（药物化学专业论文）磁性纳米颗粒复合环糊精衍生物作为新型基因载体的研究.pdf

南开大学学位论文使用授权书 l i i llli il li l lill l i iiii y 1813 9 6 6 根据南开大学关于研究生学位论文收藏和利用管理办法，我校的博士、硕士学位获 得者均须向南开大学提交本人的学位论文纸质本及相应电子版。 本人完全了解南开大学有关研究生学位论文收藏和利用的管理规定。南开大学拥有在 著作权法规定范围内的学位论文使用权，即：( 1 ) 学位获得者必须按规定提交学位论文( 包 括纸质印刷本及电子版) ，学校可以采用影印、缩印或其他复制手段保存研究生学位论文， 并编入南开大学博硕士学位论文全文数据库；( 2 ) 为教学和科研目的，学校可以将公开 的学位论文作为资料在图书馆等场所提供校内师生阅读，在校园网上提供论文目录检索、文 摘以及论文全文浏览、下载等免费信息服务；( 3 ) 根据教育部有关规定，南开大学向教育部 指定单位提交公开的学位论文；( 4 ) 学位论文作者授权学校向中国科技信息研究所和中国学 术期刊( 光盘) 电子出版社提交规定范围的学位论文及其电子版并收入相应学位论文数据库， 通过其相关网站对外进行信息服务。同时本人保留在其他媒体发表论文的权利。 非公开学位论文，保密期限内不向外提交和提供服务，解密后提交和服务同公开论文。 论文电子版提交至校图书馆网站：h t t p ：2 0 2 1 1 3 2 0 1 6 1 ：8 0 0 l i n d e x h t m 。 本人承诺：本人的学位论文是在南开大学学习期间创作完成的作品，并已通过论文答辩； 提交的学位论文电子版与纸质本论文的内容一致，如因不同造成不良后果由本人自负。 本人同意遵守上述规定。本授权书签署一式两份，由研究生院和图书馆留存。 作者暨授权人签字： 嫠明星 2 0 1 0年0 5月2 5 日 南开大学研究生学位论文作者信息 论文题目 磁性纳米颗粒复合环糊精衍生物作为新型基因载体的研究 姓名 郑明星学号 2 12 0 0 7 0 7 3 8 答辩日期2 0 1 0 年5 月2 1 日 论文类别 博士口 学历硕士甲 硕士专业学位口高校教师口同等学力硕士口 院系，所 药学院专业药物化学 联系电话l3 8 2 0 3 4 2 3 6 4e m a i l m i n g d e x i n g x i n g y a h o o c o m c a 通信地址( 邮编) ：天津市南开区卫津路9 4 号天南大联合楼d 6 0 5 备注：无 是否批准为非公开论文 否 注：本授权书适用我校授予的所有博士、硕士的学位论文。由作者填写( 一式两份) 签字后交校图书馆， 非公开学位论文须附南开大学研究生申请非公开学位论文审批表。 南开大学学位论文使用授权书 根据南开大学关于研究生学位论文收藏和利用管理办法，我校的博士、硕士学位获 得者均须向南开大学提交本人的学位论文纸质本及相应电子版。 本人完全了解南开大学有关研究生学位论文收藏和利用的管理规定。南开大学拥有在 著作权法规定范围内的学位论文使用权，即：( 1 ) 学位获得者必须按规定提交学位论文( 包 括纸质印刷本及电子版) ，学校可以采用影印、缩印或其他复制手段保存研究生学位论文， 并编入南开大学博硕士学位论文全文数据库；( 2 ) 为教学和科研目的，学校可以将公开 的学位论文作为资料在图书馆等场所提供校内师生阅读，在校园网上提供论文目录检索、文 摘以及论文全文浏览、下载等免费信息服务；( 3 ) 根据教育部有关规定，南开大学向教育部 指定单位提交公开的学位论文；( 4 ) 学位论文作者授权学校向中国科技信息研究所和中国学 术期刊( 光盘) 电子出版社提交规定范围的学位论文及其电子版并收入相应学位论文数据库， 通过其相关网站对外进行信息服务。同时本人保留在其他媒体发表论文的权利。 非公开学位论文，保密期限内不向外提交和提供服务，解密后提交和服务同公开论文。 论文电子版提交至校图书馆网站：h t t p ：2 0 2 1 1 3 2 0 1 6 1 ：8 0 0 1 i n d e x h t m 。 本人承诺：本人的学位论文是在南开大学学习期间创作完成的作品，并已通过论文答辩； 提交的学位论文电子版与纸质本论文的内容一致，如因不同造成不良后果由本人自负。 本人同意遵守上述规定。本授权书签署一式两份，由研究生院和图书馆留存。 作者暨授权人签字： 2 0 1 0 南开大学研究生学位论文作者信息 论文题目 磁性纳米颗粒复合环糊精衍生物作为新型基因载体的研究 姓名 郑明星学号 21 2 0 0 7 0 7 3 8答辩日期2 0 1 0 年5 月2 1 日 论文类别 博士口 学历硕士甲 硕士专业学位口高校教师口同等学力硕士口 院系，所药学院专业药物化学 联系电话1 3 8 2 0 3 4 2 3 6 4 e m a i l m i n g d e x i n g x i n g y a h o o c o r n c n 通信地址( 邮编) ：天津市南开区甲津路9 4 号天南大联合楼d 6 0 5 各注：无是否批准为1 卜公开论文 否 注：本授权书适用我校授予的所有博士、硕士的学位论文。由作者填写( 一式两份) 签字后交校图书馆， 非公开学位论文须附南开大学研究生申请非公开学位论文审批表。 所 包 所 本 非公开学位论文标注说明 根据南开大学有关规定，非公开学位论文须经指导教师同意、作者本人申 请和相关部门批准方能标注。未经批准的均为公开学位论文，公开学位论文本 说明为空白。 论文题目 申请密级 口限制( 2 年)口秘密( l o 年)口机密( 2 0 年) 保密期限 2 0 年月日至2 0年月日 审批表编号批准日期 2 0 年月日 限制2 年( 最长2 年，可少于2 年) 秘密1 0 年( 最长5 年，可少于5 年) 机密2 0 年( 最长l o 年，可少于1 0 年) 中文摘要 摘要 基因治疗是将人的正常基因通过一定方式导入病人的靶细胞来干预疾病的 发生、发展和进程，从而达到治疗的目的。在基因治疗的实施中，有四个重要 的环节：一是寻找有效治疗基因，二是研制可以携带基因进入靶细胞进行表达 的安全的转基因载体体系，三是选择合适转基因的途径，四是如何使治疗基因 在靶细胞中特异性表达，发挥有效治疗作用。其中缺乏有效安全的转基因传递 系统是制约基因治疗研究的一个主要瓶颈。人们越来越认识到选择合适的基因 载体，使目的基因靶向、可控并有效的表达，是基因治疗成功的关键。 本论文研究了一种具有高转染效率，低毒性的基因载体。采用羟丙基环糊 精作为骨架偶联多氨基结构的低分子量聚乙烯亚胺( p e i ) ，与超顺磁性纳米颗 粒自主装，以构建新型可降解，靶向性，低毒性非病毒转基因载体。 实验中我们通过高温分解的方法合成了有机相f e 3 0 4 超顺磁性纳米颗粒，并 且通过可降解酯键的试剂羰基二咪唑( c d i ) 连接羟丙基环糊精和具有多氨基结 构的低分子量聚乙烯亚胺( p e i ) ，得到一种水溶性的环糊精衍生物。然后通过 相转移的方法将磁性纳米颗粒从有机相转化为水相，在复合环糊精衍生物的同 时也提高了磁性纳米颗粒的生物相容性，同时该复合材料也具备了磁相应性以 及结合d n a 的能力。转染实验表明，该复合材料具有可生物降解性，低毒性， 高转染效率等优点，为基因载体的研究提供了一种好的思路和方法。 此外，糖是人体能量的载体和重要的生物信息分子，在许多重要的生理过 程中都发挥着至关重要的作用，在基因载体中连入糖基单体对主动靶向起到重 要作用。本文通过四种路线合成了不同种糖基单体以各基因载体研究。 关键词：非病毒基因载体羟丙基环糊精聚乙烯亚胺基因治疗 a b s t r a c t a b s t r a c t t h eb a s i cc o n c e p tg e n et h e r a p yi st h et r e a t m e n to fd i s e a s e sb yt h ed e l i v e r yo f h u m a nn o r m a lg e n e so rt h e r a p e u t i cg e n e si n t os p e c i f i cc e l l so fp a t i e n t si no r d e rt o s u b s t i t u t et od e f e c to rc o r r e c tt h ef a u l ti ng e n i es t r u c t u r eo rt ok i l lt h ep a t h o l o g i c a l c e l l s f o u rc r i t i c a le l e m e n t sa r ei n v o l v e di nt h em a n i p u l a t i o no fg e n et h e r a p y ：f i r s t l y ， l o o kf o rf u n c t i o n a lg e n e s ；s e c o n d l y , d e v e l o pe f f i c i e n ta n ds a f eg e n ed e l i v e r yv e c t o r s w h i c hc a nd e l i v e r yg e n ei n t ot a r g e tc e l l sa n dt ob ee x p r e s s e d ；t h i r d l y , s e l e c tt h e e f f e c t i v er o u t e st od e l i v e r y ；f o r t h l y , m a k ef u n c t i o n a lg e n ee x p r e s s e di nt a r g e tc e l l s s p e c i a l l y , p r o d u c e dam a r k e de f f e c t n o w ，e f f i c i e n ta n ds a f eg e n ed e l i v e r yv e c t o r si s t h em a i np r o b l e r mi ng e n et h e r a p y n en e e dt od e v e l o pe f f i c i e n t , r e l i a b l e ，a n ds a f e g e n ed e l i v e r yt e c h n i q u e sc o n t i n u e st oi n c r e a s e 、析t ht h ed e v e l o po fa p p l i c a t i o n sf o r g e n et h e r a p y i nt h i ss t u d y , 1 3 - c y c l o d e x t r i nh a sb e e nc h o s e na st h eb a c k b o n d w es y n t h e s i z ea l l i 曲w a t e rs o l u b l e , n o n t o x i cp o l y h y d r o x yh y d r o x y p r o p y lc y c l o d e x t r i n a n dl o w m o l e c u l a rp o l y e t h y l e n i m i n e ( p e i ) w e r es e l e c t e da ss i d ec h a i n t w oc h e m i c a l sa r e c o u p l e d 衍t hc d i ( 1 ，l - c a r b o n y l d i i m i d a z o l e ) t h ec o p o l y m e r s f o r m e dw i t ha d e g r a d a b l ee s t e r a t i cl i n k a g e t h e yw e r ed e t e r m i n e df o ra d v a n t a g eo fv e c t o r so fh i g h e f f i c i e n c yo ft h e i rd e l i v e r yd n ai n t oc e l l s f i n a l l y , w es e l e c tak i n do fh i i g hg e n e d e l i v e r ye f f i c i c e n y , l o wc y t o t o x i c i t y , s p e c i f i cc e l lt a r g e t i n ga b i l i t yg e n ed e l i v e r y s y s t e m b e s i d e s ，s u g a rp l a y sa l li m p o r t a n tp a r t i nm a n yv i t a l p h y s i o l o g i c a lp r o c e s s c o n s i d e r i n gh i g ha f f i n i t yb e t w e e nr e c e p t o ra n dl i g a n d ，w ei n t r o d u c es u g a ra sl i g a n d i ng e n ev e c t o r sw i t ht h ea i mo fa c t i v et a r g e t i n g w ed e s i g nf o u rr o u t e st os y n t h e s i z e d i f f e r e n td e r i v a t e si nt h ef u t u r eg e n es t u d y k e yw o r d s ：n o n - v i r a lg e n ed e l i v e r yh y d r o x y p r o p y l - e y c l o d e x t r i np o l y e t h y l e n i m i n e g e n et h e r a p y i i 1 1 3 基因载体的分类2 第二节阳离子高分子基因治疗载体3 1 2 1 阳离子高分子聚合物d n a 复合物的物理化学性质3 1 2 2 影响基因转染效率的因素4 1 2 3 用于基因传递的阳离子高分子载体6 第三节研究课题提出与实验设计8 1 3 。1 研究课题的提出8 1 3 2 拟定的实验内容9 参考文献1 1 第二章超顺磁性纳米颗粒的合成及性质表征1 3 第一节引言1 3 第二节实验材料与方法1 4 2 2 1 实验材料与试剂1 4 2 。2 2 实验仪器与设备1 4 2 2 3 实验方法1 4 第三节结果与讨论一一1 5 2 3 1 晶体结构表征。1 5 i i i 结构表征2 0 2 0 2 2 2 2 2 4 2 4 2 4 2 5 3 3 3 结构表征2 6 参考文献3 0 第四章磁性纳米颗粒复合环糊精衍生物作为新型非基因载体的研究 ：i ： 第一节引言3 2 第二节实验材料与方法3 2 4 2 1 实验材料与试剂。3 2 4 2 1 实验仪器与设备3 3 4 2 2 实验过程3 3 第三节结果与讨论3 7 本章小结4 0 参考文献。4 2 第五章含糖单体的制备及表征4 3 第一节引言4 3 i v 目录 第二节目标化合物的合成及表征。4 4 5 2 1 实验材料与试剂4 4 5 2 2 实验仪器与设备4 4 5 2 3 实验方法4 4 第三节含糖单体的核磁图谱5 2 本章小结4 0 参考文献6 l 致 射。6 3 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果6 4 v 第一章绪论 1 1 1 引言 第一章绪论 第一节基因治疗概述 随着人类对疾病认识的不断深入，现代医学及相关研究越来越清楚地证明， 多种疾病与基因的结构功能改变密切相关，使得在基因水平上治疗疾病的概念 在理论上具有可行性。现代基因技术发展和人类基因组工程图谱的完成为采用 基因分子生物学方法治疗各类疾病，提高人类生命质量提供了广阔的前景。 目前已有6 0 0 多临床病例，包括3 5 0 0 名遍布世界的病人，用基因治疗来纠正 遗传缺损或治疗后天性疾病，以此证明基因治疗已经达到一个很重要的发展阶 段。现在基因治疗已经进行了较多的研究，全世界范围内已经批准的基因治疗 临床试验方案己经超过了1 2 0 0 项。其中约有近7 0 是针对恶性肿瘤的治疗【l j 。 2 0 实际9 0 年代以来，随着生物化学与分子生物学理论的不断发展，基因治 疗( g e n et h e r a p y ) 已成为生命科学中最热门的研究课题之一。近年来各国纷纷 将人类基因组研究列为国家重大研究项目。在已知的人类疾病中有数千种疾病 是基因相关的，其中包括与单基因相关的先天性遗传疾病与多基因相关的后天 疾病。大部分后天疾病是各种内外因素作用于人体的遗传物质使其功能发生紊 乱而造成的。导致疾病的原因主要是基因缺陷与基因缺失。因此，基因治疗会 成为医疗领域的一场革命，对现有的疾病治疗产生深刻的影响。 1 1 2 基因治疗的方法 基因治疗的原理是：适当的外源基因引入人体细胞内，以弥补缺陷或缺失 的基因，表达出相应的蛋白质，从根本上消除产生疾病症状的内在因素。通俗 的解释为：如果病人因缺少某种已知基因患病，可以把缺少的基因通过某种特 定的载体传递到癌变的细胞内，使之表达，就可能会直接纠正基因缺乏，从而 达到治愈疾病的目的【1 】；若从基因的角度不知道病因，仅能知道病理，可以利 第二章超顺磁性纳米颗粒的合成及性质表征 用基因载体把适当的基因输送到癌变细胞处，通过其他途径破坏该病的机制。 在基因治疗的实施中，有四个重要的环节：一是寻找有效治疗基因，二是 研制可以携带基因进入靶细胞进行表达的安全的转基因载体体系，三是选择合 适转基因的途径，四是如何使治疗基因在靶细胞中特异性表达，发挥有效治疗 作用郾j 缺乏有效安全的转基因传递系统是制约基因治疗研究的一个主要瓶颈 【4 5 】。越认识到选择合适的基因载体，使目的基因靶向、可控并有效的表达，是 基因治疗成功的关键。 1 1 3 基因载体的分类 目前的基因载体可分为病毒载体和非病毒载体两种。 第一类：病毒载体 该方法是采取改变或失活病毒基因组的方法，阻止其自我复制，以此降低 病毒载体的毒性，并使病毒载体能够携带治疗基因，进行基因传递的工作。 应用比较广泛的是逆转录病毒，腺病毒，疱疹病毒和腺相关病掣6 j 等。病毒 载体由于充分利用了病毒高度进化所具有的感染和寄生特性，其有较高的转染 效率。但是，病毒载体有一定的局限性和风险性。病毒载体对可携带的基因大 小有限制性。它可能整合到宿主基因组并永远改变宿主基因结构，还可能因重 组或恢复活性而自我复制，并且病毒载体的重复使用会引起强烈的免疫响应， 不能转染非分裂细胞。特别是在1 9 9 8 年美国滨州大学人类基因治疗中心发生的 一例使用腺病毒基因治疗导致死亡的病例后【7 1 ，限制了病毒载体在人类临床实验 的研究。人们开始寻找更有效的基因传递系统。 第二类：非病毒基因载体 非病毒载体与病毒载体相比，有安全方面的优势，表现为较低的免疫原性， 不具备插入突变的能力，还具有较低成本和易于大规模生产优点，如可以携带的 基因从2 0 b p 的寡聚核苷酸到1 0 0 b p 的质粒d n a ，甚至更大的d n a ，还可易与结合 其他物质，这些使治疗基因传递系统具有靶向特异性等优点。 但非病毒载体的最大缺点是其转基因效率较低。要想获得转染效率高的基 因传递系统，首先选择合适的载体，有效浓缩d n a 分子形成稳定的纳米粒子， 保护d n a 分子的生物活性并避免酶解：能从给药部分转运至靶点并被靶细胞内 吞，在细胞内实现d n a 分子的解离释放和表达。 2 第二章超顺磁性纳米颗粒的合成及性质表征 非病毒基因载体主要包括：裸d n a ( n a k e dd n a ) 8 1 ，阳离子脂质体 9 1 和高分 子载体系统1 6 】 裸d n a ( n a k e dd n a ) 即把目的基因连接在表达的质粒或噬菌体中直接注射 而不依赖其它物质的介导，是种最简单的非病毒载体系统。电穿孔和基因枪出 现后，采用该方法避免了各种酶对d n a 的降解。目前使用的d n a 疫苗，是用 编码病毒抗原的质粒直接肌肉注射，可得有效的抗病毒免疫。但是不足之处是 裸d n a 的稳定性和转染效率不高，靶向性较差。 阳离子脂质体己被广泛应用于药物控释系统。目前使用的这类基因载体结 构都是一端有1 2 条由1 2 1 8 个碳原子组成的疏水链，使其在水性介质中形成双 层结构，并包裹d n a ；另一端为亲水性的矿头部，通过静电力与d n a 结合以 形成脂质复合物。但是也有不足，体内外转染条件差别大，易结合血浆蛋白， 重复使用毒性高等等缺点。 高分子载体利用人工合成和天然的高分子与d n a 形成复合物，通过细胞吞 噬作用将这些复合物导入细胞内。其优点是毒性小，安全性高，具有可修饰的 官能团，也可以赋予基因载体细胞靶向传递的能力。基于这些优点，高分子基 因载体的研究成为生物医用材料研究热点，有很大的发展空间。 第二节阳离子高分子基因治疗载体 1 2 1 阳离子高分子聚合物d n a 复合物的物理化学性质 阳离子高分子聚合物主要依靠带正电的聚合物将d n a 包装成一定大小的 d n a 复合物进行输送【l0 。受体介导的非病毒载体基因治疗中有效的d n a 复合 物输送过程主要是：阳离子聚合物将d n a 包装成一定大小、稳定的复合物后， 在某种组织或细胞附近，通过受体介导或以内吞的形式进入细胞内，从内吞囊 泡中释放出来后，d n a 通过核孔进入细胞核，在细胞核内进行表达【1 1 】。图1 1 是阳离子载体携带基因转染细胞的过程示意图。 3 1 2 2 1 细胞外屏障 1 与血液成分的作用 用体内进行基因治疗，d n a 阳离子高分子复合物通过血液循环分布到各组 织中。当复合物和血清蛋白、血细胞接触后，其生物分布依赖于与其最新获得 的生理化学性能。 2 免疫体统的识别 d n a 阳离子高分子复合物作为外来材料被免疫细胞( 特别是单核的吞噬细 胞系统) 识别和吞噬，会产生免疫反应。这种免疫反应不但会引起毒性，并且 降低了基因的转染效率 1 3 , 1 4 1 。 3 血管渗透性 在许多情况下，d n a 阳离子高分子复合物需要渗透果毛细管壁才能与靶向 细胞接触。毛细管壁的构造和它所在的组织有关，一般分为三类：连续，有孔， 非连续的【l5 1 。在正常情况下，只有粒径相对比较小的d n a 阳离子高分子复合物 能渗透过由非连续的内皮细胞组成的血管壁。 4 第二章超顺磁性纳米颗粒的合成及性质表征 1 2 2 2 细胞内屏障 1 细胞壁屏障 d n a 阳离子高分子复合物可以与细胞膜通过电荷相互作用及包吞作用穿过 细胞膜屏障，被细胞摄取。 2 内体逃逸 d n a 阳离子高分子复合物穿过细胞膜进入其中形成内涵体，内涵体中含有 能降解d n a 的酶，从而导致d n a 的降解和失活，故复合物需尽快从内涵体中 逃逸【1 6 】。 3 细胞核屏障 d n a 阳离子高分子复合物从内涵体中逃出后，在细胞质中迁移，通过核孔 进入细胞核才可以进行基因表达，目前没有对复合物进行细胞核的过程进行研 究。 1 2 2 3 基因转染中的载体因素 载体因素主要有四个方面： 1 z e t a 电位：z e t a 电位与载体所带的电荷量密切相关，带电量高则z e t a 电 位高，带电量低则z e t a 电位高。相对阳离子载体而言，z e t a 电位高一般可以与 d n a 牢固结合。 2 粒径：影响转染的主要因素。粒径越小转染效率越高。粒径是决定转 染系统进入溶酶体的主要因素。小的粒径易使转染系统快速进入溶酶体而被降 解，较大的粒径进入溶酶体就慢，延长d n a 在细胞内的时间，增加其从内涵体 中逃逸的机会。 3 n p 的值：n p 值就是载体氨基上的氮原子和d n a 磷酸根上磷原子的比 值。在生理条件下，一个氮原子由于结合质子而带一个正电荷，d n a 中一个磷 酸根带一个负电荷，故n p 值也能理解为正负电比值，n p 值最终关系到基因 转染载体系统带正点还是负电。 4 毒性：复合物的毒性直接影响到转染效率。脂质体的毒性比阳离子高分 子载体高，即转染效率低的限制性因素。但毒性低不一定转染效率高。 5 第二章超顺磁性纳米颗粒的合成及性质表征 1 2 3 用于基因传递的阳离子高分子载体 1 阳离子多肽 多聚赖氨酸( p l l ) 是较早使用与基因导入的阳离子聚合物纳米材料，许多 研究已经成功将p l l d n a 形成的纳米颗粒用于基因导入。多聚赖氨酸一个优势 是其易于化学修饰，能与配体结合而用于受体介导基因导入。缺点是p l l 与d n a 形成的复合物在体内易与带负电荷的非特异性细胞和血浆蛋白结合，以及在溶 酶体内易于水解失活等。目前是将p l l 与其他材料结合以改善其性能。 用于修饰p l l 的材料较多使用聚乙二醇( p o l y e t h y l e n e g l y c o l ，p e g ) ，p e g 修饰p l l 后屏蔽p l l d n a 复合物的部分表面电荷，增加复合物水溶性，是复 合物易于基因转导。p e g 是种可降解的高分子材料，有经济，易得，独特的端 基反应性和可修饰性以及很好的稳定性和无免疫性等优点。 聚乳酸- 羟基乙酸共聚物( p o l y l a c t i c p o l y g l y c o l i c a c i d ，p l g a ) ，p l g a 不仅具 有可降解性和安全无毒性，而且有保护生物大分子活性的作用。p l g a 自身就 可以作为基因载体。p l g a 与p l l 结合后能明显改善p l l 性能。 2 聚酰胺胺型树枝状高分子( p o l y a m i d o a m i n ed e n d r i m e r s ，p a m a m ) ： p a m a m 树枝状高分子具有毒性低，分子尺寸精确易控制和修饰的特点， 是一类新型的生物医用高分子材料【i 引。 p a m a m 树枝状聚合物有多个末端氨基，在生理p h 下，这些氨基发生质子 化，使p a m a m 带上球体聚阳离子特征。这些聚合物与传统的聚合物明显不同 于它们本质上呈单分散型，相对分子质量达到5 0 0 ，0 0 0 1 ，0 0 0 ，0 0 0 ，在大小形状上 是均一的【1 9 1 。 近年来，随着树枝状高分子研究的不断发展，人们的注意力以及从合成不 同类的树枝状高分子逐步转移到树枝状高分子功能化以及开发树枝状高分子的 应用能力上。在合成p a m a m 时随时可以通过控制代数、中心核分子种类和末 端功能团的性质来调整和控制其结构的大小，进而改进其转移基因的特性，增 强d n a 的转染效率。除此以外，由于p a m a m 末端具有大量的活性官能团，如 果能对树枝状高分子进行修饰，针对不同的细胞，连接特定的蛋白或受体，以 及携带磁性等，都可以使p a m a m 介导的基因转移具有靶向性。图1 2 是 p a m a m 结构示意图： 6 第二章超顺磁性纳米颗粒的合成及性质表征 图1 2p a m a m 结构示意图 3 天然阳离子高分子 比较来说，天然阳离子高分子生物相容性好，毒性低，适合用做基因传递 系统。研究较多的是壳聚糖( c h i t o s a n ) 及其衍生物。壳聚糖属于天然高分子多 糖，无毒副作用，具有生物黏附性、生物相容性和可降解性。由于壳聚糖分子 量较大，不能溶于水，给纳米微粒的制备带来了许多不便。通过对其进行改性， 制备其衍生物，既能保留其优良的生物可降解性，又可使分子量降低，细胞毒 性降低，水溶性和靶向型增强。壳聚糖最早被用作基因载体是在1 9 9 5 年1 2 0 l 。 阳离子明胶也可作为有效的基因传递系统。明胶是i 型胶原的变形形式，它 是一种在3 5 4 0 以下胶化的多聚两性电解质。在p h 小于5 时，明胶带正电荷， 能与带负电荷的d n a 发生静电吸附，通过共沉淀法制备复合物的纳米颗粒。交 联后的复合物在高离子强度的溶液中保持稳定，但未交联的复合物在p b s 中易 解离。明胶d n a 纳米颗粒中的d n a 的释放主要受明胶蛋白降解的影响。 4 聚乙烯亚胺( p o l y e t h y l e n e i m i n e ，p e i ) 这种阳离子结构有两种类型：线性的和支化性。用于基因传递的p e i 多为 支化结构，最常用的有分子量为6 0 0 ，和2 5 0 0 0 。p e i 由c h 2 c h 2 n 结构单元组 成，是已知电荷密度最大的阳离子有机高分子。支化p e l 分子中有一级胺，二 级胺，三级胺，在生理条件下，能部分质子化从而使p e l 分子带有正电荷，故 通过电荷相互作用形成紧密的复合物。 7 第二章超顺磁性纳米颗粒的合成及性质表征 p e i 的高转染效率和它的缓冲能力有很大关系。p e i 可抑制溶酶体在吞噬泡 酸性环境中的质子化，对d n a 提供更大的保护作用。p e i 能促使一股强大的 c l 流而引起吞噬泡膨胀并破裂，进而释放d n a 到细胞质中【2 l 】。 因为p e i 是有机聚合物，不容易被细胞内的酶代谢，易于在核内聚集而引 起细胞毒性。研究发现小分子量p e i ( 3 o h 6 o h ，在2 0 n a o h 的水 相体系中，1 3 环糊精的6 位仲羟基选择性的与l ，2 环氧丙烷发生了反应，首先 1 3 环糊精的6 位仲羟基在o h 的作用下，失去氢质子，形成1 3 环糊精的氧负离 子，随后进攻1 ，2 环氧丙烷的1 位碳，发生亲核反应。从碳谱可知，c 6 发生明 显的低场裂分( 6 0 1 7 6 7 8 7 ) 。证明确实在c 6 位发生了羟丙基化反应。 图3 4 6 - o - ( 2 - 羟基丙基) - 1 3 - 环糊精反应机理 3 3 2 平均取代度( d s ) 的计算 由图谱3 5化合物a6 o ( 2 一羟基丙基) 1 3 环糊精的1 hn m r 分析可知， 其中一个葡萄糖单元中h 9 和h 1 的离得较远且相互无影响，可以借助羟丙基 基团h 1 0 和环糊精h 1 的积分比值计算出平均取代度的大小。设化合物的平均 取代度为x ，h 1 0 积分值1 5 代表3 个氢，h 1 积分值7 ，代表b 环糊精h 1 的个数，因1 3 环糊精由7 个葡萄糖环组成。 故列方程式： 15 3x = 7 7 可得出化合物a6 o ( 2 羟基丙基) b 环糊精的其平均取代度为x = 5 通常用 d s 表示环糊精衍生物的平均取代度。 2 5 图3 56 - o - ( 2 羟基丙基) b 环糊精1 hn m r 3 缎 l 瞳 o 3 3 3 结构表征 本实验在b r u k e r 4 0 0 m 核磁共振仪上采用氢谱( 1 h n m r ) 和碳谱( 1 3 c n m r ) 对 不同取代度及不同取代位置的环糊精衍生物进行表征。待测样品经纯化后，将 产品在干燥的环境下转入核磁管中，迅速加入重水将其全溶解后测定核磁氢谱 和碳谱。 化合物a6 - 0 ( 2 羟丙基) b 环糊精( 平均取代度d s = 5 ) 1 hn m r ( d 2 0 ，4 0 0m h z ) ：65 0 1 ( m ，1 h ，h 一8 ) ，4 9 6 ( m ，7 h ，h - 1 ，h 一1 ) ，3 8 6 3 2 8 ( m ， 6 3 h ，h 2 ，h 2 ，h - 3 ，h 3 ，h 4 ，h 一4 ，h 一5 ，h 5 ，h 一6 ，h - 6 ，h - 7 ，h - 7 ) ，1 0 4 ( m ， 1 5 h ，c h 3 ) ；1 3 cn m r ( d 2 0 ，4 0 0m h z ) 8 1 0 1 8 1 ( c 1 ) ，8 1 0 6 ( c 一4 ) ，7 6 1 7 ( c 一7 ) ， 7 3 0 3 ( c - 3 ) ，7 1 9 7 ( c 一2 ) ，7 1 7 5 ( c 一5 ) ，7 0 6 6 ( c - 8 ) ，6 7 8 7 ( c 一6 ) ，6 6 5 4 ( c 一6 ) ，6 6 1 2 ( c 一6 ) ， 6 0 17 ( c - 6 ) ，3 6 8 6 ( c - 9 ) 姊m 即 3 6 6 - 0 一( 2 - 羟丙基) 一1 3 - 环糊精( 平均取代度d s = 5 ) 1 h n m r ，1 3 cn m r 2 7 第三章羟丙基环糊精偶联低分子量聚乙烯亚胺的合成及结构表征 化合物b6 一o - ( 2 一羟丙基) 一1 3 一环糊精( 平均取代度d s = 3 8 2 ) 1 hn m r ( d 2 0 ，3 0 0m n z ) ：64 9 ( d ，7 h ，h 1 ) ，3 2 3 8 ( m ，5 4 h ，h 2 ，h 2 ，h 3 ，h 3 ，h 一4 ， h - 4 ，h 一5 ，h 5 ，h 6 ，h - 6 ，h 一7 ，h - 8 ) ，1 0 0 1 9 6 ( m ，12 h ，h 一9 ) o 舶4 0 a o 2 01 oa 0 鲫( n ) 图3 76 - 0 - ( 2 羟丙基) t 3 环糊精( 平均取代度d s = 3 8 2 ) 1 hn m r o 化合物c 6 - 0 ( 2 一羟丙基) 1 3 - 环糊精( 平均取代度d s = 5 6 9 ) 1 h n m r ( d 2 0 ，4 0 0 m h z ) ：8 4 9 2 ( s ，7 h ，h 1 ) ，3 8 7 3 2 4 ( m ，4 h ，h 2 ，h 2 ，h 3 ，h 3 ，h 4 ，h 4 ，h 5 ，h 5 ，h 6 ，h 一6 ，h 7 ，h 8 ) 1 0 0 - 4 ) 9 8 ( d ，1 2 h ，h 9 ) ；1 , 3 c n m r ( d 2 0 ，4 0 0 m h z ) ：8 1 0 2 9 ( c - 1 ) ，8 1 3 3 ( c - 7 ) ，7 6 4 4 ( c - 4 ) ，7 3 3 3 ( c 一3 ) ，7 2 2 0 ( c 一2 ) ，6 6 3 1 ( c 一8 ) ，7 0 9 6 ( c - 6 ) ， 6 9 31 ( c 一6 ) 图3 8 6 - 0 - ( 2 一羟丙基) 一1 3 环糊精( 平均取代度d s = 5 6 9 ) 1 hn m r 化合物d 2 一o 一( 2 一羟丙基) - b - 环糊精( 平均取代度d s = 4 ) 1 h n m r ( d 2 0 ，3 0 0 m h z ) ：5 0 5 - 4 8 6 ( m ，7 h ，h 1 ，h 1 ) 3 8 3 3 2 6 ( m ，5 4 h ，h 2 ，h - 2 , h 3 ，h 一3 ，h - 4 ，h - 4 ，h - 5 ，h 一5 ，h - 6 ，h 一6 ，h 一7 ，h - 8 ) 0 9 6 0 9 2 ( m ，1 2 h ，h 一9 ) 枷 1 0 0 5 0o3 0 2 j oi o0 0 p l a t o 们 图3 1 06 - 0 - ( 2 羟基丙基) - b 环糊精p e i6 0 01 hn m r 瑚： 髓j * ； n 拟i i 再 掌2 ； 钟： ； 秘j 。鄂i ；黝i 蠡 l 托； 嚣 塞 b | ： ： l - 8 1 秘 ；一j 7 2 ； 瘩至 ：。： i ! 伪； 联m3o：oi o i f b t c - 卜l j 图3 1 l6 o 一( 2 一羟基丙基) 一1 3 一环糊精- p e i 6 0 0f t - i r 红外吸收谱图中，1 7 0 6 4 5 处有羰基吸收峰说明新的化合物6 - o ( 2 一羟基丙基) - 1 3 环糊精p e i 一 6 0 0 生成。 第三章羟丙基环糊精偶联低分子量聚乙烯亚胺的合成及结构表征 参考文献 【l 】v i l l i e r s ，a c o m p t r e n d 1 8 9 1 ，1 1 2 ，5 3 6 【2 】s z e j t l ij i n t r o d u c t i o na n dg e n e r a lo v e r v i e wo fc y c l o d e x t r i nc h e m i s t r y j c h e mr e v , 19 9 8 ，9 8 ( 5 ) ：17 4 3 - 17 5 3 【6 】g i l l e tb ，n i c o l edl ，d e l u e c h j t h eh y d r o x y lg r o u pp r o t o n a t i o nr a t e so f 1 3a n d 丫 c y c l o d e x t r i n si nd i m e t h y ls u l p h o x i d e ，t e t r a h e d r o nl e t t , 19 8 2 ，2 3 0 ) ：6 5 - 6 8 【7 】l a c hjl ，c h i ntes c h a r d i n g e rd e x t r i ni n t e r a t i o ni v i n h i b i t i o no fh y d r o l y s i sb ym e a n so f m o l e c u l a rc o m p l e xf o r m a t i o n j p h a r m s c i ，19 6 4 ，5 3 ( 8 ) ，9 2 4 9 2 7 【8 】l a c hjl ，c h i ntf i n t e r a t i o no fp h a r m a c e u t i c a l sw i t hs c h a r d i n g e rd e x t r i n si i i i n t e r a c t i o n s w i t hm o n o - h a l o g e n m e db e n z o i ca c i d sa n da m i o b e n z o i ca c i d s j jp h a r r n s c i ，1 9 6 4 ，5 3 ( 8 ) ，6 9 【9 】陶涛羟丙基- t 3 - 环糊精的特性及其药剂学应用中国医药工业杂志，2 0 0 2 ，3 3 ( 6 ) ： 3 0 5 【1 0 】蔡溱，高中1 3 - 环糊精及其衍生物在药剂学上的应用与研究进展国外医学药学分 册，1 9 9 6 ，2 3 ( 1 ) ：1 3 【l l 】d a v i sme ，b r e w s t e rme c y c l o d e x t r i n s - b a s e dp h a r m a c u t i c s ：p a s t , p r e s e n ta n dfu t u r e r e v d r u gd i