（海洋生物学专业论文）海洋胶红酵母菌tjy15a菌株产油脂的研究.pdf

f5，1j 海洋胶红酵母菌t j y l5 a 菌株产油脂的研究 学位论文完成日期： 指导教师签字： 答辩委员会成员签字： 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得l 逵! 翅遗查墓丝盂墓缱 剔童塑的! 奎拦亘窒2 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 鸯榜 签字日期：) o 旧年f 月吾j 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息 研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公 众提供信息服务。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 杏栖 导师签字： 签字日期：细f d 年j 月名j 日 签字日期：卯i 。年6 月拍 海洋胶红酵母菌t j y l5 a 菌株产油脂的研究 摘要 近年来，随着环境污染和能源危机的日益严重，生物柴油因为其可再生，可 降解及无毒副作用而受到越来越多的关注。目前，生物柴油原料油脂的主要来源 是动植物脂肪以及餐饮废油，存在成本高以及收集和运输困难的问题，因此寻找 一种廉价的原料成为了生物柴油产业化的关键。研究证明，一些微生物可以在体 内积累油脂，例如酵母、细菌、霉菌和微藻等。随着生物柴油工业的快速发展， 微生物油脂将成为生物柴油产业的富有潜力的油料来源。 从实验室海洋酵母菌种库的7 7 1 株海洋酵母中利用苏丹黑b 染色的方法筛选 得到7 株油脂含量较高的酵母菌，利用索氏提取法复筛得到l 株油脂产量较高的 海洋酵母菌菌株t j y l5 a ，该菌株分离自中国天津市大港区附近表层海水。通过 传统的酵母菌种鉴定及分子生物学鉴定，最终鉴定该株海洋酵母属于胶红酵母菌 ( r h o d o t o r u l am u c i l a g i n o s a ) 。以葡萄糖作为碳源，采用单次因子方法对t j y l 5 a 菌株发酵产油脂培养基及培养条件进行优化，得到最适产油脂的培养基组分是 ( w v ) ：葡萄糖糖6 o ，酵母粉o 8 6 ( 即碳氮比为7 0 ) ，k h 2 p 0 40 7 ，n a 2 h p 0 4 0 2 5 ，m g s 0 4 7 h 2 0o 1 5 ，c a c l 20 0 1 5 ，f e c l 3 。6 h z o0 0 1 5 ，z n s 0 4 7 h 2 0 o 0 0 2 ，m n s 0 4 h 2 00 0 0 6 ，( n i - 1 4 ) 2 s 0 40 0 5 ，初始p n 为6 。最佳培养条 件为：在2 8 和1 8 0r p m 振荡培养7 2h 。在此最佳条件下培养，菌株t j y l 5 a 的油脂最大产量可以达到4 9 6 ，菌体生物量达到1 7 9g m 。 本实验以木薯淀粉作为廉价碳源，利用海洋胶红酵母菌株t j y l 5 a 转化木薯 淀粉水解液生产酵母菌油脂，经过产油条件优化及发酵过程的补加酶及淀粉的实 验，最终油脂产量可达5 2 9 ，菌体生物量达到2 1 8g l 。对t j y l 5 a 菌株所产 油脂进行气相色谱测定，测得其油脂成分有8 5 8 为c 1 6 ：o 和c 1 8 1 ，尤其是c 1 8 ：l 约占6 3 5 ，表明主要是长链脂肪酸组成，所以t j y l 5 a 得油脂可以作为的优良 油料供给物来用于合成生物柴油。 本文研究了胶红酵母t j y l 5 a 在2l 酵罐上的发酵特性。结果表明：在发酵 1 4 8h 补加两次碳源之后，在2l 酵罐上t j y l 5 a 菌株的细胞生物量可达2 4 0g m ， 油脂产量可达5 2 5 。 关键词：海洋酵母菌；微生物油脂；胶红酵母；木薯淀粉；脂肪酸甲酯；发酵 s t u d i e so nl i p i dp r o d u c t i o nb yt h em a r i n ey e a s tr h o d o t o r u l a m u c i l a g i n o s at j y 15 a a b s 仃a c t i nt h ep a s ty e a r s ，b i o d i e s e l ，w h i c hi sar e n e w a b l e ，b i o d e g r a d a b l e ，a n dn o n t o x i c f u e lh a sr e c e i v e di n c r e a s i n ga t t e n t i o nb e c a u s eo ft h ee n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o na n d e n e r g yc r i s i sw o r l d 、析d e t h er a wm a t e r i a l sf o rb i o d i e s e lp r o d u c t i o na r ev e g e t a b l e o i la n dw a s t eo i la tp r e s e n t h o w e v e r , t h eh i g hm a t e r i a lp r i c eo fv e g e t a b l eo i la n d w a s t eo i ll e dt ot h eh i g hp r o d u c t i o nc o s to fb i o d i e s e lp r o d u c t i o n s ot of i n dc h e e p m a t e r i a l si sv e r yi m p o r t a n tf o rt h eb i o d i e s e li n d u s t r i a l i z a t i o n i th a sb e e nw e l l d o c u m e n t e dt h a ts i n g l ec e l l o i l sa r ep r o d u c e db ys o m eo l e a g i n o u sm i c r o o r g a n i s m s ， s u c ha sy e a s t ，f u n g i ，b a c t e r i a , a n dm i c r o a l g a e i ng e n e r a l ，y e a s ta n dm o l d sc a l l a c c u m u l a t em u c hm o r el i p i d st h a nb a c t e r i aa n dm i c r o a l g a e w i t ht h e r a p i d e x p a n s i o no fb i o d i e s e l ，m i c r o b i a lo i l sm i g h tb e c o m eo n eo fp o t e n t i a lo i lf e e ds t o c k s f o rb i o d i e s e lp r o d u c t i o ni n t h ef u t u r e 7 71y e a s ts t r a i n si s o l a t e df r o md i f f e r e n tm a r i n ee n v i r o n m e n t sw e r es c r e e n e df o r t h e i ra b i l i t yt op r o d u c es i n g l ec e l lo i l s a m o n gt h e m ，at o t a lo f7y e a s ts t r a i n sw e r e f o u n dt op r o d u c eh i g hl i p i d ，a n dt h ey e a s ts t r a i nt j y l5 aw h i c hw a si d e n t i f i e dt ob e r h o d o t o r u l am u c i l a g i n o s aw a sf o u n dt op r o d u c et h eh i g h e sl e v e lo fl i p i d t h e o p t i m a lm e d i u mc o m p o n e n t sa n dg r o w t hc o n d i t i o n sf o rl i p i dp r o d u c t i o nb ys t r a i n t j y15 aw e r es t u d i e du s i n g “o n e v a r i a b l e - a t - a - t i m e ”m e t h o d t h er e s u l t ss h o w e d t h a tt h eo p t i m a lm e d i u mc o m p o n e n t sf o rt h e h i g h e s tl i p i dp r o d u c t i o nb ys t r a i n t j y l5 aw e r eg l u c o s e6 0 ( w v ) ，y e a s te x t r a c t ，0 8 6 ，k h 2 p 0 40 7 ，n a 2 h p 0 4 0 2 5 ，m g s 0 4 7 h 2 0o 1 5 ，c a c l 20 0 1 5 ，f e c l 3 6 h 2 0o 0 1 5 ，z n s 0 4 7 h 2 0 0 0 0 2 ，m n s 0 4 。h e o0 0 0 6 ，( n h 4 ) 2 9 0 40 0 5 ，a n di n i t i a lp h6 2 t h e o p t i m a lg r o w t hc o n d i t i o n sw e r es h a k i n gs p e e d18 0r p m t e m p e r a t u r e2 8 u n d e r t h e s ec o n d i t i o n s ，t h eb i o m a s sa n dl i p i dc a nr e a c h17 9g la n d4 9 6 ，r e s p e c t i v e l y h y d r o l y s a t eo fc a s s a v a s t a r c hw a su s e da s t h ec a r b o ns o u r c e sf o r l i p i d p r o d u c t i o nb yt h i sy e a s ts t r a i n t h ec e l l sc o n t a i n i n g5 2 9 ( w w ) o fl i p i dw a s o b t a i n e dd u r i n gt h ef e d - b a t c hc u l t i v a t i o na n dt h eb i o m a s sr e a c h e d21 8 g 几t h e f a t t ya c i d sf r o m 足m u c i l a g i n o s at j y 15 aw e r em a i n l yc o m p o s e do fp a l m i t i ca c i d ( c 1 6 ：0 ) ，p a l m i t o l e i ca c i d ( c 1 6 ：1 ) ，s t e a r i ca c i d ( c 1 8 ：o ) ，o l e i ca c i d ( c i 8 ：1 ) a n dl i n o l e n i c a c i d ( cl8 ：2 ) ，s u g g e s t i n gt h a tt h ef a t t ya c i d sc o u l db eu s e da sf e e d s t o c kf o rb i o d i e s e l p r o d u c t i o n t h ef e d b a t c hf e r m e n t a t i o nf o rl i p i dp r o d u c t i o nf r o mh y d r o l y s a t eo fc a s s a v a s t a r c h b yr m u c i l a g i n o s at j y 15 aw a si n v e s t i g a t e di n2lf e r m e n t o r t h e e x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e dt h a ta tt h ee n do ft h ef e d b a t c hc u l t i v a t i o nt h eb i o m a s s a n dl i p i dr e a c h e d2 4 0g la n d5 2 5 ，r e s p e c t i v e l y k e y w o r d s ：m a r i n ey e a s t s ；s i n g l ec e l lo i l ；f a t t ya c i dm e t h y le s t e r ；r h o d o t o r u l a m u c i l a g i n o s a ；m a n i h o te s c u l e n t a ；f e d b a t c hc u l t i v a t i o n 目录 第一章文献综述1 1 1 微生物油脂的研究进展1 1 2 微生物油脂及油脂微生物5 1 2 1 微生物油脂的概念及组成5 1 2 2 产油微生物的种类7 1 2 3 微生物油脂的应用：1 0 1 3 微生物油脂生物合成途径及调节机制1 1 1 3 1 乙酰- c o a 和n a d p h 的形成1 1 1 3 2 脂肪酸的生物合成1 2 1 3 3 不饱和脂肪酸的形成1 4 1 3 4 甘油三酯的生物合成1 5 1 4 影响微生物油脂形成的因素1 6 1 4 1 碳源、氮源及培养基碳氮比的影响1 6 1 4 2 温度的影响1 6 1 4 3p h 值1 6 1 4 4 培养时间1 7 1 4 5 无机盐和微量元素1 7 1 4 6 其他因素对油脂合成的影响1 7 1 5 生产微生物油脂的基本工艺1 8 1 5 1 微生物油脂的生产原料1 8 1 5 2 筛选菌种1 9 1 5 3 菌体的预处理及油脂提取方法1 9 1 6 本论文研究内容及意义2 2 1 6 1 本论文研究意义和目的2 2 1 6 2 本论文研究内容2 2 第二章高产油脂海洋酵母筛选2 4 2 1 实验材料与方法2 4 2 1 1 菌株2 4 2 1 2 主要试剂及主要仪器2 5 2 1 3 培养基2 6 2 1 4 培养条件2 6 2 1 5 灭菌条件2 6 2 2 实验方法2 6 2 2 1 产油脂海洋酵母菌株的初筛2 6 2 2 2 产油脂海洋酵母菌株的复筛2 7 2 3 实验结果2 8 2 4 本章小结2 9 2 5 讨论2 9 第三章产油脂海洋酵母菌菌株t j y l 5 a 的鉴定3 0 3 1 材料与方法3 0 3 1 1 菌株3 0 3 1 2 常规鉴定培养基3 0 3 1 3 常规形态特征和生理生化鉴定3 1 3 1 4 酵母菌分子生物学鉴定3 1 3 2 结果与讨论3 3 3 2 1 酵母菌t “1 5 a 常规形态特征和生理生化反应实验结果3 3 3 2 2 酵母菌t j y l 5 a 分子生物学鉴定实验结果3 6 3 3 本章小结3 7 3 4 讨论3 7 第四章海洋胶红酵母( r h o d o t o r u l am u c i l a g i n o s a ) 以葡萄糖为 碳源生产油脂条件的优化3 9 4 1 实验材料与方法3 9 4 1 1 菌种j 3 9 4 1 2 培养基4 0 4 1 3 培养条件4 0 4 1 4 油脂含量测定一4 0 4 1 5 发酵条件的优化4 0 4 2 结果与讨论4 2 4 2 1 胶红酵母菌株t j l y l 5 a 生长曲线4 2 4 2 2 不同碳源及其浓度对菌体生产量及油脂产量的影响：4 3 4 2 3 不同氮源对菌体生长量及油脂产量的影响4 4 4 2 4 不同碳氮比对菌体生长量及油脂产量的影响4 5 4 2 5 培养基初始p h 对菌体生长量及油脂产量的影响4 6 4 2 6 不同接种量对菌体生长量及油脂产量的影响4 7 4 2 7 不同转速对茵体生长量及油脂产量的影响4 8 4 2 8 补加碳源对菌体生长量及油脂产量的影响4 8 4 3 本章小结5 0 第五章海洋胶红酵母( r m u c il a g i n o s a ) 以木薯淀粉水解液为碳 源生产油脂条件的优化5 1 5 1 实验材料与方法5 2 5 1 1 菌种5 2 5 1 2 试剂5 2 5 1 3 培养基5 3 5 1 4 培养条件5 3 5 1 5 油脂含量测定5 4 5 1 6 发酵条件的优化5 4 5 1 7 还原糖含量的检测5 5 5 1 8 补加木薯淀粉水解液对油脂积累及菌体生产量的影响5 5 5 1 9 油脂脂肪酸组成及相对含量的测定5 5 5 1 1 0 利用发酵罐发酵生产油脂：5 6 5 2 实验结果与讨论5 6 5 2 1 菌株i f o0 1 1 1 的酶活曲线5 6 5 2 2 不同碳源及其浓度对细胞生长量及油脂产量的影响5 7 5 2 3 不同氮源对细胞生长量及油脂产量的影响5 8 5 2 4 木薯淀粉水解液分批补料对油脂积累及菌体生产量的影响6 0 5 2 5 油脂脂肪酸组成及相对含量的测定6 3 5 2 6 利用发酵罐发酵生产油脂6 4 5 3 本章总结6 5 论文总结与创新点及展望j 6 7 1 、论文总结6 7 2 、本论文的创新点6 8 参考文献6 9 海洋胶红酵母菌t j y l 5 a 菌株产油脂的研究 第一章文献综述 当前，人口的增长使得不断增加的油脂需求量与自然资源严重短缺的矛盾 日益尖锐，特别是随着日趋严重的全球性能源短缺与环境恶化，使得人们不得 不从环境保护与资源开发的角度出发，积极开发替代化工燃料的可再生新能 源，如生物柴油( 脂肪酸甲酯) 就是一种具有很大发展潜力的可再生清洁能源。 目前，无论是食品油脂，还是生物柴油原料油脂的主要来源仍然是植物以及动 物脂肪，但是利用动物油脂、植物油脂已经不能完全满足人们的食用和生活中 各种油脂的需求( l ie ta 1 ，2 0 0 8 ) 。微生物油脂又称为单细胞油脂( s i n g l ec e l l o i ls c o ) ，即微生物在一定条件下，利用碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂 等作为碳、氮源，在菌体内产生的大量油脂( r a t l e d g ee ta 1 ，1 9 9 1 ) 。开发微生 物油脂一方面可以缓解动植物油脂紧缺的局面，另一方面由于产油微生物可以 在农副产品及食品工业产生的废弃物中生长，实际上是废弃物的资源再利用， 不但可以降低油脂生产成本，提高产品附加值，而且有利于环境保护。所以开 辟微生物油脂这一新的油脂资源的开发和研究，不仅丰富了传统的油脂工业技 术，而且也将是工业化生产油脂的一个重要途径。微生物油脂因为其独特的特 性在工业和商业上而具有巨大的发展潜力( r a t l e d g e ，1 9 9 2 ，1 9 9 4 ；p a p a m k o l a o u e ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 1 1 微生物油脂的研究进展 微生物油脂研究历史悠久，最早可追溯到十九世纪7 0 年代中期。第一次 世界大战期间，当时德国科学家准备利用内孢霉属( e n d o m y c e sv e r n a l i s ) 和镰刀 菌属( f u a s r i u m ) 的某些菌种作为油脂生产菌，以缓解当时食用油脂的供应不足 的状况。大约在1 9 2 0 年到1 9 4 5 年之间，德国科学家筛选出了适合生产用的菌 种。二十世纪五十年代左右，美国对微生物生产油脂也进行了研究工作，但因 为经济、技术等各种原因，研究曾一度中止( 陈睿等，2 0 0 7 ) 。 尽管微生物油脂的经济价值已经被众多科学家认可，但真正的商业开发是 从1 9 8 5 年开始的，但却因为利润不高而仅仅维持了6 年( r a t l e d g e ，2 0 0 4 ) 。 海洋胶红酵母菌t j y l 5 a 菌株产油脂的研究 近年来，具有保健或医疗功能的功能性油脂日益受到人们的青睐，微生物油脂 的研究主要集中在利用微生物生产经济价值高的特殊营养油脂，即微生物功能 性油脂，用微生物生产功能性油脂已成为当前科学研究的热门课题。多不饱和 脂肪酸p u f a s 主要是指y 亚麻酸( g l a ) 、花生四烯酸( a r a ) 、二十碳五烯酸 ( e p a ) 及二十二碳六烯酸( d h a ) ( r a t l e d g e ，2 0 0 4 ) 。它们具有重要的保健功能， 如y 亚麻酸是合成前列腺素的前体物，添加y 亚麻酸到食品中可对人体起到 改善高血脂、特异反应皮炎、胶原病、糖尿病并发症及月经前紧张症的作用； 同时可以起到抑制癌细胞繁殖，缓解酒精中毒，治疗多发性硬化症，预防或抑 制中老年疾病( 如血栓塞、动脉硬化、高血压、心虚性心脏病等) 等保健作用。 研究证明微生物功能性油脂能参与婴儿的神经系统和视网膜系统的形成过程， 能够促进婴儿的智力和视力发育( c a r l s o ne ta 1 ，1 9 9 3 ；a g o s t o n ie ta 1 ，1 9 9 5 ； b o s w e l le ta 1 ，1 9 9 6 ) 。s t e w d a n s k a 筛选到产生花生四烯酸( a r a ) 的真菌，它们总 脂中a r a 的含量达到4 2 - - 5 5 ( s t r e d a n s k ae ta 1 ，1 9 9 2 ) ；1 9 9 6 年j s i n g h 等 在优化培养基上对t h r a u s t o c h yt r a u m at c c 2 8 2 10 进行培养，5d 后d h a 产量 达到1 0 6 1m g l 。研究者还发现某些海藻和硅藻也能生产出较高产量的e p a 和 d h a ( r a d a v a n e ta 1 ，1 9 9 6 ) 。s e r a p h i m 等利用菌株m o r t i e r e l l ai s a b e l l i n a 在高糖 含量的培养基上进行培养，得到菌体生物量为3 5 9g l ，油脂产量为1 8 1g l ( p a p a n i k o l a o ue ta 1 ，2 0 0 4 ) 。m o n a 等发现g o r d o n i as p 和r o p a c u s 能够在一定 条件下积累油脂最高到8 0 ( w w ) ，但是生物量只有1 8 8g l ( m o n ae ta 1 ， 2 0 0 8 ) 。 国内利用微生物生产多不饱和脂肪酸油脂是从上世纪8 0 年代末期开始 的。1 9 8 8 年张秀鲁等报道利用微生物发酵生产y 亚麻酸油脂，其y 亚麻酸占 油脂总量的8 0 ( w w ) ( 张秀鲁等，1 9 9 3 ) 。张峻等人在1 9 9 3 年选到一株被 孢霉的突变株m 6 ，其菌体得率为2 5 ( w w ) ，油脂含量为3 2 8 ( w w ) 其中y 亚麻酸含量为8 8 4 ( w w ) ( 张峻等，1 9 9 3 ) 。同年，史国利( 南开大学 生物系) 等用深黄被孢霉a s 3 4 1 0 为出发菌株，经紫外诱变得变异株，在1 0l 罐中发酵产生g l a 时，菌体得率为2 9 3 ( w w ) ，其中g l a 含量达9 4 4 ( w w ) ( 史国利等，1 9 9 2 ) 。1 9 9 5 年，罗玉萍等分离到一株高产棕榈油酸的酵 母，总脂中棕榈油酸含量高达5 0 1 4 ( w w ) ( 罗玉萍等，1 9 9 5 ) ；2 0 0 3 年施 2 海洋胶红酵母菌t j y l 5 a 菌株产油脂的研究 安辉等通过对粘红酵母g r l 5 3 1 生产油脂发酵条件的探讨发现，油脂产量可达 菌体干重的6 7 2 ( w w ) ；清华大学缪晓玲等通过异养转化细胞工程技术获 得了脂类含量高达细胞干重5 5 ( w w ) 的异养藻细胞( 缪晓玲等，2 0 0 4 ) ； 2 0 0 6 年，曲威等以斯达氏油脂酵母为出发菌株经紫外线诱变选育出了一株高产 油脂的优良酵母菌株，生物量可达2 4 2e l ；油脂量1 4 6 9 m ( 曲威等，2 0 0 6 ) ； “等采用发酵罐连续培养法，通过发酵培养粘红酵母菌株( r h o r o s p o r i d i u m t o r u l o i d e s ) y 4 ，连续培养2 5d 之后，菌体生物量达到1 0 6 5g l ，油脂含量达到 6 7 5 ( w w ) ( l ia n dz h a o ，2 0 0 7 ) 。孔祥莉等研究了斯达氏油脂酵母利用葡萄糖 木糖混合糖为碳源生长和油脂积累的特性，发酵1 2 0h 后混合糖利用率、生物 量和菌体油脂质量分数分别达9 9 5 、1 9 0g l 和5 2 6 ( 孔祥莉，2 0 0 7 ) 。李 建等以粘红酵母a s 2 1 0 7 为实验菌株，以混合糖为碳源，细胞生物量、油脂产 量和油脂含量可分别达到1 9 5g l 、11 6 l 和5 9 5 ( w w ) ；当以木质纤维 素水解液中糠醛和乙酸作为碳源发酵时，其生物量分别达到1 5 1g m 和1 3 7 l ，油脂含量分别达到3 2 5 ( w w ) 和2 9 2 ( w w ) ( 李建等，2 0 0 8 ) ；p e n g 等在2 0 0 8 年利用麦麸和秸秆混合物做培养基，通过微球藻发酵生产微生物油 脂，油脂产量可到1 0 2 ( w w ) ( p e n ge ta 1 ，2 0 0 8 ) 。2 0 0 9 年，相光明等利用 高产油脂隐球酵母菌进行发酵培养9 6h 之后，菌体生物量达到2 5 6 7 l ，油 脂含量5 5 8 ( w w ) ( 相光明等，2 0 0 9 ) 。 国外利用微生物生产油脂已经出现产业化、规模化生产的趋势，从1 9 8 6 年起，英、日等国已相继投人工业化生产，英国j o h n & s t u r g e 公司发酵法生产 丫亚麻酸的年产量为1 0 0t 以上。我国在这方面起步较晚，如武汉烯王生物工 程有限公司曾于2 0 0 0 年引进中国科学院等离子体物理研究所的花生四烯酸高 产菌发酵技术，在5 0t 罐生产时，总脂的花生四烯酸含量在5 0 ( w w ) 以上， 干菌体得率超过3 ，总油脂超过3 0 ( w w ) 。 微生物油脂的除了可以用于功能性特殊油脂之外，还有一个重要的研究 领域，即生产生物柴油。石油能源是现代社会赖以生存和发展的物质基础。随 着地球石油储量的不断减少，特别是2 0 世纪7 0 年代出现的石油危机，使人类 认识到，解决石油能源问题的对策除有效利用石油资源外，开发新的并对环境 海洋胶红酵母菌t j y l 5 a 菌株产油脂的研究 无害的非石油类能源及可再生能源是重要的途径。1 9 8 3 年，q u i c k 首先将亚麻 籽油的甲酯用于发动机，并将可再生的油脂原料经过酯交换反应所得到的脂肪 酸单酯定义为生物柴油( b i o d i e s e l ) ( 图1 1 ) ( 曲威等，2 0 0 6 ) 。生物柴油是最重 要的液体可再生能源产品之一，其化学成分主要为长链脂肪酸甲( 或乙) 酯。生 物柴油具有润滑性能好、储运安全、抗爆性好、燃烧充分等优良性能，还具有 能量密度高、可再生、易生物降解、含硫量低等特点，可以作为优质的石化柴 油代用品。目前，生物柴油生产主要用动植物油脂作原料，但由于动植物油脂 资源非常有限，限制了生物柴油产业的发展，并且这种方法没有利用获取植物 油脂时伴生的废弃生物质资源。经过科研人员的长期的探索和研究，发现通过 微生物发酵在微生物体内合成的方法制取微生物油脂，是一条开发新油源的好 途径( l ie ta 1 ，2 0 0 8 ) 。 图1 1 醇解生产生物柴油的化学反应过程 车h ：一o o c r i l c h - _ 。o o c r i c h 2 。一o o c r 3 g l y c e r i d e c a l al v s t r ，一c o o r + 3 r o h = ；= = = 鲁= r 一, - c o o r + r 3 - ( 7 0 0 r e s t e t s c h ，o h i c h o h i c h ，一o h g l y c e r o i 近十年来，国际上利用微生物油脂生产生物柴油的产业发展更得关注。欧 洲在这方面成为世界领先者。欧洲的生物柴油生产总量从2 0 0 5 年的3 2 0 万吨 增长到2 0 0 6 年的4 9 0 万吨。这表明欧洲生物柴油生产以5 4 的年增长率增长， 2 0 0 5 年的增长率是6 5 。所以，欧洲生物柴油生产是前两年的两倍，从2 0 0 4 年的1 9 0 万吨增长到2 0 0 6 年的4 9 0 万吨，形成了欧洲的生物柴油生产加速度 累加趋势( l ie ta 1 ，2 0 0 8 ) 。 美国近十年的发展照样引人注目。生物柴油生产量从2 0 0 0 年的2 0 0 万加 仑到2 0 0 6 年的2 5 0 0 0 万加仑，到2 0 0 7 年已经达到4 5 0 0 0 万加仑。仅仅比欧洲 少2 5 0 万加仑，这显示了其显著增长。2 0 0 4 2 0 0 6 年，以每年1 1 3 0 0 万加仑的 增长量增长。据政府部门统计，在2 0 0 7 年初，共有1 0 5 个生产厂家，生产总 量达到8 4 6 0 0 万加仑。如果生产设备准备齐全，另外还有1 7 0 万加仑的生物柴 油将投入生产( c a r r i q u i r y ，2 0 0 7 ) 。 4 海洋胶红酵母菌t j y l 5 a 菌株产油脂的研究 生物柴油的迅速发展在发展中国家例如中国、巴西、阿根廷、印尼、马来 西亚等国家也发展迅速。国际生物柴油市场预计在2 0 1 6 年将达到3 7 0 亿加仑， 平均每年增长4 2 ( s i m s ，2 0 0 7 ) 。 科学的进步带动现代生物技术的发展，使产油微生物的研究技术在不断趋 向成熟，应用于油脂工业已成为现实。当前和今后其研究方向主要为： ( 1 ) 利用现代生物技术和基因工程，继续对高产油脂菌种改良。 ( 2 ) 通过各种方法降低产油微生物培养成本，如利用廉价碳源等，促进微生物油 脂产业化。 ( 3 ) 利用现代科学技术对微生物发酵产油脂工艺进行优化。 ( 4 ) 微生物油脂替代植物油脂生产生物柴油，降低生物柴油制取成本( 何东平等， 2 0 0 5 ) 。 1 2 微生物油脂及油脂微生物 1 2 1 微生物油脂的概念及组成 微生物油脂( m i c r o b i a lo i l ) 又叫单细胞油脂( s c o ，s i n g l ec e l lo i l ) ，是酵母、 霉菌和藻类等产油微生物在一定条件将碳水化合物转化并储存在菌体内的油 脂，主要是由不饱和脂肪酸( p u f a s ) 组成的甘油三酯( t a g ) ，在脂肪酸组成上与 植物油如菜籽油、棕榈油、大豆油等相似( m i a oa n dw u2 0 0 6 ) ，是以c 1 6 和 c 1 8 为主的脂肪酸( 蒲海燕等，2 0 0 3 ) 。有的干菌体含油量高达7 0 以上 ( r a t l e d g e ，2 0 0 4 ) 。 多不饱和脂肪酸( p u f a s ：p o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d s ) 含有两个或两个以上 双键且碳原子数为1 6 至2 2 的直链脂肪酸，主要包括y 亚麻酸( g l a ：g a m m a l i n o l e n i ca c i d ) 、双高度y 亚麻酸( d g l a ) 、花生四烯酸( a r a ) 、二十碳五烯酸 ( e p a ) 和二十二碳六烯酸( d h a ) ( 何东平等，2 0 0 5 ) 。d h a 和a r a 在婴儿的脑部 海绵体发育中起着重要作用，在母乳中有，而牛奶中没有，这两种物质对婴儿 的视觉和神经发育有关系( c o h e ne ta 1 ，2 0 0 5 ) 。研究证明，鱼油中含有较多 海洋胶红酵母菌t j y l 5 a 菌株产油脂的研究 d h a ，但同时也发现了鱼油中含有e p a ，而后者影响d h a 的吸收( r a t l e d g e ， 2 0 0 4 ) 。 油脂是微生物生命活动的代谢产物之一，微生物油脂也和动植物油脂一样 以两种形式存在，一种是体质脂形式，即作为细胞的结构组成部分而存在于细 胞质中，在微生物中含量非常恒定，如微生物细胞膜上的磷脂；另一种形式是 贮存脂形式，油脂在微生物细胞内以脂滴或脂肪粒形式贮存于细胞质中。微生 物油脂中甘油三酯约占9 5 ，其他脂质( 如糖脂、甘油一酯、甘油二酯) 约占1 0 。 少数不常见脂质，如硫脂、肤脂、羚基脂、蜡脂、甘油硫酸脂等，在细菌( 包括 古菌) 中也有发现。酵母和霉菌还可生产各种类胡萝卜素、酯肽基鞘氨醇类神经 鞘脂及糖脂。微生物油脂的成分组成大致类似植物油，主要为中性脂肪酸、游 离脂肪酸、磷脂及不皂化物( r a t l e d g e e ta 1 ，1 9 9 3 ) 。 微生物发酵产油脂的优点： ( 1 ) 微生物适应性强，生长繁殖迅速，生长周期短，代谢活力强，易于培养和进 行品种改良( l ia n dd u ，2 0 0 8 ) 。 ( 2 ) 微生物生产油脂所需劳动力低，占地面小，且不受场地、气候和季节变化等 的限制，能连续大规模生产( l ia n dd u , 2 0 0 8 ) 。 ( 3 ) 微生物生长所需原材料的来源十分丰富而且价格便宜，可利用农副产品、食 品加工以及造纸业的废弃物( 如乳清、糖蜜、木材糖化液等) 为培养基原料，十 分有利于废物再利用和环境保护。 ( 4 ) 微生物有氧化、脱饱和、氢化等新陈代谢能力，能改进p u f a s 的结构，且 能形成油脂及其他产品如蛋白质、维生素、抗氧化剂、微量元素等。 ( 5 ) 可以用来开发功能性油脂。与大豆油、棕榈油、葵花籽油等商品油相比，微 生物油脂营养价值更高；它含有植物、动物不能合成或少量合成的脂肪酸，如 y 亚麻酸( g l a ) 、亚油酸、花生四烯酸( a r a ) 、二十碳五烯酸( e p a ) 和二 十二碳六烯酸( d h a ) 等。 ( 6 ) 微生物油脂中的p u f a 可以作为功能性食品，而大量的其他脂肪酸可以研制 成微生物柴油，作为新的生物质能源。 ( 7 ) 禾l j 用产油微生物的突变株，可以获得微生物的独特油脂或新的脂肪酸。 6 海洋胶红酵母菌t j y l 5 a 菌株产油脂的研究 1 2 2 产油微生物的种类 1 9 8 9 年，r a t l d e g e 提出：某些微生物在一定条件下能将碳水化合物、碳氢 化合物和普通油脂等碳源转化为菌体内大量贮存的油脂，如果油脂积累量能超 过细胞总量的2 0 ，即称为产油微生物( o l e a g i n o u sm i c r o o r g a n i s m s ) ( r a t l e d g ee t a 1 ，1 9 9 1 ) 。目前，细菌、酵母、霉菌、藻类中都有产油菌株，尤以酵母菌和霉 菌类真菌居多( m ae ta 1 ，2 0 0 6 ) 。 1 2 2 1 产油酵母菌 常见产油酵母菌有：浅白色隐球酵母( c r y p t o c o c c u sa l b i d u s ) 、斯达氏油脂 酵母( l i p o m y c e ss t a r k e y i ) 、产油油脂酵母( 1 i p o m y c e sl i p o f e r ) 、粘红酵母 ( r h o d o t o r u l ag l u t i n i s ) 、红冬孢酵母( r h o d o s p o r i d u mw r u l o i d e s ) 、丛生丝孢酵母 ( t r i c h o s p o r o n p u l l u l a n ) 、解脂耶罗威亚酵母( y a r r o w i al i p o l y t i c a ) 等( l i ue ta 1 ， 2 0 0 0 ；l i a n ge ta 1 ，2 0 0 6 ) 。不同种类酵母油脂积累量不同，脂肪酸组成上也存 在较大差异( m a ，2 0 0 6 ；l i ue ta 1 ，2 0 0 7 ；l ie ta 1 ，2 0 0 7 b ) 。酵母中油脂主要为棕榈 油、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸。据报道，这种酵母油脂可以在脂肪酶和 化学试剂的催化下，作为生物柴油的原料合成生物柴油( l ie ta 1 ，2 0 0 7 b ；l i ua n d z , h a o ，2 0 0 7 ) 。绝大多数酵母仅有c 1 6 和c l s 脂肪酸，其中主要的饱和脂肪酸是软 脂酸，主要的不饱和脂肪酸是油酸，少数酵母中最多的单不饱和脂肪酸是棕榈 油酸，多不饱和脂肪酸在酵母中也存在，油酸含量一般较丰富，但亚油酸含量 很少。大多数酵母中总的油脂含量一般低于2 0 ，但是微生物中油脂的含量与 它们的生长条件有很大关系，即使是很好的产油微生物在生长条件不佳时，积 累的油脂量也很少。这是高产油脂酵母的普遍特征。产油酵母能在各种碳源上 生长良好，如葡萄糖、蔗糖、糖蜜、乳糖等。酵母转化碳水化合物为油脂的理 论转化率为3 3 ，但实际转化率很少超过2 0 ( 薛飞燕等，2 0 0 5 ) 。 1 2 2 2 产油霉菌 霉菌因其油脂含量高，并含有丰富的亚麻酸、花生四烯酸等功能性多不饱 和脂肪酸，而被较深入研究。油脂含量超过2 5 的霉菌约有6 4 种，很多霉菌油 脂含量在2 0 2 5 之间。霉菌主要用于生产高比例的不饱和脂肪酸，但大部分 产油霉菌只生产特定的油脂例女n d h a 、g l a 、e p a 和a r a 等( d u e