（发酵工程专业论文）藻蓝蛋白的分离纯化、酶解及其抗肿瘤活性研究.pdf

摘要 藻蓝蛋e t ( c y a n o b a c t e r i a - p h y c o c y a n i n ，c p c ) 是存在于藻类细胞中的光合辅助色素 蛋白。它不仅可作为天然色素应用于食品、化妆品等行业，而且能提高机体的免疫功 能，清除体内的自由基，促进动物血细胞再生，在癌症、溃疡等疾病的防治上亦卓有 成效。本文研究了藻蓝蛋白的分离纯化、酶解和藻蓝蛋白及其酶解物的体外抗肿瘤活 性，并对其抗肿瘤机理进行了初步探讨。 钝顶螺旋藻藻粉经反复冻融和超声破碎处理，离心后上清液经过盐析、透析得到 藻蓝蛋白粗提液。采用羟基磷灰石( h a ) 两步柱层析法对粗提液分离，得到纯度 a 6 2 0 a 2 8 0 4 0 的藻蓝蛋白。 采用四因素、三水平正交试验，以m t t 的实验结果为指标，优化胰蛋白酶和胃 蛋白酶对藻蓝蛋白的酶解条件，得到的四个优化酶解条件为：( a ) ：温度：4 0 ：p h ： 8 ；【胰蛋白酶】【藻蓝蛋白】：1 1 0 ；时间：6 0 分钟。( b ) 温度：3 7 ：p h ：8 ； 胰蛋白 酶】【藻蓝蛋白】：1 3 0 ；时间：9 0 分钟。( c ) - 温度：4 0 ；p h ：3 ； 胃蛋白酶】 藻蓝 蛋白】：1 2 0 ：时间：3 0 分钟。( d ) 温度：3 3 ：p h ：o 5 ； 胃蛋白酶】 藻蓝蛋白】：1 1 0 ； 时间：3 0 分钟。 采用m t t 法研究藻蓝蛋白及其酶解物对宫颈癌细胞h e l a 和黑色素瘤细胞b 1 6 的体外生长抑制作用。实验表明：藻蓝蛋白对肿瘤细胞的抑制作用有明显的剂量效应， 当藻蓝蛋白的浓度达到1 0 0i r t g m l 时，对h e l a 和b 1 6 的抑制率分别达到2 6 3 和1 9 1 ，但对正常细胞人肾上皮细胞2 9 3 t 没有明显的影响。藻蓝蛋白酶解物的抗肿瘤活性 明显高于相同浓度下的藻蓝蛋白。当选用酶解条件( a ) 时，藻蓝蛋白酶解物对h e l a 细 胞的抑制率达到4 3 2 ，对b 1 6 细胞的抑制率为2 3 2 。酶解条件为( b ) 时，藻蓝蛋 白酶解物对h e l a 细胞的抑制率为2 8 3 ，对b 1 6 细胞的抑制率则达到了4 6 4 。酶 解条件为( c ) 时，藻蓝蛋白酶解物对h e l a 细胞的抑制率达到4 5 1 ，对b 1 6 细胞的抑 制率为7 8 。酶解条件为( d ) 时，藻蓝蛋白酶解物对h e l a 细胞的抑制率为3 9 8 ，对 b 1 6 细胞的抑制率则达到4 5 6 。由此的出结论：不同酶解条件下得到的酶解物对不 同肿瘤细胞的抑制作用有很大的差异。 用酶解条件为( b ) 时得到的藻蓝蛋白酶解物处理b 1 6 细胞，经h o c h s t3 3 2 5 8 荧光 染色和比色法检测凋亡蛋白酶c a s p a s e 一3 活性，研究藻蓝蛋白酶解物的抗肿瘤机理。 研究发现，藻蓝蛋白酶解物处理b 1 6 细胞2 4 小时后，细胞发生明显凋亡，c a s p a s e - 3 活性达到最高。得出结论，藻蓝蛋白及其酶解物可能是通过激活c a s p a s e - 3 家族蛋白 诱导肿瘤细胞凋亡。 关键词：藻蓝蛋白；纯化：酶解；抗肿瘤：凋亡 a bs t r a c t c y a n o b a c t e r i a - p h y c o c y a n i n ( c p c ) i sap i g m e n ti na l g a ec e l l s c - p cw a su s e dn o t o n l yi nf o o da n dc o s m e t i ca sn a t u r a lp i g m e n t ，b u ta l s oi n h a n c i n gt h ea c t i v i t yo f l y m p h o c y t e ，i m p r o v i n gi m m u n i t y , e l i m i n a t i n gf l e er a d i c a l ，a n dp r o m o t i n gb l o o d c o r p u s c l er e b i r t h i tw a sf r u i t f u l l i np r e v e n t i n ga n dc u r i n go fc a n c e ra n dc a n k e r t h e m e t h o do fi s o l a t i o n ，p u r i f i c a t i o na n de n z y m a t i ch y d r o l y s i so fp cf r o ms p i r u l i n a p l a t e n s i s ，t h ea n t i c a n c e ra c t i v i t i e sa n dm e c h a n i s ms t u d i e so fp ca n di t sh y d r o l y s a t e s w e r ep r e s e n t e di nt h i st h e s i s c y a n o b a c t e r i u ms p i r u l i n ap o w d e rw a st r e a t e dw i t hr e p e a t e df r e e z i n ga n dt h a w i n g ， u l t r a s o n i c ，s a k i n go u ta n dd i a l y s i s ，a n dt h e nh a r v e s t e dt h ec r u d ep r o t e i n c p ca n d a l l o p h y c o c y a n i nc a nb es e p a r a t e db yh y d r o x y a p a t i t e ( h a ) c h r o m a t o g r a p h yw h i c hw a s t h em o s ti m p o r t a n tt ot h es e p a r a t i o n b yt w ot i m e so fh y d r o x y a p a t i t ec h r o m a t o g r a p h y , t h ep u r i t yo fc p c ( a 6 2 0 a 2 8 0 ) c a nb ea b o v e4 0 o r t h o g o n a le x p e r i m e n tw a su s e dt oo p t i m i z et h ec o n d i t i o no fe n z y m a t i c h y d r o l y s i s t h e r ea r ef o u ro p t i m i z e dc o n d i t i o n s o fe n z y m a t i c h y d r o l y s i s ( a ) ： t e m p e r a t u r e ：4 0 c ；p h ：8 ； t r y p s i n p c ：1 1 0 ；t i m e ：6 0 m i n u t e s ( b ) ：t e m p e r a t u r e ：3 7 ；p h ：8 ； t r y p s i n p c ：1 3 0 ；t i m e ：9 0 m i n u t e s ( c ) ：t e m p e r a t u r e ：4 0 c ；p h ：3 ； p e p s i n p c ：1 2 0 ；t i m e ：3 0 m i n u t e s ( d ) ：t e m p e r a t u r e ：3 3 。c ；p h ：0 5 ； p e p s i n p c ： 1 10 ；t i m e ：3 0 m i n u t e s g r o w t hi n h i b i t i o ne f f e c t so nh e l aa n db16c e l l so fp ca n di t sh y d r o l y s a t e sw e r e s t u d i e db ym t te x p e r i m e n t t h e r ew a sa no b v i o u sd o s e - e f f e c to fp ca n di t s h y d r o l y s a t e st oi n h i b i tt h eg r o w t ho fc a n c e rc e l l s w h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fp cw a s 10 0 1 a g m l ，t h ei n h i b i t i o nr a t eo fp ct oh e l aa n db 16w a sr e s p e c t i v e l yr e a c h e dt o2 6 3 a n d19 1 b u ta tt h es a m ec o n c e n t r a t i o n ，t h ei n h i b i t i o nr a t eo fp ch y d r o l y s a t e sw a s h i g h e rt h a np c w h e nt h ee n z y m a t i ch y d r o l y s i sc o n d i t i o nw a s ( a ) ，t h ei n h i b i t i o nr a t e o fp h y c o c y a n i nh y d r o l y s a t e sb yt r y p s i no nh e l ac e l l sw a s4 3 2 ，o nb 16c e l l sw a s 2 3 2 w h e nt h ee n z y m a t i c h y d r o l y s i sc o n d i t i o nw a s ( b ) ，t h ei n h i b i t i o nr a t eo f p b y c o c y a n i nh y d r o l y s a t e sb yt r y p s i no nb 16c e l l sw a s4 6 。4 ，o nh e l ac e l l sw a s2 8 3 wh e nt h ee n z y m a t i ch y d r o l y s i sc o n d i t i o nw a s ( c ) ，t h ei n h i b i t i o nr a t eo fp h y c o c y a n i n h y d r o l y s a t e sb yp e p s i no nh e l ac e l l sw a s4 5 1 ，o nb 1 6c e l l sw a s7 8 w h e nt h e e n z y m a t i ch y d r o l y s i s c o n d i t i o nw a s ( d ) ，t h ei n h i b i t i o nr a t eo fp h y c o c y a n i n h y d r o l y s a t e sb yp e p s i no nb 16c e l l sw a s4 5 6 ，o nh e l ac e l l sw a s3 9 8 s od i f f e r e n t e n z y m a t i ch y d r o l y s i sc o n d i t i o n sh a sd i f f e r e n te n z y m o l y s i ss i t e s ，a n dt h ee n z y m a t i c h y d r o l y s a t e sh a sd i f f e r e n ti n h i b i t i o ne f f e c t st od i f f e r e n tt u m o u rc e l l s b16c e l l sw a st r e a t e db yh y d r o l y s a t e so fc - p cb ye n z y m a t i ch y d r o l y s i s c o n d i t i o n ( b ) c e l l sw a sd y e db yf l u o r e s c e n td y e sh o e c h s t3 3 2 5 8 ，a n dc a s p a s e 3 a c t i v i t i e sw a sd e t e c t e db yc o l o r i m e t r y a f t e r2 4h o u r s ，b16c e l l sw e r ea p o p t o s i s ，a n d c a s p a s e 3a c t i v i t i e sr e a c h e dt ot h eh i g h e s tl e v e l s oc - p ca n di t sh y d r o l y s a t e sm a yb e i n d u c e dc a n c e rc e l l sa p o t o s i sb ya c t i v a t ea p o p t o s i sp r o t e i nc a s p a s e 3 k e yw o r d s ：p h y c o c y a n i n ；p u r i f i c a t i o n ；h y d r o l y s i s ；a n t i t u m o ra c t i v i t y ；a p o p t o s i s i v 论文、参加科研情况说明以及学位论文使用授权声明 论文、参加科研情况说明以及学位论文使用授权声明 一、发表论文 1 杨滢滢，王雪青藻蓝蛋白抗癌活性及其作用机理的研究进展科学时代， 2 0 0 7 ，2 2 3 ( 1 1 ) ：1 2 2 1 2 4 2 杨滢滢，王雪青，庞广昌原花青素抗肿瘤作用机制研究进展食品科学， 2 0 0 8 ，2 9 ( 10 ) ：6 9 4 - 6 9 7 二、参加科研情况 研究生期间参与天津市重大科技攻关项目”天津滨海地区适生螺旋藻藻种选 育、中试研究、及其生理活性物质研发”( 项目号：0 6 y f g z n c 0 4 2 0 0 ) 。 三、学位论文使用授权声明 学位论文作者同意授权天津商业大学将学位论文的全部内容或部分内容编入 有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅 或借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 6 5 第一章前言 1 1 螺旋藻简介 第一章前言 螺旋藻( s p i r u l i n a ) 是一类低等植物，属于蓝藻i - ( c y a n o p h y t a ) 、颤藻科( o s c i l l a t o r a c e a e ) 的一个属。螺旋藻通常为多细胞构成的丝状体、圆柱状，呈疏松或紧密 而规则的螺旋状弯曲，但形状往往受生长环境的影响而发生改变，有的甚至产生 稳定的直线形变异。螺旋藻性喜高w a a ( 2 5 3 6 ) 、高碱( p h8 1 2 ) ，光合自养， 但也能利用环境中的一些有机物作兼养生长，行无性繁殖，通常依靠藻丝体中横 隔的产生或藻丝体中伪空胞的产生而形成藻殖段。 螺旋藻含有极其丰富均衡的营养成分和多种生物活性物质，是一种优良的纯 天然食品川，被联合国粮农组织推荐为“全球人类最理想的食品”。 螺旋藻蛋白质含量高达5 0 7 0 ，由l8 种氨基酸组成，其中人体与动物 所必须的8 种氨基酸的含量接近或超过了f a o 推荐的标准，是自然界中具有重大 开发价值的食用和饵料蛋白资源，具有一定的医疗保健作用【2 】和显著的生理活性 p 】，如防治肿瘤和溃疡、提高机体免疫功能、调节血压、促进动物血细胞再生等。 综上所述，螺旋藻及其活性成分在功能性食品研究与开发方面有着广阔的应用前 景。 1 2 藻胆蛋白的组成及分类 螺旋藻蛋白含量高，主要是藻胆蛋( j ( p h y c o b i l i p r o t e i n s ，p b p ) 。藻胆蛋白具 有强烈的荧光性，发橙红色荧光，而其本身则呈红色、紫色或蓝色等。根据藻胆 蛋白的吸收光谱可将它们分为藻红蛋白( p e 和p e c ) 、藻蓝蛋白( p c ) 和别藻蓝蛋白 ( a p c ) t 4 1 。p e 根据其组成和光谱特性可分为r p e 、c p e 、b p e 、b p e 四种，p c 有一p c 和r - p c 两种。最初r 、c 和b 分别代表藻胆蛋白来源于红藻门 ( r h o d o p h y t a ) 、蓝藻i - j ( c y a n o p h y t a ) 和红藻中的红毛菜纲( b a n g i p h y c e a e ) ，但随后 的研究表明同一种类型的藻胆蛋白既可以从红藻中又可以从蓝藻中分离得到，因 此，现在这些前缀只表示光谱特性，不表示来源【5 ，6 1 。 第一章前言 藻胆蛋白是一类水溶性的寡聚蛋白，大都由两个同源性较高的肽链即a 和1 3 亚基组成，a 、p 亚基的分子量在1 5k d a 2 0k d a 之间，这两种亚基以1 ：1 的比 例构成单体( q p ) ，它们是藻胆蛋白的基本结构单位【7 1 。每种亚基有脱辅基蛋白 ( a p o p r o t e i n ) 和开链的四吡咯环发色团藻胆素组成，藻胆素通过硫醚健与脱 辅基蛋白的半胱氨酸残基共价连接【8 】( 图l 1 ) ，连接位点通常在a 8 4 ( c c 亚基第8 4 位氨基酸) 和p 8 4 ( 1 3 亚基第8 4 位氨基酸) 等保守位点上【9 ，0 1 。在藻胆蛋白内，藻胆 索以半环状和伸展状两种构象存在。一个藻胆蛋白中的藻胆素可以分为两种类 型，一种是能够吸收能量并相应地产生荧光的“荧光型”发色团；另一种称为“敏 化型”发色团，它能吸收能量并将吸收的能量快速高效地传递给“荧光型”发色团， 自身不能产生荧光。 m 呵_ _ c y 泌c k o 图l - l 藻胆索链状分子结构 f i g 1 - 1t h em o l e c u l a rs t r u c t u r eo f p h y c o c y a n o b i l i n 藻胆蛋白的( 0 【p ) 单体倾向于形成较高的聚集体( a p ) n ，常见的聚集体形式为 ( a 1 3 ) 3 或( ( 2 1 3 ) 6 。纯化的藻胆蛋白a 和p 亚基的聚集体形式往往与藻胆蛋白的种类、 蛋白浓度、溶液的p h 值和离子强度等因素有关，依条件的不同，在各聚集体之 间存在着一定的动态平衡关系 7 ，1 。 目前对于亚基的分子量大小说法不一。张成武等将纯化后的藻蓝蛋白通 过1 2 十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p a g e ) 可见钝顶螺旋藻的藻 蓝蛋白由g t 和p 两个亚基单位组成并测得它们分子量分别为1 4 5 0 0u 和1 5 0 0 0 u 。 俞丽君【1 3 1 测得藻蓝蛋白两个亚基分子量为1 4 9 0 0u 和1 7 2 0 0u 。彭卫民等以标 准蛋白的相对迁移率( x ) 及其对应的分子量的对数( y ) 为参数进行回归分析，所得 回归方程为：y = 1 0 2 2 8x + 5 1 2 5 5 ( r 2 = 0 9 8 8 9 ) ，经计算得钝顶螺旋藻中藻蓝蛋 2 第一章前言 白的a 亚基分子量约为1 6 3k d 、1 3 亚基分子量约为1 8 9k d 。 l 藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的亚基( 尤其是相同亚基) 之间的氨基酸序列同源性 很高。殷钢【1 5 】、李建宏【1 6 j 等对螺旋藻中藻蓝蛋白的氨基酸组成进行了研究。结 果表明不同品系的螺旋藻藻蓝蛋白的氨基酸组成基本一致。张成武【1 2 】对钝顶螺 旋藻藻胆蛋白进行氨基酸组成和含量分析，认为除色氨酸未测外，藻蓝蛋白含有 1 4 种氨基酸，只含微量组氨酸和脯氨酸，缺少蛋氨酸。彭卫民【1 4 】用高效液相色 谱法分析钝顶螺旋藻中藻蓝蛋白的氨基酸组成，结果表明藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白 的氨基酸组成比较相似，都是以苯丙氨酸的含量最高，其次是天冬氨酸、谷氨酸 和酪氨酸，而脯氨酸、组氨酸的含量较低。同时，藻蓝蛋白中酸性氨基酸和碱性 氨基酸含量比为2 1 4 ，比别藻蓝蛋白的1 9 3 高，因此认为藻蓝蛋白为一酸性蛋白， 同时也解释了藻蓝蛋白比别藻蓝蛋白等电点低的原因。 1 3 藻蓝蛋白的理化特性研究 由于藻蓝蛋白广阔的应用前景，研究藻蓝蛋白的理化特性成了开发螺旋藻的 重要课题。近年来，对于藻蓝蛋白的研究已深入到分子组成，在其它的理化特性 研究上也取得了较大的进展。 1 3 1 光谱学特性 光谱学特性是藻蓝蛋白的重要特征之一，光谱学特性的研究为螺旋藻藻蓝蛋 白的鉴定提供了重要依据。同时，还可利用其最大吸收进行蛋白的含量测定，为 藻蓝蛋白的产品质量控制提供了简便、有效的方法。但是，由于不同品系的螺旋 藻的藻蓝蛋白存在一定的差异及研究者采用的藻蓝蛋白样品的纯度不同，其报道 的光谱学性质也存在差别。大部分报道均表明藻藻蓝蛋白的紫外可见光光谱中 在波长2 8 0n m 、3 6 0n m 和6 2 0 啪处附近有特征吸收峰【1 2 1 5 1 7 ，18 1 。殷钢等【1 9 】还 对藻蓝蛋白进行红外光谱测定结果显示藻蓝蛋白在3 2 0 0 、1 6 5 0 、1 5 5 0 、1 1 0 0 、 1 0 5 0 和6 5 0c m 1 处有吸收峰，从而为藻蓝蛋白的鉴定提供更丰富的依据。 第一章前言 1 3 2 等电点 等电点是蛋白质最为突出的性质之一。目前对螺旋藻藻蓝蛋白等电点的报道 都在3 4 4 8 【1 2 氓2 0 1 之间。这可能是由于不同品系的螺旋藻中藻蓝蛋白的性质差 异，另一原因就是不同纯度的藻蓝蛋白影响测定结果的一致。研究结果还发现藻 蓝蛋白的等电点一般都低于别藻蓝蛋白，这可能与蛋白中氨基酸的组成有关1 1 4 1 。 1 3 3 稳定性 张以芳等【z o j 研究认为藻蓝蛋白在4 0 以下稳定，4 5 时其色素开始分解， 溶液光密度值逐渐下降，5 0 时光密度急骤下降，7 0 时溶液光密度比原来降 低7 5 ，糖溶液可以提高藻蓝蛋白对热的稳定性。何佳等【2 l l 研究发现光照对藻 蓝蛋白的影响较小，5 0 0 0i x 光照6 0 d , 时，p h5 处理的溶液光密度不变。研究还表 明，藻蓝蛋白在p h4 0 8 5 之间稳定，光密度不变，p h 值大于8 5 或小于4 o 时溶 液颜色变淡。以上研究结果说明了藻蓝蛋白对温度和p h 较为敏感，对光不敏感， 这一发现对于藻蓝蛋白在提取纯化和保存过程中条件的控制具有重要的意义。 1 3 4 荧光性 藻胆蛋白具有高度的荧光性【2 2 1 ，这一特性使得藻胆蛋自在作为荧光标记时 大有前途。自从在2 0 世纪8 0 年代将蛋白应用到免疫测定、单细胞分析和流式细胞 仪的分离，将蛋白作为荧光探针在生物的各领域都显示了很大的前景，如将多色 流式细胞技术用于细胞分析和分类等。同时，一些新的藻胆蛋白探针或共轭物的 发展提高了在稀释状态下藻胆蛋白的稳定性，! z 1 l is u n 等i 2 2 】曾用甲醛使亚基之 间化学交联，提高了其在变性条件下的稳定性。 1 4 藻蓝蛋白的生理活性研究 1 4 1 清除自由基和抗氧化功效 研究表明，藻蓝蛋白是一种有效的抗氧化剂。v a d i r a j ab b h a t 等曾对藻 蓝蛋白清除过氧亚硝酸盐阴离子的能力作过研究，发现藻蓝蛋白和它的发色团 4 第一章前言 p c b ，这种天然存在的线形四吡咯，相互作用，从而有效地清除o n 0 0 阴离子。 也有证据证明，p c b 能显著地抑制o n o o 。造成的超螺旋p b r 3 2 2d n a 链断裂。 p i n e r oe s t r a d aj e 等【2 4 1 也曾对藻蓝蛋白纯化过程中得到的不同提取物的抗氧化 活性进行了研究，通过羟基基团的清除活性来衡量。藻蓝蛋白含量的增加，抗氧 化活性也相应地增加，因而推断，藻蓝蛋白是与抗氧化活性主相关的成分。一种 功能强大的广谱抗氧化剂应该能够清除一系列的有毒自由基，而藻蓝蛋白便属于 这类物质。最重要的是，藻蓝蛋白是一种天然化合物，它毒性最低，因此可以作 为一种治疗药剂来使用。藻蓝蛋白能抑铝l j f e 3 + - 抗坏血酸维生素c 诱导的过氧化反 应。口服藻蓝蛋白提取物( 5 0 3 0 0m g l ( g ) 可显著抑制过氧化反应【2 5 2 7 1 。 1 4 2 抗炎作用 大量的体外和体内实验模型研究发现藻蓝蛋白有抗炎活性。在藻蓝蛋白处理 乙酸诱导的大鼠大肠炎试验中，组织病理学和超微结构研究显示藻蓝蛋白能抑制 炎症细胞的渗透，在一定程度上减少小鼠结肠的损伤。说明藻蓝蛋白具有一定的 抗炎症功效1 2 引。在葡萄糖氧化酶诱导的老鼠爪发炎的实验中，藻蓝蛋白降低了 水肿指数，这是因为炎症主要是由氢过氧化物和羟基自由基引起的【2 9 1 。曾对由4 醋酸诱导的鼠结肠炎，用不同剂量的藻蓝蛋白( 1 5 0 、2 0 0 、3 0 0m g k g ) , 和i 5 一对氨 基水杨酸( 5 - a m i n o s a l i c y l i ca c i d ，5 - a s a ) ( 2 0 0m g k g ) 进行预处理，结果与空白对照 组比较发现，藻蓝蛋白有显著的抗炎活性，处理后的小鼠其肠微绒毛几乎跟正常 的一样，但是与5 一a s a 相比，活性要差一点。5 a s a 是已知的抗炎剂。 1 4 3 增强机体的免疫功能 大量研究表明藻蓝蛋白能增强机体的免疫功能。张成武等f 3 0 1 研究发现正常 小鼠皮下注射藻蓝蛋白( 5m g k g ) 5 天后，能明显增加c f u e 和b f u e 的集落数。 贫血小鼠皮下注射藻蓝蛋白5 天后能明显增加白细胞、红细胞和血红蛋白的数 量。李冰等1 3 i j 研究发现藻蓝蛋白能促进机体免疫器官的发育且比螺旋藻多糖的 效果更为显著；能促进t 淋巴细胞转化为t 淋巴母细胞，明显增强机体的细胞 免疫活性；能增强b 细胞的活性，提高机体的体液免疫效应。李敏等【3 2 l 发现螺 旋藻蓝蛋白能促进小鼠脾细胞分泌i l 2 。而高剂量i l 2 能诱导生成淋巴因子激 第一章前言 活的杀伤细胞( 1 y m p h o k i n ea c t i v a t e dk i l l e rc e l l s ，l a k ) 。这类细胞可以杀伤多种对 c t l 、n k 不敏感的肿瘤细胞。李冰等1 3 i 】研究发现藻蓝蛋白组荷瘤小鼠血清及脾 细胞、胸腺细胞培养上清中t n f 含量明显高于对照组，而且藻蓝蛋白促进t n f 分泌的功能稍强于多糖。 1 4 4 抗肿瘤效应 国内外众多研究表明，藻胆蛋白能提高淋巴细胞活性，通过淋巴系统提高机 体免疫功能，增强机体的防病、抗病能力，还能清除生物体内的自由基及促进动 物血细胞再生，并且具有显著的抗肿瘤活性。 刘宇峰等【3 3 】研究了螺旋藻藻蓝蛋白对人体血癌细胞k 5 6 2 生长的影响，发现 藻蓝蛋白能有效的抑制血癌细胞k 5 6 2 的生长。张成武等【3 4 l 所作的体外培养试验 证实，螺旋藻藻蓝蛋白对人血癌细胞株h l 6 0 、k 5 6 2 和u 一9 3 7 均有不同程度的抑 制作用，并显示出显著的浓度剂量效应。v a d i r a j a 等研究表明螺旋藻c 藻蓝蛋白 能有效抑制大鼠肝癌细胞的生长。蔡心涵等【3 5 】采用不同浓度藻蓝蛋白液处理人 大肠瘤细胞株h r 8 3 4 8 作体内外激光治癌试验，发现癌细胞存活率随藻蓝蛋白浓 度降低而增高，呈良好的浓度剂量效应，并具有一定的杀伤作用。黄蓓等 3 6 l 从 螺旋藻藻蓝蛋白酶解产物中分离得到的色素肽，检测色素肽对体外培养的小鼠 s 1 8 0 肉瘤光动力疗法( p d t ) 效果的结果表明三种色素肽c c p l 、c c p 2 和c c p 3 都有 良好的p d t 效应，这暗示有可能是通过诱发凋亡途径导致细胞死亡的。其中c c p l 及c c p 3 分子量小、无毒副作用，且有一定的荧光活性，可作为新一代光敏剂。 l 。5 藻蓝蛋白的抗肿瘤机理研究 印度科学家j a g us u b h a s h i n i 等首先发现藻监蛋白可在体外诱导脂多糖激发的 r a w 2 6 4 7 巨噬细胞的凋亡，开启了对藻蓝蛋白抗肿瘤分子机理的研究。 1 5 1 凋亡的分子机制 目前认为抗肿瘤药的主要药理作用机制之一是诱导肿瘤细胞凋亡 ( a p o p t o s i s ) ( 图l 一2 ) 。细胞凋亡，又称编程性死亡，是生物界重要的生命现象之一， 6 第一章前言 是为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。与细胞坏死不同， 细胞凋亡不是一个被动的过程，而是主动的过程，它涉及一系列基因的激活、表 达以及调控等，它并不是病理条件下自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生 存环境而主动争取的一种死亡过程。 细胞凋亡的途径主要有两条：通过胞外信号激活的死亡受体途径( d e a t h r e c e p t o rp a t h w a y ) 和通过胞内信号激活的线粒体途径( m i t o c h o n d r i a lp a t h w a y ) 。 在死亡受体途径中作用的细胞表面受体d e a t hr e c e p t o r ( f a s ，t n f r i ，d k 3 ， d r 4 和d r 5 ) 是属于肿瘤坏死因子受体( t u m o rn e c r o s i sf a c t o rr e c e p t o r , t n f r ) 家族 的跨膜蛋白，与之结合的是属于t n f ( t u m o rn e c r o s i sf a c t o r , t n f ) 家族的相应配 体。其中由f a s 介导的细胞凋亡途径是研究的比较清楚的一个。配体f a s l ( f a s l i g a n d ) 与f a s 结合后，f a s 在胞内的死亡结构域( d e a t hd o m a i n ，d d ) 构象发生改变， 与接头蛋白f a d d ( f a sa s s o c i a t e dd e a t hd o m a i n ) 的d d 结合。然后由f a d d 的 d e d 结构域( d e a t he f e c t o rd o m a i n ) 招募并与c a s p a s e 8 ( 或l o ) f i 订体蛋白结合，形成 d i s c 复合物( d e a t h i n d u c i n gs i g n a l i n gc o m p l e x ，d i s c ) 。c a s p a s e 一8 ，l o 通过自身剪 切激活，并启动c a s p a s e 的级联反应，使c a s p a s e 一3 ，一6 ，9 激活，降解胞内结构蛋 白和功能蛋白，最终导致细胞凋亡【3 8 j 。 7 第一$ 前言 ，o 兀d 嘲 罔i ，2 细胞捅亡的信号途径 f i g1 - 2s i 蚪却p a t h w a yo f a 坤p b 豳 细胞应激反应，d n a 损伤等胞内凋亡信号则引起线粒体途径( m i t o c h o n d i r a l p a t h w a y ) 的凋亡。作为凋亡诱导因子，线粒体成分细胞色素c 从线粒体外膜释放 到细胞质，与a p a f - 1 ，c a s p a s e - 9 前体形成a p o p t o s o m e ，招募并激活c a s p a s e - 3 ，进而 引发c 器p a s e s 级联反应，最终导致细胞凋亡。 死亡受体途径和线粒体途径这两种介导凋亡的途径之间也有信号的偶联。有 报道发现，通常在细胞外信号途径中起作用的c a s i m s e 8 可以通过剪切b e l - 2 家 族成员b i d 产生的b i d c 端片段引起线粒体细胞色素c 的释放，间接地诱导细胞 第一章前言 内信号途径【3 9 1 。另外，死亡受体途径作用不完全时，b c l - 2 、b a x 也可以干预f a s 途径【4 0 i 。 1 5 2 藻蓝蛋白诱导肿瘤细胞凋亡 王勇等【3 7 】利用流式细胞仪分析用藻蓝蛋白处理的各组h e l a 细胞d n a ，发 现藻蓝蛋白可使h c l a 细胞停滞于g 1 期，阻止了细胞的d n a 复制和分裂。初 步认为这可能是藻蓝蛋白抑制癌细胞生长的机理。 r 0 y t 4 1 1 和j a g us u b h a s h i n i t 4 2 1 分别用c 藻蓝蛋白处理原发性肝癌 ( h e p a t o c e l l u l a rc a u r c m o m a ，h c c ) 细胞和人类慢性白血病细胞系( k 5 6 2 ) 发现：经c - 藻蓝蛋白处理后细胞抗凋亡的b c l - 2 下调，但是促凋亡的b a x 上调或没有任何变 化，因此b c l 2 b a x 的比率倾向于使细胞凋亡。研究表明，c 藻蓝蛋白通过细胞 色素c 从线粒体释放进入细胞质，p a r p 的裂解和b c l 2 的下调诱导k 5 6 2 细胞凋 亡。 李冰等【4 3 1 构建得到含有c d 5 9 基因的h e l a 细胞，以不同剂量的藻蓝蛋白作 用于体外培养的h e l a 细胞，发现藻蓝蛋白具有抗肿瘤效应，其机制可能是藻蓝 蛋白与肿瘤细胞表面的有丝分裂原受体结合，通过受体的交联和蛋白激酶活化从 而促进细胞内c d 5 9 基因的转录表达，而过量表达的c d 5 9 蛋白又和h e l a 细胞 上的f a s 结合，诱导死亡结构域的活化，从而抑制肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤细 胞的凋亡。 h a i z h e nw 抽g m 】等发现藻蓝蛋白的b 亚基( c p c p ) 具有抗癌作用。他们研究 了c p c 1 3 抑制细胞增值和诱导细胞凋亡的机制，发现经c - p c 1 3 处理后细胞中 c a s p a s e 一3 和c a s p a s e - 8 活性增加。c a s p a s e 是细胞凋亡的关键酶，在正常细胞内以 酶原形式存在，一旦被凋亡信号激活，c a s p a s e 即降解细胞内的蛋白质，使细胞 不可逆的走向死亡。 r e d d y l 4 5 1 发现，藻蓝蛋白可选择性抑制环氧化酶( c o x ) 2 活性，而c o x 2 在癌细胞中高表达。他们用脂多糖( l p s ) * u 激r a w 2 6 4 7 吞噬细胞，观察螺旋藻 藻蓝蛋白的作用，结果表明藻蓝蛋白具有剂量依赖性抑制r a w 2 6 4 7 细胞株增殖 作用，能抑制c o x 2 的表达；f c m 检测r a w 2 6 4 7 细胞呈现凋亡表现，初步认 9 第一章前言 为这种凋亡是由线粒体释放细胞色素c 及独立的b c l - 2 表达所致。 1 6 藻蓝蛋白的提取与纯化技术 蓝藻中的藻蓝蛋白往往经提取与纯化后，作为高附加值的深加工产品用于食 品、化妆品、医药保健和检测试剂等领域，不同的应用领域对其纯度有不同的要 求。藻蓝蛋白的纯度通常以纯度值( 或纯度系数) 表示，即其在可见光区的最大吸 光值与2 8 0 n m 吸光值的比值。用作分子荧光探针和光敏剂的藻蓝蛋白，其纯度 值一般需大予4 0 。近年来，国内外在藻胆蛋白的提取与纯化方面作了大量研究， 所报道的技术工艺因所选材料和研究目的不同而各具特色。但从总体上说，绝大 多数的工艺技术方法都包括蛋白粗提和柱层析纯化这两个重要步骤。 1 6 1 藻蓝蛋白的粗提 藻蓝蛋白的粗提取过程主要包括细胞破碎和盐析沉淀。细胞破碎是为了使胞 内蛋白更好的溶出，而盐析沉淀则是为了进一步除去杂质，精制藻蓝蛋白。 1 6 1 1 细胞破碎 藻蓝蛋白属于胞内蛋白质，首先要破碎细胞的细胞壁、细胞膜使其溶出。细 胞破碎程度越高，藻蓝蛋白的得率也越高。目前螺旋藻细胞破碎方法，可分为机 械法和非机械法两大类。多数研究者均采用两种或两种以上的方法，以期得到最 大的蛋白溶出率。 ( 1 ) 机械法 机械法中常用的有：超声破碎法、珠磨法和高压均质法。超声破碎法常用于 实验室研究，处理量较小，常作为藻胆蛋白提取中的辅助方法。超声波法是运用 超声波破碎藻体细胞的细胞壁，使藻胆蛋白溶出。胡一兵等阳利用超声波破碎 新鲜藻体细胞，得到了藻蓝蛋白纯度值( a 6 2 0 唧a 2 8 0 。m ) 为1 2 0 的粗提液。超声波 的功率和作用时间等对藻体细胞的破碎率影响较大，破碎处理过程中需避免因升 温及机械力引起的蛋白质变性。珠磨法和高压均质法更适于螺旋藻的规模化破 碎。 l o 第一章前言 ( 2 ) 非机械法 非机械法中常用的有酶溶法、化学渗透法和反复冻融法。 ( a ) 酶溶法 溶菌酶也可用于溶解藻体细胞壁，获得较高得率的藻蓝蛋白。c a r m e ns s 4 r l 等人采用溶菌酶对螺旋藻的藻胆蛋白进行了粗提。叶海辉等【4 3 】采用溶菌酶和高 压匀质法结合作用的方法，得到了较好的螺旋藻细胞的破碎效果。但需要注意的 是，加入化学试剂后，使后期纯化处理的难度增加，且操作不慎易会引起藻蓝蛋 白变性。 ( b ) 化学渗透法 化学渗透法是有选择性地加入某些化学试剂，改变细胞壁或膜的通透性，从 而使胞内的物质有选择性地渗透出来的一种方法。林卫红等【4 9 】用o 3m m o l l 的十 二烷基苯磺酸钠提取钝顶螺旋藻中的藻胆蛋白，提取率达到9 8 。张成武等 将收集的藻体重新悬浮于等体积的0 0 1m ( p r t7 o ) 的磷酸盐缓冲液中，力n a 0 1m t r i t o nx - 1 0 0 ，于2 0 冰箱中反复冻融两次，细胞破碎率接近1 0 0 。 ( c ) 反复冻融法 反复冻融法是将细胞反复冰冻和融解数次，利用细胞内冰粒的形成和细胞 液盐浓度增高引起溶胀使细胞破碎。通常都将鲜藻泥或藻粉悬浮于蒸馏水或低浓 度磷酸缓冲液中，经2 0 以下冰冻，再在4 左右融解，反复数次后离心获得藻 胆蛋白粗提液5 0 睨】。冻融的次数与藻类品种、材料含水量和冰冻温度等有关。因 冻融法操作简单，不需要特殊的仪器设备，故在藻蓝蛋白提取中是最常用的一种 的细胞破碎方法。 ( d ) 溶胀法 溶胀法是直接用蒸馏水或低盐溶液浸泡藻体细胞，使其溶胀、破裂，释放 出藻蓝蛋白。余九九等【5 3 】在比较液氮冻融、超声波破碎和蒸馏水低温( 4 ) 自溶 等方法对极大螺旋藻藻胆蛋白的提取效果时发现，水自溶法提取效果最好，叶绿 素复合蛋白含量少，而藻胆蛋白含量高。但针对蒸馏水自溶提取周期长( 一般需 第一章前言 l o 天) 的问题，他们又比较了几种低盐溶液对藻胆蛋白的提取效果，发现利用低 浓度的c a c l 2 替代蒸馏水可使自溶时间缩短至3 4 天。但这与超声波等其它方法 相比，提取周期仍较长。 1 6 1 2 去除杂蛋白 藻胆蛋白在粗提液中的含量虽然较高，但仍含有多种杂蛋白，直接影响其分 离纯化效果。因此，一般在利用柱层析等纯化前，要利用盐析和结晶等方法先除 去部分杂蛋白。 ( 1 ) 盐析法 盐析法是通过加入盐溶液使蛋白质沉淀析出。藻胆蛋白粗提液中常用的盐溶 液为硫酸铵，其沉淀效果也得到普遍认可。但是关于硫酸铵的盐析浓度存在多种 看法。较多的是采用5 0 、5 5 或6 0 饱和度的硫酸铵溶液进行沉淀【1 2 1 3 , 1 7 , 4 9 , 5 1 ， 5 4 1 。胡一兵等【4 6 】采用不同浓度的硫酸铵溶液，分段梯度盐析分离纯化钝顶螺旋藻 的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白，效果良好。 ( 2 ) 结晶法 结晶法是利用不同藻胆蛋白在低浓度硫酸铵中可产生不同晶体的特点，用结 晶的方法来提取藻胆蛋白。程凌江等【5 5 】采用这种方法得到了纯度值高达4 0 的 r - 藻红蛋白的微晶。 ( 3 ) 等电点沉淀法 等电点沉淀法是利用蛋白质在等电点时溶解度最小的特性，通过调节溶液 p h 值至藻蓝蛋白的等电点，使藻蓝蛋白溶解度下降而析出沉淀。汤朝晖等f 5 6 1 用 该法沉淀得到了含有三种藻胆蛋白的混合物。 1 6 2 藻蓝蛋白的纯化 藻蓝蛋白的纯化最常用的是色谱技术，也有一些其他纯化技术的报道，如萃 取法等。 1 2 第一章前言 1 6 2 1 色谱纯化 色谱技术是当今最有效的蛋白质纯化技术，在藻蓝蛋白的纯化技术中，研究 最多的也是色谱纯化技术。目前常用于纯化藻蓝蛋白的色谱纯化技术主要有以下 几种。 ( 1 ) 羟基磷灰石柱层析 羟基磷灰石( h y d r o x y a p a t i t e ，h a ) 是一种磷酸钙晶体。羟基磷灰石吸附技术对 于蛋白质、酶、核酸等生物大分子的分离和纯化具有良好的选择性。当其他分离 技术无效时，使用该技术往往能呈现良好的分离性能。而且它价格低廉，用它作 为色谱填充料，可作为制备色谱易于放大。殷钢等5 7 1 采用直径1 2m m ，柱高1 0c m 的制备型羟基磷灰石色谱吸附藻胆蛋白的粗提液，可以将藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白 较好地分离开来，得到了纯度较高的藻蓝蛋白。胡一兵等1 4 6 】采用直径3c m ，柱