（微生物学专业论文）光合细菌的筛选及其对动物免疫功能和生产性能的影响研究.pdf

摘要 本试验采集、分离、纯化、鉴定、筛选了4 株光合细菌，并研究这4 株光 合细菌对小鼠免疫功能和鲤鱼生产性能的影响，研究结果如下: 1 .从所采集的 1 9个样品中富集、分离到 3 6 株光合细菌，经过纯化并鉴 定后得到5 株光合细菌，分别是: w s t 2 2 , s c 2 1 , s c 4 2 , s x 5 2 和 s x 5 1 。其中 w s t 2 2 和 s c 4 2为沼泽红假单胞菌，s c 2 1 和 s x 5 1 为万尼氏红微菌，s x 5 2为荚 膜红假单胞菌。ws t 2 2 , s c 2 1 , s c 4 2 , s x 5 1 4 株光合细菌生长较快，在培养基 中光照培养3 天活菌数即可达到1 夕个/ m l ; 存活期长， 在液体培养基中保存3 个月后将其转入新的培养基中仍然能够保持很高的繁殖能力。 2 .用牛津杯法测定以上筛选到的8 株光合细菌对致病性大肠杆菌和沙门 氏菌的抑菌作用， 结果表明其中的4 株光合细菌在不同程度上对致病性大肠杆 菌和沙门氏菌都有抑制作用。其中 w s t 2 2对大肠杆菌的抑菌圈直径可达 3 0 - 3 2 m m, s c 4 2对沙门氏菌的抑菌圈直径达 2 0 m m以上，其余的两株光合细菌也 分别在不同程度上对致病菌有拮抗作用。 3 . 4 株光合细菌培养液分别连续灌胃小鼠两周，结果显示均对小鼠没有 毒、 副作用。 解剖结果表明试验组小鼠内脏器官的结构与对照组相比没有明显 的变化，说明4 株光合细菌作为微生态制剂生产菌种是安全的。 4 .免疫功能试验结果表明，4株光合细菌对小鼠免疫器官的发育有很好 的促进作用，试验组小鼠脾脏指数和胸腺指数均比对照组高，其中 s c 4 2组小 鼠胸腺指数较对照组差异显著 ( p 0 . 0 5 ) ; s x 5 1 组小鼠脾脏指数较对照组差异 显著 ( p 0 . 0 5 ) a 4株光合细菌对小鼠 腹腔巨噬细胞吞噬能力的促进作用非常 明显 ，4个试验组小 鼠的腹腔 巨噬细胞的吞噬率和对照组相 比差异显著 ( p 0 . 0 5 ) 。说明4 株光合细菌对小鼠的免疫能力均有促进作用，尤其是 s c 4 2 和 s x 5 1 作用更明显。 5 . 光合细菌复合培养物作为饲料添加剂应用于鲤鱼生产试验，在饲喂 3 5 天后试验组总增重分别比某公司鱼饲料组、 添加黄霉素组( 3 p p m ) , 宝”组提高 9 . 5 %, 9 .6 %, 1 5 . 4 % 合细菌可以提高鲤鱼的生产性能。 关键词光合细菌鉴定 料肉比降低了 2 . 6 %, 6 . 3 %, 4 . 8 % “ 益畜 说明光 筛选免疫功能生产性能 言 我国的畜牧业在最近几十年中有了长足的发展， 对国民经济水平和生活质 量的提高起到了不可忽视的作用。 特别是在改革开放以来，畜牧业、水产业取 得了巨大的成绩。据统计，1 9 9 7 年畜牧业、水产业占农业总产值的比重分别 为3 1 .5 %, 1 0 %，而粮食总产值仅占2 9 %。我国的肉类总产量在 1 9 9 8 年跃居 世界第一位，肉和蛋的人均占有量超过世界平均水平川; 在短短的十几年中， 我国的配合饲料产量大幅增加，一跃成为世界第二饲料工业国。这种情况下， 人们关心的不再是畜产品的数量， 而是畜产品的质量。 然而畜产品中有害物质 的残留对人体的健康和正常的生态环境造成了很大的威胁【 1 ， 其中包括抗生素 的滥用、环境的污染、生态平衡的失衡等等，逐渐引起人们的重视。 1 .畜牧水产业面临的问题以及解决办法 5 0多年来抗生素在各种领域中发挥着不可忽视的作用.在畜牧业中对促 进畜禽生长、改善饲料报酬【2 ， 、酮体组成3 ， 、繁殖性能及减少发病率和死亡率 阮5 s 方面发挥了巨大的作用，为世界的畜牧业、水产业的迅速发展起了很大 的推动作用。 但是它的副作用自从被人类发现和认识以来， 一直是人们关注的 焦点。抗生素导致细菌耐药性的提高给兽医界和人类医学界造成了很大的麻 烦， 长期使用抗生素会使病原微生物产生耐药性， 例如葡萄球菌长期接触青霉 素会产生能够水解青霉素的水解酶m ; 某些病原菌在抗生素的长期影响下， 成 为能够抵抗最新强力抗生素的“ 超级细菌” ，人们已经无法控制它们。1 9 9 9 年 美国 和欧共体成员国已经先后禁止使用多种抗生素8 ， 这些抗生素过去曾在畜 牧业中作为促生长剂长期大量的使用， 而且世界上包括我国在内的许多国家现 在仍然在使用。 同时， 抗生素的残留问题一直是饲料中添加抗生素最有争议的 问题之一，包括抗生素在动物体内的残留对消费者健康的影响，常引起过敏、 致残、 致癌等疾病川 ， 例如四环素有光敏性和胃肠道反应， 氯霉素会引起再生 性、障碍性和溶血性贫血，血小板减少和肝硬化 。 、 ; 抗生素经动物代谢后 在环境中的残留破坏了生态环境，以及这种残留加速耐药菌的产生等。另外， 违禁、 被淘汰药物的使用对人体健康造成的威胁也不可忽视【 2 ， ， 如氯霉素、 氟 呱酸等，以及 日一兴奋剂 ( 瘦肉精) 、镇静剂 ( 利血平)等仍在频繁使用。 在畜牧业、 水产业迅速发展的同时， 环境问题不可避免的出现在人们的面 前。 大量的动物粪便和由其产生的恶臭气味对周围的环境造成很大影响， 草食 动物食用大量的草料， 但是却不能够完全消化吸收， 大量的植酸磷被排放到周 围环境中，造成土壤和水源的污染 川，大量的粪便不能及时处理，致使微生 物迅速繁殖，为疾病的传播提供了条件。 随着对抗生素危害的认识、 养殖业对环境污染的逐渐严重以及人类自身健 康意识的提高， 人们对无病害、 无药物残留的食品要求越来越高， 各种抗生素 替代品也不断的面市， 将有益微生物应用于畜禽和水产业已成为一种可能， 其 中 很多都是以 微生态原理作为基本的出 发点来研制和开发的 i p 微生态学起源于上世纪 7 0年代，主要的目的是为克服抗生素的抗药性和 所造成的二重感染问题。国内何明清教授从 7 0 年代后期开始研究并利用有益 微生物， 并且取得了明显的效果， 为我国动物微生态学的发展做出了很大的贡 献 、 ， 5 随着动物微生态学的发展， 产生一种新型的产品: 动物微生态制剂。 动物 微生态制剂也称为益生菌剂， 是在微生态理论的指导下， 采用有益微生物， 经 过培养、 发酵、 干燥等特殊工艺， 制成的对人、 动物等有益的生物制剂或活菌 制剂， 包含有活菌、死菌、 代谢产物。常见的微生态制剂生产菌种包括: 芽抱 杆菌类、乳酸杆菌类、酵母菌类、霉菌类、蜓弧菌类、光合细菌类等叫。 2 ，光合细菌的应用研究 光合细菌作为微生态制剂的生产菌种之一， 是一种可以进行自身光合作用 的非致病菌。 在满足光照条件，密闭厌氧，培养基有碳源、氮源、基本的微量 元素等条件下就可以快速的生长繁殖。 光合细菌菌体中所含有的丰富的维生素、 蛋白质和微量元素能明显改善动 物饲料的营养价值。目 前光合细菌已经被广泛的应用于畜牧和水产业， 不少学 者对光合细菌的应用进行了 研究 1 7 - 2 0 1 。雏鸡饲料中添加光合细菌菌液，对雏 鸡的增重有明显的效果仁 ， ，而且光合细菌对蛋鸡的产蛋量下降有明显的 抑制 作用， 同时可提高s o d 酶活性 2 2 1 ; 在水产业上 。 ， 特别是在改善饲养的水体 环境上， 光合细菌可以增加水的溶氧量、 减少水中的硫残留量、 分解鱼虾的粪 便， 吸收水中溶解的氨等: 并可以提高鱼类成活率， 增加亩产， 降低饵料系数 ( 2 1 1 此外， 光合细菌所独有的光能合成体系使光合细菌对环境中水体的净化能 够起到很大的作用， 特别是在工业废水、 畜禽粪便污水和屠宰厂污水的处理中 作用明显 2 4 - 2 7 1 ，而且光合细菌的作用效果是活性污泥等常规污水处理剂所不 能比的 ” 。有些学者还把光合细菌和酵母菌以 及螺旋藻等混合培养用于处理 污水，也取得了一定的效果。 光合细菌的这些优点使它成为一种很好的饲料添加剂， 目前市面上已经有 一些光合细菌产品，而且效果良好，这为光合细菌的进一步发展创造了条件。 但是光合细菌作为一种微生态制剂，目前还存在一些问题， ( 1 ) 很多光合 细菌制剂都是将光合细菌从自然界中简单富集， 得到光合细菌的培养液， 就将 其应用于水产养殖中;( 2 ) 人们对光合细菌的使用上存在一种偏见，认为光合 细菌的饲用效果明显， 仅仅将其作为饲料添加剂使用， 而忽视了其他方面的作 用。 国内外很多学者对光合细菌的研究都集中在动物的增重效果、 使用量的大 小、改善水体环境等方面 卜 3 ， ，对促进免疫功能的研究甚少，只有少数文献 报道光合细菌有抵抗疾病的作用，如提高幼畜禽、鱼苗、虾等的成活率，抑制 水中病原微生物的存活 川， 对于光合细菌提高机体免疫功能的机理未见报道。 所以光合细菌增强动物免疫功能、 拮抗病原菌等机理的研究， 对光合细菌进一 步应用于畜牧和水产业， 进而替代抗生素添加将有极大的帮助。 为将光合细菌 的众多优势充分发挥到畜牧业和水产业上， 就要对光合细菌的功能进行综合评 价， 完善光合细菌从菌种的筛选、 安全性检测、 到免疫功能和生产性能的检测 的一整套方法，指导光合细菌合理使用。 3 试验目的和意义 本研究从光合细菌的采集、富集、分离、纯化到鉴定、筛选，并进行安全 性检测、 对免疫功能影响和生产应用效果的研究， 目的是筛选出一到几株既能 够提高动物生产性能又能增强宿主免疫功能的光合细菌， 用以制成光合细菌微 生态制剂来预防和治疗动物的疾病， 减少抗生素的使用，为生产无污染、 无抗 生素残留的食品提供可能， 从而达到保证人类健康、 保护环境和维持生态平衡 等目的。 材料和方法 ( 一) .试验材料 1 ，菌株:光合细菌由本实验室保存 ( 2 株) 及本试验分离 ( 3 6 株) ; 致病性大 肠杆菌a t c c 2 5 9 2 2 菌株、肠炎沙门氏杆菌由四川抗菌素研究所惠赠。 2 培 养基 3 2 - 3 5 3 2 . 1 v a n n e i l 紫色非硫细菌富集培养基: nh 4 c l na ci o . l g 0 . 2 g n a h 2 p o 4 酵母膏 0 5 g mg c 1 2 0 . 0 2 g 1 5 g 将以上各组分溶解于 l 0 0 m 1 水，1 2 1 0c 蒸汽灭菌 2 0 m i n ，制成基础培养基。 配制以下的溶液并过滤除菌:1 0 % n a h c 0 3 ;乙醇;0 . 1 m o l 磷酸。 在上述的基础培养基中加入1 0 % n a h c 0 3 5 0 m l ， 乙醇 1 . 5 m l ， 用磷酸调p h 值 7 . 0 . 2 . 2光合细菌分离培养基: 乙酸钠3 . 0 g丙酸钠0 . 3 g n a c l l o g ( n h 4 ) 2 s o 4 0 . 3 g mg s 0 4 0 . 2 g k h 2 p o 4 0 . 5 g k 2 h s 0 4 0 . 3 g c a c l 2 5 0 m g mn s 0 4 2 . 5 m g f e s 0 4 5 m g酵母膏o . l g蛋白 膝l o m g 谷氨酸0 .2 m g h 2 0 1 0 0 0 m l p h 7 .4 将以上组分溶于水后调p h ， 然后 1 2 1 0c 蒸汽灭菌3 0 m i n ， 如果配置固体培 养基则在以上的成分中加入 1 7 g 琼脂再蒸汽灭菌， 倾倒平板， 做无菌检测后用 于分离单菌落。 2 . 3营养肉汤培养基:蛋白陈l o g牛肉浸膏5 g n a c l 5 g 将上述组分溶解于 l 0 0 0 m l 水，调p h值 7 . 4 7 .6 , 1 2 1 0c 灭菌3 0 m i n ;营 养琼脂培养基在以上组分中加入 1 . 7 % 琼脂再灭菌。 3 .主要化学药品均使用分析纯。 4 . 主 要 试剂 3 4 . 3 6 0 . 1 m o l / l n a o h . 0 . 1 m o l / l h c l 、柠橡酸钠盐溶液、 g i e m s a 染液、革兰氏 染液、0 . 9 % 和0 . 8 5 %灭菌生理盐水等 鸡红细胞悬液:用已经灭菌注射器，在健康鸡翼下静脉采血 i m l ，放置于 5 倍体积的a l s v e r s 溶液中，4 可保存1 周，使用时用灭菌生理盐水洗涤3 遍 ( 2 0 0 0 r / m i n 每次5 分钟) ，然后用生理盐水配制成5 % 浓度。 a l s v e r s 溶液: 葡萄糖2 . 0 5 克， 柠檬酸三钠0 . 8 9 克， 氯化钠0 .4 2 克， 溶 解 后加蒸 馏 水 至l 0 0 m l ， 超 滤除 菌 或6 .6 x 1 0 4 p a ( 1 1 5 0c ) 灭菌2 0 分 钟。 h a n k s 溶液: 甲液: n a c l 8 0 克、 m g s 0 4 1 克、 m 9 c 1 2 1 克用双蒸水定容至4 5 0 m 1 , 氯化钙 1 .4克，加双蒸水至 5 0 m l，以上液体混合，加 i m l 氯仿: 乙液: n a 2 h p 0 4 1 . 5 2 克k h z p o 4 0 . 6 克、 酚红0 .2 克、 葡萄糖1 0 克 用双蒸水定容到5 0 0 m 1 ，加氯仿 1 m 1 ; 甲液:乙液:双蒸水=1 : 1 : 1 8 , 1 0 磅灭菌 2 0 分钟，使用前用 3 . 5 %的碳 酸氢钠调p h值至7 . 2 ; 5 .试验动物: 小白鼠:昆明系纯种小白鼠，购自四川抗生素研究所。 鲤鱼:实验室试验采用市售7 - 9 g 鲤鱼，水库生产试验采用每尾0 . 5 k g 左 右剑鲤和静鲤。 6 .主要仪器:恒温培养箱( 2 8 0c , 3 7 0c ) , 1 0 0升玻璃缸、u v 7 5 4分光光度仪 ( 上海第三分析仪器厂) 、h z s - h水浴式振荡器 ( 哈尔滨市东联电子技术开发 有限公司) 、4 冰箱、显微镜等。 ( 二) .试验方法 1 .光合细菌菌种的分离、纯化以及鉴定 1 . 1 光 合 细 菌 样 品 的 采 集 与 富 集( 2 0 . 3 2 . 3 6 3 从四川农业大学校园附近、 山西省临汾市采集， 连同本实验室保存的光合 细菌，一共 1 9种样品，分别有工业污水、生活污水、淤泥等。采用 v a n n e i l 紫色非硫细菌富集培养基进行富集培养， 先后富集三次， 直到培养基中光合细 菌成为优势菌群。 1 .2 光 合 细 菌 的 分 离 与 纯 化2 0 . 3 2 . 3 3 3 ( 1 )将富集以后的光合细菌样品分别在分离培养基上划线分离单菌落， 2 8 c 厌氧罐内光照培养2 4 小时。 ( 2 )将平板上的单菌落挑出到液体培养基中继续培养。并重复以上的步 骤，以保证菌种的纯化。同时保存己经纯化后的菌种，保种方法如下:液态 保种:将培养基灭菌后接入菌种，培养，以后每隔2 0 3 0 天转接一次。固 态保种:制备固体培养基，挑取优质光合细菌穿刺接种，培养 1 0天后用液体 石 蜡 封口 ， 放 置 黑 暗 处 ， 每 一 年 转 接 一 次 2 8 3 1 .3 光 合 细 菌 菌 种 鉴 定 3 7 - 4 1 3 根据伯杰氏鉴定手册提供的鉴定方法进行菌种鉴定，具体的鉴定步骤: ( 1 )显微镜下镜检，观察细菌的形态、颜色、特征 ( 有无鞭毛、如何运 动) 。 ( 2 )根据光合细菌的生长情况、菌液颜色初步判断该菌属于光合细菌七 大类中哪一类。 ( 3 )测定光合细菌培养液在不同波长下o d 值，绘制波长一 吸光度曲线， 根据吸收峰判定光合细菌的科、属。 ( 4 )光合细菌叶绿素检测:采用丙酮研磨，纸带法测定。取 l o m l 光合细 菌培养液，3 0 0 0 r p m 离心5 分钟后得到的菌体，生理盐水清洗两次，向菌体中 加入 7 -9 m l 丙酮，并研磨至菌体破碎，将准备好的纸带浸入丙酮溶液中，室 温下放置 1 小时，观察纸带上各叶绿素条带的位置，对照菠菜叶叶绿素条带， 确定光合细菌所含叶绿素种类 ， 。 2 .光合细菌抑菌试验 2 . 1 病 原 菌 的 制 各3 2 1 2 . 1 . 1 菌种活化: 将保存的致病性大肠杆菌和沙门氏菌接种到营养肉汤中，3 7 培养 8 - 1 o h ，使菌种活化，重复3 次使菌种彻底活化。 2 . 1 . 2 菌数测定: 将活化后的致病菌接种到一定体积的营养肉汤中，3 7 0c 1 5 0 r p m 振荡培养 1 8 h 左右，采用 1 0 倍递增稀释涂布平板法测定菌液浓度 3 4 1 ，然后用生理盐水 稀释到1 0 8 / m l , 4 保存备用 ( 可保存1 周) 。 2 .2 光 合 细 菌 的 拮 抗 试 验1 4 3 - 4 8 1 2 .2 . 1 光合细菌培养液中细菌浓度的 检测1 3 3 1 采用 1 0倍递增稀释法将菌液梯度稀释，取适当稀释度菌液 0 . 1 m l 涂布光 合细菌分离培养基平板，2 8 光照厌氧培养4 8 h ，计算培养液含菌数。然后将 光合细菌的浓度统一稀释到1 0 9 / m l 备用。 2 . 2 . 2 光合细菌菌体和代谢产物的制备: 将光合细菌培养液 3 0 0 0 r p m离心 5分钟， 取沉淀，并用生理盐水清洗 3 次， 将得到的菌体用生理盐水稀释到原体积， 制成光合细菌菌体;同时将第一 次离心所得到的上清液用无菌溥器滤过除菌，得到光合细菌的无菌代谢产物。 2 . 2 . 3 光合细菌抑菌试验: 2 . 2 . 3 . 1 光合细菌全菌液抑菌试验: 采用牛津杯法进行抑菌试验。 具体方法如下: 在普通营养琼脂平板上涂布 0 . 1 m l 稀释到1 0 8 / m l 的大肠杆菌或沙门氏 菌菌液， 在3 7 0c 温箱中 烘干2 0 分 钟， 然后将牛津杯均匀放置在平板上， 每个平板4 个牛津杯， 在牛津杯中加满光合 细菌全菌液，3 7 培养 8 -1 0小时，测量抑菌圈直径。 2 . 2 . 3 . 2 光合细菌菌体抑菌试验: 方法同 2 . 2 . 3 . 1 . 2 . 2 . 3 . 3 光合细菌代谢产物抑菌试验 方法同2 .2 .3 . 1 0 3 .光合细菌安全性检测和免疫功能试验1 4 9 - 5 1 1 3 . 1 灌胃试验: 选用体重 2 8 -3 2 8的小白鼠 ( 雌雄各半) ，分 4 个试验组和 1 个空白对照 组，每组9 只。试验组分别以不同光合细菌每天灌胃0 . 3 m l / 只，连续 1 4 天， 对照组以相同量的自来水灌胃， 观察记录各组小白鼠的活动、食欲等情况， 试 验结束时脱颈椎处死，解剖观察内脏器官是否有变化。 3 . 2自 吸试验: 将光合细菌菌液作为小白鼠的日常饮用水， 对照组则喂食 自来水。 连续喂 食一个月，记录试验期间小白鼠日常活动情况。试验结束时，称量小鼠体重， 然后测定小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率和免疫器官重，具体试验步骤如下: 试验前两天，每只小鼠腹腔注射p h 7 . 2 的h a n k s 液2 m l ; 试验当天上午，称量小鼠体重，称量后给小鼠腹腔注射 5 % 的鸡红细胞 l m l / 只，2 - 3 小时后，脱颈椎法处死，立即由腹腔注入 l m l 生理盐水。 轻揉小鼠腹部约 1 分钟，剪开腹部皮肤， 在肌肉层上开一小口，将滴管 伸入腹腔吸出腹腔液，置于滴有柠橡酸钠的离心管内，混匀。 把腹腔液滴加在洁净的载玻片上， 每片约0 . 1 -0 . 2 m l ， 每个小鼠重复3 个，将载玻片置于带盖的解剖盘中 ( 底部放 2 - 3层湿纱布) ，3 7 c 温箱孵育 3 0 m i n . 取出载波片，漂洗去上清液和未粘附在载玻片上的细胞。 所制的载玻片于室温下风干，然后用g i e m s a 染液染色5 - 1 0 分钟，冲 去多余的染液颗粒，晾干。 高倍镜下观察并计数 2 0 0个巨噬细胞中有多少个巨噬细胞吞噬了鸡红 细胞，按照以下公式计算巨噬细胞的吞噬率。 巨噬细胞吞噬率=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数 总巨噬细胞数 x1 0 0 % 将取过腹腔巨噬细胞的小鼠解剖， 取出脾脏和胸腺， 分别在电子天平称 重，记录重量，按照下面公式计算胸腺系数和脾脏系数。 胸腺系数= 胸腺重 脾脏系数= 脾脏重 小鼠体重小鼠体重 4 .光合细菌生产性能试验 4 . 1 实验室动物试验: 将体重7 -9 g 鲤鱼，分为4 个处理组，每组3 个重复，每个重复 1 3 尾， 分别喂养在 1 5口玻璃缸 ( 4 0 c mx 5 0 c mx 7 0 c m) ,置于室内饲养。第一组为基础 饲料对照组，第二组基础饲料加液体光合细菌 ( 5 m l / 缸/ 周) ，第三组基础饲料 加 0 . 1 %固体光合细菌，第四组基础饲料加 0 . 1 %芽抱杆菌。饲料配方见表 l , 表 1实验室鲤鱼生产试验基础日粮组成及营养水平 原料 玉米 麦鼓 含量( %)成分含量 大豆饼 鱼粉 棉籽饼 d l - m e t 矿添 多维 甜菜碱 磷酸氢钙 碳酸钙 抗氧化剂 防霉剂 微生物添加剂 5 3 . 4 0 3 . 1 7 1 5 . 0 0 2 0 . 2 2 5 . 0 0 0 . 1 2 1 . 0 0 0 . 3 0 0 . 0 4 0 . 1 7 0 . 5 0 0 . 0 4 0 . 0 4 1 . 0 0 粗蛋白 消化能 赖氨酸 蛋氨酸 蛋+ 肤 钙 总磷 有效磷 粗脂肪 粗纤维 灰分 4 0 . 8 8 ( %) 3 . 0 5 ( mc a l / k g ) 0 . 9 5 ( %) 0 . 2 6 ( %) 0 . 5 7 ( % ) 0 . 6 0 ( % ) 0 . 5 3 m 0 . 2 3 m 4 . 1 4 m 3 . 8 0 ( %) 4 . 9 4 m 实验室自配成粉料。 一日喂料三次， 5 天换一次水。 记录每天饲料消耗量， 饲喂6 5 天，试验结束时将各组鲤鱼分别称重，计算增重情况、料肉比。 4 . 2水库生产试验 “ ， 一 ， 四川省乐山市键为县三岔河水库进行鲤鱼试验， 试验进行3 5 天。 将0 . 5 k g 的鲤鱼平均分成4 个组， 每个组2 个网 箱， 每个网 箱内 有3 0 0 k g 鲤鱼， 试验1 组为基础饲料加3 p p m黄霉素， 试验2 组基础饲料加3 p p m黄霉素和3 % 的光合 酵母 ( 某公司商品鱼饲料) ，试验 3 组为基础饲料加复合光合细菌，试验4组 基础饲料加2 0 0 p p m“ 益畜宝” ( 美国公司提供微生态制剂) 。 饲料配方见表二， 所有饲料均在巨星公司生产为颗粒料。 8 月1 5日 分组，每网箱饲喂3 0 0 . o o k g 鲤鱼，8 月 1 6日整体消毒处理，8 月 1 9日前以基础饲料预饲，8 月 1 9日开始 正式饲喂试验。同时根据鱼的抢食情况确定每日每组投料量，准确称取饲料， 分三次投喂:上午 6 :3 0 一 7 :30 ，中午 1 :3 0 一 2 :30，下午 7 :30一 8 :30。每 日测定水温， 每周测定水质。 试验结束时将各组鲤鱼分别称重， 计算增重情况、 料肉比等指标，综合评价各试验组和对照组之间的差距。 表2水库鲤鱼试验基础日粮组成及营养水平 原料实验组 1实验组 2实验组 3实验组 4 大豆粕 小麦 菜粕 棉粕 啤酒糟 麦鼓 进口鱼粉 碳酸钙 磷酸二氢钙 食盐 膨润土 氯化胆碱 添加剂 粗蛋白 ( %) l 一lys( %) 消化能 dl 一 me t( %) ca( %) p ( % ) 21 . 4 2 3 . 8 1 6 . 0 8 刀 8 . 0 6 . 0 1 0 . 0 0 . 2 l5 0 . 3 35 1 9 . 6 2 2 . 6 1 6 . 0 8 . 0 8 . 0 6 . 0 1 0 . 0 0 . 2 l5 03 3 . 5 0 . 3 1 . 0 3 0 . 0 145 2 7 8 0 . o me a l / k g 0 . 5 0 6 1 . 0 0 . 5 8 2l 2 4 . 1 1 60 8 . 0 8 ， 0 6 . 0 1 0. 0 0 . 2 1 . 5 0 . 3 35 0 . 3 1 ， 0 3 0. 0 1 . 4 5 2 7 8 0 . o me a l /k9 0 . 5 0 6 1 . 0 0 . 5 8 1 96 j刀0 2216色 8 一 0 03 1 . 0 3 0 . 0 1 . 4 5 2 7 8 0 . o me a l /k9 0. 5 0 6 1 . 0 0 一 5 8 6. 0 1 0 . 0 0 . 2 1 . 5 0 . 3 3 . 5 o3 1 . 0 3 0 刀 1 . 4 5 2 7 8 0 刀 me a l / k g 0. 5 0 6 1 . 0 0 一 5 8 注:饲料中添加的维生素由巨星公司提供。 结 果 与 分 析 1 .光合细菌分离、纯化和鉴定的结果 1 . 1 光合细菌的分离、纯化 1 . 1 . 1光合细菌富集 17个样品采集地点和采集时间见表3 ， 分别编号为s c01 s c o 7 和s x ol s x l o 。微生态实验室保存菌种 2 株，分别为ws t z i 和 ws t 2 2 . 分三次投喂:上午 6 : 3 0 - 7 : 3 0，中午 l : 3 0 - 2 : 3 0 ，下午 7 : 3 0 - 8 : 3 0 。每 日测定水温， 每周测定水质。 试验结束时将各组鲤鱼分别称重， 计算增重情况、 料肉比等指标，综合评价各试验组和对照组之间的差距。 表2水库鲤鱼试验基础日粮组成及营养水平 原料实验组 1实验组 2实验组 3实验组 4 大豆粕 小麦 菜粕 棉粕 啤酒糟 麦鼓 进口鱼粉 碳酸钙 磷酸二氢钙 食盐 膨润土 氯化胆碱 添加剂 粗蛋白 ( %) l -l y s( %) 消化能 dl - me t( %) ca( %) p ( % ) 21 . 4 2 3 . 8 1 6 . 0 8 . 0 8 . 0 6 . 0 1 0 . 0 0 . 2 1 . 5 0 . 3 3 . 5 1 9 . 6 2 2 . 6 1 6 . 0 8 . 0 8 . 0 6 . 0 1 0 . 0 0 . 2 1 . 5 0 . 3 3 . 5 0 . 3 1 . 0 3 0 . 0 1 . 45 2 7 8 0 . o me a l / k g 0 . 5 0 6 1 . 0 0 . 5 8 21 2 4 . 1 1 6 . 0 8 . 0 8 . 0 6 . 0 1 0. 0 0 . 2 1 . 5 0 . 3 3 . 5 0 . 3 1 . 0 3 0. 0 1 . 4 5 2 7 8 0 . o me a l / k g 0 . 5 0 6 1 . 0 0 . 5 8 1 9 . 6 j刀0 2216色 8 . 0 0 . 3 1 . 0 3 0 . 0 1 . 4 5 2 7 8 0 . o me a l / k g 0. 5 0 6 1 . 0 0 . 5 8 6. 0 1 0 . 0 0 . 2 1 . 5 0 . 3 3 . 5 0 . 3 1 . 0 3 0 刀 1 . 4 5 2 7 8 0 . o me a l / k g 0. 5 0 6 1 . 0 0 . 5 8 注:饲料中添加的维生素由巨星公司提供。 结 果 与 分 析 1 .光合细菌分离、纯化和鉴定的结果 1 . 1 光合细菌的分离、纯化 1 . 1 . 1光合细菌富集 1 7 个样品采集地点和采集时间见表3 ， 分别编号为s c 0 1 - s c 0 7 和s x 0 1 s x 1 0 。微生态实验室保存菌种 2 株，分别为ws t 2 1 和 ws t 2 2 0 表 3 光合细菌样品采集时间、地点详表 样品编号采集地 点采集时间 2 0 0 2. 1 . 3 2 0 0 2. 1 . 3 2 0 0 2 . 1 . 3 2 0 0 2 . 1 . 3 2 0 0 2 . 1 . 3 2 0 0 2 . 1 . 3 2 0 0 2 . 1 . 3 2 0 0 2 . 2 . 2 0 2 0 0 2 . 2 . 2 0 2 0 0 2 . 2 . 2 0 2 0 0 2 . 2 . 2 0 2 0 0 2 . 2 . 2 0 2 0 0 2 . 2 . 2 0 2 0 0 2 . 2 . 2 0 2 0 0 2 . 2 . 2 0 2 0 0 2 . 2 . 2 0 2 0 0 2 . 2. 2 0 样 品概况 s c 01 s c 0 2 s c 0 3 s c 0 4 s c 0 5 s c 0 6 s c 0 7 s x 01 s x 0 2 s x 0 3 s x 0 4 s x 0 5 s x 0 6 s x 0 7 s x 0 8 s x 0 9 s x1 0 消江1 9 栋家属楼 外宾楼外水渠 外宾楼外水渠 川农牛场水源上游 新校区清江桥下 新校区清江桥下 川农校内操场边污水沟 段店乡东王村水田2 澡堂污水2 纺织厂生活区2 造纸厂后墙角2 云鹏药业排水口2 段店乡段店村生活污水2 西关汾河郊污水2 二建工地汾河水2 段店乡东王村河水2 段店乡东王村河水污泥2 生活污水， 水色灰色有臭味 牛场排放的污水， 水色较浅 牛场排放的污水沉积的污泥 某厂排出的污水， 有恶臭味 消江河水， 水色浅 消江河内的污泥， 土黄色 试验室以及生活污水， 有臭味 小麦根际土壤， 土质半疏松， 褐黄色 有臭味， 泥为黑色， 水色较浅， 灰色 水色黑色， 有恶臭味， 有灰黑色沉淀 纯黑色， 并将周围树叶染黑 由工业污水浸成的污泥 水色浅绿， 泥有绿色， 味微臭 水呈绿色， 有恶臭气味 水为绿色， 恶臭 水色浅， 略带绿色， 有异味 泥为灰色， 略带土黄色 注:1 代表在四川省雅安市雨城区采集，2 代表在山西省临汾市尧都区采集 以上所采集到的光合细菌样品均是采自污水或污泥以及土壤， 原因是光合 细菌在污水或污泥中存在的可能性很大， 大多数光合细菌都是存在于生物耗氧 量 ( b o d ) 5 和化学耗氧量 ( c o d )高的地方。将以上 1 7个样品富集培养得 到 1 7 个光合细菌样品，连同实验室保存的2 个，共 1 9 个样品. 1 . 1 . 2光合细菌分离 光合细菌经过固体培养基分离纯化，从 1 9株光合细菌中各分离到两种菌 落形态不同的细菌，其中一种菌落形态大标记为 1 ，另一种菌落形态小，标记 为2( 例如:从s c 0 1 样品分离出的两株光合细菌分别编号为s c l l 和s c l 2 ) o 1 . 1 . 3 光合细菌纯化 将分离得到的3 6 株细菌用固体分离培养基继续纯化。在分离平板上分离 到的单菌落没有光合细菌特有的红色或粉红色，大多数都是乳白色或淡黄色， 将这些细菌重新接入液体培养基中， 筛选到8 株能够保持快速生长的活性和特 有颜色的光合细菌，分别是 ws t 2 2 , s c 2 1 , s c 4 2 , so2, s x 5 l , s x 5 2 , s x 9 1 , s x 9 2 o 1 . 2 光合细菌的鉴定 1 . 2 . 1光合细菌吸光度检测 测定 8 株光合细菌培养液在不同波长的吸光度，检测结果见表 4 0 表 4 w s t 2 2 0. 7 6 5 0. 7 48 0 . 7 2 3 0 . 7 0 7 0 . 6 9 3 0 . 6 8 2 0 . 6 9 7 0 . 7 8 3 0 . 9 3 5 0 . 7 9 2 0 . 7 0 8 0 . 7 4 4 0 . 8 8 1 . 0 9 8 株光合细菌不同波长( n m ) 吸光度值 波 长 6 6 0 6 8 0 7 0 0 7 2 0 7 4 0 7 6 0 7 8 0 7 9 0 8 0 0 81 0 8 2 0 8 3 0 8 4 0 8 5 0 8 6 0 8 x 5 1 0 . 4 21 0 . 5 0 4 0 . 3 7 8 0 . 3 5 7 0. 3 4 5 0. 3 2 9 0 . 3 1 9 0 . 3 3 2 0 . 3 7 0 . 3 6 2 0 . 31 5 0 . 3 0 8 0 . 3 2 4 0 . 3 7 5 s x 91 0 . 5 0 6 0 . 4 7 6 0 . 4 4 8 0 . 4 2 0 . 4 0 7 0 . 3 8 9 0 . 3 7 4 0 . 3 7 7 0 . 3 8 3 0. 3 6 2 0. 3 4 2 : : 0 . 3 9 4 0 . 4 9 4 s c 4 2 0 . 6 9 5 0. 6 7 7 0. 6 5 2 0 . 6 3 6 0 . 6 2 5 0 . 6 2 6 0 . 6 6 4 0 . 7 6 7 1 . 0 7 1 0 . 9 8 2 0 . 7 0 6 0. 6 7 8 0 . 7 9 9 1 . 0 9 3 1 . 2 4 s c 6 2 0 . 9 7 4 0 . 9 5 4 0. 9 2 0. 8 9 4 0 . 8 7 3 0 . 8 7 0 . 8 91 0 . 9 8 3 1 . 3 41 1 . 3 5 9 0 . 98 0 . 8 9 0 . 9 5 7 1 . 1 2 7 1 . 4 8 x 9 2 0 . 4 2 8 0 . 4 0 3 0 . 3 7 7 0 . 3 5 9 0 . 3 4 8 0 . 3 3 7 0 . 3 4 6 0. 3 8 7 0 . 4 3 0. 3 5 8 0 . 3 3 5 0 . 3 3 3 0 . 3 6 3 0 . 4 4 0 . 5 6 8 s c 21 0 . 5 3 4 0 . 5 0 4 0 . 48 0 . 4 61 0 . 4 4 8 0. 4 3 8 0. 4 4 7 0 . 5 0 . 6 5 4 0 . 6 9 2 0 . 4 7 8 0 . 4 3 8 0 . 4 7 2 0 . 5 8 3 0 . 7 9 3 s x 5 2 0. 8 7 6 0. 8 4 4 0. 8 28 0 . 8 0 3 0 . 7 9 0 . 7 7 3 0 . 7 7 2 0 . 7 9 9 0 . 8 5 8 0 . 8 0 5 0 . 7 7 5 0 . 7 9 2 0 . 8 5 8 0 . 9 7 2 1 . 0 0 3 n目0 注: “ 一”表示没有吸光度值 为了直观表达 8株细菌的吸光度结果，按照上表的数据绘制波长一 吸光度 曲线， 见图1 。 所分离到的细菌在8 0 0 n m处有吸收峰， 而且在 8 6 0以上还有吸 收峰的存在。 光合细菌各菌种不同波长吸收峰 .一一 8 x 5 1 w s t 2 2 一 s x 9 1 s c 4 2 s c 6 2一 s x 9 2一 s c 2 1 s x 5 2 恻00侧来督 波长( n m ) 图1 :不同光合细菌在不同波长下的波长一 吸光度曲线 1 . 2 . 2 光合细菌菌落形态观察、镜检和叶绿素检测 将分离纯化的8 株光合细菌在固体平板上培养， 观察菌落形态， 色， 光学显微镜下观察细菌的染色特征、 菌体形态并测定菌体大小。 细菌所含叶绿素种类，检测结果见表 5 。 革兰氏染 然后测定 镜检结果显示，大多数细菌都呈卵圆形到杆状的菌体形态，其中 s x 5 2 , s x 9 1 s c 2 1 s x 5 1 s c 但是s c 4 2 , s x 5 2等菌体形态相似但大小不同。结合表 5的观察结果， 文献的鉴定方法，鉴定结果为:s c 4 2 , ws t 2 2为沼泽红假单胞菌，s x 5 2 膜红假单胞菌，s c 2 1 和s x 5 1 为万尼氏红微菌。其余3 株细菌不能鉴定。 参照 为荚 表5 忿 株光合细菌形态观察和叶绿素种类 菌种 编号 革兰氏 染色 细胞 大小 ( r m) 细胞形态 液体培养 生长状态 有无培养 颜色 叶绿素 种类 w s t 2 2一1 . 8 士0 . 3 卯形或球形细胞单个存在 内含物 有不染 色部位 桔黄色a s c 21 球状:1 3士0 . 3 杆状: 0 . 8 - 1 . 0 x 1 . 5 - 有的两个连在 杆状或球形一起， 有的细胞无浅红色a 1 . 9 排成一排。 s c 4 22 . 3 士0 . 2 卵形 ( 有的 为弧形 ) 无红棕色a s c 6 2十1 . 6 士0 . 5 球形或卵形 有不染 色部位 粉红色a sx 5 11 . 0 士0 . 1 卵形 大部分细胞簇 集在一起， 少数 单个存在 有的细胞两个 连在一起 大小均匀， 个别 细胞长杆状 无浅红色a sx 5 2 球状:1 . 0 土0 . 2 杆状: 1 . 0 - 1 . 2 x2 . i - 2 . 6 细胞大小不均 杆状或球状匀， 个别细胞很无 长 深红色a s x 9 1 1 . 0 - 1 . 2 义 2 . 0 - 2 . 1 杆状 细胞有些分散 均匀， 大部分形 状不规则 细胞有些分散 均匀， 大部分形 浅红色 无桔黄色a s x 9 2 1 , 0 - 1 . 2x 2 . 0 - 2 . 1 杆状 无深红色a 一一一一一一一一-一一一一一一一_ 一 _ 一_ . 2 .光合细菌抑菌试验 牛津杯法检测8 株光合细菌的全菌液、 菌体和代谢产物对两种致病性细菌 的抑菌效果，检测结果见表 6 0 表 6 光合细菌抑菌圈直径 ( m m) 菌种大肠杆菌 代谢产物原 菌液菌体原菌液 沙门氏菌 代谢产物菌体 w s t 2 22 9 . 0 士2 . 0 s c 21 3 0 . 0 士2 . 0 1 7 . 0 士 1 . 0 s c 4 22 0 . 0 士3 . 0 2 0 . 0 士 1 . 0 2 0 . 0 士1 . 0 1 1 . 0 士2 . 0 sc 6 22 0 . 0 士2 . 0 1 5 . 0 士1 . 0 1 2 . 0 士 1 . 0 2 0 . 0 士2 . 0 2 0 . 0 士 1 . 0 1 4 . 0 士3 . 0 sx 5l1 8 . 0 士 1 . 0 sx 5 2 1 5 . 0 士1 . 0 1 5 . 0 士1 . 0 s x 91 s x 9 2一一_ 注: 一 代表没有抑菌圈 从表6结果可以看出，ws t 2 2 , s c 2 1 , s c 4 2 , s x 5 1 这4 株光合细菌对致病 性大肠杆菌和沙门氏菌有抑菌效果。 其中 s x 5 1 和 s c 4 2 对两种致病菌都有较好 的抑制作用，w s t 2 2只对大肠杆菌有较好的抑制作用，s c 2 1只对沙门氏菌有 较好抑制作用， 其余菌株对致病菌的作用效果很不明显或者根本没有作用， 所 以本试验选择 ws t 2 2 , s c 2 1 , s c 4 2 , s x 5 1 作进一步研究。 3 .光合细菌安全性检测 3 . 1 灌胃试验 将所筛选到的4 株光合细菌 ( ws t 2 2 . s c 2 1 . s c 4 2 . s x 5 1 )作为试验组的 应用菌种，进行安全性检测， 试验结束后，解剖小鼠，观察内脏器官情况，照 片见附图。 从照片中， 我们可以看到试验组小鼠的腹腔和胸腔均无异常情况出现， 肺 脏、心脏、肝脏、消化道、胸腺和脾脏与对照组相比，没有肉眼可见的病变， 说明这 4 株光合细菌对小鼠无毒、副作用，安全性检测合格. 3 . 2自 吸试验 同样采用上面的4 株光合细菌进行自吸试验 ( 1 )记录各组小鼠试验期间饮用光合细菌菌液量， 对照组饮用自 来水量 结果见表 7 0 表 7 各组小鼠饮用水量 ( m l ) 日期 s c 4 2sc 21w s t 2 2 s x 51对照组 4. 1 0 -1 52 5 8 2 4 73 2 93 5 8 4. 1 6 -2 02 6 7 2 6 32 4 22 6 3 4 . 21 - 2 53 0 32 3 62 3 92 5 9 4 . 2 6 - - 3 02 8 32 3 02 8 22 6 8 5 . 1 -5 . 73 8 03 5 73 5 53 3 7 总计 1 5 911 3 8 31 4 5 31 4 5 7 36tl9t25(24:34(46 c 2 )试验期间每三天称重一次，各组小鼠平均体重见表 8 . 表8 试验各组小鼠平均体重 ( 妒 日期 4 . 1 1 4 . 1 4 4 . 1 7 s c 4 2s c 21w s t 2 28 x 51 对照组 3 0 . 1 2 士4 . 3 1 2 8 . 9 0 士5 . 3 1 2 5 . 8 7 士4 . 1 3 3 0 . 9 9 士4 . 9 1 3 0 . 9 9 士5 . 8 4 2 6 . 0 2 士5 . 4 2 3 1 . 6 9 士4 .