（微生物学专业论文）地衣芽孢杆菌α乙酰乳酸脱羧酶基因在酿酒酵母工业菌株中的表达.pdf

原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完 全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：左互j 虱j ：盈。日期：q 3 二型2 圣9 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：盎芝! 丑奎壤导师签名：龟2 雀生0 日 期： 山东大学硕士论文 i 摘要 在啤酒生产中，双乙酰( d i a c e t y l ) 是影响啤酒风味的重要物质之一，它的口 味阀值很低( 0 0 2 0 1 0 m g l ) ，当双乙酰的浓度超过口味阀值时会使啤酒产生一 种很不愉快的馊酸味，严重影响啤酒的风味和质量。双乙酰是酵母代谢的主要 副产物，它的产生贯穿啤酒发酵的整个过程，生产上以控制双乙酰含量作为控 制啤酒是否成熟的主要指标。d 一乙酰乳酸脱羧酶( a a e e t o l a c t a t ed e e a r b o x y l a s e ， a a l d c ) 能催化双乙酰的前体物乙酰乳酸( d a c e t o l a c t a t e ) 直接脱羧生成 3 羟基2 一丁酮( 俗称乙偶姻) 避开双乙酰产生的途径。酿酒酵母本身不含有 a - 乙酰乳酸脱羧酶基因，利用基因工程技术将细菌的a 一乙酰乳酸脱羧酶基因 引入酵母细胞，得到具有a 一乙酰乳酸脱羧酶活性的重组酵母工程菌株，是啤酒 发酵中加速q 乙酰乳酸分解，控制双乙酰形成的最根本有效措施。 地衣芽孢杆菌( b a c i l l u sl i c h e n i f o , m i s ) 是一种公认安全的微生物( g r a s ) ， 其来源的许多酶制剂产品已广泛应用到食品工业中。本文在前期工作的基础上， 在含有a 一乙酰乳酸脱羧酶基因高效表达框的整合质粒p m i r y 2 a l d c 上插入 铜抗性基因，转化啤酒工业生产菌株( 三孔酵母) ，经酶活测定，从上百株转化 子中筛选到了三株( a 1 6 ，a 3 0 ，a 5 5 ) 具有一乙酰乳酸脱羧酶活性的工程菌。提 取转化子的染色体，通过p c r 技术扩增和酶切验证证明了a 一乙酰乳酸脱羧 酶基因在工业酵母基因组中的整合。稳定性实验中表明，在完全培养基中连续 培养5 0 世代，重组菌株细胞中质粒存在的比例仍为9 3 6 ，a 一乙酰乳酸脱羧 酶基因在酵母细胞中稳定表达，适于工业生产。a 一乙酰乳酸脱羧酶在重组菌株 中的比酶活达到5 8 1 0 。u m g ，将重组菌株接种麦芽汁，并以三孔工业酵母作 对照菡测定双乙酰含量变化，与对照菌相比重组菌株的双乙酰峰值较低，且降 到低于口味阀值( 0 0 2 0 1 0 r a g l ) 的时间比对照菌缩短。 野生型酵母，如酵母工业菌株，其遗传背景、生长特征及内在的生理生化 特征与实验室菌株有很大不同。首先，工业菌株往往没有常规酵母转化子筛选 的营养缺陷型标记，只能利用某些显性标记，例如g 4 1 8 和c u ”。其次，转化 技术上也与对实验室菌株的转化有所不同，因此需要建立酵母工业菌株转化体 系。本文通过敏感度实验测定了三株酿酒酵母工业菌株对g 4 1 8 和c u 2 + 的最大 山东大学硕士论文 抗性，发现三株菌对g 4 1 8 的耐受性差别很大，s p s c 酒精酵母耐受性最强达到 7 5 0ug m l ，三孔酿酒酵母耐受性最差，只有1 0 0u g m l 。同株菌在不同的培养 基上对铜离子的耐受性相差也很大，s p s c 酒精酵母在y e p d 培养基上可以耐 受1 5 m m o l lc 1 d 2 + ，但在c s m 培养基上只可以耐受l m m o l lc u 2 + 。对工业菌株 三孔酿酒酵母进行醋酸锂法转化的系列条件做了研究，确定o d 6 0 0 值0 8 1 0 时 是最佳细胞收获时间，转化子先在完全培养基上生长6 h 再涂布g 4 1 8 选择平板 可以大大提高转化子的数量，初步建立了三孔酿酒酵母的转化体系。 改造啤酒工业生产菌株，一方面要使菌株高效稳定表达a 乙酰乳酸脱羧酶 活，低产双乙酰以适于工业化大生产；另一方面，要保留菌株的发酵性能，维 持原有的啤酒风味。根据啤酒工业生产的要求，我们选定了以下几个发酵性能 作为监控指标：发酵力、表观发酵度、凝集力、酒精含量。经测定表达a 乙酰 乳酸脱羧酶酶活的工程菌与出发菌株相比，发酵性能基本基本保持不变。 关键词：n 乙酰乳酸脱羧酶基因；双乙酰；整合；工业菌株 山东大学硕士论文 a b s t r a c t d i a c c t y l ( d a ) i st h ei m p o r t a n tc o m p o n e n to fy e a s t - d e r i v e do f f - f l a v o ri nb e e r t h et a s t ea n ds m e l lo f d i a c e t y li sd e t e c t e da tav e r yl o wl e v e l ( 0 0 2 0 1 0 m g 几) ，a n d m o s tp e o p l ef i n di tu n p l e a s a n t d i a c e t y li sp r o d u c e dd u r i n ga l lt h ef e r m e n t a t i o nt i m e a n di t sc o n t e n th a sb e c o m et h es y m b o lo ft h em a t u r eo fb e e r t h ec t a c e t o l a c t a t e d e c a r b o x y l a s e ( - a l d c ) i sa l le n z y m et h a tc o n v e r t st h ep r e c u r s o ro fd i a c e t y l d a c e t o l a c t a t e ，d i r e c t l yt oa c e t o i nw h i c h h a sn oe f f e c to nb e e rf l a v o r t h i se n z y n l ew a s f o u n di nm a n yb a c t e r i ab u tn o ti ny e a s t s a a c e t o l a c t a t ed e c a r b o x y l a s eg o n eo ft h e b a c t e r i ac a nb et r a n s f o r m e di n t ot h ec e l l so fs c g r e v i s i a et oc o n s t r u c tt h er e c o m b i n a n t y e a s t s t r a i nh a v i n go a c e t o l a c t a t ed e c a r b o x y l a s e a c t i v i t y b a c i l l u sl i c h e n i f o r m h i so n eo ft h em i c r o o r g a n i s m sg e n e r a l l ym g a r d e da ss a f e ， a n de l l z y m e sp u r i f i e df r o mi th a db e e nw i d e l yu s e di nf o o di n d u s t r y t h eq a l d c e x p r e s s i o nb o xw a sl i n k e dt ot h em u l t i p l ei n t e g r a t i o np l a s m i dp m i r y 2 t oc o n s t r u c t r e c o m b i n a n ti n t e g r a t i o np l a s m i dp m i r y 2 一a l d c t h e na n t i g e n e t i c i nw a si n s e r t e d i n t ot h e m u l d p l ei n t e g r a t i o np l a s m i dp m i r y 2 一a l d c t o g e t an e w p l a s m i d p m i r y 2 - a l d c g 4 1 8 t h ep l a s m i dw h i c h h a dt h ed o m i n a n ts e l e c t i o nm a r k e rg o n e w a st r a n s f o r m e d i n t ot h ei n d u s 伍a l y e a s t s t l a i no f s a n k o n g t o g e t t h e t r a n s f o r m a n t s t h r e e t r a n s f o r m a n t s ( a 1 6 ，a 3 0 ，a 5 5 ) t h a tw e r eg o t f r o mh u n d r e d s o ft r a n s f o r m a n t sh a da l d ca c t i v i t yb yd i r e c tm e a s u r e m e n to fa l d c a c t i v i t y t h e a l d c g o n ew o u l d b eo b t a i n e db yp c rf r o mg e n o m ed n ao ft h eu ：a n s f o r m a n s ，a n d i tc o u l da l s ob e g o t a f t e r c u t t i n gb ye n z y m e t h e t r a n s f o r m a n s g r e w f o r5 0 g e n e r a t i o n s t h er a t i oo ft h ec e l l sw h i c hh a da l d cg a n ew a ss t i l l8 3 4 a sw a s s t a t e da b o v e ，d - a l d c g e n e w a s i n t e r g r a t e di n t ot h eg e n o m e o f t h ei n d u s t r i a ls 订a i n ， a n ds u i t a b l ef o rm a s s i v e p r o d u c t i o no f b e e r t h ew i l dt y p ey e a s t s ，f o re x a m p l et h ei n d u s t r i a ly e a s ts t r a i n ，a r em o r ec o m p l e x i nt h eg e n e t i cb a c k g r o u n d ，g r o w t hc h a r a c t e r sa n d p h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r sc o m p a r i n g w i t ht h el a b o r a t o r ys t r a i n s ot h et r a n s f o r m a t i o ns y s t e mo f y e a s ti n d u s t r i a ls w a i ni s 山东太学硕士论文 n e e d e db ee s t a b l i s h e d f i r s to f a l l ，i n d u s t r i a ls t r a i n sc a no n l yu s ed o m i n a n ts e l e c t i o n m a r k e r g e n e s ，f o re x a m p l eg 4 1 8o rc u 2 + ，b e c a u s ei n d u s t r i a ls t r a i n sh a v en o a u x o t r o p h i em a r k e rg e g e s s e c o n d 耽t h e r ea r es o m ed i f f e r e n c e so f t r a n s f o r m a t i o n t e c h n o l o g yb e t w e e ni n d u s t r i a la n dl a b o r a t o r ys t r a i n s s e n s i t i v i t yo f t h r e ei n d u s t r i a l s t r a i n st og 4 1 8a n dc u 2 + w e r et e s t e d n 坨s e n s i t i v i t yo ft h r e es t r a i n st og 4 1 8w a s v e r yd i f f e r e n t s p s ca l c o h o ly e a s ts t r a i nh a dt h em o s te n d u r a n c et og 4 1 8a n dc o u l d g r e wi nm e d i u mh a v i n g7 5 0ug m e ( 3 4 1 8 s a n k o n gw a st h ew e a k e s ta n di tc o u l d n t g r o w w h e nm e d i u mh a dg 4 1 8 e x c e e d i n g1 0 0 l ig m e t h es a r n es t r a i n h a dd i f f e r e n t e n d u r e n c et oc u 2 + o nd i f f e r e n tm e d i a s p s ca l e o h o ly e a s tc o u i de n d u e1 5 m m o l l c u 2 + i nt h ey e p dm e d i u mb u ti to n l vc o u l de n d u ei r n m o l lc u 2 + i nt h ec s m m e d i u m w h e nt r a n s f o r m e d b y l i a ct h eb e s tc e l lg r o w t ht i m eo f s a n k o n g w a so d 6 0 0 0 8 1 0a n dg r o w i n gf o r6h o u r so nc o m p l e t em e d i u mb e f o r et r a n s f e r r e dt og 4 1 8 s e l e c t i o np l a t ec o u l di n c r e a s et h en u m b e ro ft r a n s f o r m a n t s t h i sl a i dt h eb a s eo f t r a n s f o r m a t i o ns y s t e mf o r s a n k o n g t h ep u r p o s eo fe s t a b l i s h m e n to fy e a s ti n d u s t r i a ls t r a i ni st om a k eas t e a d y e x p r e s s i o no fd - a l d c i no r d e rt or e d u c et h ep r o d u c t i o no fd ai nt h em a s s i v e p r o d u c t i o no fb e e r , a n dt or e t a i nt h e f e r m e n t a t i o nc a p a c i t yo ft h eo r i g i n a ls t r a i nt o k e e pt h ef o r m e rt a s t eo f t h eb e e r a c c c o r d i n gt ot h ei n d e x e si nt h eb e e ri n d u s t r y , w e c h o s es u c hf e r m e n t a t i o nc h a r a c t e r sa so u rr e g u l a t i o ni n d e x e s ：t e s t i n go ff e r m e n t a t i o n a b i l i t y ，t e s t i n go f f e r m e n t a t i o nd e g r e e ，t e s t i n go fe t h o n a lp e r c e n t a g e t h ee x p e r i m e n t i n d i c a t e dt h a tt h et r a n s f o r m a n si n d u s t r i a ls t r a i ne x p r e s s i n go - a l d ch a sa l m o s tt h e s a m ef e r m e n t a t i o n c a p a c i t ya st h eo r i g i n a l ，s o m ee v e ng r e a t e r k e y w o r d s ：a a c e t o l a c t a t ed e e a r b o x y l a s e ，d i a c e t y l ，i n t e g r a t i o n , i n d u s t r i a ls 缸 r i n 6 山东大学硕士论文 本文缩写词表 - a l d c一a c e t o l a c t a t ed e c a r b o x y l a s eq 一乙酰乳酸脱羧酶 b s a c s m d t t e d 弘 g 4 1 8 p g k p c r p m s f b o v i n e $ e r l l l l la l b u m i n牛血清白蛋白 c o m p l e t es u p p l e m e n tm i x t u r e 完全合成培养基 d i t h i o t h r e i t o l二硫苏糖醇 e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d乙二氨四乙酸 g e n e t i c i n 遗传霉素 p h o s p h o g l y c e r a t ek i n a s e 磷酸甘油激酶 p o l y m e r a s ec h a i n r e a t i o n聚合酶链式反应 p h e n y l m e t h a n e s u l f o n y lf l u o r i d e 甲基磺酰氟 山东大学硕士论文 1 绪论 1 1 啤酒发酵中双乙酰的产生 1 1 1 啤酒发酵中的双乙酰 啤酒是一种以大麦芽为主要原料、经过酵母发酵、带有啤酒花的苦香味并 含有c 0 2 泡沫的低酒精度饮料。它富含各种维生素、蛋白质、碳水化合物及矿 物质等营养成分，深受人们喜爱，是当前饮料酒重点发展方向。我国的啤酒年 产量已超过千万吨，随着人们生活水平的提高，啤酒的需求量将逐年增加，因 此运用科技促进啤酒工业发展有着巨大的经济价值。传统的啤酒发酵工艺通常 分为主酵期和后酵期两个阶段，主酵期的主要产物是酒精和c 0 2 ，另外还有一 系列的发酵副产物，这些发酵产物决定了啤酒的风味、色泽等理化性质；后酵 期是主酵期的延续，在低温密闭容器中进行，一般需3 1 0 周才能使啤酒风味趋 于成熟、c 0 2 达到饱和。啤酒风昧的成熟成为影响啤酒成熟速率的限制性因素。 在众多影响啤酒风味的物质中，双乙酰是最为关键的成分之一。双乙酰的口味 阀值很低( o 0 2 0 1 0 m g l ) ，当在啤酒中的浓度超过口味阀值时会产生一种很不 愉快的馊酸味，破坏啤酒的风味。双乙酰的产生贯穿啤酒发酵的整个过程，其 含量已成为啤酒发酵成熟与否的标志( m a s s e h e l e i n ，1 9 8 6 ) ，所以生产上以控制 双乙酰含量作为控制啤酒是否成熟的主要指标之一( 王文甫，1 9 9 7 ) 。 1 1 2 双乙酰的产生与还原 双乙酰是在正常的啤酒发酵过程中由酿酒酵母细胞代谢的必然产物之一。 它是由细胞缬氨酸生物合成的中间产物之一n 一乙酰乳酸分泌到细胞外后，经非 酶促的氧化脱羧反应自发产生的( l e w i s ，1 9 5 8 ：w a i l l w r i g h t ，1 9 7 3 ) ，见图l 。 山东大学硕士论文 c 0 2 l 乙麟捐分异构还酶 q ，芦一二羟基异戊酿 割 二轻暖脱水酶 a 嘏戍酸 谷氮鲮) 1 分技链氮墓篮谷氯馥转氰氍 。一酮戊二睦，i l 一缬复宝睃 图i 缬氨酸合成及双乙酰形成的途径 双乙酰 从图1 中可以看出，由丙酮酸至缬氨酸的生物合成途径，在酵母菌中由四 种酶催化进行。研究表明( c h u a n ge ta l ，1 9 6 8 ) ，缬氨酸形成过程中，q 一乙酰 乳酸会过量产生，逐步积累，一部分渗出细胞进入啤酒发酵液中，通过自发进 行的非酶促的氧化脱羧反应转化成双乙酰。这主要是由于催化a 乙酰乳酸还原 成n ，s ，二羟基异戊醇的同分异构还原酶的效率很低，造成乙酰羟基合成酶催化 产生的n 乙酰乳酸形成累积。 酵母细胞可产生双乙酰还原酶将双乙酰还原成乙偶姻( a c e t o i n ，3 - 羟基2 丁酮) ，乙偶姻的口味阀值( 3 0 一l o o m g ，l ) 远大于双乙酰，它对啤酒风味的影响 要小得多。但。乙酰乳酸的自然氧化脱羧速度比双乙酰还原速度还要慢1 0 倍， a 一乙酰乳酸的去除反而成了双乙酰去除速率的限制因素；另外，发酵液中的双 乙酰必须依靠渗透酶进入酵母细胞，在细胞内完成还原过程，见图2 。因此，啤 酒发酵过程中需要相当长的时间爿能将双乙酰含量降到口味阈值以下，极大影 穗丫 山东大学硕士论文 响生产效率。为此，人们就逐渐改进生产工艺，以期减少双乙酰的生成。 图2双乙酰在酿酒酵母中的产生和还原 1 2 控制双乙酰的方法 1 2 ，1 优化发酵工艺 双乙酰含量是啤酒发酵成熟与否的标志，它的产生与还原是加速啤酒成熟， 缩短发酵周期，提高设备利用率中极其重要的环节，通过分析影响双乙酰含量 的各种因素，现己发展了多种控制双乙酰含量的生产工艺。 加大酵母接种量使麦芽汁中酵母细胞浓度变高，分解速度加快，虽然a 乙酰 乳酸形成的较多，但分解的量也多，啤酒中双乙酰残留量降低( 韩志芳等，2 0 0 0 ) ； 同时，较大的酵母接种量可减少酵母增殖，从而减少缬氨酸的消耗，双乙酰的生 成量可得到抑制( 刘辉，1 9 9 8 ) 。但过大的接种量易使啤酒产生酵母味或者酒体 味淡。 酵母性能是影响啤酒双乙酰含量的重要因素，选育低双乙酰产生能力的酿酒 酵母是控制啤酒生产中双乙酰产生量的一种途径。利用遗传工程结合传统诱变等 手段对酿酒酵母进行改造，选择具有较低乙酰羟基合成酶酶活，较高乙酰羟酸同 分异构还原酶酶活的菌株，从而限制a 一乙酰乳酸的生成，促使其向缬氨酸转化， 可降低酿酒酵母产生双乙酰的能力( p e t e r s e n ，1 9 8 6 ：d i l l e m a n s ，1 9 8 7 ：v a k e r i a ， 1 9 9 1 ；g o o s s e n s ，1 9 9 1 ：m i t h i e u x ，1 9 9 5 ) 。但这种方法容易产生酵母本身缬氨 o 山东大学硕士论文 酸合成的缺陷，对发酵造成不良影响。将酿酒酵母在不同双乙酰含量的培养基中 培养，筛选到在高浓度双乙酰条件下能够进行正常的代谢活动的抗双乙酰变异菌 株，能够迅速地将双乙酰还原成乙偶姻，使啤酒成品中双乙酰含量降低( 李崎， 1 9 9 8 ) 。 提高麦芽汁中a 氨基酸的含量是控制双乙酰的另一途径。从双乙酰形成途径 和调节机制可知，双乙酰的前体物质是a 乙酰乳酸，其形成所需酶一乙酰羟基合 成酶受该途径终产物缬氨酸的反馈抑制。因此，提高麦芽汁中n 氨基氮含量，相 应的缬氨酸含量增加，就会反馈抑制缩合酶的活性，a 一乙酰乳酸生成受到抑制， 从而降低双乙酰的生成量。麦芽汁中a 氨基氮在1 8 0 2 2 0 m g l 时，双乙酰含量基 本达到最低( 肖连冬，2 0 0 1 ) 。n 氨基氮过高会导致发酵过快，缺少高中分子蛋 白质，影响啤酒的泡沫和口味( 马挂亮，2 0 0 0 ) 。 适当提高主发酵温度也是公认的降低双乙酰含量的有效措施。提高发酵温 度，酵母繁殖加快，a 乙酰乳酸含量高，向双乙酰的转化也快，只有转化成双 乙酰，才会有双乙酰的还原( n a r z i s s ，1 9 9 0 ；s h i n d o ，1 9 9 4 ) ：但发酵温度过高 对啤酒口味有一定影晌，所以一般不超过1 2 。 接种麦芽汁充氧，发酵后期严格控制氧的摄入可以降低双乙酰生成。冷麦 汁中溶解氧要求达到8 p p m 以上，可促进酵母生长繁殖，增加酒液中酵母数，从 而提高细胞浓度，增强酵母对双乙酰的还原能力。但发酵后期，若溶入氧，就 会使酒液中残存的a 乙酰乳酸发生氧化脱羧反应，产生大量的双乙酰；因此， 在发酵后期及啤酒灌装时都要严格控制氧的摄入。 补加高泡酒是降低双乙酰的另一有效措施( 韩志芳，2 0 0 0 ) 。一般可将酒汁 倒出l o 2 0 ，然后补加1 0 2 0 的发酵最旺盛的发酵液( 建成高泡酒) 。由于酵 母数高、新鲜旺盛，可将双乙酰还原至2 ，3 一丁二醇，而使酒汁双乙酰达标。 1 2 2 使用q 一乙酰乳酸脱羧酶制剂 减少啤酒中双乙酰的生成量更简捷有效的方法还是使用q 一乙酰乳酸脱羧酶 ( 一a c e t o l a c t a t ed e c a r b o x y l a s e ，q a l d c ) 划剂。丹麦诺和诺德公司开发用于 啤酒发酵的a l d c 制剂是由重组枯草芽孢杆菌中提取的短芽孢杆菌a l d c 制 荆，催化。一乙酰乳酸直接脱羧生成乙偶姻而不经过双乙酰产生途径( i n o u e ， 山东大学硕士论文 t 9 7 0 ，s h o v e r s ，1 9 7 3 ) 。该制剂用于啤酒生产可缩短啤酒成熟期，提高设备利用 率，啤酒感官和理化指标都达到部颁标准。陈炜等用高效表达质粒p b v 2 2 0 克 隆短芽孢杆菌a l d c 基因，在大肠杆菌中表达，表达的a l d c 占细胞总蛋白质 量的4 0 以上。在非选择性培养基中3 0 c 连续培养5 0 代以上，质粒保持稳定。 但是，这株含a l d c 基因的重组大肠杆菌中使用了氨卞青霉素抗性基因作为选 择标记。作为食品添如剂时必须保证在产品中绝对没有该菌株的活细胞，也不 含完整和有生物活性的抗生素抗性基因d n a ( 陈乃用，2 0 0 1 ) ，给生产应用造 成了一定的困难。赵民强等人( 1 9 9 9 ) ，将q 一乙酰乳酸脱羧酶( 酶活力 1 5 0 0 a d v g ) 按l o g 吨麦芽汁加入冷麦芽汁中一起进入发酵罐，可以将熟化的 时间从原来的9 天缩短为6 天，并能明显降低双乙酰的反弹幅度；而酶的添加 对酵母的正常发酵和啤酒风味均无不良影响。彭智辉( 酿酒科技，2 0 0 1 ) 等提 出了n 。乙酰乳酸脱羧酶和葡萄糖氧化酶共催化去除双乙酰的设想，并研究分析 了共催化的可行性。由图3 可以看到，一方面a 乙酰乳酸在氧存在下自然氧化 脱羧生成双乙酰，氧是双乙酰存在的必要条件；另一方面，n 乙酰乳酸是双乙 酰的前体，是形成双乙酰的基础。因此，从这两方面着手，加入a 乙酰乳酸脱 羧酶催化a 一乙酰乳酸直接生成乙偶姻，而葡萄糖氧化酶可使氧与啤酒中的葡萄 糖生成葡萄糖酸内酯消耗溶解氧。 自然氧化脱羧 乙偶姻 图3n 乙酰乳酸的还原 1 2 3 构建含a 一乙酰乳酸脱羧酶基因的酿酒酵母工程菌 a 一乙酰乳酸脱羧酶能催化a 乙酰乳酸直接脱羧生成乙偶姻，不经过双乙酰 产生的途径。但酿酒酵母本身不含有n 乙酰乳酸脱羧酶基因，利用基因工程手 段将细菌的。一乙酰乳酸脱羧酶基因引入酵母细胞，得到具有a 乙酰乳酸脱羧酶 山东大学硕士论文 活性的重组酵母工程菌株，加速q 乙酰乳酸的分解，从而控制双乙酰的形成。 为满足工业化生产条件的需要，细菌a 乙酰乳酸脱羧酶基因应该在无选择压力 的条件下稳定存在于酵母细胞中。利用酵母的整合型质粒可以将a 乙酰乳酸脱 羧酶基因整合于酵母细胞的染色体上，获得能够在工业生产条件下稳定表达a 乙酰乳酸脱羧酶的重组酵母工程菌株。国外报道的发酵实验表明，利用工程菌 株进行的啤酒发酵，在发酵终了时发酵液中双乙酰的含量明显下降，极大的缩 短了啤酒发酵的后酵期。n 一乙酰乳酸脱羧酶基因整合于酵母染色体中对于酵母 的生长速率和乙醇的生成能力没有影响，而且没有改变啤酒的风味。因此，构 建能够产生a 乙酰乳酸脱羧酶的酿酒酵母工程菌株，可以提高生产效率和设备 利用率，降低生产成本，具有重大的经济效益。 1 2 3 1a 乙酰乳酸脱羧酶基因的克隆 为了克隆到适于啤酒发酵应用的a 乙酰乳酸脱羧酶基因，g o d t f r e x i s e n 等 ( 1 9 8 3 ) 对各种生物资源进行了广泛的筛选检测，发现除了原核微生物具有产 生a 乙酰乳酸脱羧酶能力，酵母、丝状真菌、海藻等真核生物均不产生该酶。 经研究发现原核生物1 0 个科的3 8 种细菌能产生a 乙酰乳酸脱羧酶活性，且a 乙酰乳酸脱羧酶活性的产生与这些细菌都能利用柠檬酸做碳源的生活习性密切 相关，细菌利用柠檬酸产生丙酮酸，进而产生d 一乙酰乳酸( b r a n e n ，1 9 7 2 ； g o d t f r e d s e r l ，1 9 8 3 ：o l s e n ，1 9 8 8 ：r a s m u s s e n ，1 9 8 5 ) 。 应用于食品工业当中的基因其来源最好是公认安全的微生物( g e n e r a l l y r e g a r d e d a ss a f e ) ，才好为人们所接受。在啤酒发酵工业中使用的基因还应在啤酒 发酵条件下表达较高的酶活并保持稳定，且不影响成品啤酒的风味。地衣芽孢 杆菌( b a c i l l u s 1 i c h e n i f o r m i s ) 是一种公认安全的微生物，已广泛用于食品工业酶 制剂的生产中，是可选的a 乙酰乳酸脱羧酶的生产菌种之一。本实验室测定并 报道了地衣芽孢杆菌的d a l d c 基因序列( 郑华军，2 0 0 1 ) 。通过在g e n c b a n k 等网上数据库查询，将迄今为止已正式报道了的细菌n 乙酰乳酸脱羧酶基因列 于表l 。 山东大学硕士论文 表1 已报道的克隆到的q 一乙酰乳酸脱羧酶基因 a 乙酰乳酸脱羧酶产生菌氨基确认号参考文献 酸数 e n t e r o b a c t e r 御目 2 5 9l 0 4 5 0 6 s o n e ，1 9 8 8 k l e b s i e l l at e r r i g e n a2 5 9l 0 4 5 0 7 b l o m q v i s t ，1 9 9 3 v i b r i oc h o l c r a e a c e t o b a c t e r 口倒s s p 2 6 1a e 0 0 4 2 3 6 h e i d e l b e r g ，2 0 0 0 x y l i n u m 3 0 4$ 6 9 1 5 0 y a m a n o ，1 9 9 4 b a c i l l u ss u b t i l i s2 5 5l 0 4 4 7 0 r e n n a , 1 9 9 3 b a c i l l u sb r e v i s2 8 5a 3 7 7 5 7 d i d e r i c h z e n ，1 9 9 0 l i s t e r f a m o n o c y t o g e n e s 2 3 0a f l 0 5 3 4 1w o m b o ，1 9 9 9 c o x i e l l ab u r n e d i2 5 5u 1 4 3 9 3 m o ，1 9 9 4 l a c t o c o c c u sl a c t i s2 3 6x 8 2 6 2 0 s w i n d e l l ，1 9 9 6 s t a p h y l o c o c o a s a l g r e l t $2 3 4a 咖3 1 3 7 k u r o a a , 2 0 0 1 l e u c o n o s t o co e r o s2 3 9x 9 3 0 9 1 g a r m y n , 1 9 9 6 l a c t o c o c c u sl a c t i ss u b s p l a c t i s2 2 1a e 0 0 6 3 4 3b o l o t i r 吨0 0 1 b a c i l l u st i c h e n i f o m g s2 6 5a f 4 2 8 0 9 5b a ox m 2 0 0 1 分析表明所有报道基因相互间的氨基酸序列的同源性大约在2 0 - - 4 5 之间， 而k l e b s i e l l at e 川卵n a 与e n t e r o b a c t e r a e r o g e n e s 之间的氨基酸同源性高达8 7 。 根据地衣芽孢杆菌a 乙酰乳酸脱羧酶的基因序列推测了该基因的氨基酸一级结 构并与其他来源的。一乙酰乳酸脱羧酶的一级结构进行了比较，发现与产气肠杆 菌e n t e r o b a c t e ra e r o g e n e s 和肺炎克雷伯氏菌k l e b s i e l l at e r r i g e n a 有较高的同源 性，而与其他已知氨基酸序列的n 一乙酰乳酸脱羧酶的同源性较低，说明地衣芽 孢杆菌在进化关系上与产气肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌有较近的亲缘关系( 郑华 军，2 0 0 1 ) 。 1 2 3 2q 乙酰乳酸脱羧酶基因在酿酒酵母中的表达 s o n e ( 1 9 8 8 ) 等克隆了产气肠杆菌的a 一乙酰乳酸脱羧酶基因，并将该基因 转化酿酒酵母，在乙醇脱氢酶启动f 控制下表达，转化株每毫克蛋白含2 3 单 山东大学硕士论文 位a 乙酰乳酸脱羧酶。转化株和亲株的实验室发酵实验表明，转化株发酵液中 双乙酰含量比亲株低的多，而发酵能力和啤酒的风昧没有明显区剐。 s u i h k o ( 1 9 9 0 ) 等将克氏杆菌的q 乙酰乳酸脱羧酶基因克隆到在酵母中自 主复制的y e p 质粒上，获得具有a 乙酰乳酸脱羧酶活性的转化株。 鉴于含有外源基因的质粒载体在酵母细胞中的稳定性，b l o m q v i s t ( 1 9 9 1 ， 1 9 9 3 ) 用基因置换的方法将上述两神a 乙酰乳酸脱羧酶基因分别在p g k 和 a d h 启动子控制下表达，并整合到酵母染色体中，得到稳定的转化子。5 0 升规 模的发酵实验中，p g k 启动子控制的转化株发酵终了时不需要熟化过程，双乙 酰的含量就已经在标准量以下：用a d h 启动子控制的转化株也只须要4 5 天的 熟化时间，两种情况下啤酒的质量无明显差别。 f u j i i 等( 1 9 9 0 ) 用含有核糖体d n a 的酵母整合型质粒载体将产气肠杆菌的 n 乙酰乳酸脱羧酶基因整合到酵母染色体中，由于酵母染色体中含有约1 4 0 个 串联重复的r d n a 基因，质粒可以多拷贝整合到染色体中，转化株含有多拷贝 的a 乙酰乳酸脱羧酶基因，在没有选择压力的培养条件下保持稳定。发酵实验 表明多拷贝的a 乙酰乳酸脱羧酶基因对酵母菌的生长速度和发酵雒力没有影 响。 y a m a n o 等( 1 9 9 4 ) 以带g 4 1 8 抗性标记的整合质粒为载体将醋化醋杆菌木 质亚种的a 一乙酰乳酸脱羧酶基因整合到g 4 1 8 敏感的酵母受体菌的染色体中， 获得稳定高效表达的转化株。研究了在振荡和发酵条件下a d c l 、p g k 、g p d 三种启动子对a 一乙酰乳酸脱羧酶基因表达量的影响，证明p g k 启动予是o 乙 酰乳酸脱羧酶基因在酿酒酵母中高效表达的最强的启动子。 w o r b e l 等( 1 9 9 2 ) 构建了含纹膜醋酸杆菌乙酰乳酸脱羧酶基因的酿酒酵 母工程菌，在发酵对比实验中，工程菌熟化期缩短牡1 0 天。o r m e l a 等( 1 9 9 6 ) 利用缺失- - 8 0 0 - - 1 5 0 0 b p 上游序列的a d h 启动子在酿酒酵母细胞中表达细菌 的n 乙酰乳酸脱羧酶基因获得了不产双乙酰的酵母工程菌株。该工程菌产生的 n 一乙酰乳酸脱羧酶足以降低双乙酰在啤酒中的含量，而且该菌适合商浓度麦芽 汁的发酵。 郭文洁等( 2 0 0 1 ) 用随机克隆的方法获得枯草芽孢杆菌的n 乙酰乳酸脱羧酶 基因并实现了该基因在酿酒酵母工业菌株中的表达。 山东大学硕士论文 本实验室秦玉静( 2 0 0 0 ) 等通过建立基因文库克隆到地衣芽孢杆菌豹a 一乙 酰乳酸脱羧酶基因，并实现了该基因在酿酒酵母实验室菌株中的表达。 1 2 3 3 酿酒酵母中基因稳定高效表达策略 酿酒酵母表达体系是广泛应用于外源基因表达的系统之一。随着酵母工程 菌株产业化的要求以及分子生物学技术的发展，使外源基因在酵母菌中稳定高 效表达不仅有其必然性而且具有可能性，各种策略成为近年来研究热点之一。 外源基因稳定高效表达的前提条件是外源基因片段在受体菌中的稳定存在、高 拷贝维持及高效启动子的使用。为了实现外源基因的稳定高效表达采取了各种 策略。 2 口质粒是酿酒酵母( sc e r e v i s i a e ) 的内源性附加体质粒。常规以2f 质粒 为骨架构建的载体( v e p 系列) 可以在酿酒酵母中多拷贝维持，但在没有选择压力 存在时是不稳定的，易于丢失难以实现外源基因的稳定表达。基于天然2 p 质 粒在细胞中多拷贝稳定维持的特性，d a l el l ( 1 9 9 1 ) 以完整的2 爿质粒构建商效 表达载体，寻找对其稳定性没有影响的克隆位点，结果表明2l a 质粒上的h p a i 位点可作为克隆位点，可使外源基因稳定高效表达。k l u y v e r o m y c e s d r o s o p h i l a r m m 中存在着类似于2 口质粒的p k d l ，以该质粒为骨架构建的载体稳 定商效表达了活性木聚糖酶( w a l s hd j ，1 9 9 8 ) 。改造寄主的遗传特性是提高2 j 【f 质粒的稳定性的另一种策略，s l e e pd ( 2 0 0 1 ) 的研究表明，酿酒酵母染色体基 因u b c 4 的突变可以提高内源性2 口质粒的拷贝数及稳定性。 酵母整合质粒不含酵母自主复制序列，不能在酵母细胞中自主复制，一般 是通过载体上的酵母d n a 片段与受体菌基因组发生同源重组，将外源基因整合 到酵母染色体上，并随染色体一起复制、分配，因而具有很好的遗传稳定性。 最初设计的整合质粒载体( 例y i p 5 ) 的整合位点是营养标记，一般整合在染色体 上的外源基因拷贝数少，导致产物表达量小，不能满足大量生产外源蛋白质的 需求( 酵母遗传学，1 9 8 9 ) 。为了提高外源基因的拷贝数，j i n g d o n g z h u ( 1 9 8 6 ) 等人以破坏的自主复制序列a r s 为整合位点，使外源基因在染色体上可达到6 个拷贝。酵母核糖体r n a 的基因r d n a 在染色体中具有l o o 一2 0 0 个重复，是 提高外源基因拷贝数的最佳整合位点之一，t e r e s as l 等构建了以r d n a 为整合 6 山东大学硕士论文 位点的质粒p m i r y 2 ( f o rm u l t i p l ei n t e g r a t i o ni n t or i b o s o m a l d n ai ny e a s t ) ，大大 提高了外源基因拷贝数，且稳定性高。目前以r d n a 为整合位点的载体已用于 表达多种外源蛋白，如n 一乙酰乳酸脱羧酶、异淀粉酶、a 淀粉酶等。潘辉等( 1 9 9 9 ) 采用酿酒酵母2u 环的f l p - f r t 位点特异性重组系统介导外源基因在染色体 r d n a 位点的定点整合。与以往的r d n a 整合技术相比，用于定点整合的质粒载 体只需带有一个f r t 位点，而无需包含r d n a 片段，在转化酵母时无需将其线 性化，而且转化效