护理开题报告范文.doc

.中图分类号： 单位代号： 密 级： 学 号： 本科实习论文题目: 内镜生物膜现状调研及手工刷洗效果的研究 作 者： 学科专业： 护理学 指导教师： 完成日期： 年月日 南通大学本科生实习论文开题报告课题名称内镜生物膜现状调研及手工刷洗效果的研究阅读文献情 况国内文献 15 篇开题日期年月日国外文献 10 篇开题地点南通大学护理学院（或实习医院）一 文献综述与调研报告：（阐述课题研究的现状及发展趋势，本课题研究的意义和价值、参考文献）随着内镜技术的飞速发展，通过内镜进行检查及治疗已广泛应用于临床。由于内镜属于重复使用的医疗器械，国家2004年颁布的内镜清洗消毒技术操作规范1参考文献只标注引用文献，只参考未引用的不标注。要求使用后的内镜必须按照要求经过高水平消毒合格后方能用于其它患者。高水平消毒主要分为清洗（水洗和清洗剂浸泡）和消毒两大步骤：水洗是通过手工刷洗的方法对内镜进行初步的清洁，清洗剂浸泡是通过清洗剂的灌流清除内镜生物负荷，高水平消毒是使用消毒剂进行灌流处理使之达到高水平消毒的效果。但由于临床内镜使用的高周转率、内镜本身结构精密度高、结构复杂、材质特殊，多数不耐高温、易腐蚀，使用后微生物和有机物残留，给使用后内镜的清洗、消毒带来困难，容易形成生物膜（Biofilm）。生物膜是微生物通过嵌入自身分泌的胞外多聚体物质（Extracellular Polymeric Substances，EPS第一次出现英文专有名词时在括号里写出全称，首字母缩写。后面再出现时直接写缩写。)而形成的不可逆的、紧密结合的结构群体，附着在有或无生命物体表面，并且表现为生长速率、基因转录和表型的改变2-4。由于生物膜对外界环境的抵抗力强，影响清洗消毒的效果，是造成消毒失败和患者感染的重要原因。第一步：首先阐述课题研究的范畴或是背景。 本开题报告即是在“内镜消毒和生物膜引起感染”这一范畴展开问题。国内外的医学专家、研究学者对生物膜已进行了大量的实验研究，现将与内镜生物膜清除相关的国内外研究概况叙述如下:接着写：目前该选题研究现状（文献综述）。文献综述可以包括以下内容：1、理论的渊源及演进过程；2、国内外有关研究的综述；3、本人对以上综述的评价。总之，是他人在你这个研究课题上做过哪些研究，得出什么观点，总结出什么方法，请你进行介绍。国外研究概况：1. 内镜生物膜相关感染日益受到重视，但缺乏统一明确的内镜清洗规范。近年来，各国纷纷出台内镜清洗消毒及感染控制的临床指南和规范5-12，社会、公众对于内镜清洗消毒失败的关注，也增加了临床内镜机构对于规范的遵从性、重视度10引用同一篇文献的，标号要一致。但是规范和指南对手工刷洗和清洗剂浸泡等具体步骤未能有明确的说明。法国健康产品安全署(The French Agency for Safety of Health Products, AFSSAPS)颁布的规范6定了刷洗的时间不能少于10min。美国消化护士学会(the Society of Gastroenterology Nurses and Associates, Inc. SGNA)2010年最新颁布的标准中只规定了使用合适规格的清洗刷对内镜管道进行刷洗直至没有肉眼可见的污物。11美国食品与药物管理局(the U.S. Food and Drug Administration, FDA, U.S.)关于内镜自动清洗机的指南中却提到，某公司生产的自动清洗机在机洗步骤之前只需进行床边预处理，无需进行手工刷洗步骤。12FRANK M. MOSES和JENNIFER S. LEE对美国内镜机构的调查发现实行手工刷洗和清洗剂清洗的占70%；存在重复使用一次性内镜清洗刷的占66%；对钳子管道刷洗一次、二次、三五次、五次的比例分别为21%、35%、37%、4%。13究其原因，都是由于规范未阐述手工刷洗过程中清洗刷的选择，刷洗的次数、时间、速度等重要步骤，说明较为模糊，导致各内镜机构手工刷洗方法的巨大差异性，清洗效果也无法得到保证。2. 手工刷洗的作用对于预防生物膜形成及其清除的相关研究尚缺乏。手工刷洗能够有效的清除内镜管道污染物已经被证实，Timothy S Charlton使用4种不同类型的清洗刷对内镜管道进行刷洗实验，结果显示刷洗步骤能够清除新的内镜管道中52%96%的污染物和旧的内镜管道中73%85%的污染物，不同的清洗刷对污染物的清除效果也不相同。14但是不同结构、不同型号的清洗刷对于内镜管道的手工刷洗效果尚未被比较与证实。由于生物膜都是牢固附着在内镜管道壁上，且更易于附着在损伤的管道部位，使得清除生物膜的难度大大增加。注气注水管道由于结构及管道细小无法进行机械清洗，而只能通过清洗剂和消毒剂的灌注达到清洗消毒作用，因此较钳子管道更容易形成生物膜，这在A. Pajkos等15对内镜管道进行的检测中也被证实。由此可见，有无实施手工刷洗对生物膜的清除是有其实际意义的。对于手工刷洗作用的研究，为内镜管道生物膜的预防和清除带来比清洗剂和消毒剂效果更佳的可能。3. 内镜生物膜的存在经小样本实验检测证实，但无现状调研及相关因素分析。Tom Coenye等16的研究估计人类感染的65-80%是与生物膜相关的。Linda Bisset等17对高水平消毒后且细菌培养为阴性的109条内镜进行PCR检测，发现有40%的内镜钳子管道有大肠杆菌DNA残留，提示这些内镜可能有生物膜的形成。同样在A. Pajkos等15对正在临床使用的13条内镜管道的检测中发现，有5条的活检吸引管道和12条注气注水管道形成了生物膜，其中9条尤为严重。内镜管腔表面的光滑程度与否对于污染物的黏附残留非常重要，如果管腔等的表面有纵向划痕，会导致球菌的积聚。18对内镜生物膜使用临床调研的方法，开展调查问卷与实验室检测，了解生物膜的形成与内镜临床使用、清洗消毒间关系的有关研究尚缺乏。4. 执行严格而有效的清洗流程是预防内镜生物膜形成的重要条件。生物膜在内镜管道中的形成不乏报道，Linda Bisset17和A. Pajkos15的实验报道中内镜生物膜的发生率分别为40%和92%。有学者认为，通过清洗步骤就能够降低细菌生物膜在内镜管道中形成的机率。19,20欧洲消化内镜协会(European Society for Gynaecological Endoscopy, ESGE)颁布的清洁和消毒技术说明（2003）5指出，清洗是整个内镜清洗消毒流程中最为关键的步骤。如果手工刷洗的步骤没有有效的实施，残留在内镜管道中的蛋白质由于消毒剂得固定作用而促进生物膜形成，残留在管道内的有机物会影响消毒剂的消毒作用而最终导致消毒的失败21。不彻底的清洗与消毒间互为因果、恶性循环，导致生物膜的形成而引发内镜相关感染的发生。一旦生物膜在内镜管道中形成，仅使用常规的清洗消毒方法是无法将其有效去除的。15因此，有效的消毒必须以合格的清洗为前提，这对于预防内镜生物膜的形成具有重要意义。内镜管道内成熟生物膜的强抵抗性会导致常规清洗和消毒的无效，引发一系列的医院感染问题。5. 有效的清洗对生物膜的清除作用受到普遍重视。对于生物膜的清除，美国APIC（The Association for Professionals in Infection Control and Epidemiology, Inc）指南9指出，能够减少生物膜的形成和活性对于减少内镜相关感染尤为重要，并强调彻底手工刷洗对此的重要性。Karine Marion等22的血液透析装置生物膜沾染实验表明，与消毒剂比较，生物膜的清除应该更重视清洗的作用。Jaeeun Kim等23的研究表明，生物膜中的大肠杆菌对含氯消毒剂的敏感性比浮游的大肠杆菌下降了8300倍。对于成熟的生物膜，使用含有季胺类化合物的消毒剂不仅不能去除生物膜，反而将生物膜固定于内镜表面，导致其更不易于被清除。20Karen Vickery等24的实验研究表明，不同的清洗剂能够清除内镜管道上065%的生物膜，其中不含酶的清洗剂Matrix能够完全清除生物膜中的细菌和EPS。由此可见，内镜清洗消毒的两大步骤中，清洗对成熟生物膜的清除作用是更为主要的。6. 生物膜形成机制的基础研究较为丰富，但是未能为预防生物膜及其清除形成提供依据。生物膜最初由自由游动的细菌黏附在内镜管道表面，细胞与细胞间形成柱状和蘑菇状的信号交流结构，液体能够在周围循环。该结构使细菌最大程度的暴露在流动的营养下，而且减少了细胞废弃物的堆积。对于这些形成机制的研究，国外有细菌黏附机制25，26、微菌落结构机制27、饥饿相关抵抗机制、细胞间信号传递28以及特异基因表达29，30等理论已较为完善。基于这些理论基础，大量的临床和科学实验应用于探究对生物膜的清除效果影响的研究。D. Lindsay在回顾了大量文献后，总结了目前控制生物膜的方法，包括：防止最初的微生物附着、抑制生物膜的形成、针对性的清除EPS和改变检测的方案等4。但是尚未有较好的、确切的解决该问题的方法，因为生物膜对外界抵抗作用是复杂的、多因素的，当其暴露在不良环境中，其本身的结构即朝着抵抗该环境和抵抗微生物制剂的方向变异，这些因素都增加了实验研究的困难程度31。因此仍未能有较好的、确切的解决该问题的方法。国内研究概况：1. 内镜技术发展及使用普及，医院感染控制重视不足。在上海，平均每30位住院病人或每70个门诊就诊病人中就有1人接受内镜检查32，且该项比例仍在上升。部分医院存在日诊量过高，内镜数量相对不足的矛盾，造成了内镜清洗消毒时间不够，消毒效果不达标等问题33。我国医疗机构普遍存在对内镜清洗消毒重视度不够、资源限制、对规范执行力不强等不良现象，导致了内镜消毒合格率普遍偏低34的结果。由此可见，我国目前的内镜清洗消毒工作仍然存在许多问题，发生医院感染的隐患普遍存在。2. 生物膜相关研究较多，但有关内镜生物膜相关研究较少。在对国内文献进行检索时，有关细菌生物膜的研究报道很多，但多为相关研究进展的报道。还有一些对其他医疗器械形成的生物膜实验研究，基本上都是体外进行，未能合理考虑临床实际情况。葛新35，36和陆烨37等的报道均为不同细菌生物膜对消毒剂的抵抗作用，其结果都与国外研究结果相似。曹勇的不同内镜洗涤剂对内镜管腔大肠杆菌生物膜清除力比较的实验研究38，其研究结果与Vickery K等24的研究结果一致，即非含酶清洗剂对生物膜的清除效果较含酶清洗剂更佳。部分研究使用的材料并非临床内镜材料，不能代表临床内镜生物膜的真实情况。37综上，目前国内尚缺乏有关内镜生物膜发生原因及相关因素的调查研究。第三步：指出该范畴内目前存在的问题。同时通过手工刷洗对内镜生物膜进行干预的实验性研究目前国内外均尚未见报道。问题2基于上述研究现状和需要，本项研究将在前期工作的基础上（内镜生物膜模型的建立和不同清洗剂清除内镜生物膜的实验研究），继续深入研究手工刷洗方法对内镜生物膜的清除效果。首先开展临床内镜生物膜现状调研及相关因素的分析，了解内镜生物膜污染现状及污染原因，第三步：由问题引出本课题研究的目的和意义。目的最后都是为了解决存在的问题。此处目的1为通过清洗、消毒来防止生物膜的形成提供注意用词：没有了。因为课题尚未做。解决问题的方向和科学有效的指导，从而更好的防止内镜相关医院感染，保障医疗安全。意义1再通过对临床使用后的内镜和制作的内镜生物膜模型分别进行干预处理，同时对不同干预种类、次数等水平进行不同设置，采用内镜常规处理措施的多因素多水平的干预，分析手工刷洗方法对内镜生物膜的清除效果研究目的2。由于接近临床实际，对内镜的清洗消毒具有切实可行的指导意义，为通过临床内镜的有效清洗来防止生物膜的形成提供可靠的理论依据。研究意义2至此解决了“为什么要进行本研究”这个问题。Why 因为这是一篇硕士论文的开题，所以这部分篇幅较长，同学们在写的时候不需要这么多字，但是同样必须紧密围绕为什么要进行本研究”这个问题有层次的展开。现状、问题、目的、意义。参考文献：格式要规范，见护理研究p111.1中华人民共和国卫生部内镜清洗消毒技术操作规范S卫医发2004100号2004：5-92J.W. Costerton, P.S. Stewart, E.P. Greenberg. Bacterial Biofilms: A Common Cause Of Persistent Infections. Science 1999:284:13181322.3Rodney M. Donlan and J. William Costerton. Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms. Clinical Microbiology Reviews 2002:15:167193.4D. Lindsay, A. von Holy. Bacterial biofilms within the clinical setting: what healthcare professionals should know. Journal of Hospital Infection 2006:64:313-325.5ESGE Guidenlines Committee. Technical note on Cleaning and Disinfection. Acta Endoscopica 2003:33:639-6506J.C. Darbord. Importance of cleaning for reprocessing endoscopes and thermolabile sterile medical devices: French use and regulations. Journal of Hospital Infection 2004:56:S40S43.7U. Heudorf, M. Exner. German guidelines for reprocessing endoscopes and endoscopic accessories: guideline compliance in Frankfurt/Main, Germany. Journal of Hospital Infection 2006:64:69-75.8Tandon RK, Ahuja V. Non-United States guidelines for endoscope reprocessing. Gastrointest Endosc Clin N Am 2000;10:295-318.9Alvarado CJ, Reichelderfer M. APIC guidelines for infection prevention and control in flexible endoscopes. Am J Infect Control 2000;28:138-155.10Douglas B. Nelson. Recent advances in epidemiology and prevention of gastrointestinal related infections. Current Opinions in Infectious Diseases 2005:18:326-330.11Standards of infection control in reprocessing of flexible gastrointestinal endoscopes. Gastroenterology Nursing 2010:33:70-80.12The American Society for Gastrointestinal Endoscopy (ASGE). Automated endoscope reprocessors. Gastrointestinal Endoscopy 2010:72:675-680.13FRANK M. MOSES, MD, and JENNIFER S. LEE, RN. Current GI Endoscope Disinfection and QA Practices. Digestive Diseases and Sciences, Vol. 49, Nos. 11/12 (November/December 2004), pp. 17911797.14Timothy S Charlton. A comparison of the efficacy of lumen-cleaning devices for flexible gastrointestinal endoscopes. Australian Infection Control 2007:12:81-90.15Tom Coenye, Hans J. Nelis. In vitro and in vivo model systems to study microbial biofilm formation. Journal of Microbiological Methods 2010:83:89105.16Linda Bisset, Yvonne E. Cossart, Warwick Selby, Richard West, Denise Catterson, Kate OHara, Karen Vickery. A prospective study of the efficacy of routine decontamination for gastrointestinal endoscopes and the risk factors for failure. Am J Infect Control 2006:34:274-80.17Pajkos, K. Vickery, Y. Cossart. Is biofilm accumulation on endoscope tubing a contributor to the failure of cleaning and decontamination? Journal of Hospital Infection 2004:58:224229.18K. A. WHITEHEAD, J. VERRAN. The effect of surface topography on the retention of microorganisms. Food and Bioproducts Processing 2006:84(C4): 253259.19American Society for Gastrointestinal Endoscopy (ASGE). Infection control during GI endoscopy. Gastrointestinal Endoscopy 2008:67:781-790.20K. Marion, J. Freney, G. James, E. Bergeron, F.N.R. Renaud, J.W. Costerton. Using an efficient biofilm detaching agent: an essential step for the improvement of endoscope reprocessing protocols. Journal of Hospital Infection 2006:64:136-142.21G. Kampf, R. Blo, H. Martiny. Surface fixation of dried blood by glutaraldehyde and peracetic acid. Journal of Hospital Infection 2004:57:139143.22Marion K, Pasmore M, Freney J, et al. A new procedure allowing the complete removal and prevention of hemodialysis biofilms. Blood Purif 2005;23:339-348. 23Jaeeun Kim, Betsey Pitts, Philip S. Stewart, Anne Camper, and Jeyong Yoon. Comparison of the Antimicrobial Effects of Chlorine, Silver Ion, and Tobramycin on Biofilm. Antimicrobial Agents And Chemotherapy 2008:52:14461453.24Vickery K, Pajkos A, Cossart Y, et al. Removal of biofilm from endoscopes: evaluation of detergent efficiency. Am J Infect Control 2004;32:170-176.25K.C. Marshall, R. Stout, R. Mitchell. Mechanism of the initial events in the sorption of marine bacteria to surfaces. J. Gen. Microbiol. 1971:68:337348.26Katsutoshi Hori, Shinya Matsumoto. Bacterial adhesion: From mechanism to control. Biochemical Engineering Journal 48 (2010) 424434.27Bridier, F. Dubois-Brissonnet, A. Boubetra, V. Thomas, R. Briandet. The biofilm architecture of sixty opportunistic pathogens deciphered using a high throughput CLSM method. Journal of Microbiological Methods 2010:82:6470.28D. DeBeer, P. Stoodley, Z. Lewandowski, Biotech. Bioeng 1994:44:636.29D. G. Davies, A. M. Chakrabarty, G. G. Geesey, Appl. Environ. Microbiol 1993:59:1181-.30Maira-Litran T, Allison DG, Gilbert P. Expression of the multiple antibiotic resistance operon (mar) during growth of Escherichia coli as a biofilm. J Appl Microbiol 2000;88:243-7.31Gilbert P, McBain AJ. Biofilms: their impact on health and their recalcitrance toward biocides. Am J Infect Control 2001;29:252-255.32赖晓全.内窥镜污染的现状及控制J.中国消毒学杂志，2004，21(1)：60-62.33廖如燕，张贤昌，林锦炎，钟昱文，张里君.广东省医院内窥镜污染与消毒现状调查J.华南预防医学,2005,31(5):60-63.34黄俊毅,陈坤.浙江省医疗机构2008年内镜消毒管理现况调查J.浙江预防医学，2009,21（9）：40-45. 35葛新,董小青,王玉祥.肺炎克雷伯菌生物膜对消毒剂抵抗性研究J.中国卫生检验杂志,2006,16(2):231-232.36葛新，王丹敏,詹曦菁.葡萄球菌生物膜对消毒剂抗力的研究J.中国消毒学杂志,2007,24(2):122-125.37陆烨,虞晓珍,陆龙喜.内镜中铜绿假单胞菌生物膜对消毒剂抗性研究J.中国卫生检验杂志,2008,18(7):1348-1349.38曹勇.不同内镜洗涤剂对内镜管腔大肠杆菌生物膜清除力比较J.浙江:浙江大学医学院,2009.二 课题的基本内容，预计解决的难题二、三部分解决怎么去进行研究这个问题。How课题的基本内容：研究内容要具体、明确。要学会将选题分解，一点一点去做。1. 临床内镜生物膜现状调研；2. 不同手工刷洗方法对内镜生物膜的清洗效果。预计要解决的难题：如何去控制手工刷洗人为因素的一致性，防止因为操作而产生的偏倚。三 课题的研究方法包括：科研设计方法；研究方法：对象选取方法（抽样方法，选择标准）；分组方法（随机分组等）；处理因素（实验因素）；资料收集方法和资料分析方法。、技术路线1. 临床内镜生物膜现状调研（1） 调研对象的选取 调研对象：选取送往内镜维修点维修的内镜钳子管道。 选择标准：临床中使用过的内镜钳子管道；内镜钳子管道管腔保存完好，无人为刮擦及损坏。 样本收集例数：根据r=0.5(预期的现患率),a=0.05（参考值范围）,d=0.03（允许误差）,全国范围内收集1068例样本，每例样本长度为20cm。（2） 调研方法 收集方法：在维修点内维修更换的内镜钳子管道，由维修中心固定工作人员随机截取20cm。 送维修内镜钳子管道一般资料表格的设计：纸质问卷发放和电话调查相结合。 问卷结果分析：了解全国临床内镜生物膜发生率；找出临床内镜生物膜产生的原因；分析内镜在临床的使用情况与生物膜形成间的关系；分析不同等级医院、不同清洗消毒情况等因素对生物膜形成的影响。 激光共聚焦显微镜（Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM）观察：对收集到的内镜钳子管道进行荧光染色后使用CLSM观察生物膜形成的有无和程度、管道有无刮痕和裂缝，分析整个生物膜的分布均匀与否。 结晶紫染色（Crystal Violet Stain）观察：将收集到的内镜钳子管道随机截取2cm一段，用0.25%结晶紫液染色5min，纵行切开后使用连接有摄像机的光学显微镜进行观察。每一样本取六张照片，生物膜的覆盖率使用Scion图像处理软件进行计算。2. 不同机械清洗方法对内镜生物膜的清除效果比较（1） 研究对象 选择制作内镜材料的特氟龙（Teflon）管，直径4mm，长度200cm，环氧乙烷灭菌后备用。 分组方法组：灭菌水空白对照；组：Olympus可重复使用内镜清洗刷；组：Ruhof一次性使用含酶内镜清洗刷；组：Pull Thru一次性使用内镜清洗刷。 组、组、组分别刷洗1次、2次、3次。（2） 研究因素 来自于Olympus公司生产的统一规格、批号、日期的可重复使用内镜清洗刷。 来自于Ruhof公司生产的统一规格、批号、日期的一次性使用含酶内镜清洗刷。 来自于Pull Thru公司生产的统一规格、批号、日期的一次性使用内镜清洗刷。（3） 研究方法 建立内镜生物膜模型a) 培养临床分离的大肠杆菌：取少量斜面保种的大肠埃希氏菌菌株,接种于无菌Muller-Hinton肉汤培养基获得纯种菌液。b) 制作大肠杆菌菌悬液：用倾注平板法,调整细菌浓度为106CFU/ml备用。c) 制作的细菌浓度为106CFU/ml大肠杆菌菌悬液与大肠杆菌培养基以10：1比例混合，放入灭菌的500ml的玻璃瓶内，持续37恒温灌流Teflon管腔；蠕动泵控制速度在80100mlh，以模拟临床操作中内镜污染的条件，持续灌流10天，每日更换大肠杆菌菌悬液和培养基。实验重复5次，每次试验用的Teflon管在恒温箱中以同样方式盘放。 使用不同机械清洗方法对内镜生物膜进行处理a) 持续灌流10天后，取出Teflon管，排空管腔内的灌流液，用浸有75%酒精的无菌纱布擦干Teflon管外表面。弃去Teflon管的两端各5cm，用无菌手术刀片以组16cm，组16cm（a）、16cm（b）、16cm（c），组16cm（d）、16cm（e）、16cm（f），组16cm（g）、16cm（h）、16cm（i），分段切开并标记。b) 组为空白对照组，放入盛有无菌PBS的容器中进行冲洗，轻轻翻转容器5次，弃去PBS液,用吸管吸取残余的溶液，重复3次后取出，洗掉浮游菌，用无菌干纱布吸净多余液体。将准备好的Ultrasnap拭子擦拭Teflon管内管腔，使用ATP生物荧光法检测有机物残余量。用无菌手术刀片将长16cm的管腔分别切为5段3cm和1段1cm长的Teflon管。c) 组为Olympus清洗刷组，Teflon管a、Teflon管b、Teflon管c分别浸泡在盛有无菌PBS的容器中各刷洗一次、二次、三次。刷完后每段Teflon管分别放入盛有无菌PBS的容器中进行冲洗，轻轻翻转容器5次，弃去PBS液,用吸管吸取残余的溶液，重复3次后取出，洗掉浮游菌，无菌干纱布吸净多余液体。将准备好的Ultrasnap拭子擦拭Teflon管内管腔，使用ATP生物荧光法检测有机物残余量。用无菌手术刀片将长16cm的管腔分别切为5段3cm和1段1cm长的Teflon管。d) 3cm长的Teflon管为收集管腔内的细菌，试验管纵向切开等分为两部分，每段管腔的内表面用一个2mm宽的消毒小木棒进行擦刮，与擦刮棒一起放入盛有5mlPBS的试管中。这5个试管先进行超声水浴10min（4247KH、20），然后使用漩涡振荡器振荡1min。振荡后的悬浮液。e) 振荡后的液体进行梯度稀释并重复接种3个平板，37培养48h后进行细菌菌落学计数。f) 1cm长的Teflon管行荧光染色后进行CLSM检查。d) Teflon管组和组处理方法同组。（4） 评价方法 细菌菌落计数：收集后的菌液进行细菌梯度稀释。经震荡混匀器充分震荡均匀后的液体取1ml接种至直径90mm的无菌平皿，每个平皿分别倒入无菌的45-48营养琼脂15ml-18ml，边倾注边摇匀。待琼脂凝固，于37培养箱内培养24h后计数。培养后观察菌落生长情况,记录平板菌落数,计算细菌总数（菌落数/镜=2个平皿菌落数平均值2）。细菌计数的结果用实际菌落数的常用对数(log cfu/cm3)为标准菌落计数单位来表达。菌落计数换算为标准菌落计数单位。实际菌落数(cfu/cm3)=肉眼可计菌落数稀释倍数/体积，取实际菌落数的常用对数(log cfu/cm3)为标准菌落计数单位。 ATP生物荧光法检测：准备好Ultrasnap拭子并确定其外表面干净且干燥。打开盖子，将Ultrasnap拭子放入ATP生物荧光法检测仪中后关闭盖子。开始检测，15s后观察结果读数。结果判断：045RLU为合格，46RLU为不