（食品科学专业论文）一种新的Bifidobacterium+infantis细菌素的分离鉴定和性质分析.pdf

c h i n e s ea b s t r a c t 摘要 双歧杆菌在母乳喂养儿肠道内大量存在，对婴幼儿有很多好处，如营养、免疫 及抗感染作用等。多年的临床研究表明，人在摄入一定量的双歧杆菌除了能提供基本 的营养作用之外，还有抗过敏、抗肿瘤、调整肠道功能等多种促进人体健康的作用， 作为一种益生菌，双歧杆菌在食品和医药领域有着越来越多的应用。但在双歧杆菌对 致病菌的抑制作用研究方面，人们一直认为双歧杆菌之所以能够抗菌是因为它们能产 生有机酸，如乳酸和乙酸等，而最新的研究表明某些双歧杆菌中基因编码的抗菌肽 ( 细菌素或类细菌素类物质) 也是它们有抑菌活性的重要原因之一。 本论文选择b i f i d o b a c t e r i u ma d o l e s c e n t i s ( b a d o l e s c e n u s , 青春双歧杆菌) ， b i f i d o b a c f e 加mb i f i d u m ( b b i f i d u m , 两歧双歧杆菌) 。b i f i d o b a c f e n u m n f a n t i s ( b i n f a n t i s ，婴儿双歧杆菌) 和b i f i d o b a c t e r i u m 0 n g u m ( 8 i o n g u m , 长双歧杆菌) 四株菌 为出发菌株，采用b a c i l l u sc e r e u sc b c e r e u s ，蜡状芽孢杆菌) 和e s c h e r i c h i ac o i l 候 c o i l ，大肠杆菌夕为指示菌进行发酵上清液的抗菌活性检测。实验结果表面四株双歧杆 菌均有抑菌效果，对在对数生长期的e c o f i 的抑制率均在7 5 以上，其中b 仂厂a 九如对 e c o l ia s1 5 4 3 的抑制率达9 5 ；而对在对数生长期的b c e r e u s 的抑制率比对ec o i l 的低些，但也均在6 0 以上，其中b 0 n g u m 对b c e r e u s 的抑菌效果达蛰j 7 5 。在此 基础上，选择b - j 仃角n f s 和b i o n g u m 的发酵上清液进行蛋白酶酶解实验，结果确认了 这些抑菌物质是一些蛋白质，而不是有机酸，对这些抑菌蛋白物质的抑菌热稳定性和 p h 稳定性的研究进一步确认了这些物质是一些细菌素或者是类细菌素物质。初步的实 验结果表明来自b i n f a n t i s 的抑菌物质的热稳定性和p h 稳定性都较b i o n g u m 的强，因 此本论文选择b i f i d o b a c t e n u mi n f a n t sb c r c1 4 6 0 2 进行后续的实验，对其产生的抑菌 物质进行分离纯化、鉴定及性质分析。 由于来自b i f i d o b a c f e 砌m n f a n t sb c r c1 4 6 0 2 的类细菌素物质的性质和已经 报道的细菌素性质较接近，它们也是分泌到发酵上清液。因此硫酸铵沉淀、与生产菌 的吸附解吸、与硅酸吸附解吸等提取方法也适用于本菌株所产生的类细菌素物质的首 步分离。在硫酸铵沉淀实验中，采用8 0 的硫酸铵和发酵上清液反应沉淀得到蛋白 质，其含有的总抑菌活性达8 0 ，比活力上升了4 5 6 倍，回收产物经透析后比活力 上升了7 6 倍，但总活力仅剩8 。而在类细菌素物质与生产菌吸附和解吸试验中，类 细菌素物质的吸附受发酵的p h 影响显著，在p h 6 0 到7 0 之间，死亡的细菌能1 0 0 v i i c h i n e s ea b s t r a c t 詈詈曼曼詈曼曼喜皇! 皇皇! 曼曼曼詈皇詈詈! 曼! 曼! 詈曼鼍皇! i二u 皇! 曼寡曼! 曼! 皇皇鼍皇! 曼鼍鼍詈曼皇曼! ! 曼曼! 曼! 皇曼皇! ! ! ! ! 暑! 皇! 曼 吸附细菌素类物质，在p i l l 5 到2 0 之间，类细菌素物质开始从生产菌上解吸。这种 方法能将类细菌素物质纯化1 2 0 倍，比活力达3 1 6 0 5a u m g ，得率为6 4 。在类细菌 素物质与硅酸的吸附试验中，再次确认了类细菌素物质在硅酸( 5 ) 上的吸附受发酵 液p h 影响显著。在p h 5 0 到7 0 之间，吸附率达10 0 ，当p h 值低于5 0 或高于 7 0 时，吸附率分别为6 7 和4 5 。本实验表明硅酸吸附解吸适合b i f i d o b a c t e n u m i n f a n t i sb c r c1 4 6 0 2 中类细菌素物质的纯化，纯化倍数和回收率都较其它两种方法 高。因此本文后续实验中类细菌素物质的首步分离将采用硅酸吸附解吸法。 由于b i f i d o b a c t e r i u mi n f a n t i sb c r c1 4 6 0 2 所产的类细菌素物质对许多格兰氏阳 性菌和阴性菌都有抑制效果，我们将其定义为b i f i d i ni ，其抑菌模式与l a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u m ( p l a n t a r u m , 植物乳杆菌) b c r cl16 9 7 类似。对b i f i d o b a c t e r i u mi n f a n t i s b c r c1 4 6 0 2 使用m r s 培养，3 7 0 c 培养6 小时后到对数中期，酶活为4 0 0a u m l ，1 6 小时后进入稳定期，最大酶活为1 6 0 0a u m l 。在纯化b i f i d i ni 的过程中，为了获得较 高的回收率，本研究中采用了“三步走”的方法：第一步采用的是硅酸吸附解吸，得 到的比活力为6 7 6 9 6a u m g ，回收率为8 0 ：第二步采用的是阳离子交换层析，经 n a c l 梯度洗脱后得到的产物比活力上升到11 5 3 1 5a u m g ，回收率为6 4 ；而最后一 步采用的反向高效液相色谱，主峰的保留时间在3 6 8 8m i n 。整个流程下来，b i f i d i ni 总的纯化倍数为1 3 9 0 倍，得到的最终比活力为3 6 5 7 1 4a u m g ，总回收率为2 5 6 。在 此基础上对纯化产物进行了t r i c i n e s d s p a g e 分析，纯化后b i f i d i ni 的相对分子质量 约为3k d a ，在m a l d i t o f 的检测实验中在2 8 7 9 7d a 得到一个峰。将纯化产物用 e d m a n 降解法对n 端的蛋白序列进行检测，得到了n h 2 l y s - t y r - g l y - s e r - v a l p r o l e u g l y 的高疏水序列，这与己报道阳离子抗菌肽的特征相似，但其氨基酸序列与 g e n e b a n k 已报道细菌素序列未有重叠，说明它是一种新的乳酸菌细菌素，并从n 端的 n h 2 l y s t y r 判断它有可能是属于对李斯特菌具有特异抗菌特性的i i a 类细菌素。 最后对b i f i d i nl 的性质进行了考察，各类酶解实验表明蛋白酶酶解可以让b i f i d i n i 完全失活，而过氧化氢酶，a 淀粉酶和酯酶对其活力没有影响；b i f i d i ni 的热稳定性 很高，在1 2 1 0 c 处理1 5 分钟，其活力没有任何损失；其活性在p h 4 到p i l l 0 的范围 内稳定。根据b i f i d i ni 的分子量大小、李斯特菌抗性及部分已知氨基酸序列可初步判断 它是一种未报道的细菌素，并基本可定义属于第二类细菌素。在此基础上对 b i f i d o b a c t e r i u m n f a n t sb c r c14 6 0 2 进行了质粒消除实验，该菌株经过4 0p g m l 吖 v i i i c h i n e s ea b s t r a c t 啶黄处理后可突变为b i f 菌株，该突变株不产生b i f l d i ni 但是对b i f i d i ni 具有免疫性， 由此可判断b i f i d i ni 的产生与b i f i d o b a c t e d u mi n f a n t i sb c r c1 4 6 0 2 中的一个质粒有 关，但b i f i d i ni 的免疫性与此质粒无关。经过本实验研究，所获得的b i f i d i nl 具有很高 的热稳定性和较宽的p h 稳定性，这些将为此细菌素在食品加工和食品安全控制等领域 的应用提供良好前提，也将为b i f i d o b a c t e r i u m 仃f a n t sb c r c1 4 6 0 2 作为益生菌在食 品领域的应用提供了依据和理论基础。 关键词 抗菌活性，细菌素，类细菌素物质( b l i s ) ，婴儿双歧杆菌，纯化，质粒消化。 i i ii ! i x c p h d 硼私活 a b s t r a c t b i f i d o b a c t e r i aa r en o r m a ii n h a b i t a n t so ft h eh u m a ng a s t r o i n t e s t i n a lt r a c t t h r o u g h o u tl i f e ，w h i c hs t a r tt oc o l o n i z et h et r a c tj u s td a y sa f t e rb i r t h t h e ya r e c o n s i d e r e dt ob ep r o b i o t i c ss i n c et h e ye x e r th e a l t he f f e c t sb e y o n db a s i cn u t r i t i o n w h e ni n g e s t e di ns u f f i c i e n tn u m b e r s t h i sc o n c e p th a sr a i s e dag r o w i n gi n t e r e s tf o r t h e i ra p p l i c a t i o ni nf o o da n dm e d i c i n e u n t i lr e c e n t l y ，t h ea n t i m i c r o b i a la c t i v i t yo f b i f i d o b a c t e r i ah a sb e e nm a i n l ya t t r i b u t e dt ot h ep r o d u c t i o no fo r g a n i ca c i d s ，s u c ha s l a c t i ca n da c e t i ca c i d s ，b u tm a n yr e c e n t l yp u b l i s h e dr e p o r t sh a v em e n t i o n e dt h e i n v o l v e m e n to fa n t i m i c r o b i a lp e p t i d e si nt h i si n h i b i t o r ya c t i v i t y t h ea n t i m i c r o b i a le f f e c t so ft h es u p e r n a t a n t so b t a i n e df r o mf o u rs t r a i n so f b i f i d o b a c t e r i a ；b i f i d o b a c t e r i u ma d o l e s c e n t i s ，b i f i d o b a c t e r i u mb i f i d u m ，b i f i d o b a c t e r i u m i n f a n t i s ，a n db i f i d o b a c 据d u m o n g u mw e r et e s t e da g a i n s tt w ot y p e so fi n d i c a t o r s t r a i n s ，b a c i l l u sc e r e u sa n dt h r e es t r a i n so fe s c h e r i c h i ac o l i t h e r ew a sas i g n i f i c a n t r e d u c t i o ni nt h eg r o w t ho ft h ei n d i c a t o rs t r a i n s 。w h e r e b ya l lec o i ls t r a i n sw e r e i n h i b i t e dm o r et h a n7 5 o ft h e i rl o gc f ui nm o n o c u l t u r e ，o fw h i c hb i n f a n t i sr e d u c e d 9 5 o fec o i la s1 5 4 3 o nt h eo t h e rh a n d ，o n l ym o r et h a n6 0 o ft h el o gc f uo fb c e r e u sw a sr e d u c e db ya l lb i f i d o b a c t e r i a ls u p e r n a t a n t s ，i np a r t i c u l a rb i o n g u m ( 7 5 ) i tw a so b s e r v e dt h a ts u b s t a n c e so rf a c t o r so t h e rt h a no r g a n i ca c i d sm a y c o n t r i b u t et ot h ea n t i m i c r o b i a la c t i v i t yo fc e l lf r e es u p e r n a t a n t ( c f s ) b i n f a n t i sa n db i o n g u m a f t e ri tw a si n a c t i v a t e d b yp r o t e o l y t i ce n z y m e sw h i c h c o n f i r mt h e p r o t e i n a c e o u sn a t u r eo ft h ea n t i m i c r o b i a ls u b s t a n c e s a l s oh e a ta n dp hs t a b i l i t y f u r t h e rp r o v e st h ep r o t e i n a c e o u ss t r u c t u r ef o rt h e s es u b s t a n c e sw h i c hc o u l db e d e s i g n a t e da sb a c t e r i o c i n so rb a c t e r i o c i n l i k ei n h i b i t o r ys u b s t a n c e ( b l i s ) f o ri t s h i g ht e m p e r a t u r es t a b i l i t ya n dw i d e rp hr a n g e ，t h ea n t i m i c r o b i a ls u b s t a n c e sw h i c h c o u l db ed e s i g n a t e da sb a c t e r i o c i n so rb l i sf r o m8 价幻，7 t sb c r c14 6 0 2w a s c h o s e nt oc o n t i n u et h ep r o c e s so ft a r g e t i n gs u c hp r o m i s i n gb a c t e r i o c i n so rb l i sf r o m t h i sb a c t e r i u mw h i c hc o u l dc o n t r i b u t et ot h ee l u c i d a t i o no ft h em e c h a n i s mu s e db y b i f i d o b a c t e r i ai nh o s td e f e n s ea g a i n s tp o t e n t i a l l yp a t h o g e n i cb a c t e r i a s i n c eb l i sf r o mb i n f a n t i sb c r c14 6 0 2a r et h es a m ea so t h e rb a c t e r i o c i n s ； t h e ya r es e c r e t e di n t ot h eg r o w t hm e d i u m ，m o s tp u r i f i c a t i o na p p r o a c h e ss t a r tw i t ha m e t h o dt oc o n c e n t r a t et h e mf r o mc u l t u r es u p e r n a t a n t s t h em o s tc o m m o nm e t h o d u s e da st h ef i r s tp u r i f i c a t i o ns t e pi sa m m o n i u ms u l p h a t ep r e c i p i t a t i o nw h i c hw a s i v j a 叼m z nu n i v e r s i t y 嘶d 御站硫 a p p l i e dw i t h8 0 s a t u r a t i o no ft h en e u t r a l i z e dc e l lf r e es u p e r n a t a n t ( n c f s ) f r o m8 i n f a n t i sb c r c1 4 6 0 2a n dr e s u l t e di n8 0 o ft o t a la c t i v i t ya n da4 5 6f o l di n c r e a s ei n s p e c i f i ca c t i v i t y a f t e rd i a l y s i s 。t h es p e c i f i ca c t i v i t yi n c r e a s e d7 6f o l d s ，b u tt o t a la c t i v i t y r e c o v e r e d 。d e c r e a s e dt o8 1 nt h es e c o n dm e t h o d ；a d s o r p t i o na n dd e s o r p t i o no ft h e b l i so n t o f r o mt h ep r o d u c e rc e l l s ，t h ea d s o r p t i o no ft h eb l i st ot h ep r o d u c e rc e l l s w a ss t r o n g l ya f f e c t e db yt h ep ho ft h ec u l t u r eb r o t hw h e r e b y10 0 a d s o r p t i o nt ot h e k i l l e dc e l l so c c u r e db e t w e e np h6 0t o7 0 d e s o r p t i o no fb l i sf b mt h ep r o d u c e r c e l l sw a sa c h i e v e da tp h1 5 2 0 t h i sp r o c e d u r ei n c r e a s e dt h ep u r i f i c a t i o nf o i d12 0 t i m e sw i t has p e c i f i ca c t i v i t yo f3 1 。6 0 5a u m ga n day i e l do f6 4 i nt h ea d s o r p t i o n a n dd e s o r p t i o no fb l i so n t o f r o ms i l i c i ca c i d ；i tw a sc o n f i r m e dt h a tt h ea d s o r p t i o no f t h eb l i st os i l i c i ca c i d ( 5 ) w a ss t r o n g l ya f f e c t e db yt h ep ho ft h eb r o t hc u l t u r eo f w h i c h10 0 a d s o r p t i o no c c u r e db e t w e e np h5 0t o7 0 ，w h e r e a sa tp hv a l u e sb e l o w 5 0a n da b o v e7 0 ，t h ea d s o r p t i o nr a t i od e c r e a s e dt o6 7a n d4 5 ，r e s p e c t i v e l y t h e b e s tm e t h o di nt e r m so fp u r i f i c a t i o nf o l da n dy i e l dw a st h ea d s o r p t i o na n dd e s o r p t i o n o fb l i so n t o f r o ms i l i c i ca c i d b i f i d o b a c t e d u mi n f a n t i sb c r c14 6 0 2w a sf o u n dt op r o d u c eab a c t e r i o c i n w h i c hw et e r m e di ta sb i f i d i n1w i t hi n h i b i t o r ya c t i v i t i e sa g a i n s taw i d er a n g eo fg r a m p o s i t i v ea n dg r a m n e g a t i v eb a c t e r i a i t sm o do fa c t i o nw a sb a c t e r i c i d a la g a i n s t l a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u mb c r c116 9 7 a na c t i v i t yl e v e lo f4 0 0a u m li nt h em i d d l eo f t h ee x p o n e n t i a lp h a s e ( i e 6h ) a n dm a x i m u ma c t i v i t y ( 16 0 0a u m 1 ) a tt h eb e g i n n i n g o ft h es t a t i o n a r yp h a s e ( i e 16h ) w a sr e c o r d e di nm r sb r o t ha t3 7 。c at h r e e - s t e p p u r i f i c a t i o np r o c e d u r ew i t hh i g hr e c o v e r yy i e l d sh a sb e e na p p l i e dt ot h eb i f i d i n i p u r i f i c a t i o n f i r s ts t e ps t a r t e dw i t ha d s o r p t i o na n dd e s o r p t i o no fb i f i d i n io n t o f r o m s i l i c i ca c i d ( a d s a ) r e s u l t e di nap u r i f i c a t i o nf o i do f2 5 7w i t has p e c i f i ca c t i v i t yo f 6 7 6 9 6a u m ga n day i e l do f8 0 i nt h es e c o n ds t e p ，t h ea c t i v ee x t r a c ta d s aw a s a p p l i e dt ot h ec a t i o n - e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h yo ns ps e p h a r o s ea tp h7 6w i t h b a c t e r i o c i na c t i v i t yw e r ee l u t e db e t w e e n0 3a n d0 4mn a c ii n d i c a t i n gt h a tt h eb i f i d i n ii sah i g h l yc h a r g e dc a t i o n i cc o m p o u n d a f t e ra p p l y i n gt h i ss t e p ，t h es p e c i f i ca c t i v i t y i n c r e a s e dw i t h115 3 15a u m ga n dt h ei n i t i a la n t i b a c t e r i a la c t i v i t yw a s6 4 f i n a l p u r i f i c a t i o ns t e po fb i f i d i n i b yr p h p l cr e v e a l e dt h ep r e s e n c eo fam a j o rp e a k c o r r e s p o n d i n gt or e t e n t i o nt i m e so f3 6 8 8m i n t h ep u r i f i c a t i o np r o t o c o lo ft h eb i f i d i ni r e s u l t e di nap u r i f i c a t i o nf o l do f13 9 0w i t has p e c i f i ca c t i v i t yo f3 6 5 7 14a u m ga n da y i e l do f2 5 6 t h em o l e c u l a rw e i g h tf o rt h ep u r i f i e db i f i d i n1w a se s t i m a t e dt ob e a r o u n d3k d ab yt r i c i n e s d s - p a g ea n dc o n f i r m e db ym a l d i t o fd e t e c t e dp e a k _lmlm l _l v j z a n g n a 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t el n a c t i v a t i o no fb i f i d i n i a c t i v i t yw a so b s e n ，e da f t e rt r e a t m e n tw i t h p r o t e o l y t i ce n z y m e s ，b u tn o tw i t hc a t a l a s e ，a a m y l a s ea n dl i p a s e b i f i d i ni s h o w e d h i g ht e m p e r a t u r es t a b i l i t yu pt o12 1 。cf o r15m i n u t e sw i t hn ol o s si ni t sa c t i v i t y 。a n d h a dp hs t a b i l i t yi nt h er a n g eo f4 10 p l a s m i dc u r i n gw i t h4 0 p g m la c r i f l a v i n ey i e l d e d w i t hb i fv a r i a n tc e l l sw i t hn oc a p a b i l i t yo fp r o d u c i n gb i f i d i ni ，b u tr e t a i n e di m m u n i t yt o b i f d i ni p r o d u c t i o no fb i f i d i ni ，b u tn o ti m m u n i t yt ob i f i d i nlc o u l db ea s s o c i a t e dw i t ha p l a s m i d ( ii3 寸o o n i b 苍emm-i山dci 西dii苟cy o西i寸西i i 叮_ o d c m c k d a ) r i b o s o m a l l yp r o d u c e dp e p t i d e st h a t u n d e r g oe x t e n s i v ep o s t t r a n s l a t i o n a lm o d i f i c a t i o n t h i sc l a s sl sf u r t h e rd i v i d e di n t o t w os u b g r o u p s c l a s sl ai n c l u d e se l o n g a t e d ，a m p h i p a t h i c ，p o r e f o r m i n gl a n t i b i o t i c s ( e g n i s i n ) a n dc l a s s i br e g r o u p sr i g i da n dg l o b u l a ra n t i m i c r o b i a lp e p t i d e s ( e g m e r s a c i d i n ) c l a s si ip e p t i d e sa r es m a l l ( 10 k d a ) ，m e m b r a n e a c t i v e 。u n m o d i f i e d p e p t i d e s t h i sc l a s si ss u b d i v i d e di n t ot h r e es u b g r o u p s c l a s si l aa r ep e d i o c i n - l i k e a n t i l i s t e r i a p e p t i d e sw i t h t h e i rn t e r m i n a l p a r t c h a r a c t e r i z e db yac o n s e n s u s 1 6 c 矗印t e r1 i n t r o d u c t i o na n d l i t e r a t u r e0 fr e v i e w y g n g v x cm o t i f c l a s sl i bb a c t e r i o c i n sr e q u i r ec o m b i n a t i o no ft w op o l y p e p t i d e sf o r f u l la n t i m i c r o b i a la c t i v i t y ( e g e n t e r o c i nl 5 0 ) ，w h i l ec l a s si i ca r eo t h e rb a c t e r i o c i n s ( e g a c i d o c i nb ) c l a s s 川c o m p r i s e sl a r g e ，h e a tl a b i l ep r o t e i n ( 3 0k d a ) s u c ha s h e l v e t i c i nj c l a s si v ( k l a e n h a m m e r ，19 9 3 ) c o m p l e xb a c t e r i o c i n sc o m p o s e do f p r o t e i np l u so n eo rm o r ec h e m i c a lm o i e t i e sr e q u i r e df o ra c t i v i t y ( t a b l e1 3 ) t a b l e1 3c l a s s e so fb a c t e r i o c i n s ( s o u r c e ：n e se ta 1 ，19 9 6 ) c l a s ss u b c l a s sb a c t e r ip r o d u c e r d e s c r i p t i o n o c i n s c l a s si c l a s si i c l a s s 川 c l a s si - t y p e a l a n t i b i o t i c s c l a s si - t y p e b l a n t i b i o t i c s c l a s sl l a c l a s sl i b c l a s si i c n i s i nl a c t o c o c c u s l a n t i b i o t i c s ：l a n t i b i o t i c s ，s m a l l ( 5k d a ) l a c t i s p e p t i d e sc o n t a i n i n gl a n t h i o n i n ea n d b - m e t h y ll a n t h i o n i n e m e r s a c ib a c i l l u s d i ns u b t i l i s p e d i o c i p e d i o c o c c u s np a 1a c i d i l a c t i c i l a c t a c i nl a c t o b a c i l l u s f j o h n s o n f i a c i d o c i nb h e l v e t i c i nj l a c t o b a c i l l u s a c i d o p h i l u s l a c t o b a c i l l u s h e l e v e t i c u s n o nl a n t i b i o t i c s ：s m a l ih e a t s t a b l e p e p t i d e s s y n t h e s i z e d i naf o r mo f p r e c u r s o rw h i c hi sp r o c e s s e d a f t e rt w o g l y c i n er e s i d u e s ，a c t i v ea g a i n s tl i s t e r i a ， h a v eac o n s e n s u ss e q u e n c eo fy g n g v c i nt h en t e r m i n a i n o ni a n t i b i o t i c s ：t w oc o m p o n e n ts y s t e m s ： t w od i f f e r e n tp e p t i d e sr e q u i r e dt of o r ma n a c t i v ep o r a t i o nc o mp l e x n o ni a n t i b i o t i c s ：t h i 0 1 a c t i v a t e dp e p t i d e s l a r g e ( 3 0 k d a ) h e a t l a b i l ep r o t e i n s c l a s si vl a c t o c il a c t o b a c i l l u s c o m p l e xb a c t e r i o c i n s ：p r o t e i nw i t hl i p i d n2 7h e l e v e t i c u sa n d o rc a r b o h y d r a t e 1 6 2 m e t h o d st op u r i f yb a c t e r i o c i n s t h ep u r i f i c a t i o no fb a c t e r i o c i n si so f t e nl a b o r i o u s ，t i m e c o n s u m i n g ，d i f f i c u l ta n d n e e d se x p e r i e n c es i n c et h e ya r eo f t e ns m a l la n dv e r yh y d r o p h o b i cc o m p o u n d s p r o d u c e di nv e r yl o wa m o u n t s ( b e d e a u da n dc e n a t i e m p o ，2 0 0 4 ) t h e r ea r ev a r i o u s p u r i f i c a t i o nm e t h o d sp u b l i s h e dw h i c hd e p e n do nt h et y p eo fb a c t e r i o c i no rt h e a p p l i c a t i o no ft h ed e s i r e de n dp r o d u c t ( c a r o l i s s e n m a c k a ye ta 1 ，19 9 7 ；p a r e n t ea n d r i c c i a r d i 。19 9 9 )