（轻工技术与工程专业论文）酶促羧酸酯类香精和糖酯的合成研究.pdf

一，lc 一、 学位论文数据集 | l i l l | l l l l l l l l l l l | i l l i l i i 帅l y 18 7 7 3 5 8 中图分类号q8 1 4学科分类号 1 8 0 7 1 4 0 论文编号 1 0 0 1 0 2 0 1 1 1 1 4 5 密级内部事项 学位授予单位代码 1 0 0 l o 学位授予单位名称北京化工大学 作者姓名马娅学号 2 0 0 8 0 0 11 4 5 获学位专业名称轻工技术与工程获学位专业代码 0 8 2 2 0 3 课题来源国家自然科学基研究方向酶催化 论文题目酶促羧酸酯类香精和糖酯的合成研究 关键词 食品添加剂、香精、糖酯、酶催化、c a n d i d as p 9 9 1 2 5 论文答辩日期 2 0 1 l 一5 2 3论文类型应用研究 学位论文评阅及答辩委员会情况 姓名职称工作单位学科专长 指导教师邓利副教授北京化工大学酶催化、油脂综合利用 评阅人1徐家立研究员中科院微生物所酶工程、生物化工 评阅人2王芳教授 北京化工大学 生物化工 评阅人3 评阅人4 评阅人5 徽员蝴冯嵬教授北京化工大学生物工程 答辩委员l王芳教授北京化工大学生物化工 答辩委员2张丽叶教授 北京化工大学生物材料 答辩委员3 田平芳 副教授 北京化工大学分子生物学 答辩委员4张鹏副教授 北京化工大学微生物学 答辩委员5 注：一论文类型：1 基础研究2 应用研究3 开发研究4 其它 二中图分类号在中国图书资料分类法查询。 三学科分类号在中华人民共和国国家标准( g b t1 3 7 4 5 9 ) 学科分类与代码中 查询 四论文编号由单位代码和年份及学号的后四位组成。 摘要 酶促羧酸酯类香精和糖酯的合成研究 摘要 食品添加剂是指加入食品中，使食品的色、香、味俱佳的物质， 食品添加剂根据不同分类标准可以分多种。其中香精和乳化剂是食品 添加剂中的重要物质，随着人们生活水平的提高和传统的食品添加剂 生产方法显露出来的品质问题，近年来，绿色生产的食品添加剂成为 人们研究的热点。本文以实验室自制的国刀优如s p 9 9 1 2 5 脂肪酶为催 化剂，合成酯类香精和糖酯类的表面活性剂，探讨了酶促合成过程中 的各个影响因素以及对分离纯化工艺进行研究。主要工作如下： l 、开发了利用本实验室自制的固定化国，z 疣如s p 9 9 1 2 5 脂肪酶 催化己酸乙酯的合成的一条新工艺。研究了酶促合成过程中的影响因 素，最优条件为：反应溶剂为正己烷5 m l ，己酸浓度o 3 m ，醇酸摩 尔比1 6 ：1 ，加酶量o 1 2 3 9 ，硅胶加入量o 6 9 ，4 0 ，1 5 0 r m i n 下反 应8 h ，最终己酸转化率为9 6 。研究了固定化酶催化反应过程中的 使用寿命，发现第3 批次的酸转化率仍能达到7 5 。反应溶剂正己烷 经过处理之后可以回收利用。 通过对己酸乙酯合成过程的一些条件进行调控，结果发现：在己 酸低浓度下流加乙醇没有显著效果；当己酸浓度高于o 8 3 m 时，流加 乙醇效果明显，酸转化率可提高1 0 左右。将酶用含反应底物的溶液 进行预处理，效果不显著。 北京化工大学硕士学位论文 2 、研究了短链酸和短链醇合成羧酸酯反应的一般规律。结果发 现随着酸碳链长度的增加，酸转化率随之增加，随着醇碳链数的增加， 酸转化率先上升后下降。在无溶剂条件下，己酸能与除了乙醇之外的 其他几种短链醇发生酯化反应，己酸丁酯、己酸戊酯合成效果最好， 且最适醇酸摩尔比都为1 6 ：1 ，己酸转化率分别为5 7 和3 7 。 3 、系统对比研究了薄层色谱、气相色谱、液相色谱这几种分析 糖酯的方法。结果发现薄层色谱和液相色谱是较好的分析方法。薄层 色谱能够快速定性的分析糖酯反应液中的各个组分，以甲苯：乙酸乙 酯：甲醇：水( 1 0 ：5 ：4 5 ：o 2 ，v 肭) 为展开剂，分离效果最好。 气相色谱分析糖酯需要对糖酯进行衍生化，过程较为繁琐，且分离效 果较差。液相色谱可用作果糖酯的定量分析，选择流动相为纯甲醇， 流速为1 m l m i n ，e l s d 漂移管温度为4 0 ，载气流速为2 l m i n ，在此 条件下，各组分的分离度较高。此外，还对液相色谱法分析果糖酯的 精密度、回收率和稳定性进行研究，均符合测定要求，说明液相色谱 法是分析糖酯的最优方法。 4 、开发了利用固定化勖 历如s p 9 9 1 2 5 脂肪酶合成果糖月桂酸 酯的新工艺。研究了溶剂、底物浓度、底物摩尔比、加酶量、分子筛 浓度等对酶促合成果糖月桂酸酯的影响。结果显示：在6 0 ，3 0 0 印m 的磁力搅拌水浴锅中预处理2 h 。最佳合成条件：果糖初始浓度o 0 8 m ， 酸糖摩尔比为4 ：1 ，加酶量为o 0 2 5 m 1 溶剂，分子筛加入量为o 0 6 9 “ 溶剂，温度4 5 ，此时果糖月桂酸单酯得率在3 0 9 l 。 研究了酶预处理方式对酶活性的影响，选择了低浓度的盐溶液和 l i 处理 性并 未得到改善。 5 、探索了果糖和月桂酸合成产物的分离纯化工艺，研究对比了 液液萃取和柱层析两种分离的方法。结果显示：氯化钠溶液为2 4 ， 氯化钠溶液与反应液体积比为l ：1 ，4 0 下除糖，效果最好，用饱 和碳酸钠溶液除月桂酸，最后产品纯度可达9 5 ，得率为31 。柱层 析法以甲苯：乙酸乙酯：甲醇：水( 1 0 ：5 ：4 5 ：o 2 ，v v v v ) 为流 动相，上样量3 9 分离效果最佳，产品最终纯度为9 2 ，得率为8 3 。 ， 关键词：食品添加剂，香精，糖酯，酶催化，阮，z 旃如s p 9 9 1 2 5 i 二坠巡三查兰堡圭兰垡丝奎 i v e n z y m a t i cs y n t h e s i s0 fc a r b o x y l i ce s t e r f r a g r a n c e a n ds u g a re s t e rw i t hi m m o b i l i z e dca n d i d as p 9 9 一l2 5 a b s t r a c t f o o da d d i t i v e sa r ei m p o r t a n ti nf o o di n d u s t r i e s ，t h e yc a ni m p r o v e t h ec 0 1 0 r ，f l a v o r ，a n dt a s t eo ft h ef o o d f o o da d d i t i v e sc a nb ed i v i d e di i l t o m a n yt y p e st h r o u 曲d i f f e r e n tm l e s n o w a d a y s ，e i l z 舯a t i cc a t a l y z e df o o d a d d i t i v e sa r es t u d i e dw i d e l yb e c a u s et h ep r o d u c t ss y n t h e s i z e db y c h e m i c a lw a yh a v es o m es h o r t c o m i n g i nt h i ss t u d y ，s e l f e s t a b l i s h e d i m m o b i l i z e dl i p a s eq ，z 疣如s p 9 9 一l2 5w a s 锄p l o y e dt oc a t a l y z et h e p r o d u c t i o no fc a r b o x y l i ce s t e r a n ds u g a re s t a 1 1 dt h ef a c t o r sd u r i n gm e c a t a l y z e dp r o c e s si n c l u d i n gs o l v e n t ，e n 习吼e 锄o u n t ，m o l e c u l a r s i e v e s a n dp r e t r e a t m e n to fl i p a s ew e r ei n v e s t i g a t e d ，m ep u r i f i c a t i o no ft h es u g a r e s t e rw a sa l s os t u d i e d t h er e s u l t sw e r ea sf o u o w s ： 1 、t h ei n u n o b i l i z e dl i p a s ec 口，z d 讹s p 9 9 一l2 5c a t a l y z e ds y n m e s i so f e t h y lh e x a n o a t ei ns o l v e n tw a s s t u d i e d t h ee f f e c t so fs o m ef a c t o r so nt h e c o n v e r s i o no f h e x a n o i ca c i dw e r ei n v e s t i g a t e d ，m es o l v e n t ，t h e 锄o u n to f l i p a s e ，t h ec o n c e n t r a t i o no fa c i d ，t e m p e r a t u r e t h er e a c t i o nw a s p e r f o m e di n5 m l s o l v e n ts y s t e m ，t h eo p t i m a lr e a c t i o nc o n d i t i o n sw e r e r e a c t i o nt e i l l p e r a t l l r e4 0 ，s h a k es p e e d15 0 r m i n ，h e x a n o i ca c i d v c o n c e n t r a t i o no 3m ，t h eh e x a n o i ca c i d e t h a n o lr a t i ol ：1 6a 1 1 dt h e a m o u mo f l i p a s eo 12 3 9 ，c e r t a i n 锄o u n to fs i l i c ag e lw a sa d d e dt ot h e r e a c t i o nm e d i u ma st h ew a t e r d b s o r b e n t t h ec o n v e r s i o no ft h ea c i d r e a c h e d9 6 a r e rr e a c t i o nf o r8hu i l d e rm e o p t i m a lc o n d i t i o n s t h e s t a b i l i t yo ft h ei m m o b i l i z e dl i p a s ew a sa l s os t u d i e d ，a n dt h ec o n v e r s i o no f t h ea c i dr e m a i n e da b o v e7 5 a r e r3b a t c h e s t h ec o n t r o lt ot h er e a c t i o nw a s s t i l d i e d ，s u c ha ss t 印w i s ea d d e dt h e e t h a n o la n d p r e 仃e a t e dt h e 黜卿ew i t hs u b s t r a t e t h er e s u l t ss h o w e dt h a t i t se 腩c t i v et os t e p w i s ea d dt h ee t h a n o li nh i g h a c i dc o n c e n t r i l t i o n ，b u t t h ee f f e c to f p r e t r e a 衄e n tt 0e n z m ew a sn o to b v i o u s 2 、i nt h es y n t h e s i so fs h o r ta l c o h o la n d s h o r ta c i d ，t h ec o n v e r s i o no f t h ea c i di n c r e a s e dw i t ht h ec a r b o nn u m b e r o ft h ea c i d w h e nt h ea c i d c a r b o nn u m b e rw a s l e s st h a nt l 玳e ，t h ee f f e c to ft h ea c i dt ot h er e a c t i o n w a sm o r e s i g n i f i c a n tt h a nt h ea l c o h o l ，h o w e v w h e nt h ea c i dc a r b o n n u m b e rw a sm o r et h a nt h r e e ，t h ee f i f e c to f a l c o h o lt ot h er e a c t i o nw a sm o r e i m p o r t a n tt h a nt h ea c i d ，a c e t i ca c i da n de t h a n o lh a di n h i b i t i o nt oe n z y m e s m u s tb ed e i i i v a t e db e f i o i e e s t e rq u a n t i t a t i v ea n a l y s i s ， m em o b i l ep h a s ew 硒m e t h a n o l ，n o wr a t e11 1 1 ：l m i n ，“rt e m p e r a t u r eo f e l s dw a s4 0 ，c 御t i e rg a sn o wr a t e2 l m i n u n d e rt h ec o n d i t i o n ，e v e r y c o m p o n e n ti nt h er e a c t i o ni n c l u d i n gm l c t o s e ，f m c t o s em o n o l a u r a t e ，l a u r i c a c i d ，6 1 l c t o s ed i l a u r a t ec o u l db ed i v i d e de f f e c t i v e l y 4 、i n 也ep r e s e n tw o r k ，i m m o b i l i z e dl i p a s ec a t a l y z e df m c t o s e m o n o l a u r a t ei no 唱a n i cs o l v e n tw a ss t u d i e d u s i n gi m m o b i l i z e dl i p a s e c 锄疣如s p 9 9 12 5 ，t h ee f f e c t so f d i 绦黼n ts o l v e n t s ，t e m p e r a t u r e ，e n z y m e a m o u n t ，m o l a rr a t i oo fa c i d f m c t o s e ，m o l e c u l a rs i e v e so nr e a c t i o n ，a n d d i f r e r e i l tk i n d so f l i p a s ep r e t r e a t m e n tw e r ei n v e s t i g a t e d t - b u t a n o lw a s s e l e c t e da st h e 陀a c t i o nm e d i u m t h eo p t i m a lc o n d i t i o n sf o rm l c t o s e m o n o l a u r a t es y n t h e s i sw e r e ：r e a c t i o nt e i n p e r a t u r e4 5 ，e n 刁，1 1 1 ea m o u n t 2 5g l ，m o l a rr a t i oo fa c i 彤肌c t o s e4 ：1 ，m o l e c u l a rs i e v e s6 0 l t h e c o n c e n t r a t i o no ft h e 丘1 l c t o s e 瑚d n o l a u r a t ew a sa b o v e3 0 l t h ee f i f e c to f s a l ts 0 1 u t i o n so nt h el i p a s ea c t i v 时s h o w e dt h a t ( n h 4 ) 2 s 0 4 ( 1n l m ) s o l u t i o nw a sh e l p 如l t ot h ei m m o b i l i z e d1 i p a s e 5 、t h es 印a r a t i o na n dp u r i 丘c a t i o nc o n d i t i o n sw e r es t u d i e d ，t w o m e t h o d sw e r eu s e d ：e x t r a c t i o na n dc o l u m nc h r o m a t o g r 印h y t h e e x t r a c t i o nc o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e d ：2 4 n a c ls o l u t i o nw a su s e dt o r e m o v et h er e s i d l l a ls u g a ri nt h er e a c t i o ns y s t e mu n d e r4 0 ，s a t l l r a t e d n a 2 c 0 3s o l u t i o nw a su s e dt or e m o v er e s i d u a ll a u r i ca c i d t h em o b i l e v l i 些塑奎堂堡主兰垡笙苎 p h a s eo fc 0 1 u m nc h r o m a t o 鲫h yw a st o l u e n e ：e t h y la c e t a t e ：m e t h a n o l ： w a t e f l o ：5 ：4 5 ：o 2 ( v 嗍) ，t h eo p t i m a ll o a dw a s3 9 k e y w o r d s ：f o o da d d i t i v e s ；f a l ：t ya c i de s t e r s ； s u g a re s t e r ；e n z y m a t i c s y i l t h e s i s ；劬刀幽如s p 9 9 12 5 v i l l 目录 目录 第一章绪论1 1 1 前言1 1 2 有机介质中酶催化的研究进展? 2 1 2 1 有机介质中酶的结构和性质3 1 2 2 有机介质中酶催化反应类型4 1 2 3 有机介质中酶促反应体系5 1 3 酶法合成羧酸酯类香精研究进展5 1 3 1 己酸转化率的计算方法6 1 3 2 加水量的影响6 1 3 3 酶的影响7 1 3 4 反应底物的影响8 1 3 5 溶剂的影响1 0 1 3 6 反应时间和温度的影响1 0 1 4 糖酯的酶法合成研究进展1 0 1 4 1 溶剂的影响1 1 1 4 2 酶的影响1 1 1 4 3 水分的影响1 2 1 4 4 脂肪酸碳链长和酸糖摩尔比的影响1 2 1 5 立题背景及意义1 2 1 6 主要研究内容1 3 第二章酶催化合成己酸乙酯的研究1 5 2 1 引言1 5 2 2 材料和方法1 5 2 2 1 实验试剂1 5 2 2 2 实验仪器和器材1 6 2 2 3 实验方法1 6 2 3 实验结果和讨论1 8 2 3 1 反应介质的影响1 8 i x 北京化工大学硕士学位论文 2 3 2 反应时间的影响1 9 2 3 3 加酶量的影响1 9 2 3 4 底物摩尔比的影响：2 0 2 3 5 吸水剂的影响2 l 2 3 6 反应温度的影响2 2 2 3 7 脂肪酶的使用寿命2 3 2 3 8 正己烷的回收利用2 3 2 3 9 反应过程的调控2 4 2 4 小结2 5 第三章酶促其他羧酸酯类香精的合成2 7 3 1 引言2 7 3 2 材料和方法2 7 3 2 1 实验试剂2 7 3 2 2 实验仪器和器材2 8 3 2 3 实验方法2 8 3 3 实验结果和讨论2 8 3 3 1 酸和醇碳链数对反应的影响2 8 3 3 2 无溶剂条件下合成羧酸酯3 2 3 4 小结3 4 第四章糖酯分析方法的选择3 5 4 1 引言3 5 4 2 材料和方法3 5 4 2 1 实验试剂3 5 4 2 2 实验仪器和器材3 5 4 2 3 实验方法3 6 4 3 实验结果和讨论3 8 4 3 1 薄层色谱法分析糖酯3 8 4 3 2 气相色谱法分析蔗糖酯3 9 4 3 3h p l c e l s d 分析糖酯4 2 4 4 小结4 4 x 目录 条件的选择4 7 4 7 5 2 材料和方法4 8 5 2 1 实验试剂4 8 5 2 2 实验仪器和器材4 8 5 2 3 实验方法4 8 5 3 结果和讨论5 0 5 3 1 溶剂的影响5 0 5 3 2 反应时间的影响5 1 5 3 3 反应液预处理时间的影响5 3 5 3 4 温度的影响5 4 5 3 5 果糖初始浓度的影响5 5 5 3 6 底物摩尔比的影响5 5 5 3 7 加酶量的影响5 6 5 3 8 分子筛的影响5 7 5 3 9 预处理对固定化酶的影响5 9 5 4 小结6 l 第六章产物分离纯化及鉴定。6 3 6 1 引言6 3 6 2 材料及方法6 3 6 2 1 实验试剂6 3 6 2 2 实验仪器和器材6 4 6 2 3 实验方法6 4 6 3 结果及讨论6 5 6 3 1 液液萃取法分离纯化产品6 5 6 3 2 柱层析法分离纯化产品6 8 6 3 3 两种分离方法的比较7 l 6 3 4 产品的质谱图7 2 6 4 小结7 3 x l 塑垡三奎堂堡主堂垡丝兰 第七章结论及建议7 5 7 1 结论7 5 7 2 创新点7 6 7 3 问题及建议7 6 参考文献7 9 致谢8 3 研究成果及发表的学术论文8 5 作者和导师简介8 6 i 1 1 前言 随着人们生活水平的提高，对食品的要求也越来越高，这使得食品添加剂成 为食品工业中不可缺少的一部分，食品添加剂的加入满足了人们对于食品色、香、 味的要求。食品添加剂种类繁多，按照种类可以分为2 2 大类，1 0 4 4 种u 捌。按照 功能分可分为香精、乳化剂、着色剂等。 食品添加剂中不可或缺的一项就是香料，香料是能够发出令人愉悦的气味的 物质，广泛应用于食品、化妆品、洗涤用品中，是各相关行业不可或缺的重要原 料。虽然在产品中香料的含量很少( 除了香水以外在不同的产品中含量为 o 1 一o 3 ) ，但是却起着重要的作用。 食品乳化剂是食品添加剂中另一重要的物质，它能够使原本互不相溶的液体 形成稳定的乳浊液。近年来糖酯因为其良好的表面活性而被广泛应用于食品、化 妆品和医药行业中。它是一类非离子型的表面活性剂，与离子型的表面活性剂相 比，它具有良好的生物相容性、可生物降解和无毒等优点。而且合成糖酯的原料 易得，根据酰基供体和酰基受体的不同，糖酯的种类可以达到几百种，能够满足 各个领域的应用。近年来，随着糖酯用途的不断扩展，全球仅蔗糖酯和葡萄糖酯 的年产量就达到6 0 0 0 吨【l j 。 我国食品添加剂有着广阔的市场和大的需求量，目前市场上已经得到应用的 食品添加剂种类繁多且齐全。究其制备方法主要分为三种：一是从天然产物中提 取，比如一些香料可以从植物、水果中提取得到，这种天然的香料备受人们的青 睐，但是依靠这种方法获得的产品成本较高，而且产量较低，无法满足市场的需 求。二是化学合成法，目前化学合成法是制备食品添加剂的主要方法，化学合成 法快速、简单而且成本较低，易于工业化研究，在近期来看具有良好的市场前景。 三是生物催化法，主要是酶催化法。 近年来，由于食品工业中存在着一定的安全隐患，因此食品安全问题成为人 们关注的焦点，此时，酶法合成食品添加剂的优点凸现出来：反应条件温和、产 物纯度和品质高、分离纯化工艺相对简单。如在食品添加剂香精和乳化剂的酶法 合成中，酶法合成的产品品质更好：得到的己酸乙酯性能明显优于化学合成的； 在乳化剂糖酯的酶法合成过程中，优点更明显，如底物糖不易焦化，产品纯度高， 北京化工大学硕士学位论文 副产物少。 在酶催化合成食品添加剂的过程中，一般是在有机溶剂中进行的，因此对有 机介质中酶催化情况进行研究甚为重要，主要包括酶在有机溶剂中的结构、性质 以及稳定性、酶促反应体系、反应过程中的影响因素等。 1 2 有机介质中酶催化的研究进展 在有一段时间内，人们一直认为像蛋白质、核酸等这一类的生物大分子只有 在水溶液中才能发挥它们的生物功能，这一思想束缚了酶催化技术的发展。到 1 9 1 3 年，才有关于非水相酶催化的报道。但是真正的广泛应用是1 9 8 4 年，当 i b 锄o v 和z a l 【a 【3 】在s c i c e 上发表了一篇文章，说明酶在非水相中也能够催化反 应，他们成功的合成了肽、醇、酯等多种有机化合物。从此，有机相酶催化技术 越来越被人们广泛的研究。 有机相酶催化除了具有水相酶催化的优点外，还具有一些水相酶催化不具备 的优点【4 ，习： 1 、在非水介质中，水含量较少，酶分子更易表现出“刚性特点，可以选 择不同的溶剂体系来合成不同类型的产物。在非水介质中，酶和配体的相互作用 可能诱导酶分子的构象的改变，从而可以调控催化剂的立体、手性选择性和底物 专一性。 2 、在水相催化体系中，酶的失活的很多原因都跟水有关，因此，在非水介 质中，酶具有更高的稳定性。 3 、在非水介质中，一些水参加的副反应程度大大降低，如酯化反应，水含 量的减少使得酯化速率大大高于水解速率，使得产物的得率更高。 4 、非水介质中酶催化反应产物易于分离纯化，产品得率较高。 5 、酶在有机溶剂中不会溶解，这样可以将酶回收，进行重复利用，从而大 大降低了酶催化成本。 2 第一章绪论 1 2 1 有机介质中酶的结构和性质 酶在水溶液中能够催化反应，说明酶在水溶液中具有催化活性，同样，酶在 有机溶剂中也能催化反应，这说明酶的结构或者说是酶结构的活性部位和水溶液 中是一样的。在水溶液中，酶以三级结构的形式存在，发挥催化作用必须具备两 个条件即要有“紧密 ( c o m p a c t ) 和“柔性”( n e x i b i l i 劬嘲。在非水介质中，酶维 持活性也必须具备这两个条件。 在水溶液中，存在两种氢键，一是蛋白质分子内的氢键，二是蛋白质分子和 水分子形成的分子间的氢键。蛋白质分子的活性部分相当于一个“盖子 ，当蛋 白分子和水分子形成分子间的氢键时，这个“盖子”就被打开，呈现“开启 ( u i l l o c k i n 蓟状态，同时，蛋白质分子内的氢键使得酶蛋白相互之间紧密地联系在 一起。蛋白的“紧密”和“开启 这两种状态是动态平衡的，所以蛋白具有一定 的“柔性。正是由于酶在水溶液中即有紧密的空间结构也有很大的柔性，才使 得酶能够发挥催化活性【_ 7 1 。 z a k s 【8 】认为酶在疏水环境( 水含量 c 1 2 ) 和糖发生反应，因 此蛋白酶在糖酯方面的应用并不广泛。2 、相对于蛋白酶而言，脂肪酶的应用更 加的广泛，研究更多更细，可催化多种酸和多种糖反应合成糖酯，其酰化一般发 生在6 o h 。3 、抗体酶是最近新发现的一种可用于糖酯酯化反应的酶，它具有更 高的立体选择性，能够得到纯度更高的6 一o 蔗糖单酯。 酶在有机溶剂中的稳定性一般比在水溶液中的稳定性要高，日i b a n o v 认为酶 稳定性的提高是因为水含量少的缘故，酶的失活必须有水的参加，水含量的减少 3 北京化工大学硕士学位论文 降低了酶失活的几率。部分酶在有机溶剂中的热力学稳定性如表1 1 【8 1 所示。 表1 1 酶在非水和有机介质中的稳定性 t a b i el 一1e n z y m es t a b i l i 哆i nw a t e ra n do 珞酗1 i cs o l v 肌t e n z y m e m c d i 啪 h o ts t a r b i l i t y c 柚d i d am g o s al i p 勰e l i p o p r o t e i n1 i p 邪e c i 巧恤。啦l p s i n p e g s l l b t i l i s i i l r n 缸e a c p a s e a t p 鹊e ( f l 硝j p 嬲e ) r 鹤t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e ( h i i l d i ) p - g 1 u c o 锄y l 黜 啪z 雕 i “6 n f j ，凼 w a t i p h 7 o t h b l l t y l 血h e p t 锄o l w a t e r p h 7 0 t o h l o l 9 0 ，4 0 0 h o c t 觚e 1 0 0 w a t p h8 0 ，5 5 o c t 锄e 1 l o n o n 觚e ，1 1 0 。6 h w a t p h8 o ，9 0 n h e x a d e c 锄e 8 0 w a t e r - 7 0 t l o l u 0 1 7 0 w a t e r 6 0 n h 印t 觚e ，5 5 ，3 0 d 2 一p r o p 锄o l ，5 0 ，3 0 h h 戗锄e m y l e ，1 1 0 t l 2 2 6 h t 1 2 2 m i i l t l 2 2 1 5h t l 2 2 m i n 胁n a i n e da c t m 哆4 0 t 1 2 。8 0 n l i n t l 2 = 1 5 m i n t l 2 28 0 m i l i r 啪a i n o da c t i 、，i t y9 5 t l 2 2 4 h t l 2 1 0 m i l l r 锄a i n e da c t i v i t ) r1o o r e m a i n e da c t i 访锣8 0 t 1 2 = 1 4 0 幽 w a t c r t l 2 2l o m i n 1 2 2 有机介质中酶催化反应类型 酶在有机溶剂中能够发生催化作用极大了促进了酶工业应用的发展，到目前 为止，据报道能够用在有机相催化的酶种类较多，主要有脂肪酶、酯酶、蛋白酶、 过氧化氢酶、多酚氧化酶、a t p 酶、胆固醇氧化酶、细胞色素氧化酶等。但研究 最多的还是脂肪酶。酶主要以游离形式和固定化形式存在。脂肪酶在有机相中可 催化的反应有水解、酯化、酯交换、肽的合成、酰化等，其中以酯化反应和酯交 换用的最多。如函，z 旃如s p 9 9 1 2 5 可用于生物柴油的合成【1 5 1 ，蜡酯的合成【1 6 1 ， 维生素a 棕榈酸酯的合成【1 7 】。 4 第一章绪论 体系 有机介质中酶催化的反应体系有很多：最常见的有有机溶剂体系，无溶剂体 系，反胶束体系，离子液体系等。 有机溶剂体系是应用的最多的一种非水相酶促反应体系【l 引，大多数酶催化 产物都需要在有机溶剂的存在下合成。如己酸乙酯的合成【1 9 1 ，糖酯的酶催化合 成【2 0 】都需要有机溶剂的参与。非水相溶剂的作用主要表现为三点：一是使酶向 催化酯化反应的方向进行，二是它可以增加疏水性底物的溶解度，三是它可以降 低对酶有害的底物如乙醇、甲醇等的抑制作用。 在工业中，无溶剂反应体系比有溶剂反应体系更具有竞争性【2 1 2 2 】，在无溶剂 条件下，酶可以直接作用于反应底物，提高了反应底物浓度和产物浓度，催化选 择性高，而且工艺简单，使得最后的产品易于分离纯化，产品的安全性更高，不 存在溶剂残留的问题，这在食品工业中显得尤为重要。 反胶束系统是由表面活性剂在非极性溶剂中形成的透明或半透明的热力学 稳定系鲥2 3 4 】，在这种体系下，水溶性化合物的溶解度更高，水溶性化合物和脂 肪酶溶于反胶束形成纳米级的微型水池中【2 5 】，脂溶性的化合物溶于有机溶剂中， 反胶束将有机相和水相混合，这样就保证了酶催化反应的高速进行。 离子液体是有机盐在1 0 0 下熔化而成的，它们的非挥发性和热稳定性使它 能够代替有机溶剂。它能够溶解极性和非极性、有机、无机物和聚合物。有文献 【2 6 】报道离子液体可以做为反应介质，它可以加快反应、增强选择性、提高酶的 稳定性。 在有机相酶催化体系中，除了常见的这几种反应体系之外，还有超临界流体 体系，低共熔多相体系，气体介质体系等。 1 3 酶法合成羧酸酯类香精研究进展 羧酸酯类香精在食用香精工业中起着重要的作用，而己酸乙酯是羧酸酯类香 精中最具代表性的物质。目前工业上主要依靠化学合成的方法来获得己酸乙酯， 还有极少的是从天然产物中分离得到。但是由于在化学合成过程中容易生成各种 副产物，影响产品质量和安全。从植物中提取得产物天然而得到人们的喜爱，但 是这种靠提取的方法来获得产品价格昂贵，且数量有限。所以，酶催化合成己酸 乙酯以其独特的优点而被人们广泛研究。 5 北京化工大学硕士学位论文 荷兰的u n i c h 锄ai n t 锄a t i o n a l 公司于1 9 9 0 年发明专利，并在第2 年推出 “b i o c s t e r ”的系列生物酯商品，批次生产规模已上几吨另外c r o d a u l l i v e r s a l 【，t d 用白以如缸，m g o s a 脂肪酶生产蜡酯。国内也开始注意脂肪酸酯合成的研究【2 7 1 。 1 3 1 己酸转化率的计算方法 目前，己酸转化率的测定方法都是用酸碱滴定法【2 8 。，即反应一段时间后， 取一定量的反应液( 如果用的是游离酶，须加入乙醇使酶失活) ，用n a 0 h 滴定， 记录体积。计算公式如下： 口= 掣1 1 6 i i c i 口= 可l u u 殆 式中：v o 为o h 时样品消耗的氢氧化钠毫升数，v 为反应一定时间后样品消耗 氢氧化钠毫升数。 在以酶为催化剂的酯化反应过程中，影响因素较多，如含水量、溶剂、加酶 量、底物浓度及摩尔比、反应时间和反应温度，下面将对几个重要的因素进行总 结。 1 3 2 加水量的影响 对于不同的文献，水含量的表示方法不一样，所以结果也不同。如在此条件 下【2 9 】：己酸与乙醇的摩尔比为1 ：2 ，己酸浓度0 4 m o l l ，以辛烷为溶剂，3 6 时 反应2 4 h 。当水的加入量处于o 2 o 6 时，己酸转化率可以超过9 0 以上，所以 加水量以o 2 o 6 为宜。如果按体积比计算【3 1 1 ，则加水量在0 4 ( v v ) 。 酯化反应过程中会生成水，所以对反应过程中水含量加以控制很重要。主要 有两种方法，一是采用吸水硅胶来脱水，二是采用分子筛来脱水。在研究中多采 用分子筛来脱水，主要研究了分子筛的加入时间和加入量【3 0 3 1 1 。 溶剂为环己烷，己酸浓度o 2 m o n 。乙醇浓度0 2 6 m o 儿，脂肪酶o 4 9 ，在4 0 ， 1 5 0r m i n 下反应。分两种处理方法：一是在反应之前对溶剂和底物脱水处理，而 是反应平衡后加吸水剂吸水。结果如图1 1 和图1 2 所示。 6 分子筛鼍g 图1 1 分子筛用量对酯合成的影响 f i g 1 一le f f e c to f t l l em o l e c l l l 盯s i e v e s 吼m es y n t l l 鹤i so f 嚣t 盯 l l i l 附 堡棚 爵 萎 2 0 0 s1 01 5加 列饲雁 图1 2 分子筛作用时间对酯合成的影响 f i g 1 2e 虢c to f m ea d d i t i o nt i m eo f m 0 1 e c l l l a rs i e v e s t h es y n t h 骼i so f 铭衙 图1 1 是在反应之前先将溶剂和底物用3 a 分子筛除水，再加入酶，在一定条 件下反应。由图1 1 可以看出，随着分子筛加入量的增加，酸转化率先上升后下 降。当分子筛加入量到0 6g 时，己酸转化率最高。图1 2 为反应一段时间后再加 入o 6 93 a 的分子筛，从结果可知，在酯化反应达到平衡后，分子筛的加入可以 提高3 左右的己酸转化率，但是效果并不明显。这说明两种处理方法差别不大。 1 3 3 酶的影响 1 3 3 1 酶种类对酯化反应的影响 在酯化反应的进程中，酶是最重要的一个元素，酶的活力高低直接影响酯合 成率的大小，所以，对酶的研究也较多【2 2 彤】，如表1 2 所示。目前进行的一系列 酯化合成反应中，其实都是大同小异，不同的都是所用的酶不一样，最后通过比 7 北京化工大学硕士学位论文 较得出那种酶的催化效果最好和最经济适用。 表l - 2 不同来源的脂肪酶的催化效率对比表【2 9 。3 】 t a b l e1 2e 岱to fm ee n z y m eo nt h er e a c t i o n 2 9 3 3 】 1 3 3 2 抑制剂对酶促反应的影响 在庚烷中酶促合成己酸乙酯体系