（生物医学工程专业论文）p16基因甲基化检测型芯片的制备与应用.pdf

东南大学硕士学位论文 m e t h y la t io n p a tt e r n , a m e t h y la t io n - s p e c if ic o l ig o n u c le o t id e m ic r o a r r a y f o r q u a n t it a t iv e a n a ly s is is d e v e lo p e d . t h e m e t h o d u s e s b is u lf at e - m o d if ie d d n a a s a t e m p la t e f o r p c r a m p l if ic a t io n , r e s u lt i n g in c o n v e r s io n o f u n m e t h y la t e d c y t o s in e , b u t n o t m e t h y la t e d c y t o s in e , i n t o t h y m in e w it h in c p g is la n d s o f i n t e r e s t . t h e a m p l if ie d p r o d u c t , t h e r e f o r e , m a y c o n t a in a p o o l o f d n a f r a g m e n t s w it h a lt e r e d n u c le o t id e s e q u e n c e s d u e t o d iff e r e n t ia l m e t h y la t io n s t a t u s . a t e s t s a m p l e is h y b r id iz e d t o a s e t o f o lig o n u c le o t id e a r r a y s t h a t d is c r im in a t e m e t h y l a t e d a n d u n m e t h y la t e d c y t o s i n e a t s p e c if ic n u c l e o t id e p o s it io n s , a n d q u a n t it a t iv e d iff e r e n c e s in h y b r id iz a t io n a r e d e t e r m i n e d b y fl u o r e s c e n c e a n a ly s is . 4 c l in ic a l s a m p le s o f g a s t r ic c a n c e r a r e q u a n t it a t iv e ly d e t e c t e d a n d m e t h 功 a t i o n p a t t e r n o f 5 m e t h y la t e d c l o n e s a r e a n a ly z e d w it h t h e m e t h y l a t io n - s p e c if ic o lig o n u c le o t id e m ic r o a r r a y . t h e r e s u lt s o f m ic r o a r r a y h y b r id iz a t io n a r e in a g r e e m e n t w it h s e m i- m s p a n d b is u lf it e g e n o m ic d n a s e q u e n c i n g . it s h o w s t h a t m e t h y l a t io n - s p e c ifi c o li g o n u c l e o t id e m ic r o a r r a y f o r q u a n t it a t iv e a n a ly s is is a p r o m is i n g t e c h n iq u e f o r m a p p in g m e t h y la t io n c h a n g e s in m u lt ip le c p g is la n d lo c i a n d f o r g e n e r a t in g e p ig e n e t ic p r o f ile s in canc er . k e y w o r d s : d n a m e t h y la t io n , s e m i- m s p , m e t h y la t io n - s p e c if i c o l ig o n u c le o t id e m ic r o a r r a y f o r q u a n t it a t iv e a n a ly s i s i i i 东 南 大 学 学 位 论 文 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包 含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育 机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研 究 生 签 名 : 一 一 远 牡 里 乙 一日期 : 丝 主 期 鱼 夕 日 东 南 大 学 学 位 论 文 使 用 授 权 声 明 东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学 位论文的复印件和电子文档，可以 采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外， 允许论文被查阅和借阅，可以公布 ( 包括刊登) 论文的全部或部分内容。论文 的公布 ( 包括刊登)授权东南大学研究生院办理。 研究 生签名: ;七 牲 圣 ，导师 签 名:期: 竹 ,i 宁 网 4 o vi 东南大学硕士学位论文 1 . 1 . 2 基因芯片的原理及制备 基因 芯片的 工作原 理与 经典的 核 酸分 子杂交 方法 ( s o u t h e r n b lo tt i n g和 n o rt h e r n b lo tt i n g ) 是一致的， 都是应用核酸序列作为探针与互补的靶序列杂交， 通过随后的信号检 测 进行 定 性与 定 量 分 析 5 . 6 1 。 但与 传 统 核 酸印 迹杂 交 方 法 相比 ， 基因 芯片 技术 绝不仅 仅是 改变了 载体和检测步骤， 最本质的改 变在于基因芯片技术具有了高通量，高灵敏度， 快速 自 动等显著的特点1 2 . 7 . 8 1 d n a芯片的制备方法主要有离片合成法和在片合成法两种。 离 片合成 一 般采 用点 样 法 17 ， 将 预 先 合 成 好的 核 酸 探 针固 定 到固 体 基片 表 面。 根 据 具 体应用的不同，探针可以是d n a 序列、逆转录的c d n a 或者是合成的寡核昔酸序列。探针 可通过紫外交联或者通过修饰的氨基基团固定到基片表面。点样法的优点在于成本低， 速 度快，可在小型实验室制备。 在片合成法是依据组合化学原理， 通过一组定位模板来确定表面上不同的化学偶联位 点和次序。 其关键是把高密度寡核营酸探针阵列分解成模板定 位技术和固相 d n a化学在 片合成技术。 f o r d o r 等人提出了 一种光脱保护d n a固相原位合成技术， 应用组合化学原 理 成 功 地在1 c m 2 的 基 片 上 在 片 合 成了1 0 0 万 种 不 同 的d n a探 针 1 0 。 但该 方法 制 备 成 本 高，在单步合成产率方面还有一些问题尚未解决。陆祖宏等人提出的分子印章法采用普通 的d n a合成试剂，不仅合成原理新颖， 而且试剂成本低 有良 好的发展前景1 1 1 1 . 1 . 3 基因芯片在肿瘤研究中的应用 一、 肿瘤基因表达谱分析 肿瘤在发生、发展过程中， 增殖周期中不同的阶段、 不同的病理分期、不同的生物学 行为以 及在不同的诱导环境下， 肿瘤细胞的基因表达谱均不同，利用基因芯片高通量、平 行处理的 优势比 较差异基因 表达谱， 使得实验由 静态研究变为动态研究， 从基因水平实时 反映 肿瘤的 生长调节等信息， 了 解表 现型和 基因型的 相互关系 1 2 1 二、月 巾 瘤分子分型 目 前肿瘤的 分类依据是细胞组织来源、形态学、 蛋自 标记物和生物学行为等标准， 显 然基因 表达谱则是以 上所有这些的分子基础，从基因水平分类肿瘤可以 在传统的 分类基础 上发现新的肿瘤类型或亚型. 并且可以 更为真实准确的反映临床表现， 推断预后，为临 床 医 生对肿瘤患 者综 合评估 提供客 观依 据1 3 1 三、 肿瘤基因 诊断芯片 通过对易感人群、高危人群中癌前病变和早期肿瘤的基因表达谱的大规模筛选研究 利用特异性的肿瘤相关基因 或特异性的基因 表达模式，设计出 基因 诊断芯片， 用于 肿瘤普 查，以达到早期诊断、早期治疗的目的，将具有重要的社会效益和经济意义。目 前用于检 测 基因 突 变的 诊断 芯 片已 在 美 国 上 市 ， l e h m a n 等 1 4 1用a ff y m e t r ix 公 司 研 制 的p 5 3 基 因 突 变检测芯片分析了有乳腺癌家族史的4 2 例乳腺癌病人的p 5 3 基因第2 -1 1 外显子和内 含 子的突变情况， 发现有3例在核昔酸序列第， 3 9 6 4位发生了点突变( g - - c ) ， 而在散发的 1 7 ， 例乳腺癌病人中则均未见此变化。 第一章 绪论 四、 肿瘤基因功能研究 在筛选出大量肿瘤相关基因的 基础上， 研究基因的功能( 老基因的新功能、 新基因的未 知功能) 、 基因间相互作用和调控关系是下一步的工作重点。 基因功能的研究可以从基因 聚 类分析、 蛋白 质大分子空间结 构研究 等途 径入手。 基因聚 类( g e n e c lu s t e r ) 即 根据统 计分析 原理，对具有相同统计分析行为的多个基因进行归类的分析方法，归为一个簇的基因在功 能上可能相似或有关联 1 2 1 五、基因芯片技术与其他实验技术的联合应用 目 前，在研究不同组织差异表达基因的 方法中，除了基因芯片外，还包括基因表达系 列分析( s a g e ) 、 差 异表 达p c r ( d d - p c r ) 、 代表 性差异分析( r a d ) 、 抑制性差减技术 ( s s h ) 等，依据不同的实验条件和目的，将芯片技术与它们相结合，发挥各自 优势， 可以达到高 效率、 低成本地筛查分析 差异基因表达 谱的目 的 1 2 1 综上所述，利用基因 微阵 列研究人类肿瘤学将会有助于肿瘤发生过程中相应的分子事 件的 研 究， 更 深 刻 地了 解 肿 瘤 及 其它 疾病 的 基因 变 化 路 径 和 机 制 (4 .5 1 。 近来 研 究 证实 ， 肿 瘤 的发生、发展是一个复杂的多阶段过程，是多种肿瘤相关基因表达失常或许多肿瘤抑制基 因失活所致。 基因芯片为研究肿瘤发生发展中的基因开关及表达程度提供了强有力的工具， 被越来越多的肿瘤生物学家用来比较肿瘤组织与相应正常组织间的基因表达差异，分析肿 瘤生长的各期相关基因的表达模式。基因芯片技术在肿瘤研究领域中 具有重要应用价值。 1 . 2 d n a甲基化与肿瘤 在多阶段癌变过程中， 基因 表达的 异常可能 通过基因 机制 ( g e n e t ic m e c h a n is m ) 和 后 生 机 制( e p ig e n e t ic m e c h a n is m ) l -9 。 基 因 机 制 即d n 结 构 改 变 学 说 ， 认 为 癌 变 是 由 于致癌物质使 d n a结构发生变化， 包括基因 缺失突变等引起基因失转录或产生结 构异常 的基因产物。 后生机制主要是指d n a胞嗜吮5 号位甲基化改变， 引起基因表达异常而d n a 顺序及基因产物不变。染色体异常和 d n a甲 基化改 变都是可遗传的，是导致基因 组不稳 定 性而引发肿瘤的 重要 机制11 5 1 . 2 . 1 d n a甲基化的概述 d n a甲 基化是指生物体 在d n 甲 基 转移酶( d n a m e t h y lt r a n s f e r a s e , d m t ) 的 催化 下，以s - 腺营甲 硫氨酸 ( s a m) 为甲基供体， 将甲基转移到特定碱基上的 过程， 如图， . 2 a 高 等 真核 细 胞 通常 是对d n a 分 子 上5 - c p g序 列的 胞erg 进 行甲 基化 修 饰 11 7 1 1 . 2 . 2 d n a甲基化引发肿瘤的机制 c p g 核昔酸在人类基因 组中占1 0 %， 其中7 0 % - 8 0 % 呈甲 基化状态， 可称为甲 基 化的c p g位点。 非甲 基化c p g二核昔酸区 域 仅占 基因组的， % 2 % ， 这些c p g二 核昔 酸以 较大的密度分布于基因的5 端， 称为c p g岛。 c p g岛 一般为几百至一千碱基长 ， 通 常位于基因的5 端启动区，也可延伸至基因的外显子区。 现今己知在所有管家基因 和一些 组织特异基因的5 端调控区均有c p g岛， 估计哺乳动物的一半基因中含有c p g岛， 人类 东南大学硕士学位论文 基 因 组中 约 有4 5 0 0 0 个c p g岛 1 8 。 除 了 雌 性 动 物 的 非 活性x 染 色 体 基 因 ， a l u 和l h im 序及印记基因的5 c p g岛以 外， 其他所有常染色体基因的5 c p g岛都是非甲 基化的，非 甲 基化基因处于转录活动状态， 而甲 基化基因处于失转录状态。 5 c p g岛甲 基化导致相应 的 基因失转录的 机制主要有直接机制和间接机制。 直接机制是指c p g岛甲 基化干扰t f ( 转 录因子)与调控区d n a的结合。间接机制包括甲基化d n a结合蛋白与甲基化 d n a特异 结合而抑制基因 转录及d n a甲 基化改 变染色质结构， 阻碍下 f 与d n a结合从而抑制转录。 虽然 d n a甲 基化主要影响基因 表达， 但5 一 甲 基胞哈咙引起高频率突变及其有关基因的改 变， 也是致癌机制的 一个重要方面。 d n a 5 c p g岛的甲 基化通过直接间 接机制导致基因 表 达异常， 而胞” 卿 夔 的高甲 基化又可引起基因组的不稳定， 这些都表明d n a 5 c p g岛甲 基 化在基因表达、肿瘤发生过程中起着相当重要的作用。 正常细胞中活性转录基因的5 c p g岛多处于非甲 基化状态， 而位于大部分染色体散在 的c p g位点是甲 基化的。 细胞癌变是 基因 表达失 控的 结果， 肿瘤细胞中 散在的c p g位点 甲 基化程度低于正常组织，异常高表达的基因 表现为低甲 基化状态。 另一方面肿瘤细胞中 存在区 域性c p g岛 高甲 基化。d n a甲 基化的基因外改变与癌基因的 激活以 及抑癌基因的 失 活 有 关 1“ 。 n h , n h 2 n :- d n a m e t h y lt r a n s f e r a s e s -a d e n o s y lm e th io n i n e介 ch3 nh 卿t o s in e 5 -m e t h y lc y t i s in e 图1 .2 c p g甲 基化 1 . 2 . 3 d n a甲基化研究方法的进展 d n a的 异常甲基化与肿瘤的发生发展密切相关。d n a甲 基化已 成为 研究热点， 有关 研究方法发展迅速。 甲基化研究方法大抵分为两大类: 1 ， 基因组d n a的甲 基化检测; 2 . 特 定d n a片段的甲 基化检测。 目 前的 研究重点已 转移到特定基因尤其是抑癌基因的甲 基化。 一、基因组d n a的甲 基化检测 肿瘤组织中 癌基因异常表达， 基因组 d n a的甲 基化程度一般较相应的正常组织低。 检测方法主要有以下三种。 这些方法只能检测基因 组 d n a的甲 基化，并不能具体到 特定 的基因和位点。 1 . 限制性内 切酶酶解法 采用不能切割含5 m c p g片段的甲 基化敏感的限 制性内 切酶分 别消化处理肿瘤和正常组织d n a ，经琼脂糖凝胶电 泳检测，正常组织d n a酶解后小片段 会 多 于 肿 瘤组 织d n a ， 且 呈 弥 散 状 12 0 1 。 这 种 方 法较 为 粗略， 要 求 两 组的 甲 基 化程 度 有明 显 的区别， 而且这种方法只能 考察限制酶识别序列内的c p g位点， 假阳性较高。 2 .甲 基化酶 温育 法 在一定条 件下 用甲 基化酶催 化、- s - 腺普甲 硫氨酸 ( 3 h - s a m ) z i . 第一章 绪论 2 2 1 ， 使甲 基基团 掺入待测d n a 。 由 于反 应是 过量的 ， 可最大限 度地掺入甲 基， 故 可推知 掺 入前d n a样本的甲 基化情况，并以 肿瘤区与正常区c p m值之差了 解该样本基因 组d n a 甲 基 化 水平f 降的 程 度 2 3 1 . 这 种方 法 较为 简 便， 但 精 确 度不 高。 3 .高压液相色谱 ( h p l c ) 法 将d n a以 酸或酶裂解为脱氧核普， 通过色谱柱分离出各 种碱基，由波长 2 6 0 n m 的紫外光测定其吸收峰并定量，灵敏度 0 . 0 1 。由积分面积 5 m c l ( 5 m c 十 c ) 的 百 分 数 检 测基因 组d n a 中5 m c的 含 量即d n a甲 基 化的 水 平 12 1 , 2 4 1 。 此 法是目前测定基因组d n a中5 mc总量最标准的方法。 二、 特定d n a片段的甲 基化检测 近年来人们发现在癌变组织中 抑癌基因低表达甚至不表达，甲 基化程度比止常组织明 显增高12 5 . 2 6 1 , d n a甲 基化异常不仅能促进染色体缺失、重排和突变， 还可直接灭活抑癌 基因口 典 型的 抑癌基因p 1 6 , r b 和v h l 等c p g位点甲 基化普 遍存 在于多 种缺乏 突变 和丢 失的 肿瘤中， 因 而d n a异常甲 基 化可能是肿 瘤中 抑癌基因 失活的 重要机制12 7 1 特定d n a片段的甲 基化检测方法有以 下凡种。 1 . d n a印 迹 采用甲 基化敏感及非甲 基化敏感的限 制酶 ( h p a i 工 和m s p i ) 分别消化待 测d n a ,再进行d n a印迹杂交。 消化后的d n a片段经琼脂糖凝胶分离后转印到纤维素 膜上， 再 与靶 序列 互 补的 探针 杂 交。 利 用 放 射自 显 影 技 术 检 测 靶 序 列的甲 基 化 位点 【2 8 1这 个方法的原理是根据甲 基化敏感的限制酶不能切割含5 m c p g片段的 特性， 判断被测d n a 序列中的一个或多个c p g位点的甲 基化状态。 缺陷在于: ( 1 ) 仅限于限制酶识别序列内的c p g位点; ( 2 ) 要求甲基化的 等位基因的 比 例达到百分之一以 上; ( 3 ) 要求每个d n a 样品的 量5 - 1 0 u g ; (4 ) 不完 全酶 切可能 导致 假阳性。 2 .限制性内切酶- p c r 利用甲 基化敏感的限制酶与聚合酶链反应 p c r ) 联用的策略， 把 p c r引物设计在酶切位点的两侧，d n a被酶切后，只有发生甲基化不被切割的 d n a 才 能 被户 c r 扩 增 2 9 1 。 此 法 检 测c p g 岛 异 常甲 基 化 灵 敏 度高 ， 可 用 过 量 的 酶 量( 4 。 单 位 / u s d n a ) 完全消化组织 d n a以 避免酶切不完全出 现的 假阳 性， 但这种方法也只限于检测限 制酶所能识别的c p g位点。 3 . 测序法f r o m m e r 等采用了亚硫酸氢盐对d n a进行化学修饰的方法，为研究d n a甲 基化提供了 一种全新的思路。 其原理是单链 d n a中未发生甲 基化的 胞啼咤可被亚硫酸氢 盐脱氨基而转变成尿啼咙， 而甲 基化的胞嗜淀保持不变。然后， 利用 p c r技术对所需要 的那段序列进行扩增，将尿咭淀全部转化成胸腺啼淀。最后， 对 p c r产物进行测序并且 与 未 经 修 饰的 序 列比 较， 便 可 判 断 该c p g位 点 是 否 发 生甲 基 化 3 0 1 。 在 该 技 术 的 推 动 下 . 有 关 特 定 基 因 控 制区c p g岛 异 常甲 基 化 与 肿 瘤 发 生 相 关 的 报 导 大 量出 现 13 1 . 3 2 . 3 3 , 3 4 1 。 但 是此方法需要大量的克隆测序， 较为繁琐、昂 贵。 4 .甲 基化 特异的p c r ( m s p ) m s p是h e r m a n 等 首先提出 的 a。 它的 原 理是 在设计 的引物中包含多个c p g位点， 一对引 物是针对c p g位点发生甲 基化设计的， 另一对是针 对c p g位点未甲 基化设 计的。 m s p 是一种分析 给定d n a序列是 否甲 基化的 快 速定 性的 方法。 近来提出了 一种改 进的m s p 法， 采用巢式p c r的 方法提高了p 1 6 基因甲 基化的 检 测灵敏性。 东南大学硕士学位论文 如果引物设计的不合理， 总 d n a的不完全亚硫酸氢盐修饰可能会导致甲基化胞啼吮 的 假阳 性， 可 通 过限 制 性内 切 酶 酶 解 法 检测p c r产 物 作 进 一 步的 判 断 【3 6 1 。 同 时， 由 于甲 基化特异弓 ! 物所包含的c p g位点有限 也会丢失 一些甲 基化信息。 5 .甲 基化敏感性单链核昔酸引物延 伸 ( m e t h y la t io n - s e n s it iv e s in g le n u c le o t id e p r im e r e x t e n s io n , m s - s n u p e ) g o n z a lg o 和j o n e s 改 进了 用 于 检测 突 变的 单 链核 昔 酸引 物 延 伸 法 ， 用 于 特定c p g 位点 的 甲 基 化 定 量 研 究 3 7 1原 理 为 ， 经 亚 硫 酸 氢 盐 修 饰。 n a 后 ， 用 相 应的引物扩增出目 标序列， 所得的目 标序列作为m s - s n u p e反应的 模板。 设计引 物的末端 要求在g p g位点前一个核普酸结束。 延伸时掺入同位素标记的d c 下 户 和d 竹户 ， 加入 d n a 聚合酶。 如果目 标位点发生了甲 基化， c就会在核昔酸延伸时连上去， 反之则会连上丁 。 根据掺入c和t的 量能判断目 标位点的甲基化程度。 所以，引物的设计和d n a的修饰是 关键。 6 . 变性高 效液相色 谱法 ( d 日 户 l c ) 邓大君等3 8 借鉴了。 日 p l c检测点 突变的方 法， 把 发生甲 基化的多个c p g位点 作为多位点突变，原理为， 先用亚硫酸氢盐修饰d n a 再用 p c r 扩增 含c p g位点 的 靶 序 列， 用d h p l c在 部 分 变 性 温度 下 测定 靶序 列的 保留 时间. 靶 序列发生甲基化后， 其保留时间比 未甲 基化的 靶序列明显增长。 此方法可快速检测c p g岛甲 基化， 但是能否通过测定变性温度的上升幅度或保留时 间的延长 程度来进行甲基 化程度的定量测定还有待研究。 而且， 这种方法最大的不足在于 它无法检测特定位点的甲 基化模式。 7 . 电 化学 法 侯 鹏等 13 9 1发 展了 一 种电 化 学结 合l in k e r - p c r的 方 法 来 检测d n a甲 基 化。 首先， 将来自 胃 癌组织及正常人外周血的基因组d n a经内 切酶m s e i ( 一* a a ) 消化成短 片段， 但c g密集区却保持完整。 酶切产物纯化后连接通用的连接子，作为p c r扩增时 的引物。 其次， 连接产物经甲 基化敏感性内 切酶b s t u i 酶解， 未甲 基化的 连接产物被切断， 经p c r 扩增得不到产物， 而甲 基化的 连接产物保持完整， 经尸 c r 扩增后能 得到产物。 最 后， 根据p 1 6 的序列设计互补的探针 ( 该探针上含有b s t u i 酶切位点) ， 将其固定于经过 修饰的金电 极上构成一个电 化学生物转感器。p c r产物与电 极在一个潮湿的条件下杂交， 并且以 ! c o ( p h e n ) 3 1 ( c i o , ) 3 作为电 化学指示剂。采用循环伏安 ( c v )和方波伏安 ( s wv ) 两种方法对杂交结果进行检测。结果表明s wv较c v有更高的灵敏度，因此在进行d n a 甲 基化检测时应采用s wv法。 该方法能有效地检测d n a甲 基化。 这种方法具有以 下几个特点: 1 ) 快速检测， 一般 不超过， 4秒; 2 ) 避免了 胶、 放射性同位素及印记带来的麻烦;3 )具有较高的灵敏度; 4 ) 靶序列无需标记:5 ) 成本低且结果较为可靠。 但是目 前无法实现高通量的检测。 8 . 微 阵 列 技 术 d n a m ic r o a r r a y ) d n a 微阵 列， 又 称d n a芯 片 或 基因 芯 片。 这 种基 于杂交的寡聚核昔酸微阵列是为了在基因 组范围内 检测 d n a变异而涌现出来的一种新型 技术。 主要有整个基因组范围内 扫描的差异甲 基化杂交 d m h ) 及针对某个基因 检测的甲 基化特异性微阵列 ( m s o ) 等。 a . 差 异甲 基 化 杂 交( d m h ) ， 首 先 是1 9 9 9 年由h u a n g 等 14 0 提出 的 . 包 括c p g岛 微 阵列的制备、标记靶序列的制备以及扫描图谱的分析。 d m 日的优点在于能够在整个基因组范围 检测甲 基化的发生模式，高度实现了 微阵列 第一章 绪论 技术的高通量优势。 缺陷 在于只能局限于酶切位点的甲 基化发生情况， 遗漏了很多信息， 而且由于是整个基因组范围内 的杂交， 假阳性的几率较大。 b . 甲 基化特异性微阵列( m s o ) 是由 g it a n 等发展的一种d n a 甲 基化分析技术14 1 1 . 该 方法利用亚硫酸氢盐处理的方法， 结合p c r 技术将基因组d n a 中未甲 基化的c 全部转变为 下 ， 而5 m c 保持不变。 根据这种变化，设计甲 基化与非甲 基化探针来检测c p g 位点的甲基 化状态。然后，将经s s s 工 甲 基化酶处理的阳性样本与未处理的阴性样本按不同比 例混合 后与m s o 微阵列杂交， 以 此作为d n a 甲 基化定量分析的标准曲 线。 根据标准曲 线来确定多 个c p g 岛的甲 基化改变， 但该微阵列无法确定所研究c p g 岛具体的甲 基化模式。 a d o rj b n 等 4 2 在 此 基 础 上 对 探 针 的 设 计 做了 一 些改 进， 他 们 所 设 计的 探 针只 包 含一 个 c p g 位点，并 采用 这个方法 检测了 p 1 5 . p 1 6 , h m l h i 等大 量基因。 该微阵 列虽 然能 确定 甲 基化 模 式， 但 只 是 针 对 单 个 的 c p g 位 点， 只 能 检 测 抑 癌 基因 启动 子区 很 有限 的 儿 个c p g 位点 ， 对于 抑癌 基因 c p g 位点 密 集区 的甲 基 化 模式 研究 意 义并 不 是 太 大。 1 .3本课题的目的意义及实验设计 1 . 3 . 1 课题背景 抑癌基因p 1 6 在大多 数肿瘤中失 活， 但p 1 6 基因 缺失在原发肿瘤中 检出率很低， 突变更 罕 见 4 3 1 ， 而 p 1 6 基 因 的 启 动 子 区 ， 第 ， 外 显 子 和 第 2 外 显 子 均 含 5 c p g 岛 。 研 究 表明 在 乳 癌、 肾癌、鼻咽癌、食道鳞癌、前列腺癌、膀肤癌等常见肿瘤中，p 1 6 基因甲 基化己 成为p 1 6 基因失活的主要机制14 4 1 一、p 1 6 基因甲 基化 p 1 6 抑癌基因的 功能与 细胞周期调节密切相关， 它是细胞 周期的一 种负 性调 控因 子， 阻止细胞生长 分裂。p 1 6 蛋白与细胞周期蛋白d 具有竟争性与周期蛋白依赖性激酶4 ( c d k 4 ) 结合的 特点， p 1 6 与细胞周期蛋白 d 竞争性与c d k 4 结合， 抑制c d k 4 活性， 使视 网膜母细胞瘤基因蛋白 ( f r b )不能被磷酸化而保持活化状态， 阻止细胞由g 1 向s 期的过 渡。 p 1 6 基因 的失活， 引 起g 1 期缩短， 细胞周期加 速， 特别是d n a 在没有 修复 前过早地 进 入s 期，可能是细胞恶性转化的关键。 p 1 6 基因失 活存在 5 c p g 岛甲 基化 机制。 一 些存在p 1 6 基因 纯合性缺失的 肿瘤检测到有 p 1 6 基因甲 基 化。 h e r m a n 4 la s t 的 研究显 示， 乳 癌p 1 6 基因纯 合性缺失 在细胞 系中为 5 0 % ( 3 / 6 ) ，原发瘤中米发现，而p 1 6 基因甲 基化在细胞系中为3 3 % ( 2 / 6 ) 、在原发瘤中 9 0 % ( 5 / 6 ) , 肾 癌 原 发 瘤 和 转 移 瘤 细 胞 系中 纯 合 性 缺 失 5 0 % ( 1 3 / 2 6 ) 、 甲 基 化 2 3 % ( 6 /2 6 ) . l o 14 6 的 研究显示 鼻咽癌p 1 6 基因 纯合性 缺失 在细胞系中 为 6 7 % ， 在原发 瘤为 3 5 %， 而p 1 6 基因甲 基 化 在 原 发 瘤 中 为 2 2 % ( 6 / 2 7 ) . l ig g e t l l报 道 在 头 颈 部 鳞 癌 中 存 在 p 1 6 基 因 纯 合 性 缺 失 、 甲 基化和基因突 变。由 此可以 看出 在乳 癌、肾 癌、鼻 咽癌、 食道鳞癌等常见 肿瘤中， p 1 6 基 因纯合性缺失和甲 基化已 成为p 1 6 基因失活的 主要机制。 有意义的是在一些未发 现p 1 6 基因 纯合性缺失的人类常见肿瘤中发现p 1 6 基因甲 基化。 h e r m a n 4 6 1 的 研究发 现， 前 列 腺 癌 细胞 系 无p 1 6 基因 纯 合 性 缺失， 但有p 1 6 基因甲 基化 6 0 % ( 3 / 5 ) , g o n - z a l e z - z n lu e t a 0 8 报 道 ， 在 未 培 养 的 膀 胧 癌 和 细 胞 系 中 p 1 6 基 因 甲 基 化 发 生 东南大学硕士学位论文 分 别为 6 0 % ( 1 2 1 1 8 ) 和 3 9 % ( 1 2 1 3 1 ) 。 结 果 显 示， 在 前 列 腺 癌、 膀 肤 癌中 p 1 6 基因 5 c p g 岛甲 基化似乎是p 1 6 基因失活的唯一主要机制。 对正常组织及一些癌前病变p 1 6 基因甲基化状态的 研究显示:正常膀肤上皮、肾 脏、 白 细 胞、 鼻 咽 部 粘 膜、 乳 腺 组 织 、 前 列 腺 组 织 均 显 示 p 1 6 基 因 5 c p g 岛 非 甲 基 化 4 5 ,4 7 ,4 9 1 二、胃 癌中p 1 6 基因失活的机制及研究现状 胃癌是我国 最常见的恶性肿瘤。p 1 6 基因c p g岛甲 基化可导致p 1 6 表达缺失，是该 基因灭活的重要途径， 该基因的灭活与胃 癌的发生密切相关。 l e e 等 5 a 最早 报 道了p 1 6 甲 基 化 与 胃 癌 的 关 系 。 他 们 用甲 基 化 敏 感 性限 制 性内 切 酶 研 究了9 个胃 癌细胞株， 发现2 个细胞株有甲 基化， 而且不表达p 1 6 m r n a ; 体外以 去甲 基 化剂5 - d e o x y - a z a c y t id in e 对胃 癌 细 胞 系 处 理 后， 可 见因c p g岛 异常甲 基 化 而 封闭 的 基因 重 新 表 达。 s o n g 等 5 1 用甲 基 化 敏 感 性 限 制 性内 切 酶 研究 了9 个胃 癌 细 胞 株 及2 8 例 原 发 性 胃 癌标本， 结果显示， 5 个胃 癌细胞株及5 例原发性胃 癌有启动子c p g岛的甲 基化， 它们 均不表达p 1 6 蛋白: 另外1 例原发性胃癌也不表达p 1 6 蛋白， 但无c p g岛的甲 基化。 s h i m 等 15 2 1 用甲 基 化 特 异 性p c r 研 究 了8 8 例 散 发 性胃 癌， 其 中3 7 例( 4 2 % ) 有p 1 6 的 甲 基 化。 他们通过免疫组织化学分析了4 1 例胃 癌 ( 2 2 例有甲 基化，1 9 例无甲 基化) 的p 1 6 蛋白 表 达 情 况， 结 果 显 示: 在2 2 例 有甲 基化 的胃 癌 标 本中 ， 1 9 例( 8 6 % ) 完全 不 表 达p 1 6 蛋 白;而在1 9 例无甲 基化的胃 癌标本中， 仅有2 例 ( 1 1 %) 完全不表达p 1 6 蛋白。在这8 8 例n 癌标本中， 2 1 例曾 证实有微卫星不稳 v 性 ，这2 1 例中1 3 例 ( 6 2 %)有p 1 6 的甲 基 化。全欣鑫等5 3 用甲 基化特异性 尸 c r检测了3 6例胃 癌和2 2例正常胃豁 膜组织中 p l 6 / c d k n 2 基因 外显子1 的c p g岛甲 基化情 况。 结果 显示: 1 3 例( 3 6 1 %) 胃 癌标本和 1 例 ( 4 . 5 %) 正常胃 u膜中有c p g岛 异常甲 基化。以 上结果 均证明:p 1 6 基因c p g岛 甲 基化 可导 致p 1 6 表达缺失， 是该基因 灭活的 重要 途径， 该基因的 灭活与胃 癌的 发生 密切 相关。 综 上所 述， 原 发 瘤中 存在5 c p g甲 基 化 而 致失 活 的 机 制 表明p 1 6 基因 在 肿瘤中 的 失 活 可能比以前认识到的更为 广泛， 也即有更多的肿瘤与p 1 6 基因失活有关， 而p 1 6 基因甲 基 化在某些肿瘤中表现出早期事件的 特性， 使p 1 6 基因甲 基化的 检测具有早期诊断价值。 但 是日 前国内 采用的研究方法大多为m s p ， 无法定量检测， 也无法检测出 具体位点的甲 基化 发生情况。 1 . 3 . 2本课题的实验设计 抑癌基因的表达是受其操纵子所调控的， d n a序列中5 号位胞啼咙 ( c ) 的甲 基化状 态在调节基因表达中 起着重要作用， 其中 启动子区 c p g 岛甲 基化是导致抑癌基因失活的 重要原因。人们还认识到在肿瘤的发生发展过程中， 基因c p g岛的甲 基化密度逐渐增加， 是一个动态过程。所以， 许多研究者认识到定量研究肿瘤中 基因甲 基化的必要性。 本课题在传统的m s p法的 基础上。 首先， 采用半巢式p c r 法来初步检测6 0 例胃癌 组织标本的p 1 6 基囚甲 基化的 发生 情况， 并 用免 疫组化的 方法考 察了胃 癌样本中p 1 6 蛋白 的表达与甲 基化的关系。 然后利用微阵列技术来进一步检测其甲 基化情况。以 此来说明微 阵列技术的优势。 本课题制备了p 1 6 基因启动子区甲 基化检测型基因芯片， 绘制了甲 基化 第二章 半巢式m s p 法用于胃 癌p 1 6 基因甲 基化的初步分析 第二章半巢式m s p 法用于胃 癌p 1 6 基因甲 基化的 初步分析 在开展芯片检测p 1 6 基因甲 基化的工作之前， 我们先采用了一些常规的方法对临床胃 癌样本p 1 6 基因启动子区甲 基化作初步的检测，以 此作为芯片检测的参照，突出 制备甲 基 化检测型芯片的 优点。为此， 我们将半巢式m s p 的 方法用于6 0 例临床胃癌样本p 1 6 基因启 动子区甲 基化的初步检测。 半巢式m s p 是一种改进的m s p ， 在m s p 的两条引物中增加了 一 条引 物， 对所需检测的d n a 序列能 起到一个放大效应， 能够进一步提高甲 基化检测的灵敏 度。 我们还采用组织免疫染色 ( i h c ) 的方法考察了胃 癌组织p 1 6 蛋白的表达与p 1 6 基因甲 基化的关系。 2 . ，样本d n a的抽提与亚硫酸氢钠处理 双链d n a 是非常惰性的化学物质。 它潜在的 反应基团隐藏在中 央螺旋内， 并经氢键紧 密连接。 它的碱基对受外侧磷酸和糖形成的强大环层的保护，这种保护因内 在的 碱基堆积 力而进一步加强。 这样的化学耐受性赋予基因组d n a 文库的持久性和价值使得或大或小的 遗传工程和测序计划成为可能h l 本课题所采用的 6 0 例胃 癌及其对应正常组织取自 南京鼓楼医院和中大医院， 均为新鲜 组织，取少量浸泡于无水乙醇中， - 2 0 保存，其余液氮保存。 2 . 1 . 1样本d n a的消化抽提 一、 用蛋白 酶k 和酚一 氯仿消化抽提的原理 在e d t a( 赘合二价阳离子以抑制d n a s e ) 存在的情况下， 用蛋白 酶k 消化真核细胞或 组织， 用去垢剂s id s 溶解细胞膜并使蛋白 质变性。核酸通过有机溶剂抽提进行纯化。 这样 获得的d n a 可作为 聚合酶 链反应( p c r ) 的 模板 il l 二、实验试剂 1 0 x t e 缓冲液 1 0 %s d s 蛋白 酶k ( 2 0 m g l m l ) 饱和酚 氯仿 无水乙醇 3 m醋酸钠 琼脂糖s ig m a 1 x 丁 b 三缓冲液 三、实验仪器 离心机，c e n t r if u g e 5 4 1 5 d , e p p e n d o rf o 移液器，1 0 n 1 , 1 0 0 p 1 , 1 0 0 0 p 1 , g i l s o n . 离心管，1 . 5 m 1 , e p p e n d o rf . 东南大学硕士学位论文 电泳仪，p a c 3 0 0 0 , b io r a d e 凝 胶 成像系 统， s y n g e n e , g e n e g e n iu s . 温控灵敏微波炉，l g o 电子天平，f a 1 0 0 4 ，上海天平仪器厂。 四、实验步骤 1 . 将保存于 一 2 0 无水乙 醇中的 样本取出少量， 切碎， 移入1 .5 m 1 的离心管中， 加入3 7 5 p ! 1 0 x t e 缓冲液、 2 0 11 1 1 0 % s d s 和5 n 1 蛋白 酶k , 温和混匀， 5 0 - 5 5 c 消化3 - 5 小时。 2 . 用等量苯酚抽提一次。 将混合液缓慢颠倒十分钟至一层乳状物出现。关键: 不能 振荡! 3 ， 于室温以5 5 0 0 r p m 离心1 5 分钟。小心地吸出d n a 水相。 确保水相没有混入苯酚。 4 . 用等体积1 : 1 的苯酚: 氯仿抽提一次， 将混合液缓慢颠倒十分钟， 重复步骤3 e 5 .用等体 积氯仿 抽提一次， 将混 合液缓慢 颠倒十分钟， 于室温以 5 5 0 0 r p m 离 心1 5 分 钟。小心地吸出d n a 水相。 6 加入2 倍体积的预冷无水乙 醉和4 0 闭3 m醋酸钠， - 2 0 沉淀3 0 分钟。 7 ， 在4 下， 2 0 0 0 r p m 离心3 0 分钟，弃上清。 8 . 加入7 0 %乙 醇洗涤， 在4 下1 2 0 0 0 r p m 离心5 分钟，弃上清。 9 . 用烘箱将d n a 烘干， 5 0 0c 1 小时， 溶于5 0 闭 去离子水。 1 0 .取5 训d n a 用， x 丁 b e 于1 % 琼脂糖凝胶上电泳， 检测抽提结果。 2 . 1 . 2样本d n a的亚硫酸氢钠处理 一、 亚硫酸氢钠处理的原理 单链d n a 的未甲 基化胞哦睫可被亚硫酸氢盐脱去氨基而转变成尿嗜陡， 而5 m c 不能 被 修 饰， 仍 保 持为 5 m c (z l 。 具体 过 程为: 第一 步， 亚 硫 酸氢 钠 使 胞啼 睫 磺 化; 第二 步， 对苯 二酚脱氨基;第三步， 在碱性环境下，磺基消失， 成为尿啼呢。如图 2 . 1 所示。 “ 。一、 nh=i st e p 1 s u l p h o n a t io n c y t o s i n e s u lp h o n s t e h = o 。 日 ，- 闪h nles夕 1，f f0 咬 冬- 一 5 0 7 u f a c l l s u lp h o n e t e hn再 s te p 3 al k a l i d e s u l p h o n a t i o n 图2 . ，亚硫酸氢钠处理使未甲 基化的胞r k 陡转化为尿咄陡 第二章半巢式m s p 法 用于胃 癌p 1 6 基因甲 基化的 初步分析 二 、实验试剂 3 m n a oh 1 0 m m对苯二酚s ig m a 3 . 6 m亚硫酸氢钠 ( p h = 5 . 0 ) s i g m a 去离子水 8 0 % 异丙醇 1 0 m酷酸胺 ( p h = 7 . 0 ) 无水乙醇 石蜡油 wi z a r d d n a c le a n - u p s y s t e m , p r o m e g a a 7 2 8 0 三、实验仪器 水浴锅 离心机， c e n t r if u g e 5 4 1 5 d , e p p