（生物化学与分子生物学专业论文）肥胖抵抗与肥胖大鼠代谢差异研究.pdf

1 实验材料 2 实验方法 2 1肥胖抵抗与肥胖大鼠模型的建立 1 0 2 2 血样与各器官组织的采集一1 0 2 3 大鼠血液生化指标检测一 2 4肝脏组织总r n a 的提取与i 沁a t i m ep c r1 l 2 5 大鼠血浆胰岛素水平的检测一一一一1 3 2 6 组织切片制备与h e 染色 2 7w e s t e mb l o t 2 8 统计分析 14 15 2 0 实验结果 一2 l 1 肥胖抵抗与肥胖大鼠模型建立情况一2 l 2 各组大鼠肝脏湿重、睾丸及肾周脂肪含量检测2 l 3 各组大鼠肝脏组织的病理学分析2 2 4 各组大鼠血清生化指标检测与分析一2 3 5 大鼠肝脏脂代谢相关基因的表达情况一2 6 6 各组大鼠血清胰岛素水平比较一2 6 7 各组大鼠胰腺组织凋亡相关蛋白的表达与分析3 0 讨论 一3 l j 、结 一3 4 参考文献 缩略词表 综述 致谢 4 0 北京协和医学院硕i ：学位论文 中文摘要 肥胖是一种多因素与多基因疾病，机体内伴发着非常复杂的变化过程。肥胖同 样是多种代谢相关疾病的前期最重要的风险因素之一。 为了便于研究，采用人工饲喂高脂饲料制作肥胖动物模型一直是进行肥胖研究 的有利工具，饲喂相同高脂饲料可以得到饮食诱导的肥胖( d i e t i n d u c e do b e s i t v ， d i o ) 动物、饮食诱导的肥胖抵抗( d i e t i n d u c e do b e s i t yr e s i s t a n c e ，d i o r ) 动物以 及中间体重动物，以肥胖建模模型进行对照研究来揭示肥胖发生复杂机制的相关研 究很少，本论文中，我们对肥胖抵抗大鼠与肥胖大鼠之间的代谢差异进行了研究。 我们构建了肥胖抵抗和肥胖大鼠模型，通过检测各组血液生化项目、r e a l t i m e p c r 、e l i s a 、病理切片h e 染色及w e s t e m 方法对大鼠脂代谢调控与胰腺功能进行了 研究。 研究结果显示：饲养2 5 周时，d i o r 大鼠肝脏艘e 卯j c ，彳c c 、尉s 的m r n a 表 达显著低于d i o 大鼠组( p o 0 1 ) ；d i o r 大鼠的血清胰岛素水平显著低于d i o 大鼠 ( p o 0 5 ) ；肥胖抵抗大鼠与肥胖大鼠都有肝脏脂肪变性与胰腺组织受损；d i o 及 d i o r 大鼠胰腺组织凋亡诱导蛋白b i k 、b a ) 【、c l e a v e dc a s p a s e3 及凋亡抑制蛋白b c l 2 表达均显著高于对照组。 上述结果表明，艘e 卯j c 的表达降低是导致高脂饲养肥胖大鼠发生肥胖抵抗的 直接原因，d i o 大鼠的肝脏脂肪化较d i o r 显著，两组大鼠的胰腺组织明显凋亡。 本研究从另一个角度揭示肥胖与肥胖抵抗的发生机制，为进一步的临床药物研究制 造了较好的动物模型。 关键词：大鼠；肥胖抵抗；脂代谢；调控基因；凋亡蛋白 2 ( d i o ) a n da l l i m a l sw i t hb o d yw e i 出锄o n gd i o 锄dd i o - rw i t hs 锄eh i g hf a td i e t r e s e a r c ho nt h ec o m p l i c a t e dm e c h a n i s m so fo b e s i t y t h r o u g hc o m p a r a t i v em o d e lo f o b e s i t yi sq u i t el i m i t e d s oi no u rs t u d y t h ed i f f e r e n c e so fm e t a b o l i s mo nd i o rr a t sa n d d i or a t sw e r ea n a l y z e d a r e rs u c c e s s f u l l ye s t a b l i s h e dd l oa n dd i o ra i l i m a lm o d e l s ，w em a d eas t u d yo n l i p i dm e t a b o l i s ma n dp 锄c r e a t i cf u n c t i o nt h r o u g hm e t h o d so fr e a l t i m ep c r ，e l i s a ， w e s t e mb l o t ，p a t h o l o g i c a lh e s t a i n i n ga n dd e t e c t i n gt h er e l a t e db i o c h e m i c a l i n d e x e s r e s u l t ss h o w e dt h em r n ae x p r e s s i o no f 歙凹p j c ，彳c c ，尉si nd i o - rr a t sw e r e s i g n i f i c a n t l yl o w e r t h a no b e s i t yr a t sg r o u p ( p 0 o1 ) a r e r2 5w e e k sf e e d i n g c o m p a r e dt o d i or a t s ，t h es e m mi n s u l i nl e v e lo fd i o - rr a t sw e r el o w e r ( p 0 0 5 ) t t l e r ew e r e 胁y d e g e n e r a t i o n a i l d p a i l c r e a t i c t i s s u ed 锄a g ei nb o t hd i o rr a t sa n dd i or a t s a p o p t o s i s - r e l a t e dp r o t e i n so np a n c r e a sh a v eb e e ne x p r e s s e di nd 1 0 一rr a t sa n dd i or a t s ， i n c l u d i n gb i k ，b a x ，c l e a v e dc a s p a s e 3a n db c l 一2a sa ni n h i b i t o ro f 印o p t o s i sp r o t e i n a l l t h e s ep r o t e i ne x p r e s s i o n s 、v e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h en o n l l a lg r o u p t h e s er e s u l t s s u g g e s tt h a tl o w e re x p r e s s i o no fs i 也b p lcl e a dt ot h eo b e s i t ) ， r e s i s t a n c ed i r e c t l y 、h i c hi sa l s oa st h er e s e a o no nd i 虢r e n c e so fl i p i dm e t a b o l i s ma i l d 印o p t o s i si np a n c r e a s o u rs t u d yr e v e a l st h em e a c h i n s mo fo b e s 时a 1 1 do b e s i t y r e s i s t a j l c e o c c u i 彻c ef r o ma n o t h e ra s p e c tw h i c hm a yp r o v i d eag o o da n i m a lm o d e lf o rc l i n i c p h 跗n a c y - k e yw o r d s ：m t ；o b e s i t yr e s i s t a n t ；l i p i dm e t a b o l i s m ；r e g u l a t o r yg e n e s ；a p o p t o s i sp r o t e i n 3 北京协和医学院硕i j 学位论文 1 上j 一 日盯吾 随着社会经济的发展，肥胖( o b e s i t ) ，) 的发生率逐步提高，成为不容忽视的疾 病，其与高血压、糖尿病、冠心病、代谢综合征等一系列慢性疾病都有着密切的联 系，被列为世界上第六位影响人类健康的危险因素。全世界超过1 0 亿的成人和1 0 的儿童属于超重和肥胖，每年死于肥胖相关疾病的人数达到三十万【i - 2 】。肥胖症的病 因较复杂，可分为无明显原因的单纯性肥胖和继发于营养失调、内分泌、丘脑垂体 肿瘤等疾病的继发性肥胖两类1 3 j 。单纯性肥胖可伴有内分泌系统改变，主要是碳水 化合物及动物性脂肪摄取量超过消耗量，多余的能量转化为脂肪储存在各组织及皮 下；继发性肥胖则伴随某些疾病而发生，如胰岛性肥胖、甲状腺机能低下性肥胖等。 随着人类生活水平的不断提高，单纯性肥胖症的患病率逐年升高。 肥胖患者常伴有血脂异常、脂肪肝、胰岛素抵抗等。研究证实肥胖是一种多因 素与多基因疾病，属于遗传因素和环境因素相互作用的结果，此外内分泌、代谢、 中枢神经系统等因素也参与了肥胖的发病过程。多个前瞻性流行病学研究发现体重 与死亡的危险性的关系呈“u 字型曲线，体重过高会增加死亡的风险率【4 】。 迄今为止，已经发现了超过1 0 0 种可能在决定人的体重中发挥作用的基因，这 些基因通过中枢神经系统或在中枢神经系统内部发挥作用1 5 制，参与能量的摄取、体 内的代谢利用、脂肪合成和储能等一系列复杂的综合调控过程。因此利用各种因素 诱导出理想的肥胖动物模型非常必要。肥胖动物模型是研究肥胖发病机制与治疗方 法的主要工具，目前常用的模型按病因可分为遗传性肥胖模型、营养性肥胖模型、 缺少活动性肥胖模型、内分泌性肥胖模型、下丘脑性肥胖模型等【_ 7 1 。高脂肪饮食是 导致人类和啮齿类动物肥胖发生的主要环境因素，为了便于研究，采用人工饲喂高 脂饲料制作肥胖动物模型一直是进行肥胖研究的有利工具【8 驯，而在实际诱导肥胖的 过程中，饲喂相同高脂饲料的动物会出现明显肥胖、轻度肥胖和不肥胖三种不同结 果【1 0 d 。上世纪8 0 年代l e v i n 等【1 2 j 发现用高脂饲料喂养同一品系的同批大鼠，有 一部分会发生肥胖，而有些大鼠不发生肥胖。因此把用饲喂高脂饲料得到的肥胖大 鼠称为饮食诱导的肥胖( d i e t i n d u c e do b e s i t y ，d i o ) 大鼠，同样饲喂条件下不肥胖的 大鼠称为饮食诱导的肥胖抵抗( d i e t i n d u c e do b e s i t yr e s i s t a n c e ，d i o r ) 大鼠。关于这 两类大鼠对于肥胖发生的易感性差异，诱导机制一直未明确。 肥胖与肥胖抵抗的发生与能量代谢、摄食行为存在密切关系。能量的利用率受 遗传、体内代谢状态等多种因素影响，有研究报导遗传因素能够影响4 0 的能量消 耗差异3 。，即使通过限制饮食使摄食量相同，具有肥胖基因的大鼠仍易发生肥胖【l4 1 。 高脂诱导肥胖和肥胖抵抗的形成是一个涉及全身多系统的代谢过程，可能是由 中枢神经系统和周围系统共同作用的结果。而食欲调节激素调控的差异直接会影响 大鼠热能摄入量和能量利用率差异。目自订研究表明瘦素( l e p t i n ，l p ) 可能参与这 4 北京协和医学院硕i ：学位论文 一过程的调控。l p 是脂肪细胞分泌的一种肽类激素，在血液中的浓度与体脂量呈 正相关。l p 与下丘脑的l p 受体结合从而影响神经内分泌激素的分泌，引起食欲降 低、促进能量消耗；激活脂肪细胞膜上的肾上腺能受体，增加热能的形成，从而降 低体脂。当通过饲喂高脂饲料诱导肥胖形成时，通过d i o 大鼠血脑屏障的l p 明显 比d 1 0 r 大鼠低，而诱导前并无这一差异。同时d i o 大鼠位于下丘脑的l p 受体的 m r n a 表达比d i o r 低【。5 】。d i o 大鼠血清中l p 明显高于d i o r 组，其敏感性降 低，发生l p 抵抗，无法正常调：符神经内分泌激素的分泌，影响摄食的调节从而有 助于肥胖的形成 j 。 长期高脂饲料的摄入会导致体内脂质水平升高，脂质降解产生大量的游离脂肪 酸，使肝脏对葡萄糖的利用减少且对胰岛素敏感性和摄取能力下降，导致机体代偿 性地对胰岛素的分泌产生胰岛素抵抗，因此d 1 0 大鼠胰岛素会高于d 1 0 r 大鼠【1 8 】。 由于肥胖发生主要表现在过多的脂肪沉积于皮下和内脏组织中，并伴随着能量 代谢调节的失衡，因此与脂肪代谢密切相关的分子机制研究成为目前肥胖研究领域 的重要方向。长期高脂及高热量饮食的摄入会对机体的正常脂代谢产生影响，造成 脂肪的分解、合成及储存的紊乱，导致体内脂肪异常蓄积。肝脏作为脂代谢的主要 器官，对脂肪的分解、合成和储存意义重大，因此肝脏中脂代谢相关基因的表达与 营养性肥胖之间的关系是目前的研究热点。目前，针对代谢及转录调节相关基因与 肥胖之间的关系进行的研究丌展得很多。代谢相关基因包括乙酰辅酶a 羧化酶 ( a c e t y l c o ac a r b o x y l a s e ，a c c ) 、脂肪酸合酶( f a 蚵a c i ds y n t h e t a s e ，f a s ) 、肉毒 碱棕榈酰转移酶( c a m i t i n ep a l m i t o y l t r a n s f e r a s ei ，c p ti ) 、激素敏感酯酶 ( h o m o n e s e n s i t i v el i p a s e ，h s l ) 、硬脂酰辅酶a 去饱和酶l ( s t e a r o y l c o a d e s a t u r a s e 1 ，s c d l ) 、二酰基甘油酰基转移酶l ( d i a c y l g l y c e r o la c y l t r a l l s f e r a s e ，d g a t l ) 等， 这些酶是脂肪合成或分解过程中的限速酶，对脂代谢起到了决定性的作用。转录调 节相关基因主要是一些能够调节上述酶表达的转录因子，这些转录因子通过影响其 各自的靶基因谱参与脂代谢的调节，如：固醇调节元件结合蛋白1 c ( s t e r o lr e g u l a t o r y e l e m e n tb i n d i n gp r o t e i n 1 c ，s r e b p 1 c ) 、糖反应元件结合蛋白( c a r b o h y d r a t er e s p o n s e e l e m e n tb i n d i n gp r o t e i n ，c h r e b p ) 、肝x 受体0 【( 1 i v e rx r e c e p t o r0 【，l x r a ) 等。 碳水化合物反应元件结合蛋白( c a r b o h y d r a t er e s p o n s ee l e m e n tb i n d i n gp r o t e i n ， c h r e b p ) 是新发现的能与糖类应答元件( c a r b o h y d r a t er e s p o n s ee l e m e n t ，c h r e ) 结合的蛋白质，其组织分布、结构特性及r n a 的结合活性与葡萄糖敏感转录因子的 特征一致，能调节葡萄糖的敏感性，从而调节机体内脂肪的代谢。高糖饮食能够促 进肝组织中的c h r e b p 表达1 1 9 j 。 固醇调节元件结合蛋白( s t e r o lr e g u l a t o 巧e l e m e n tb i n d i n gp r o t e i n s ，s r e b p s ) 是 一种参与胆固醇和脂肪酸代谢调控的核转录因子，能与脂质合酶基因的启动子或增 强子的固醇调节元件结合，激活靶基因转录，特异性调控胆固醇和脂肪酸代谢。目 北京协和医学院硕f ：学位论文 前对s i 迮b p 进行调控的主要冈素是肝脏x 受体( l i v e fxr e c e p t o ra ，l x ra ) 、胰岛 素和葡萄糖。l x ra 与维甲酸x 受体( r e t i n o i dxr e c e p t o r s ，r x r s ) 形成异二聚体， 与s l 迮b p 基因启动子的r x 刚l x rd n a 结合位点结合，介导s r e b p 的转录。当给予 高脂饮食或者l x ra 激动剂，激活l x ra 后能够介导s r e b p 的转录，从而产生脂 肪酸与胆固醇结合形成胆固醇酯，降低血中游离的胆固醇浓度【2 0 1 。 在肝脏组织中，肝脏合成脂肪酸的限速酶乙酰辅酶a 羧化酶( a c e t y lc o a c a r b o x y l a s e ，a c c ) 的m r n a 在d i o 大鼠中表达比d i o r 大鼠副1 6 l ；d i o r 大鼠白色 脂肪组织中甘油三酯水解过程中的限速酶激素敏感脂肪酶( h o n n o n e s e n s i t i v e l i p a s e ，h s l ) m i a 含量高于d i o 大鼠，h s l 有助于加快脂肪分解速度，减少脂肪 推挤，有利于肥胖抵抗的形成i i7 。 但是这些都是基于单一的脂肪代谢有关的蛋白酶类研究，无法从整个脂质代谢 途径进行整体的观察，因此为了探讨饮食诱导的肥胖抵抗大鼠体脂减少的原因，我 们通过肥胖抵抗与肥胖大鼠模型的建立，选择从脂代谢调控这一途径，利用r e a lt i m e r t p c r 技术对相关的重要基因的表达进行验证，寻找差异，同时结合全面的血液 生化指标，血清胰岛素水平的检测和大鼠肝脏和胰腺组织的病理改变、凋亡情况比 较d i o 大鼠与d 1 0 r 大鼠的异同，从而探讨有关大鼠肥胖易感性差异的相关机制， 为防治肥胖提供有用的实验依据。 本论文在成功建立肥胖抵抗大鼠与肥胖大鼠模型的基础上对其各自的血液生 化指标进行检测和分析，对大鼠肝脏脂代谢相关基因的表达情况进行了相对全面的 检测，并通过对血清胰岛素的比较和肝脏、胰腺组织的病理学分析来研究两组大鼠 存在的肥胖易感性差异的有关机制。 6 医学科学院基础医学研究所实验动物中心。 1 2 喂养饲料 高脂饲料 4 5 0k c a l 儋 蛋白质 1 6 9 脂肪1 6 5 碳水化合物 5 8 5 普通饲料 3 3 4k c a l 儋 蛋白质 1 9 2 脂肪3 1 碳水化合物 5 4 3 均购自北京科澳协力饲料有限公司。 ，购自北 养于中国 1 3 主要实验器械及耗材 手术剪刀、手术刀、大镊子、止血钳、眼科剪、眼科镊、铡刀、保温桶、e p p e n d o r f 管、促凝管、封口膜及液氮等。 1 4 代a 1 t i m ep c r 使用引物序列 g e n en a m ef o 刑a r dp r i m e rr e v e r s e dp r i m e r 7 例r 5 - c a g a c c a g c g t g g g c g 一3 5 - g a a c a a a g a 班c t t g c a g a c g a t g - 3 均由上海生物工程公司合成。 1 5 工具酶及分子标准 名称生产商原产国 d n a 聚合酶 核酸分子量标准 蛋白分子量标准 1 6 试剂盒 名称 1 a k a r ab i o t e c h n e we n g l a n db i o l a b s n e we n g l a n db i o l a b s 大连宝生物 u s a u s a 生产商原产国用途 t r i z o l 反转录试剂盒 q p c rs u p e n i l i x 胰岛素检测e l i s a 试剂盒 d e p c 1 7 抗体 名称 i n v i t r o g e n u s a p r o m e g a u s a 全式金 c h i n a m i l l i p o r e u s a 上海生工c h i n a 生产商 i 斟a 提取 反转录p c r r e a l t i m ep c r 胰岛素检测 抑制i 州a 酶 原产国 一抗： c a s p a s e 一3a n t i b o d y b c l 一2a n t i b o d y b i ka n t i b o d y b a ) ( a n t i b o d y c e l ls i g i l a l i n g c e h s i g n a l i n g c e l ls i g n a l i n g c e l ls i g n a l i n g 8 u s a u s a u s a u s a 北京协和医学院硕i ：学位论文 x i a p a n t i b o d y b a c t i na n t i b o d y c e uf r a c t i o n a t i o nk i t 二抗： g o a ta n t i - r a b b i ti g g h r p 1 8w e s t e mb l o t t i n g 相关产品 名称 c e l ls i g n a l i n g u s a s a n t ac m z b i o t e c l u l o l o g y u s a c l o n t e c h j 印a n s a n t ac m zb i o t e c i u l o l o g yu s a 生产商原产国 p r o t e a s ei n h i b i t o rc o c k t a i lt h b l e t sr o c h e p h o s p h a t a s ei n h i b i t o rc o c k t a i l1 a b l e t s r d c h e e c lw e s t e mb l o t t i n gs u b s t r a t ep i e r c e 1 9 数据库网站和分析软件 美国国立生物技术信息中心： 荷兰医学文摘： 主要分析软件： s w i t z e r l a n d s w i t z e r l a n d u s a 1 1 0 主要仪器及设备 台式高速冷冻离心机( e p p e n d o r f ，g e 肌a n y ) ；超高速冷冻离心机( k e n d r o ， g e 衄a n y ) ：干燥箱( 上海一恒科技有限公司，中国) ；p c r 仪( a p p l i e db i o s y s t e m s ， u s a ) ；水平电泳仪北京市六一仪器厂，中国) ；垂直板电泳仪及转移芯( 北京市六 一仪器厂，中国) ；水平摇床( 北京市六一仪器厂，中国) ；紫外观测仪及照相系统 ( s i m ，u s a ) ；电热恒温水槽( 上海一恒科技有限公司，中国) ；超纯水系统 ( m i l l i p o r e ，u s a ) ；8 0 低温冰箱( n e wb m n s w i c ks c i e n t i f i c ，f r a n c e ) ；定时恒温 磁力搅拌器( 上海理达仪器厂，中国) ；p h 计( m e t t l e r l d l e d o ，s w i t z e r l a j l d ) ； 电子天平( m e t t l e r t o l e d o ，s w i t z e r l a l l d ) ；漩涡振荡器( 其林贝尔仪器，中国) ； 超净工作台( 北京市东联哈尔仪器制造有限公司，中国) ；液氮存放罐( 乐山市东 亚机电工贸有限公司，中国) ；全自动生化分析仪a u 5 4 0 0 i i ( o l y m p u s ，日本) 。 9 茉逝世嫩薹毯 北京协和医学院颀 ：学位论文 2 实验方法 2 1 肥胖抵抗与肥胖大鼠模型的建立 本实验选用雄性s d 大鼠建立实验动物模型。1 1 0 只4 周龄雄性s d 大鼠，s p f 饲养环境下随机选取9 0 只大鼠采用高脂饲料饲喂2 5 周，根据体重筛选得到饮食诱 导的肥胖抵抗( d i e t i n d u c e do b e s i t yr e s i s t a n c e ，d i o r ) 大鼠与饮食诱导的肥胖 ( d i e t i n d u c e do b e s i t y ，d 1 0 ) 大鼠，另2 0 只大鼠采用基础饲料饲喂2 5 周得到正常对 照组大鼠。 动物自由饮水、摄食，每周称重及测量身长1 次，饲喂2 5 周后，与正常对照 组大鼠相比，高脂饲料组大鼠可以根据体重分为d i o 大鼠、d i o r 大鼠与中间体重 大鼠：体重高于对照组大鼠最高体重的选取为d i o 大鼠( n - 4 2 ) 、体重低于对照组大 鼠体重平均值的选取为d i o r 大鼠( n = 2 3 ) 、体重介于两者之间的为中间体重大鼠 m = 2 5 ) 弃去。 2 2 血样与各器官组织的采集 2 2 1 取材动物 雄性d 1 0 r 大鼠、d i o 大鼠、正常对照组大鼠。 2 2 2 取材标本 血液、脾脏、胰腺、肾脏、脂肪、肌肉、肝脏和脑。 2 2 3 取材步骤 a 大鼠经吸入乙醚麻醉后，眶下取血约2m l 入促凝管中。 b 脱颈处死大鼠。 c 将大鼠腹部朝上固定于蜡盘，用7 5 酒精消毒皮肤，待解剖。 d 以手术剪剪丌大鼠腹部皮肤，暴露腹腔。 e 用眼科剪及眼科镊小心分离大鼠腹腔内脏器。 取大鼠胰腺、脾脏、肾脏、脂肪( 肾周及睾丸附近) 、肌肉、肝脏和脑组织。 g 大鼠各组织标本经处理后，分类存放。 2 2 4 标本处理及保存 a 血液样本：待血液凝固后，离心分离血清，分装，于8 0 冰箱保存。 b 病理样本：取大鼠新鲜组织于组织固定液中固定，包埋于蜡块中保存。 c 组织样本：取大鼠新鲜组织分装后，迅速于液氮中冷冻，并于8 0 冰箱保 存备用。 l o 北京协和医学院硕i j 学位论文 2 3 大鼠血液生化指标检测 将- 8 0 冰箱保存的各组血清样本取出，于室温中冻融，在离心机上2 0 0 0 叩州m i n 短暂离心3 0 s ，去除溶血的样本，然后迅速在全自动生化分析仪a u 5 4 0 0i i 中上机检 测，所有的检测项目在检测前均进行了严格的室问质控。 2 4 肝脏组织总i 矾a 的提取与r e a l t i m ep c r 2 4 1 准备工作 尽可能使用无菌、一次性塑料制品。标明r n a s e f r e e 的塑料制品，如没有开 封则不用做处理，可直接使用；对于国产塑料制品，则必须经过特殊处理j 能使用。 1 ) 在玻璃烧杯中注入去离子水，加入d e p c 使d e p c 的终浓度为0 1 ，搅拌 均匀，使d e p c 完全溶于水中。 2 ) 将要处理的塑料制品( 包括t i p 头，离心管等) 浸泡到溶液中，注意要确保 t i p 头或是离心管内壁也充分接触到d e p c 溶液。 3 1 在通风柜中室温处理过夜。 4 ) 将d e p c 水溶液小心倒到废液瓶中，用锡箔纸封住装有已用d e p c 水处理 过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少3 0 分钟。 5 ) 烘箱用合适的温度烘拷至干燥。置于干净处备用。 6 ) 璃玻和金属物品也要确保干净，一般将其洗净后在烤箱中2 5 0 烘烤3 小 时以上。 2 4 2 组织i a 提取步骤 由于肝脏组织各种酶十分丰富，所以i 矾a 提取要切实注意快速，冰上操作， 防r n a 酶污染原则。 1 ) 将肝脏组织取出，切下约1 0 2 0 m g 放入4 m l 试管中( 注意保持冰冻状态) ， 加入啊z o l 约1 1 5 m l 后匀浆。 2 ) 将试管放在冰浴的烧杯中，进行间断性匀浆( 2 0 s 5 次，每次间断5 s ) ，匀 浆速度为3 5 0 0 转秒。 3 ) 室温放置5 m i n ，使其充分裂解。 4 ) 将裂解后的液体转移到新的1 5 m l 离心管中，低温离心5 m i n ( 转速为 1 2 ，0 0 0 r p m ) ，弃去沉淀。 5 ) 按2 0 0 u l 氯仿m 1 z o l 加入氯仿，上下颠倒振荡( 动作柔和，以免基因组 d n a 断裂) 约2 0 s 使之混匀，室温下放置1 5 m i n 。 6 ) 低温条件下1 2 ，0 0 0 印m 离心1 5 m i n 。 7 ) 吸取上层水相约3 0 0 肛l 至另一离心管中，弃下层酚相。吸取过程中千万不要 吸取中间界面，以免吸取杂物影响r n a 质量。 北京协和医学院硕l ：学位论文 8 ) 加入等体积的异丙醇混匀，室温条件下醇沉约1 0 m i n 。 9 ) 4 1 2 ，0 0 0 印m 离心1 0 m i n ，弃上清，i a 沉于管底。 1 0 ) 按1 m l7 5 乙醇m l 晡z o l 加入7 5 乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。 l1 ) 4 7 ，5 0 0 r p m 离心5 m i n ，尽量弃上清。 1 2 ) 室温晾干或真空干燥5 1 0 m i n 。此过程r n a 样品不要过于干燥，否则很难 溶解。 1 3 ) 加入2 0 “l 经d e p c 处理过的蒸馏水( 经高压处理的0 1 的d e p c 水) ，室 温放置2 0 m i n 使i a 充分溶解，最后一8 0 保存。 2 4 3 总i a 的定量 r n a 定量方法与d n a 定量相似。r n a 在2 6 0 m 波长处有最大的吸收峰，因 此，可以用2 6 0 r u i l 波长分光测定r n a 浓度，o d 值为l 相当于大约4 0 “m l 的单 链i 矾a 。如用l c m 光径，用r n a 溶剂稀释样品n 倍并以溶剂为空白对照，根据 读出的2 6 0 i l i i lo d 值即可计算出样品稀释f j 的浓度： r n a ( m g m l ) = 4 0 2 6 0 n m0 d 值稀释倍数l 0 0 0 同时，r n a 的o d 值还可用于判断r n a 的纯度：较纯的r n a o d2 6 0 o d2 8 0 的比值在1 8 2 o 之间。若比值较低，说明有残余蛋白质存在；比值太高，则提示r n a 有降解。 2 4 4 反转录 使用p r o m e g ac d n a 第一条链合成试剂盒。 1 ) 在o 2 m l 的p c r 管中加入总赋a2 5 p g 、o l i g od tp r i m e r ( 5 0 “m ) l 肛l 、d n t p m i x t u r e ( 1 0m me a c h ) l p l 、最后加d e p c 水至l o “l 。 2 ) 将上步加好的混合液摇匀，然后将p c r 管放于p c r 仪中6 5 保温5 分钟， 最后迅速在冰上急冷lm i n 。 3 1 将p c r 管从冰浴中取出，稍离心，使管壁上的液体沉于管中。 4 ) 在上述p c r 管中配制下列反转录反应液：5 p r i m e s c r i p tb u 仃e r4 肛l 、r n a l s e i n h i b i t o r ( 4 0u p 1 ) 0 5 p l 、逆转录酶p r i m e s c r i p t ( 2 0 0u p 1 ) 0 5 l 、最后加d e p c 水 至2 0 “l 。 5 ) 将装有反应液的p c r 管放于p c r 仪中4 2 反应约5 0m i n 、7 0 灭活1 5 m i n ， 然后放于冰上冷却，最终得到c d n a 的第一条链。 2 4 5r e a l - t i m ep c r 1 ) 反应体系：2 t r a n s s t a nq p c rs u p e m l i x1 0 “l ( 含t r a j l s s t a nt a q 新型热启动 酶，s y b rg r e e ni 荧光染料，d n t p s ，p c r 增强剂，稳定剂) ，c d n al 肛l ，上下游 1 2 北京协和医学院硕i ：学位论文 弓l 物共2 “l ( 1 0 p m 0 1 ) ，力口d d h 2 0 至2 0 “l 。 2 ) 反应条件：9 5 预变性3m i n ，9 5 1 5s e c ，5 8 2 0s e c ，7 2 3 0s e c ，一共 4 5 个循环。使用b i o r a di q 5 荧光定量p c r 仪进行反应，所得结果用b i o r a di q 5 p c r 仪自带软件进行分析。引物序列如下 7 b l e1 p r i m e rs e q u e n c e sf o rr e a l t i m ep c r 2 5 大鼠血浆胰岛素水平的检测 在处死雄性d i o r 大鼠、d 1 0 大鼠、正常对照组大鼠f j 行框下取血，采集的血 样保存于预装有2 0 u 肝素钠的1 5 m le p 管中，轻柔颠倒混匀，置于离心机中 2 5 0 0 印删，m i n ，离心5 m i n ，收集上清的血浆，置于8 0 冰箱待测。 用鼠胰岛素e l i s a 检测试剂盒检测血浆中胰岛素含量，每个9 6 孔板包含6 个 鼠胰岛素标准品样品孔、背景孔、2 个质控品，余为待测样品孔，均设置复孔。试 剂盒组成： a 预先包被有抗鼠胰岛素抗体的单克隆抗体9 6 孔板 b 封板胶纸 c 1 0 h r p 浓缩洗液 d 鼠胰岛素标准品：0 2 ，0 5 ，l ，2 ，5 ，1 0 n m l e 鼠胰岛素质控品l 和2 基质溶液 g 分析溶液 h 鼠胰岛素捕捉抗体 i 酶工作液 i 底物 k 终止液 c 每孔加入3 0 0 斗l 稀释洗液，洗板三次。 d 吸净各孔中洗液后加入1 0 肛1 分析溶液至各孔( 标准品孔除外) 。 e 加入l o “l 基质液至各孔( 标准品孔除外) 。 加入1 0 p l 不同浓度的鼠胰岛素标准品至标准品孔。 g 加入l o p l 质控品l 和1 0 “l 质控品2 至各孔( 标准品孔除外) 。 h 待测孔各加入l o “l 样品。 i 加入8 0 p l 捕捉抗体至所有孔中，封板胶纸密封9 6 孔板，室温孵育2 小时。 j 弃去各孔溶液，每孔加入3 0 0 “l 稀释洗液洗板3 次。 k 弃净各孔后每孔加入1 0 0 “l 酶工作液，封板胶纸密封9 6 孔板，室温孵育3 0 分钟。 1 弃去各孔溶液，每孔加入3 0 0p l 稀释洗液洗板6 次。 m 每孔加入1 0 0 p l 底物液，封板胶纸密封后放入水平摇床上1 5 分钟，使其充分 反应。 n 每孔加入1 0 0 肛l 终止液停止反应，4 5 0 n m 和5 9 0 m 处测吸光度，用4 5 0 啪 处的吸光度减去5 9 0 i u i l 处吸光度值得到值作为最终o d 值。 绘制标准曲线：在半对数纸上以鼠胰岛素标准品o 2 ，o 5 ，1 ，2 ，5 ，1 0 n g m l 浓度 为x 轴，其最终o d 值为y 轴，得到标准曲线，得到回归方程。根据吸光度计算出 各样品中胰岛素的含量。 2 6 组织切片制备与h e 染色 2 6 1 石蜡切片取材及标本处理 1 ) 将新鲜组织取出，于生理盐水中漂洗后，迅速放入4 多聚甲醛溶液固定。 2 ) 上行酒精脱水：5 0 、6 0 、7 0 、8 0 、9 0 酒精中分别浸泡1 5 h 。 3 ) 二甲苯i 及二甲苯i i 中各浸泡1 0 m i n 。 4 ) 将组织浸于6 5 7 0 石蜡中6 0 m i n 。 5 ) s a l ( u r at i s s u e t e k 包埋机进行组织石蜡包埋。 6 ) 以l e i c ar m2 1 3 5 切片机进行切片。 7 ) s a k u r at i s s u e t e k 烤片机，7 0 下烤片l h ，备用。 2 6 2 苏木素一伊红( h e m a t o x y l i n e o s i n ，h & e ) 染色 1 ) 切片用两道二甲苯脱蜡共约4 0m i n 。 1 4 北京协和医学院顾l ：学位论文 2 ) 用两道无水酒精将二甲苯洗去，共约4 0 m i n 。 3 ) 梯度酒精入水( 由高到低为l o o ，9 5 ，9 0 ，8 0 ，7 0 ) 。 4 ) 流水冲洗干净后入苏木素染液5 m i n ，水洗。 5 ) 流水冲洗干净后入1 盐酸酒精分化液2 3 s e c 。 6 ) 清水冲洗2 m i n ，温水返蓝。 7 ) 入l 伊红乙醇溶液2 0 s e c 。 8 ) 酒精梯度脱水( 由低到高为7 0 ，8 0 ，9 0 ，9 5 ，1 0 0 ) 。 9 ) 入二甲苯透明，于二甲苯i 和二甲苯i i 中各浸泡1 0 m i n 。 1 0 ) 中性树胶封片。 2 7w e s t e r nb i o t 2 7 1 组织匀浆 1 ) 从8 0 冰箱中取出冻存的大鼠胰腺组织，在冰冷的平皿上切割标本，每份 标本大约取5 m g 左右，然后装于4 m l 的管中并迅速放于液氮中保持样本的冰冻状态。 2 ) 待标本切割完毕后，将装有组织的4 m 1 的试管中加入l m l 蛋白裂解液，在 电动匀浆机上匀浆。 3 ) 将试管放在冰浴的烧杯中，进行间断性匀浆( 2 0 s 5 次，每次间断5 s ) ，匀 浆速度为3 5 0 0 r p 州s 。 4 ) 将匀浆好的蛋白液放于冰箱中4 摇动2 h ，使裂解液中的化学试剂充分发挥 裂解作用，并使原浆后的残渣沉淀。 5 ) 将试管中的上清液转移至1 5 m l 的离心管中进行离心( 1 2 0 0 0 印m 2 0 m i n ) 。 6 ) 离心完毕后，小心从离心机中取出管子并置于冰上，吸取上清于干净e p 管 中置于冰上，弃掉沉淀。将上清液分装到新的试管中，标记好后冻存于一8 0 冰箱， 或直接进行下游实验。 注：如上清液中仍然含有杂质，将第5 步的离心过程在重复一遍。 2 7 2b c a 蛋白含量检测法 b c a ( b i c i n c h o n i l l i ca c i d ) 法，原理为：在碱性环境下蛋白质与c u 2 + 络合并将c u 2 + 还原成c u h ；b c a 与c u l + 结合形成稳定的紫蓝色复合物，在5 6 2 衄处有较高的光 吸收值，且该测定值与蛋白质浓度成正比；通过绘制标准曲线，可以得到待测蛋白 样品的浓度。 1 ) 配置工作液：5 0 倍体积b c a 反应液与1 倍体积c u s 0 4 溶液混合，混匀至无 沉淀，混合后溶液呈嫩绿色。 2 ) 配置梯度浓度的标准蛋白溶液：用p b s 倍比稀释b s a ，配置浓度分别为0 p 咖l ，2 5 0 “g m l ，5 0 0 州m l ，2 0 0 0i l g m l 的标准蛋白溶液。 北京协和医学院硕i 二学位论文 3 ) 微板测定样品：将2 5p l 标准蛋白及待测样品与2 0 0p l 工作液混合，6 0 反 应1 5 3 0m i n 。 4 ) 样品测定5 6 2 啪的o d 值，绘制标准曲线并计算蛋白浓度。 2 7 3 制胶 1 ) 固定好玻璃板胶槽，以免露胶： 2 ) 配置1 2 分离胶：将1 2 分离胶灌至距玻璃板顶端约1 5 c m 处，用去离子 水覆盖胶的上层，室温放置4 5 6 0m i n ，待胶凝固。 3 ) 凝固后，倒掉上层水分，并用滤纸将残留的水分吸干。 4 ) 配置5 浓缩胶：将5 浓缩胶灌满胶槽，并插入梳子，室温放置l h 以上。 5 ) 待胶凝固后，将制胶器放入电泳槽中，上下槽中加入l 电泳缓冲液。 6 ) 小心拔掉梳子，标记不连续胶分界线。 下表所示为s d s p a g e 常用的1 2 的分离胶和5 浓缩胶的成分： 1 2 分离胶 去离子水 3 0 丙烯酰胺 1 5 mt r i s h c lp h8 1 0 s d s 1 0 a p s t m e m d 5 浓缩胶 3 3m l 4 0m l 2 5m l 1 0 0 “l l o o 肛l 4 l 去离子水 3 0 丙烯酰胺 l mt r i s h c lp h6 8 1 0 s d s 1 0 a p s t m e m d 2 5 3m l 6 7 0 “l 6 6 7 “l 4 0p l 4 0 “l 4 “l 2 7 4 电泳 1 ) 电泳前，蛋白样品加入5 样品缓冲液，然后9 8 煮沸变性5 分钟。蛋白 m a r k e r 同样要煮沸5 m i n 。 2 ) 将变性好的蛋白样品加入到胶孔中( 一般