（生态学专业论文）日本伏翼pipistrellus+abramus种群遗传学研究.pdf

2 0 1 1p h dd i s s e r t a t i o n s c h o o lc o d e ：1 0 2 6 9 s t u d e n tc o d e ：5 2 0 7 1 3 0 0 0 3 3 e a s tc h i n an o r m a l u n i v e r s i t y p o p u l a t i o ng e n e t i c ss t u d yo nt h ej a p a n e s ep i p i s t r e l l e ，p i p i s t r e l l u s a b r a m u s ( c h i r o p t e r a ：v e s p e r t i l i o n i d a e ) a c a d e m y ：墅! 鳗兰! 堕! 壁sf o ra d v a n c e d 坠f 婴至婴亘s 亘里l i n a r yr e s e a r c h m a j o r ：e c o l o g y r e s e a r c hd i r e c t i o n ：幽囤幽u l a re c o l o g y t u t o r ： 里r q es h u z h a n g p h dd e g r e es t u d e n t l iw e i m a y , 2 0 1 1 华东师范大学学位论文原创性声明 郑重声明：本人呈交的学位论文日本伏翼( p i p i s t r e l l u sa b r a m u s ) 种群遗传学研 究，是在华东师范大学攻读硕d = 博士( 、) 学位期间，在导师的指导下进行的 研究工作及取得的研究成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他 个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体， 均已在文中作了明确说明并表示谢意。 作者签名： 华东师范大学学位论文著作权使用声明 日本伏翼( p i p i s t r e l l u sa b r a m u s ) 种群遗传学研究系本人在华东师范大学 攻读学位期间在导师指导下完成的硕士博士( ) 学位论文，本论文的研究成果 归华东师范大学所有。本人同意华东师范大学根据相关规定保留和使用此学位论 文，并向主管部门和相关机构如国家图书馆、中信所和“知网”送交学位论文的印 刷版和电子版；允许学位论文进入华东师范大学图书馆及数据库被查阅、借阅； 同意学校将学位论文加入全国博士、硕士学位论文共建单位数据库进行检索，将 学位论文的标题和摘要汇编出版，采用影印、缩印或者其它方式合理复制学位论 文。 本学位论文属于 ( ) 1 经华东师范大学相关部门审查核定的“内部”或“涉密”学位论文事， 于年月日解密，解密后适用上述授权。 ( ) 2 不保密，适用上述授权。 导师签名 劲? ，晕乞a2 - = ：童左博士学位论文答辩委员会成员名单 姓名职称单位备注 钟扬教授复旦大学主席 王升跃教授国家人类基因组南方研委员 究中心 ， 朱瑞良教授华东师范大学委员 王天厚教授华东师范大学委员 陈小勇教授华东师范大学委员 摘要 摘要 相对于欧洲和北美洲，第四纪冰川时期的气候变化对亚洲生物群落的分布和 遗传结构形成的影响的研究报导至今还很少。在冰川后期的种群扩张期间，地理 屏障对某个物种的扩散能力的促进或限制的作用同样对其种群遗传结构有重要 的影响。日本伏翼( p i p i s t r e l l u sa b r a m u s ) 在中国大陆、海南岛和舟山群岛等很 多地理区域都有分布。近些年来，由于生态环境的严重破坏以及城乡建设的快速 发展，对于盎要栖息于居民老房里的翼手目动物类群，如日本伏翼，在某些地区 其种群数量急剧下降。遗传多样性是种群长期生存繁衍和抵御疾病等外界胁迫的 基础，种群数量的演变历史对种群的保护有很重要的指导作用。我们对日本伏翼 的遗传多样性以及种群间的基因流动等方面进行研究，可以使我们能更全面了解 日本伏翼的生存现状及其种群历史演替情况，并制定正确的、合理的动物保护措 施。 本文运用线粒体d n a 和微卫星d n a 两种不同分子遗传标记对日本伏翼分 布于国内的1 7 个地理种群的种群遗传结构及其种群历史情况进行研究。其结果 如下： 1 、以富集法首次构建了日本伏翼微卫星d n a 文库，共筛选出微卫星引物 1 0 对。以这1 0 对引物分别扩增广西桂林的日本伏翼种群3 7 份个体d n a 样品， 结果显示，每对引物扩增条带均呈现出多态性，所有微卫星位点的平均等位基因 数达到1 0 个，范围在7 1 3 个不等。杂合度观测值和期望值范围分别为0 4 8 6 - - 0 9 7 1 和0 7 5 2 - - 0 8 7 6 。分析发现，3 个微卫星位点( w w 6 、p a l 3 3 和1 - 2 0 ) 偏 离了哈迪温伯格平衡，但没发现任何2 个位点存在连锁不平衡。成功筛选出这 些微卫星位点对促进日本伏翼及本属其他物种的种群遗传结构深入研究有重要 的作用。 2 、线粒体d n a 数据和微卫星d n a ( 8 对位点引物) 数据共同表明，日本 伏翼的不同地理种群均具有较高的遗传多样性。种群遗传多样性主要指标的变化 范围较大，线粒体d n a 单倍型多样性( h ) 为0 2 8 6 0 9 ，核苷酸多样性( n ) 为0 0 0 0 2 5 - 0 0 1 8 7 8 ：微卫星d n a 的种群杂合度观测值( h o ) 为0 5 8 - - 0 8 9 ， 摘要 杂合度期望值( h e ) 为0 6 7 - - 0 8 2 ，种群的平均等位基因丰富度为4 1 3 - - 1 0 3 6 。 3 、以两种分子遗传标记对1 7 个种群的研究结果共同说明，自然地理环境对 日本伏翼种群结构的连续性产生明显的影响。更重要的是，这两种标记的结果都 揭示，横亘在海南岛和中国大陆间的琼州海峡对日本伏翼的基因流产生显著的阻 隔作用。同时，在两种遗传标记的结果中，所有种群的遗传距离与地理距离均呈 显著相关( 线粒体d n a ，r 2 = 0 2 7 ，p 0 0 0 1 ；微卫星d n a ，r 2 = 0 3 1 ，p 0 0 0 1 ) 。 4 、线粒体d n a 序列单倍型的错配分布分析( m i s m a t c hd i s t r i b u t i o n ) 说明， 自第四纪冰期以来，大陆舟山群岛日本伏翼种群和海南岛的日本伏翼种群都经 历了种群扩张事件，且前者在t c s 的基因网络分析中呈现星状拓扑结构。线粒 体d n a 分析结果揭示，在相互隔离7 0 0 0 9 0 0 0 年后，大陆与舟山群岛日本伏翼 种群问仍能检测到共同祖先单倍型，不过，海南岛与大陆相互隔离的时间虽然也 在1 0 0 0 0 年左右，但海南岛日本伏翼种群内没能检测到共享单倍型，说明没有发 现共同的祖先或通过近期种群扩张而来。 5 、微卫星d n a 数据分析结果并没有完全支持线粒体d n a 数据的分析结果， 反之，发现在大陆舟山群岛日本伏翼种群和海南岛日本伏翼种群间存在一些差 异( 见结果部分) ，进一步说明了只有综合运用不同分子标记对种群遗传空间尺 度进行分析，才能更为准确和有效地评价物种种群遗传结构及其种群历史演化情 况。 本文运用了线粒体d n a 和微卫星d n a 两种不同的分子标记比较分析了日 本伏翼不同种群的遗传特征与地理分布的关系，为进步研究该物种的谱系地理 学特征奠定了基础。 关键词：翼手目，日本伏翼，细胞色素b ，种群结构，扩散，微卫星，多态性 i i 摘要 a b s t r a c t c o m p a r e dt oe u r o p ea n dn o r t ha m e r i c a , t h ei n f l u e n c eo fc l i m a t i co s c i l l a t i o n s d u r i n gt h ep l e i s t o c e n ei ns h a p i n gt h ed i s t r i b u t i o na n dg e n e t i cs t r u c t u r eo fb i o t ai na s i a i sn o tw e l lk n o w n t h ei n f l u e n c eo fg e o g r a p h i c a lb a r r i e r si np r o m o t i n go rr e s t r i c t i n g t h ed i s p e r s a la b i l i t yo fa s p e c i e sd u r i n gp o s t g l a c i a le x p a n s i o n sw i l la l s oh a v eal a r g e i m p a c to ni t sp o p u l a t i o ng e n e t i cs t r u c t u r e t h ej a p a n e s ep i p i s t r e l l eb a t ，p i p i s t r e l l u s a b r a m u s ，i sf o u n do v e raw i d er a n g ei nc h i n a , i n c l u d i n gh a i n a ni s l a n da n dt h e z h o u s h a na r c h i p e l a g o r e c e n t l y , i ns o m ea r e a s ，t h en u m b e ri n d i v i d u a l so fs o m eb a t s p e c i e sh a v ed r a m a t i c a l l yb e e ni nd e c l i n ed u et os e r i o u s l yd e s t r u c t i v ee c o l o g i c a l e n v i r o n m e n ta n df a s td e v e l o p m e n to ft o w n s g e n e t i c d i v e r s i t yi s t h e b a s i so f p o p u l a t i o nl o n g t e r ms u r v i v a la n dr e s i s t i n gt h ed i s e a s e s d e m o g r a p h i ch i s t o r y a n a l y s i si sv i t a lt op o p u l a t i o np r o t e c t i o n i no r d e rt oc o m p r e h e n s i v e l yu n d e r s t a n d s u r v i v a ls t a t u sa n dd e m o g r a p h i ch i s t o r ya n de s t a b l i s ha c c u r a t ep r o t e c t i o n s t e p sf o r p i p i s t r e l l u sa b r a m u s ，i tp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei ne s t i m a t i o no fg e n e t i cd i v e r s i t ya n d g e n ef l o wb e t w e e np o p u l a t i o n s w ea p p l i e db o t hm i t o c h o n d r i a l ( c y t o c h r o m e6 ) a n dm i c r o s a t e l l i t em a r k e r st o e x a m i n ep o p u l a t i o ng e n e t i cs t r u c t u r ea n dd e m o g r a p h i ch i s t o r yi nt h i s s p e c i e s t h e m a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 w ed e s c r i b et h ef i r s ts e to ft e nm i c r o s a t e l l i t em a r k e r si s o l a t e di np i p i s t r e l l u s a b r a m u s t h en u m b e ro fa l l e l e sp e rl o c u sr a n g e df r o m7t o13 t h eo b s e r v e da n d e x p e c t e dh e t e r o z y g o s i t i e sv a l u e sr a n g e df r o m0 4 8 6t o0 9 7 1a n df r o mo 7 5 2t oo 8 7 6 ， r e s p e c t i v e l y t h r e el o c i ( w w 6 、p a l 3 3a n d l - 2 0 ) r e v e a l e ds i g n i f i c a n td e p a r t u r ef r o m h a r d y w e i n b e r ge q u i l i b r i u ma n dn ol i n k a g ed i s e q u i l i b r i u mw a sf o u n db e t w e e nl o c i p a i r s t h e s ei n f o r m a t i v em i c r o s a t e l l i t em a r k e r sw i l lb eap o w e r f u lm o l e c u l a rt o o lf o r i i i 摘要 s t u d y i n gt h ep o p u l a t i o ng e n e t i cs t r u c t u r eo fpa b r a m u s ，a sw e l la so t h e rs p e c i e so f t h i sg e n u s 2 b o t hr e s u l t so fm t d n aa n dm i c r o s a t e l l i t ed n a ( 8l o c i ) r e v e a l e dp i p i s t r e l l u s a b r a m u sc o n t a i n r e l a t i v e l yh i 曲g e n e t i cd i v e r s i t i e sa m o n gd i f f e r e n tg e o g r a p h i c p o p u l a t i o n s f o rt h em r o c h o n d r i a ld n a ( m t d n a ) d a t a ，t h eh a p l o t y p ed i v e r s i t y r a n g e df r o m0 2 8 6t o0 9 ， a n dn u c l e o t i d ed i v e r s i t yr a n g e df r o m0 0 0 0 2 5t o0 018 7 8 f o rt h em i c r o s a t e l l i t ed a t a ，t h eo b s e r v e dh e t e r o z y g o s i t y ( h o ) a n de x p e c t e d ( h e ) h e t e r o z y g o s i t yr a n g e df r o m0 5 8t o0 8 9a n df r o mo 6 7t oo 8 2 ，r e s p e c t i v e l y t h e a l l e l i cr i c h n e s s ( r s ) r a n g e df r o m4 1 3t o1 0 3 6a m o n gs a m p l e dp o p u l a t i o n s 3 o u rr e s u l t ss u g g e s tt h a tg e o g r a p h i c a lf e a t u r e sh a v eh a dac l e a ri m p a c to n p o p u l a t i o nc o n n e c t i v i t yi npa b r a m u s s p e c i f i c a l l y , b o t l lm a r k e r si n d i c a t et h a tt h e q i o n g z h o us t r a i t ，w h i c hs e p a r a t e sh a i n a ni s l a n df r o mt h ec h i n am a i n l a n d ，a c t sa sa s i g n i f i c a n tb a r r i e rt og e n ef l o w l i k e w i s e ，b o t hg e n e t i cd i s t a n c eo fm t d n aa n d m i c r o s a t e l l i t ed n aw e r es i g n i f i c a n tw i t hn a t u r a l g e o g r a p h yd i s t a n c e ( m t d n a , r 2 = o 2 7 ，p 曼訾o霉鬈鼎! z 。u 卜最 ir日iijoiin r i _ i 嵌 趸ii宝lx r 1 1 胀 基焉肖q r 1 1 扫量i n o 蓑堪蛊悬磊嫩q 磊葡虿一)(繇厦 su盘n人警删暑iin璐饭孓u!，i婚婴ii墨自盘雪趟嫌恕isotlq舻躁暴 勺写isi窝iij矗曰怔嫩。警一odi号之磊嚼君舀曰枯r11枣墨iio尝uou坦k 暑u=山巡蝌 嚣u一毛oz谜嚣 ii唧疃夹聿 咨一一80，i簧女卓米 鑫jv餐凶 矗d吕舌苔oiou伞芒毽毒 _rbhh四ito时q h i i 寸o；习弓一一_)uh-o口oh葛oo一蹦iiiiq【il碡 搽梏求舞婪米匠导牛秣摹将皿 i n 懈 i乙。一ql工 燃椒坷宴葵料躲 第三章结果 第三章结果 第一节日本伏翼微卫星位点的筛选与结果 一、基因组d n a 的提取 通过按照基因组提取说明书的方法和步骤进行操作，得到4 只( s h 0 3 、s h 0 6 、 s h 0 7 、s h l 0 ) 日本伏翼肌肉组织的总基因组d n a 。用l 的琼脂糖凝胶进行电 泳检测，结果如图3 1 所示，说明电泳结果显示了很好的提取效果。 图3 1 日本伏翼肌肉组织基因组d n a 电泳检测结果 f i g 3 - 1 g e n o m i cd n ao f p i p i s t r e l l u sa b r a m u sm u s c l et i s s u ed e t e c t e db y1 a g a r o s e g e l 二、基因组d n a 的酶切及其酶切片段回收 将以上提取到的4 只蝙蝠肌肉组织d n a 样品等体积混合后用限制性内切酶 m b oi 在3 7 水浴锅进行过夜酶切。用1 的琼脂糖凝胶进行电泳检测，呈现一 定范围大小的d n a 片段连续图谱，显示酶切完全，如图3 2 所示。 第三章结果 图3 2 总基因组d n a 经内切酶m o bi 酶切后的电泳检测结果 f i g 3 2 m o b id i g e s t i o np r o d u c t i o no fg e n o m i cd n ad e t e c t e db y1 a g a r o s eg e l 三、酶切产物加l i n k e r 接头后的p c r 扩增 酶切产物在两端加上l i n k e r 接头后在1 6 c 环境下进行过夜连接。之后以单 条s a u l a 为引物进行连接产物p c r 扩增，用1 的琼脂糖凝胶进行电泳检测， 结果显示以连接产物为1 0 m 的体系扩增，其效果最佳，在3 0 0 9 0 0 b p 目的区域 有明显的弥散亮带。把3 0 0 9 0 0 b p 目的凝胶区域切下，进行回收纯化，得到s a u l a 扩增产物，如图3 3 。 图3 3 以s a u l a 为引物对加l i n k e r 接头后的酶切产物进行p c r 扩增电泳检 测结果 f i g 3 3 p c rp r o d u c t i o no fg e n o m i cd n af r a g m e n t sl i g a t e dw i t hl i n k e r sa m p l i f i e d 第三章结果 w i t hp r i m e rs a u la 四、杂交和洗脱后单链特异性片段的再次p c r 扩增 将s a u l a 扩增产物进行变性，经过与带有生物素( a c ) n 重复探针杂交并 洗脱后得到单链特异性片段。再次以s a u la 为引物，对单链特异性片段进行 p c r 扩增，得到双链特异性片段d n a ，此p c r 产物含有丰富的目的微卫星片段。 如图3 - 4 所示，单链d n a 为2 2 5 肛l 的体系扩增效果最佳。 图3 4 单链特异性d n a 片段的p c r 扩增电泳结果 f i g 3 4 p c rp r o d u c t i o no f t a r g e ts i n g l es t r a n dd n aa m p l i f i e d 谢t hp r i m e rs a u l a 五、阳性白斑克隆鉴定 双链特异性片段d n a 以p m d l 9 v e c t o r 为载体进行质粒连接，连接产物以 t o p l 0 感受态细胞进行转化，在含有l b 培养基的培养皿上置于3 7 恒温培养箱 里过夜培养生成阳性白斑。将阳性白斑挑选到含有4 0 0 1 上1 的l b 培养液的离心管 内，放在3 7 恒温水平摇床培养4 6 小时。以s a u l a 为引物或通用引物m 1 3 f ( 4 7 ) 和( a c ) l o 为引物进行克隆鉴定，如图3 5 所示，说明菌落有目的大小条带的白斑 的阳性克隆，并将其送到生物公司进行菌液测序。 第三章结果 图3 5 以m 1 3 f ( 4 7 ) 和( a c ) l o 为引物对白斑进行阳性克隆鉴定 f i g 3 - 5 c l o n i n gi d e n t i f i c a t i o no f w h i t e - p o s i t i v es p o t sa m p l i f i e dw i t i lp r i m e rm 1 3 f ( 4 7 ) a n d ( a c ) l o 六、引物设计与最优退火温度的梯度尝试 利用p r i m e rp r e m i e r 5 0软件或在线的p r i m e r 3 0 ( a h t t p ：f r o d o w i m i t e d u p r i m e r 3 o ) 程序在每个序列的重复区域核心区的两翼分 别设计上下游引物，共设计了1 0 对引物，并把引物序列发给生物公司合成。对 于每对引物，以混合的稀释的日本伏翼基因组d n a 为模板，采用梯度p c r 的方法 ( 温度范围为1 0 ) 尝试扩增，最终得到每对引物的最佳退火温度，如图3 6 。 然后在最佳退火温度上进行个体扩增尝试，确保引物的特异性并得知引物是否适 合用于种群扩增。 图3 - 6 引物设计后的梯度扩增尝试 f i g 3 - 6 g r a d i e n tp c ra m p l i f i c a t i o no fn e ws y n t h e s i z e dm i r o s a t e l l i t el o c u s 3 1 、参。 分 第三章结果 七、引物荧光标记和种群基因分型 确保1 0 对微卫星引物具有特异性后，将每对引物的上游引物5 末端进行荧 光修饰( f 枷，h e x 或t a m r a ) 。荧光引物合成后与其相对应的下游引物一起 对来自广西桂林的日本伏翼种群3 7 个样品进行基因分型，用g e n e s c a n3 7 或 g e n o t y p e r3 6 分析软件进行个体微卫星基因型判定，如图3 7 所示，导出并整理 数据，用g e n e p o p 3 3 软件分析了哈迪温伯格平衡( h a r d y w e i n b e r ge q u i l i b r i u m ， h w e ) 及基因连锁不平衡( 1 i n k a g ed i s e q u i l i b r i u m ，l d ) 、杂合度观测值( o b s e r v e d h e t e r o z y g o s i t y ) 、杂合度期望值( e x p e c t e dh e t e r o z y g o s i t y ) 、每对引物位点的等位 基因数目等有关种群遗传学参数( 表3 1 ) 。 从表3 1 上可以看出，1 0 对微卫星位点都具有多态性，平均每个位点数为 1 0 6 ，每个位点的等位基因数在7 1 3 个不等。在1 0 对位点中，杂合度观测值为 0 4 8 6 , - - - , 0 9 7 1 ，杂合度期望值为0 7 5 2 - - - , 0 8 7 6 ，说明了这些位点具有较高的多态 性。其中，位点w w 6 ( e u 6 6 1 7 7 4 ) 、p a l 3 3 ( e u 6 6 1 7 7 8 ) 和1 2 0 ( e u 6 6 1 7 7 9 ) 偏离了哈迪一温伯格平衡( p iqdo ：西一oo一焉 芝舀儡djo昌!jdjo d鲁董oagq蔷iirbq趸 誓册文毫叁qioj言d0一。卷piq。一。耋。葛2。一目go ii。一蒿苫_譬jbi：【o 1 【_ c o 一号_ 咔姆缎投掣嘲爿器璐$将曰h-c群 睬姆料捺 第j 章结果 第二节日本伏翼种群遗传学的分析结果 一、线粒体d n a 多态性分析 在1 7 个采样地点中，总共扩增了1 0 2 个个体日本伏翼线粒体d n a 序列( c y t b 基因) ，经过人工比对和校对后，其有效序列长度为1 1 2 2 b p ，并将这1 0 2 条c y t b 基因序列提交到基因库( 基因库序列号为g q 3 3 2 4 8 2 g q 3 3 2 5 2 9 ) 。通过d n a s p 软件分析，共产生特异的单倍型( h a p l o t y p e ) 序列2 7 条。在所有的线粒体d n a 序 列中，发现共有6 4 个可变位点，没发现有任何的插入和缺失位点出现。 在三个地理区域种群中，其平均单倍型多样性( h ) 为0 6 7 3 ，其中大陆区域 种群为0 6 3 6 士0 1 8 ，海南岛种群为0 6 3 9 - a ：0 1 9 ，舟山群岛种群为0 8 5 5 + 0 0 6 ( 表 3 2 ) 。在2 7 条单倍型序列中，有1 5 条是单位点变异( 占5 4 ) 。单倍型h l 和 单倍型h 2 为最常见的单倍型，其中单倍型h 1 在种群l 、种群4 到种群1 2 出现 分布( n = 2 9 ，2 8 ) ，单倍型h 2 在种群1 到种群3 、种群9 到种群1 2 ( 舟山群 岛种群) 中有分布( n = 1 7 ，1 6 ) ，且这两个单倍型在海南岛种群中没有分布， 而从海南岛种群产生的单倍型在大陆种群和舟山群岛种群没有出现。三个地理区 域种群的平均核苷酸多态性( 1 - i ) 为0 0 0 2 5 ，其中海南岛种群最低，为 0 0 0 1 1 + 0 0 0 0 9 ，舟山群岛种群次之，为o 0 0 1 2 a ：o 0 0 0 1 ，大陆种群最高，为 0 0 0 3 9 - a ：0 0 0 7 ( 表3 2 ) 。 3 5 n-tq_nhn ；寸ihn心nnh s n_nt q 寸t qnn寸hn 寸_ nn n _ _ 高 卜i n 心卜a - ni n 卜i n _ ni n nq n g nn 寸- n 卜a2=譬2=2 2 墨 心n 扫一-o一口。勺一_oqqtliir d 葛一o on o o o 0卜o _ 【o o oi 卜o o o on 寸n o o - 0n n o o o卜n【oo0卜一o 0西o o o o寸_ h o o on o o o 0 卜卜o o o o心c i o o o n 卜o 吨。 心0厶o 卜n o a 0 【0 婚o0 寸西o崎n on n 卜。卜口o 均心冀一 吨o n i o 寸_ 【n 吨_ 小n t _ 卜o i n 一 卜n i 谚n 0卜寸0 寸n n _ 【 。 oo口oi漕甚口o一au肖a -o0il_哥。苫 o=u一二cliogjo山 它q之doodci占。一(i时 iooi_ijil口ooj 搽通怕蚺 籁剥逛斟 唧将卖 伞g 枯嚣 h乙q一号怒。暑雳。暑警sj岩iijnii皇一80，i由盖u-o c i d n n h_【iio勺qp警zlf譬心毽警芒葚息铀oiio一苗鼍cioci全口一茸一一一d砖中意d一苗iioo“c q一号，工 匣罂忑懈奸伞芒枯霉嚣求掣昧锹啦璎g枯毒剐舞牛柑d般叩基器v累世圣口葚巢繇g占nn一_璐举将皿n糊昏n僻 眯姆褂捺 第三章结果 二、线粒体d n a 谱系分析( 系统发育分析) 通过p a u p4 0 和m r b a y e s3 1 对所有单倍型的序列进行邻接树( n j 树) 及 贝叶斯树的构建，我们发现两种树的构建结果相似，因此只以贝叶斯树代表线粒 体d n a 谱系分析结果( 图3 8 ) 。在谱系图中，有2 个明显的地理区域分支而且 有很好的树支支持率，在a 支中，包括了除了h 1 3 和h 1 4 ( 桂林的两个个体的 单倍型) 外，所有的单倍型都是来自大陆种群和舟山群岛种群的个体，反之，b 支中的单倍型来自所有的海南岛种群加上桂林的两个个体的单倍型( h 1 3 和 h 1 4 ) 。在我们的m s n 简约网状图中，同样发现有2 个分离明显的地理亚群，而 它们之间的隔离突变达3 5 次( m u t a t i o n a ls t e p s ) 之多( 图3 9 ) ，其中a 支显示 了以普遍分布的单倍型h 1 为中心的星状拓扑结构，而b 支虽然显示了相似的拓 扑结构，但没有以任何单倍型为中心的星状拓扑结构。 3 7 第三章结果 m a i n l a n dc h i n aa n d z h o u s h a na r c h i p e l a g o d u l e s i l i n y i w u h a n x i a n g t a n g s h a n g h a i 蒌囵z h o u s h a n a r c h i p e l a g o 三卜 h h ，1 6 7 d z h o u s h a na r c h i p e l a g o h 1 3 f 1 g u i i i n h 1 4l i h a i n a ni s l a n d 图3 8 基于线粒体d n a 序列的贝叶斯系统发育树分析，爪哇伏翼( p i p i s t r e l l u sc f j a v a n i c u s ) 作为树的外群 f i g 3 - 8 a5 0 c o n s e n s u s t r e ef r o ma b a y e s i a np h y l o g e n e t i ca n a l y s i s p i p i s t r e l l u s 巧j a v a n c u s w a su s e da st h eo u t g r o u p 3 8 r_囵日目囡囡目 1 2 3 嶂 5 6 竹 住 h h h h h 冲 h h h 3 4 5 6 o 1 2 7 舷 舫 屹 呦 呦 屹 图3 - 9 基于线粒体d n a 序列的单倍型网状进化关系图。颜色代表不同的种群地理区域：白 色，中国大陆；灰色，舟山群岛；黑色，海南岛 f i g 3 - 9 t c sh a p l o t y p en e t w o r kf o r 只a b r a m u s c o l o u r sr e p r e s e n td i f f e r e n tp o p u l a t i o nr e g i o n s w h i t e ：c o n t i n e n t a lc h i n a ；g r e y ：z h o u s h a na r c h i p e l a g o ；b l a c k ：h a i n a ni s l a n d 3 9 第三章结果 三、线粒体d n a 的种群结构与基因流 在线粒体d n a 中，全部s t 精确检测( g l o b a l e x a c tt e s t ) 表明了所有研究种 群间的遗传结构差异( 显著性差异水平为p 0 0 5 ) 。在所有的遗传距离矩阵中， 海南岛种群的遗传距离与大陆和舟山种群的遗传距离出现显著性差异( p 0 0 5 ) ，但在区域内的种群之f 日q ( a m o n gp o p u l a t i o n s w i t h i nr e g i o n s ) 和种群内个体之间( w i t h i np o p u l m i o n ) 水平上呈现了显著性的差 异( p 0 巍然0 5 ：p p 一0 5 ) 麓iia裟嚣)b嚣淼嚣240001 2 1 0 0 0 c i 前( 大约在 年前之间， 为9 5 ) ，b 进瞄又u 耳朋叫啊“ 絮豢冀慧嚣。篆2 2 = = 蒜i ：。蕊= ： b 两个进化支之间的分化时间大致在2 0 0 0 0 年丽l 灭爹一位“w u u 。0 “。“ 一e 薯p l 一0 b # 一e ，驴 _ i o b 0 3 - 1 1 日本伏翼在大陆舟山群岛种群( a ) 和海南岛种群( b ) 的错配分布情况 f i g 3 n m