次，监测点每天取样，取样点处2 0 分钟取样一次在当场和实验室 进行检测相关指标。 2 1 给水管网中细菌再生长机制及其影响因素 2 1 1 给水管网中细菌再生长机制 给水管网中细菌再生长的原因有：出厂水中含有较多的细菌进入管网： 管网中细菌的生长繁殖；输水过程中外源细菌的进入。而在出厂水正常消毒、 管路完好的情况下，第二种情况是引起自来水中细菌再生长的主要途径。 细菌在管网中生长包括在水中的悬浮生长和在管壁的附着生长。给水管道内 的湍流效应对其悬浮生长显然不利；而在管壁的粘滞层中水流速度很小，营养物 质浓度梯度以及布朗运动都可使细菌从水中迁移到管壁表面。细菌通过以聚合物 架桥为主要机制的可逆粘附过程而牢固粘附于管壁表面；此过程中，如细菌分泌 的粘附管壁的有机物质与管壁表面作用性质发生变化，则发生不可逆粘附，细菌 在管壁定居成功。包括细菌在内的各种微生物、微生物分泌物和微生物碎屑在生 存环境相对较好的管壁表面沉积、附着和生长，使管网内形成生物膜。 给水管网中出厂水为贫营养环境，其中生长的细菌大多数是以有机物为营养 基质的异养菌。异养细菌所具有的独特的饥饿生存适应方式，以及几种异养菌可 共同利用大多数基质的特性，使得细菌在含有微量有机物的管网中生存成为可 能。此外与高营养基质相比，贫营养基质下生长的细菌对消毒剂具有更高的抗性， 9 第二章模拟给水管网细菌再生长影响因素研究 生物膜、颗粒物质、管壁表面的保护作用也成为细菌能在管网中生长的重要原因。 2 1 2 给水管网中细菌再生长影响因素 影响细菌在给水管网中生长的因素很多，主要包括：余氯、可生物降解有机 物含量、温度、腐蚀产物和沉淀物。但当一个水厂及其管网系统相对固定时，从 实际角度来看可人为控制的因素主要是水中有机物营养基质的浓度和余氯的含 量。 出厂水通过加氯或氯胺消毒并保持管网内一定的余氯含量是目前普遍采用 的消毒方法，但大量研究证实部分细菌或大肠杆菌在氯消毒过程后能在管网中修 复，重新生长【2 3 】；此外，加氯量过高将会引起大量氯化消毒副产物的生成，使饮 用水中“三致”物质增加，饮用水安全性降低。而异养菌生长必须依靠管网水中 的可生物降解物质，在给水管网贫营养环境下，一般认为有机基质的含量是影响 其生长的主要因素，因此减少水中可生物降解有机物的含量将对控制异养细菌的 生长起到决定性的作用。 2 2 实验室模拟给水管网概况 在实际给水管网中采样进行分析监测存在多重困难，比如：在选择采样点的 时候，可能因为存在采样困难而不能选择具有代表性的点而只能选择就近点；在 下雨天很可能因为采样困难而使数据中断，不能分析雨天时管网中水质的情况； 要想具体分析管道的腐蚀情况就更困难，只能在管网发生爆管的时候才能进行采 样，这在实际实验分析的时候是比较困难的。由于存在以上诸多问题，本课题决 定在实验室建立小型模拟给水管网进行水质分析。 进行水质监测是力求以管网中少数点的水质反映整个管网水质状况，从而实 现监测和控制管网水质的目的。国家标准规定了采样频率和基于人口数的监测点 数量，但对其选址仅有定性的叙述。实际工作中应使监测点的选择最有代表性， 即监测点水质合格时，足以保证尽可能多的用户用水水质达标。采样点的布设原 则是监测工作的重要环节，水质监测点的选取通常遵循以下原则： a 出厂处设点的原则。在每个水厂出水处设立水质监测点，以测定处理后 水进入管网的水质状况； b 管网末梢处设点的原则。因为在供水管网末梢处，水中消毒剂在水力传 输过程中浓度逐渐降低，致使水质状况随之下降，所以在管网末梢处设立几个监 测点对监测、控制整个管网的水质水平是非常必要的； c 按影响因素交叉选取的原则。把影响水质的客观因素的取值范围分段， l o 第二章模拟给水管网细菌再生长影响因素研究 然后选取符合不同交叉范围的管段以尽可能的包括管网中所有的管段情况，使得 监测数据能反映水质在整个管网中的变化。 为了真实的模拟实际管网，通过水力计算与分析，在实验室建立小型模拟给 水管网，管网和水箱均为p e 材质，结合监测点的布置原则，根据实验室的实际 情况分别在管网进水口、变径、管路交汇处和出水口等九处设置水龙头用于取样， 具体构造见附录2 。该管网水箱进水接实验室自来水，水进入水箱后，通过水泵 的提升使水进入管网中，最后再回到水箱中。通过调节阀门可以改变管网水循环 方式、路径和水力条件。 2 3 监测指标的确定和检测方法 2 3 1 监测指标的确定 国家在生活饮用水水质卫生规范中，对供水管网水质进行了明确而细致 的规定，将饮用水水质指标分为常规检验项目和非常规检验项目两大类。其中常 规检验项目又分为感官性状和一般化学指标、毒理学指标、细菌学指标、放射性 指标四类。非常规指标又分为感官性状和一般化学指标和理学指标两类。这些指 标中影响管网细菌再生长的因素很多，国内外不少学者也对管网中细菌再生长情 况作了不同层次的研究，根据阅读相关文献资料及水质分析的经验总结，选定研 究探讨温度、浊度、余氯、总氯、p h 、t o c 、u v 2 5 4 与细菌总数的相关关系，具 体见表2 1 。 表2 1实验监测指标 监测指标监测目的 温度 浊度常规指标，反映水体基本状态 p h 余氯常规指标，反映水体基本状态：与细菌再生长密切相关 t o c 反映水体中有机物质总量，评价水体有机污染程度 u v 2 5 4 水中有机物水平的度量指标 2 3 2 检验方法 在所选定的监测指标中，除细菌总数测定方法有所不同外，其他的指标均参 第_ 章模拟给水管网细菌再生长影响因素研究 照水和废水监测分析方法( 第四版) 1 2 4 】，具体情况如表2 2 所示。 表2 2 水质监测方法 监测项目检测方法仪器类型 温度水温计法温度计 浊度光散射法 h a c h2 1 0 0 a n 型浊度仪 总氯d p d 比色法h a c h4 6 7 0 0 0 01 型余氯仪 余氯d p d 比色法 h a c h4 6 7 0 0 0 0 1 型余氯仪 p h 值玻璃电极法 h a c hs e n s l o n1 型p h 仪 t o c t o c 仪测定 t o c 测定仪( 岛津t o c 一) u v 2 5 4紫外分光光度法 t u 18 0 0 分光光度计，抽滤机 对于细菌总数的检测，如按照标准方法培养2 4 h ，营养琼脂方法常检测不出 或检出量极低的情况，不利于实验研究。有机物组成广泛但含量低的p 2 a 培养 基有利于受损菌修复生长【2 5 1 ，并适合产色素茵生长，饮用水中产色素菌多为机会 致病菌或致病菌【2 6 1 。同时耐氯菌在r 2 a 培养基上生长良好，培养5 - - - 7 天后，生 长缓慢的耐氯菌菌落开始出现。因此，实验中均采用r 2 a 培养基进行h p c 测定。 2 4 物化指标对细菌总数的影响 2 4 1 温度对细菌总数的影响 水温能直接或间接影响细菌生长，如水处理流程的处理效果、微生物生长速 度、消毒效率、余氯消耗、管道腐蚀速度、管网水力条件、人们对水量的需求等。 水温可能是影响细菌生长的主要因素之一。大量研究表明，水温高于1 5 后， 细菌表现出较强的代谢活性。f r a n s o l e t z 7 】等发现水温不但影响细菌生长速度、而 且延长对数生长期和使产率因子升高，同时他发现大肠埃希氏菌和其他肠道菌尽 管能在5 - - - - 4 5 范围生长，但水温低于2 0 时生长很慢。l e c h e v a l l i e r l 2 8 】的研究 也发现实际管网中细菌的生长与水温有密切的关系，但即使在水温为5 时管网 中仍有细菌生长。因此在冬季给水管网中仍会有细菌活动，但细菌的活动将大为 降低。 在实验中发现温度对细菌总数测定结果的影响较大，对2 0 0 6 年1 1 月1 2 月的1 号监测点( 管网入水口) 的水温和细菌总数作图，结果见图2 1 。 第二章模拟给水管网细菌再生长影响因素研究 图2 - 1 温度与细菌总数的相关关系图 从图中可以看出随着水温的升高和降低，细菌总数也随之增加和减少，而且 水温低时，细菌生长缓慢。这说明温度是影响细菌总数的一个重要因素。 2 4 2 余氯对细菌总数的影响 饮用水中采用氯消毒方法始于2 0 世纪初，其作为消毒剂已经有1 0 0 多年的历 史。目前在出厂水中普遍采用加氯或氯胺的消毒方法并保持管网一定的余氯以控 制细菌生长。氯或氯胺消毒的原理是破坏细胞膜、酶系统、蛋白质。但自由氯在 水中容易分解，而且由于部分细菌或大肠杆菌在管网中能修复、重新生长，所以 即便保持较高的自由氯或氯胺也难以控制铁管中的生物膜的形成。有的细菌有抗 氯性，少量的余氯可能不起作用。 由于模拟管网规模小，管路短，为了尽量符合实际条件，选择管路末梢监测 点( 9 号点) 研究自由余氯对细菌总数的影响，每次取样前先在水箱内人为加入 一定量的安替福民以达到一定的余率值，然后每隔2