（食品科学专业论文）Cellulomonas+spGJT07产果聚糖的研究.pdf

c e l l u l o m o n a ss p g j t 0 7 产果聚糖的研究 c e l l u l o m o n a ss p g 朋0 7 产果聚糖的研究 摘要 果聚糖是由以p 2 ，6 一键和p 一2 ，1 一键连接的呋喃果糖基组成的同多糖，因其特 有的物理特性和生物学活性在食品、医学、制药、农业、化妆品和保健品等领域 有着广泛的应用开发价值。本文以筛选具有优良性状的果聚糖生产菌株为基本目 的和出发点，考查了不同因素对菌株发酵产糖的影响，进行了初步的工艺放大实 验，对多糖进行了分离纯化及单糖组分分析的研究。主要的研究结果如下： 1 通过定性分析和定量分析相结合的有效的定向筛选方法，从果园土壤样 品中筛选得到一株产果聚糖能力较高的菌株g j t 0 7 ，经鉴定为c e l l u l o m o n a s ( 纤 维单胞菌属) 。据查阅资料尚未发现国内外有关纤维单胞菌属微生物产果聚糖的 报道。c e l l u l o m o n a ss p g j t 0 7 菌株产生果聚糖属最新发现。 2 由单因素实验和正交实验确定了c e l l u l o m o n a ss p g j t 0 7 菌株最适产糖的 发酵培养基组成为( g n ) ：蔗糖4 0 ，蛋白胨7 0 ，硫酸铵1 4 ，k 2 h t 0 4 2 0 ，m g s 0 4 o 2 5 ，f e s 0 4o 0 1 ；由单因素实验确定了该菌株最适产糖的培养条件为：初始p i - i 8 0 、温度3 0 、装液量7 5m l 2 5 0m l 、摇瓶转速1 8 0r p m 、接种量6 ( v v ) 、培 养时间4 8h 。在最佳的培养基和培养条件下，该菌株产果聚糖得率为4 0 ( 基于 培养基中4 的蔗糖含量) 。 3 蔗糖的添加量对果聚糖的产成有较大的影响，发酵液p h 的调整对产糖影 响不大。g j t 0 7 菌株发酵产糖过程中，蔗糖累积添加总浓度为8 时，其转化率 及果聚糖产量都较高，分别为3 7 2 1 、2 5 7 8g a 。1 0l 全自动发酵罐补料放大实 验验证了以上实验工艺的可行性，并为进一步工艺放大实验提供了数据参考和理 论基础。 4 确定了果聚糖的最佳提取工艺为：发酵液调至中性后高温浓缩至原来的 1 2 ，浓缩液调p h8 0 ，加入2 5 倍乙醇沉淀多糖。经s e v a g e 法脱蛋白、透析及 s e p h a c r y ls - 3 0 0h r 凝胶柱层析分离纯化。凝胶渗透色谱法( g p c ) 确定了 c e l l u l o m o n a ss p g j t 0 7 果聚糖的重均分子量为7 4 0k d a 。 5 结合红外光谱、纸色谱和高效液相色谱三种分析方法，确定了 c e l l u l o m o n a ss p g j t 0 7 胞外多糖为果聚糖。 c e l l u l o m o n a ss p g j t 0 7 产果聚糖的研究 本课题的研究结果为果聚糖的进一步开发利用奠定了一定的理论基础。 关键词：c e l l u l o m o n a s ( 纤维单胞菌属) ，果聚糖，发酵，组分分析 i i c e l l u l o m o n a ss p g j t 0 7 产果聚糖的研究 s t u d yo ff r u c t a np r o d u c t i o nf r o mc e l l u l o m o n a ss p g j t 0 7 a b s 仃a c t f r u c t a n ，ah o m o p o l y m e ro f f r u c t o s el i n k e db y1 3 - 2 ，6 一o r1 3 - 2 ，l f r u c t o f u r a n o s i d i c b o n d s ，o f f e r sav a r i e t yo fi n d u s t r i a la p p l i c a t i o n si nt h ef i e l d so ff o o d s ，c o s m e t i c s ， p h a r m a c e u t i c a l s ，a g r i c u l t u r e ，a n ds oo n i nt h i sp a p e r ，af r u c t a np r o d u c i n gs t r a i ni s i s o l a t e d , t h es e l e c t i o no ft h eo p t i m a lf e r m e n t a t i o nm e d i u ma n dc o n d i t i o n sf o rf r u c t a n p r o d u c t i o nf r o mt h a ts t r a i n ，e x t r a c t i o nm e t h o d s ，c h a r a c t e r i z a t i o na n dc o m p o n e n t so f f r u c t a na r es t u d i e d 1 af r u c t a np r o d u c i n gs t r a i ng j t 0 7i si s o l a t e df r o mo r c h a r ds o i lt h r o u g ht h e c o m p o u n ds c r e e n i n gm e t h o d so fq u a l i t a t i v ea n dq u a n t i t a t i v ea n a l y s i s t h es t r a i n g j t 0 7i d e n t i f i e da sc e l l u l o m o n a s i ti st h ef i r s tr e p o r tt h a tt h es t r a i no fc e l l u l o m o n a s p r o d u c e sf r u e t a n 2 t h em e d i u mc o m p o n e n t sa n df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sa r eo p t i m i z e da c c o r d i n g t ot h eo n e - a t a t i m em e t h o d ，w h i l et h ec o n c e n t r a t i o no fm e d i u mc o m p o n e n t si s d e t e r m i n e db yo r t h o g o n a lm a t r i xm e t h o d t h er e s u l t ss h o wt h a tt h e o p t i m a l f e r m e n t a t i o nm e d i u mi sa sf o l l o w s ( 妒) ：s u c r o s e ，4 0 ；p e p t o n e ，7 o ；( n i - h h s 0 4 ，1 4 ； k h 2 p 0 4 ，2 0 ；m g s 0 4 ，o 2 5 t h es u i t a b l ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sa r ea sf o l l o w s ： i n i t i a lp h8 0 ，t e m p e r a t u r e3 0 。c ，m e d i u mv o l u m e7 5 m l 2 5 0 m l ，i n o c u l u mv o l u m e6 ( v v ) ，t i m e4 8h i ns u c ho p t i m a ln u t r i t i o na n de n v i r o n m e n t a lc o n d i t i o n s ，t h em a x i m a l f a n a c t a ny i e l dr e a c h e s3 6 i nr e l a t i o nt ot h es u c r o s ea f t e r4 8hf e r m e n t a t i o n 3 t h ea d d i n ga m o u n to fs u c r o s eh a sah e a v ye f f e c to nf u c t a np r o d u c i n g ，w h i l e p ha d j u s t i n go ff e r m e n t a t i o n b r o t hh a sn oe f f e c to ni t w h e na c c u m u l a t i v e c o n c e n u a f i o no fs u c r o s er e a c h e s8 i nf e r m e n t a t i o nb r o t h t h ei n t r o d u c t i o no fs u c r o s e a n df r u c t a ny i e l da r eh i g h e r , 3 7 2 1 a n d2 5 7 8g 1 ，r e s p e c t i v e l y t h em a g n i f y i n g e x p e r i m e n to f1 0 la u t o m a t i cf e r m e n t a t i o nf l a s kv a l i d a t e sa b o v ef e r m e n t a t i o nt e c h n i c s ， a n dp r o v i d e ss o m ed a t ar e f e r e n c ef o rf u r t h e rs t u d y 4 t h eo p t i m a le x t r a c t i n gp r o c e s sf o rp o l y s a c c h a r i d ei sd e t e r m i n e da sf o l l o w s ： t h ef i l t r a t ei sh a t e da f t e ra d j u s t e dt op h7 0i no r d e rt ob ec o n c e n t r a t e dt oi 2v o l u m e ， a d j u s t e dt op h8 0 ，a n dt h e np r e c i p i t a t e db y2 5 v o l u m eo f9 5 e t h a n o l ，t h e i i i c e l l u l o m o n a ss pg j t 0 7 产果聚糖的研究 p r e c i p i t a t ei ss o l v e di nd e i o n i s e dw a t e ra n dp r e c i p i t a t e da g a i n , t h e nc e n t r i f u g e d ，t h e c r u d ep o l y s a c c h a r i d e ( l v - 1 ) i so b t a i n e d t h es e m i - p u r i f i e dp o l y s a c c h a r i d e ( l v - 2 ) i s o b t a i n e df r o ml v - 1a f t e rd e p r o t e i n i z a t i o nt h r e et i m e sb ys e v a g em e t h o d l v - 3i s o b t a i n e df r o m l v - 2a f t e r p u r i f i e du s i n gs e p h a c r y l s - 3 0 0 g e lf i l t r a t i o n c h r o m a t o g r a p h i ct e c h n i q u e t h ea v e r a g em o l e c u l a rw e i g h to fl v - 3i sd e t e r m i n e dt o b e7 4 0k d ab yg e lp e r m e a t i o nc h r o m a t o g r a p h y 5 t h ep o l y s a c c h a r i d ef r o mc e l l u l o m o n a ss p g j t 0 7i sc o n f i r m e dt ob eaf r u c t a n c o m p o s e do ff r u c t o s eu s i n gt h ea n a l y s e so fi n f r a r e ds p e c t r u m ，p a p e rc h r o m a t o g r a m a n dh i g hp r e s s u r el i q u i dc h r o m a t o g r a m t h es t u d i e so ft h i sp a p e rp r o v i d eat h e o r e t i cf o u n d a t i o nf o rf u r t h e re x p l o i t a t i o n a n da p p l i c a t i o no f f r u c t a n k e yw o r d s ：c e l l u l o m o n a s ，f r u e t a n ，f e r m e n t a t i o n , a n a l y s i so f c o m p o s i t i o n i v c e l l u l o m o n a ss p g j t 0 7 产果聚糖的研究 0 前言 0 1 立题背景和意义 糖类的研究已有百年多的历史，糖类的生命科学几乎与蛋白质的生命科学同 时诞生，但由于糖结构的复杂性和研究手段的局限性，使得对糖的研究进展非常 缓慢，研究水平也远远落后于核酸与蛋白质( 金城，2 0 0 1 ) 。近二十多年来，随 着分子生物学的兴起，物理和化学技术的发展，人们对糖的认识有了质的飞跃， 逐渐认识到糖及其复合物分子具有极其重要的生物功能，多糖与免疫功能的调 节、细胞与细胞的识别、细胞间物质的运输、癌症的诊断与治疗等，都有着密切 的关系。近年来人们又发现多糖的糖链在分子生物学中具有决定性作用，此外它 还能控制细胞的分裂和分化、调节细胞的生长和衰老。多糖在医药、食品工业、 发酵工业及石油工业上也有着广泛的应用。因此，对糖类的研究再次成为人们关 注的焦点。 多糖是由糖苷键连接起来的醛糖或酮糖组成的天然大分子，按来源不同，可 分为植物多糖、动物多糖和微生物多糖。微生物多糖是细菌、真菌等微生物在代 谢过程中产生的对微生物有保护作用的生物高聚物。微生物多糖在工业生产与生 活的许多领域具有广泛的应用价值。如，细菌的荚膜多糖在医药上可用于疫苗( 陈 怡，2 0 0 2 ) ：海洋细菌胞外多糖“海拿登”( m a r i n a c t a n ) 因其显著的抗肿瘤活 性已进入多糖抗肿瘤新药开发的临床阶段( u m e z a w a ，1 9 8 3 ) ；虫草多糖能增强 机体免疫功能，对肿瘤细胞有抑制作用( 焦严朝等，1 9 9 0 ) 。与动、植物多糖 相比，微生物多糖具有生产周期短、不受气候和地理环境条件限制、易于提取分 离和应用范围广等特性，所以得到广泛研究( d ep h i l i p p i s 等，2 0 0 1 ) 。目前， 已大量投产的微生物多糖主要有黄原胶、结冷胶、热凝多糖、小核菌葡聚糖、短 梗霉多糖等( 魏培莲，2 0 0 2 ) 。其中许多微生物多糖已作为胶凝剂、成膜剂、保 鲜剂、乳化剂等，广泛应用于食品、制药、石油、化工等多个领域。 果聚糖是自然晃中分布最广泛的生物高分子，是由以p - 2 ，6 - 键和p 一2 ，1 一键连接 的呋喃果糖基组成的同多糖。根据连接键的不同，分为两种类型的果聚糖：菊糖 和左聚糖( h a n 和c l a r k e ，1 9 9 0 ) 。菊糖由b 2 ，1 键连接的呋喃果糖组成，通常 c e l l u l o m o n a s 印g j t 0 7 产果聚糖的研究 是一种植物来源的果聚糖，在菊科和禾本科中作为一种储存糖类。左聚糖是由 p 一2 ，6 一键连接d 呋喃果糖残基作为主链，以一些p 一2 ，l 一键连接作为支链所组成的果 聚糖。据文献报道，许多微生物尤其是细菌是果聚糖的一个重要来源，其中绝大 多数的细菌果聚糖都是左聚糖型果聚糖，即果糖残基主要以b 2 ，6 键连接。如枯 草芽孢杆菌、运动发酵单胞菌、多黏芽孢杆菌、产果聚糖气杆菌、解淀粉欧文菌、 草生欧文菌、水生拉恩菌、假单胞菌等。果聚糖及其衍生物因具有抗肿瘤、抗病 毒、抗辐射、抗氧化、降低血清胆固醇和甘油三酯含量等生理活性和特有的物理 特性，而被广泛地应用于医学、药学、化妆品和食品等工业中( p a r k 等，2 0 0 3 ) 。 植物中的果聚糖还具有多种生物保护功能，如调节植物适应低温光合作用、调控 植物蔗糖分配以及使植物适应水分亏缺、高c 0 2 浓度、缺氧条件等( 成善汉等， 2 0 0 2 ) ，因此吸引了众多植物学家和农业科学家的兴趣。由于果聚糖及其衍生物 在上述许多方面的广泛需求，过去2 0 多年中，工业化果聚糖的产量上升了1 0 0 倍 ( 从1 0 0 0 吨上升到1 0 0 0 0 0 吨) 。因此，对果聚糖的研究具有重要的意义和价值。 国外对果聚糖尤其是微生物果聚糖的生产和应用进行了许多研究，目前已达 到分子生物学水平。国内研究主要集中于低聚果糖的合成及应用研究方面，微生 物来源的果聚糖研究尚无报道。与植物果聚糖相比，微生物来源的果聚糖具有生 产周期短、不受气候和地理环境条件限制、易于提取分离和生理活性更强等优点。 果聚糖作为一种功能性生物材料，在食品、医学、化妆品、制药和农业等工业上 具有巨大的应用潜力。但是，目前果聚糖由于供应量有限，而致使其实际商业应 用受到限制。因此，寻找一种能分泌果聚糖并适于大规模工业生产的果聚糖产生 菌成为整个问题的关键，具有重要的理论意义和应用价值。本课题拟从以下几个 方面进行研究： ( 1 ) 通过产物定性和定量分析相结合的定向筛选方法，筛选出一株具有容 易培养、产糖能力高等优良性状、并具有规模化生产潜力的果聚糖生产菌株，并 进行菌种鉴定。 ( 2 ) 通过研究不同因素对其产糖能力的影响，从而优化菌株产糖条件，提 高产糖能力，以便获得适用于工业化生产的最佳培养基组成与发酵产糖条件。并 进一步进行工艺放大实验，为该菌种的规模化生产提供基础性研究。 ( 3 ) 通过对产物多糖分离提取条件的优化研究，确定出最佳提取工艺；并 c e l l u l o m o n a ss p g j t 0 7 产果聚糖的研究 对粗多糖进行纯化分离，得到部分纯品，进而进行分子量、组分分析等理化性质 的研究。 本课题研究对于微生物资源及其产物的充分利用和开发奠定了一定的理论 基础。 0 2 果聚糖研究进展 多糖( p o l y s a c c h a r i d e s ，p s ) 又称多聚糖，是由醛糖或酮糖通过糖苷键连接在 一起的线性或分枝链状聚合物，广泛存在于植物、动物和微生物中，是自然界含 量最丰富的生物高分子。按化学结构分类，多糖分为同多糖和杂多糖，由一种单 糖组成的多糖称为同多糖，如纤维素、淀粉，它们由d 吡喃葡萄糖组成：具有 两种或多种不同的单糖组成的多糖称为杂多糖( 张力田，1 9 8 8 ) 。按来源不同， 多糖又可分为植物多糖、动物多糖和微生物多糖。其中研究得较早的是从细菌中 得到的荚膜多糖，它在医药上主要用于疫苗。科学家对真菌多糖做了广泛而深入 的研究，如酵母菌多糖、食用菌多糖，特别是食用菌多糖的研究，其中以香菇多 糖研究的较为清楚。另外，植物多糖的开发也倍受人们的青睐，由于我国是中药 的起源之地，而糖类是中药材中普遍存在的成分，在对各种中药材的化学成分研 究的过程中，人们都少不了对其中多糖的关注。 果聚糖是由以p 一2 ，6 一键和p 一2 ，1 一键连接的呋喃果糖基组成的同多糖，是自然界 中分布最广泛的生物高分子。根据连接键的不同，分为两种类型的果聚糖：菊糖 和左聚糖( h a n 和c l a r k e ，1 9 9 0 ) 。菊糖由b 2 ，1 键连接的呋喃果糖组成，通常 是一种植物来源的果聚糖，在菊科和禾本科中作为一种储存糖类( v a n d a m m e 和 d e r y c k e ，1 9 8 3 ) ，因此可以从自然界植物中分离得到菊糖型果聚糖。左聚糖是 由b 一2 ，6 键连接d 呋喃果糖残基作为主链，以一些p 2 ，1 一键连接作为分支点所组成 的果聚糖，通常来源于微生物，绝大多数的细菌果聚糖都是左聚糖型果聚糖。 世界各国对果聚糖的研究可追溯到1 8 0 4 年，至今已有2 0 0 多年的历史( r o s e ， 1 8 0 4 ) 。早期的研究主要集中于果聚糖的生理学和生物化学特性，随着果聚糖代 谢酶类的发现，研究的重点转向对果聚糖代谢过程和功能的认识( p o l l o c k 和 c a i n s ，1 9 9 1 ) 。1 9 8 8 年在德国、1 9 9 1 年在英国、1 9 9 6 年在美国召开了3 次果聚糖 国际学术会议。果聚糖的研究也已从基础科学向应用技术的方向发展。微生物果 c e l l u l o m o n a ss pg j t 0 7 产果聚糖的研究 聚糖与植物果聚糖相比分子量较高，但分支度较少、结构较简单、水溶性好，这 些特征正是技术应用所需要的，而且其生产不受季节控制、生产周期短、提取分 离简单、生产成本低。因此，国外学者很早就开始了对微生物果聚糖的研究与开 发，目前其研究水平已达到分子水平。 0 2 1 合成果聚糖的主要微生物 由于果聚糖增加了加工液体的黏度，因此曾被认为是在糖和果汁加工过程中 人们所不希望的副产物( h a r t ，1 9 9 0 ) 。1 9 0 1 年，g r e i g - s m i t h 发现了一株枯草 芽孢杆菌在蔗糖上生长时，能够产生果聚糖。此后由于果聚糖潜在的应用价值， 它开始受到越来越多的关注，已经有许多产生果聚糖的微生物被鉴定。如环状芽 孢杆菌( b a c i l l u sc i r c u l a n s ) 、嗜热脂肪芽孢杆菌( b a c i l l u ss t e a r o t h e r m o p h i l u s ) 、 枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 、多黏芽孢杆菌( b a c i l l u s p o l y m y x a ) 、路氏乳 杆菌( l a c t o b a c i l l u sr e u t e r i ) 、内氏放线茵( a c t i n o m y c e sn a e s l u m d i i ) 、运动发酵 单胞菌( z y m o m o a sm o b i l i s ) 、木醋杆菌( a c e t o b a c t e r x y l i n u m ) 、产果聚糖气杆 菌( a e r o b a c t e rl e v a n i c u m ) 、解淀粉欧文菌( e r w i n i aa m y l o v o r a ) 、水生拉恩菌 ( r h a n e l l aa q u a t i l i s ) 、假单胞菌( p s e u d o m o n a s ) 等。 0 2 2 细菌果聚糖的生物合成 0 2 2 1 细菌果聚糖合成的酶学 研究资料报道细菌果聚糖主要是由左聚糖蔗糖酶( 蔗糖：2 , 6 b - d 果聚糖：6 - d 果糖基转移酶；蔗糖果糖基转移酶，e c 2 4 1 1 0 ) 从蔗糖来合成，该酶广泛存 在于微生物中，以胞内组成酶和胞外诱导酶的形式存在( h a n ，1 9 9 0 ) 。在自然 界中，左聚糖蔗糖酶最丰富的底物是蔗糖，棉籽糖也可以作为其底物。 左聚糖蔗糖酶是一种转移酶，它将整体的果糖基催化转移到各种受体分子 上。这个酶催化以下反应( h e t t w e r 等，1 9 9 5 ) 。 1 聚合反应 ( 蔗糖) 。一( 葡萄糖) 。+ 左聚糖+ 寡糖 ( 0 - 1 ) 2 水解反应 蔗糖+ h 2 0 一果糖+ 葡萄糖( 0 - 2 ) c e l l u l o m o n a ss p g j t 0 7 产果聚糖的研究 ( 左聚糖) 。+ h 2 0 一( 左聚糖) 。1 + 果糖( 0 ：3 ) 3 受体反应 蔗糖+ 受体分子一果糖基受体+ 葡萄糖 ( o 4 ) 4 交换反应 蔗糖+ h c 】葡萄糖一果糖一【1 4 c 葡萄糖+ 葡萄糖 ( 0 5 ) 5 歧化反应 ( 左聚糖) m + ( 左聚糖) 。一( 左聚糖) 。1 + ( 左聚糖k l ( o - 6 ) 该酶同时催化水解和聚合反应( 反应0 - 1 ) ，生成左聚糖和游离的葡萄糖。 该反应在蔗糖作为唯一的果糖基供体和受体时发生，包括三步：引发，增长和终 止。通过从供体重复地向正在生长的受体分子转移己糖基，左聚糖链逐步增长。 该酶主要通过乒乓机理催化一个偶联发应，也就是紧跟着蔗糖水解之后发生果糖 基转移反应，该反应存在一个果糖基一酶中间体( c h a m b e r t 和g o n z y t r e b o u l ， 1 9 7 6 ) 。 当水作为受体时，从蔗糖和果聚糖中都可产生一个游离的果糖( 反应0 2 ) 。 该反应在以上提及的所有左聚糖蔗糖酶催化反应中都发生，但是与糖作为受体时 相比，反应速率要慢得多。反应0 3 在环境中有受体存在的条件下发生，该酶 将蔗糖的果糖基专一性地转移到受体中醛糖的c 一1 羟基。因此，含有羟基的化 合物，如甲醇、水、寡糖、左聚糖，都可作为果糖基受体( h e s t r i n 和a v i g a d ， 1 9 5 8 ) 。 反应机理产生了一个非还原糖化合物和一系列寡糖，其中具有一个以上果糖 部分的糖分子作为主要的反应产物。在高浓度的果糖供体如蔗糖和棉籽糖存在 时，该反应优先发生。反应o - 4 可认为类似于反应0 2 和0 3 ，但是与蔗糖的 再生不同，其具有一个高能键。这个酶还催化歧化反应0 5 ，其中左聚糖或寡聚 体的聚合度得到了改变。以上的反应相互竞争，产生了一个特异性的主要产物和 一些次要产物，但它们主要是由环境因素控制的。 0 2 2 2 细菌果聚糖合成的遗传学基础 迄今为止，至少已克隆和表征出8 种革兰氏阴性菌株的左聚糖蔗糖酶基因。 这8 种菌是：重氮营养醋杆菌( a n i e t a 等，1 9 9 6 ) 、木醋杆菌( t a j i m a 等，2 0 0 0 ) 、 c e l l u l o m o n a ss pg j t 0 7 产果聚糖的研究 重氮营养葡糖酸醋杆菌( c a r m e n 等，2 0 0 2 ) 、解淀粉欧文菌( d u l 等，2 0 0 4 ) 、 丁香假单胞菌大豆致病变种、丁香假单胞菌菜豆致病变种( h e t t w e r 等，1 9 9 8 ) 、 水生拉恩菌( s o n g 等，1 9 9 8 ) 和运动发酵单胞菌( s o n g 等，1 9 9 3 ) 。几种革 兰氏阳性菌的左聚糖蔗糖酶基因也已经被克隆，如枯草芽孢杆菌( l i 等，1 9 9 7 ) 和链球菌( s a t o 等，1 9 8 4 ) 。所有的左聚糖蔗糖酶基因都具有几个保守区，它 们被认为对酶的活性至关重要。尽管存在有保守区，但不同来源的酶仍有所不同。 酶基因的来源不同，其同源性也存在差异。 0 2 2 3 细菌果聚糖合成的调控 0 2 2 3 1 蛋白水平的调控 微生物利用蔗糖的类型有两种：胞内利用和胞外利用。通常，这些蔗糖的吸 收利用系统存在于胞内；蔗糖通过p t s 系统运输。对于一些缺失p t s 系统的细菌， 如运动发酵单胞菌，首先在胞外将蔗糖水解成单糖，然后将这些单糖转移到胞内 ( d im a r c o 和r o m a n o ，1 9 8 5 ) 。 运动发酵单胞菌利用蔗糖是由两种糖水解酶共同作用的。葡萄糖的吸收和利 用系统( g t k 系统) 非常靠近l e v u 操纵子，而且在代谢上也与运动发酵单胞菌 的蔗糖利用系统相关联。g 腩系统受到紧密相连的基因表达机制的调控( l i u 等， 1 9 9 2 ) 。在l e v u 和g t f 操纵子的插入序列中，发现了两种分别负责编码类似l r p 调节蛋白和天冬氨酸消旋酶的假定的开放读框( s o n g 等，1 9 9 9 ) 。 在分子水平上，迄今报道的编码蔗糖水解酶的基因在染色体上是不相连的， 但是，它们都与编码属于p t s 系统的附属基因相连( b r u c k e r 等，1 9 9 3 ) 。这些 基因的表达受到调节机理的调控，如反终止作用或阻遏。 0 2 2 3 2 转录和翻译水平上的调控 编码胞外左聚糖蔗糖酶和蔗糖酶的基因已经被分离和表征。k y o n o 等 ( 1 9 9 5 ) 报道了含有编码运动发酵单胞菌和枯草芽孢杆菌胞外左聚糖蔗糖酶和蔗 糖酶基因的核苷酸序列。这两个基因位于染色体上的同一个操纵子中，然而，在 其它细菌和酵母中，几乎所有编码糖水解酶的基因都分散在染色体上( c a r s o n 和 b o t s t e i n ，1 9 8 3 ) 。在诱导物( 蔗糖或果糖) 存在时，枯草芽孢杆菌的左聚糖酶 基因被激活，并且受一个控制蔗糖操纵子表达的多效应调节系统的调控。含有 c e l l u l o m o n a ss pg j t 0 7 产果聚糖的研究 d e g s d e g u , a e g o ( 先前是s a c 珥口j 盘q ) 和d e g r 基因的多效应调节系统，可影响s a c b 的表达( d e b a r b o u i l l e 等，1 9 9 1 ) 。左聚糖蔗糖酶眭1 s a c b 基因编码，并从与s a c r 基因座紧密连接的组成型启动子处开始表达。勋棵基因座含有一个终止转录的回 文结构。在蔗糖存在的条件下，属于s a c s 操纵子的s a r 】，基因产物一个反终止 因子，允许s a c b 基因的转录。这个基因的表达也受到其他调节基因的控制，如双 组成系统d e g s d e gu 和咖q ( r a p o p o r t 和k l i e r ，1 9 9 0 ) 。 0 2 3 用生物技术生产果聚糖 果聚糖可以通过微生物发酵或者酶法合成技术来生产。 0 2 3 1 微生物发酵法生产果聚糖 0 2 3 1 1 果聚糖生产菌株的分离和筛选 在筛选果聚糖生产菌株的过程中，可以通过使用含有蔗糖的固体琼脂平板 来测定果聚糖的形成活性，然后根据分析程序来筛选生产果聚糖的菌株。从琼 脂平板上收集果聚糖，再醇沉提取出来，酸水解后，通过纸色谱( p c ) 或薄层 色谱( t l c ) 分析确定果聚糖的单一性，在层析纸上或t l c 板上果糖被鉴定为 单一斑点。 0 2 3 1 2 果聚糖的微生物发酵法生产 微生物发酵生产果聚糖，蔗糖的转化率较低，生产果聚糖的条件也随所用微 生物的不同而不同( 见表0 1 ) 。因为蔗糖被作为能源来利用、副产物的形成、 左聚糖蔗糖酶生产的低水平以及细菌中存在有左聚糖酶活力等缘故，发酵法生产 果聚糖得率较低。另外，高分子量的果聚糖黏度较高，致使从发酵液中回收果聚 糖的过程较为困难。理论上，当蔗糖作为底物时，由左聚糖蔗糖酶来生产果聚糖 的得率为5 0 ( 质量分数) 。通常，基于培养基中的蔗糖含量，生产果聚糖的发 酵得率不会高于理论得率的5 8 ( 见表o 1 ) 。 0 2 3 2 酶法合成果聚糖 酶法合成果聚糖的最适温度范围为o 4 0 。从运动发酵单胞菌制备得到的 左聚糖蔗糖酶在0 时表现出最大的果聚糖形成活力，因此它能提供一种污染概 c e l l u l o m o n a ss p g j t 0 7 产果聚糖的研究 三 宾 嵩星善 蛊霜 量 篁 2 n g 2篁 昌 蛊宙蛊b 宙蛊b墨 - 8 暴馨g岳察雠埘牝州燃链艇*嘲如嚣氍g醐称辩*醐盐铽鲻罩fb让铽辖求蛊 ooon种2j苫 。凸昏一驰矗)iq n66i|和日首兰o nnai|、日曼鼍。f1 66一静若一0一 066一鲁王小西i|暮 寸m_一q目fl幽 盘暮os毪。譬。晕fz穹。善苗哥芎昌)|嚣制嵌粗霉廿盐撼擦魍 毒号譬h薯#8美z)粗晕井盐撼需喜 童鼍鐾富毒毒s粗匝鞯酬* 晕葛蠢芝崔言ou毫ov粗士糖精鼯搴辑 s8，|t芸皇菩主3粗能备州抖 堇蔫置望暮u苦v龌蜒晕搬簿帐 。墨#暑oq宴毛若v粗靶觎搬蒜蚺 b毫u3唾粗靶埒耀 箍怯帮舔 逞妊求恻蟮哥k话醋州 述舡嚣世 0 铽牝乱埘 七随 g一萎口q量盘茸iio专npo蠢p3mi_o oo盘 襄舔眯忆州蠼凿越_【_0懈 c e l l u l o m o n a ss pg j t 0 7 产果聚糖的研究 率最小的稳定操作条件( s o n g 等，1 9 9 6 ) ；来自假单胞菌的左聚糖蔗糖酶在1 8 时活力最高( h e t t w e r 等，1 9 9 5 ) ；来自拉恩菌属的温度为4 0 活性最高( o h t s u k a 等，1 9 9 2 ) 。大多数左聚糖蔗糖酶在温度高于4 5 时就失活，而b a c i l l u ss p t h 4 2 是个例外，它在5 0 时表现出最大的果聚糖形成活力( a m m a r 等，2 0 0 2 ) ，这 种热稳定性有利于大规模生产果聚糖。左聚糖蔗糖酶一般在p h 值4 7 范围内稳 定，运动发酵单胞菌、假单胞菌、拉恩菌、b a c i l l u ss p t h 4 2 来源的酶最适p h 值 都为6 0 。 为了较好地控制生产过程，国外众多研究致力于固定化酶法生产果聚糖。 j a n g 等( 2 0 0 0 ) 研究发现，将运动发酵单胞菌左聚糖蔗糖酶固定在羟基磷灰石 上时，它对盐和去垢剂所表现出的酶学和化学特性与原始酶相同，但是固定后酶 最适d h 值变为酸性。当将运动发酵单胞菌左聚糖蔗糖酶固定在磁铁矿表面时 ( j a n g 等，2 0 0 1 ) ，该酶产糖最适p h 值由原来的5 0 变为4 0 ，热稳定明显提高， 果聚糖合成能力下降，但水解能力增强，其所生产的低分子量果聚糖比例提高了 2 3 倍。 0 2 4 果聚糖的应用 果聚糖是一种水溶性和黏性的高分子多糖，具有多种生理功能和生物活性。 因而被广泛应用于医学、药学、农业和食品等工业中。随着果聚糖生产成本的降 低，其应用将会大大增加。 0 2 4 1 医学应用 早在2 0 世纪3 0 年代，果聚糖就被用在医疗上，用于肾功能的鉴定。此后果聚 糖及其衍生物在医疗上的潜在应用日益重要。微生物来源的果聚糖有很好的抗肿 瘤活性( c a l a z a n s 等，1 9 9 7 ) ，这种活性与其分子量大小( y o o 等，2 0 0 4 ) 和 支链结构( y o o n 等，2 0 0 4 ) 有关。果聚糖对肿瘤细胞有直接的效果，这与它对 细胞膜的修饰有关，包括对细胞渗透性的改变( l e i b o v i c i 和s t a r k ，1 9 8 5 ：c a l a z a n s 等，2 0 0 0 ) ，以及它具有防辐射保护和抗菌活性( l i e p a 等，1 9 9 3 ；v i n a 等， 1 9 9 8 ) 。果聚糖还具有降低血清胆固醇和甘油三酯含量的活性( y a m a m o t o 等， 1 9 9 9 ) 。r o b e r t 和g a r e g g ( 1 9 9 8 ) 认为果聚糖的硫酸化、磷酸化和乙酰化衍生 c e l l u l o m o n a ss pg j t 0 7 产果聚糖的研究 物具有抗艾滋病毒的活性，可以作为抗艾滋病药物。 o 2 4 2 制药应用 果聚糖及其衍生物在制药工业中有着广泛的应用。其衍生物可作为制造药片 时的赋形剂以及将水转运至凝胶的试剂，如纤维素衍生物、果胶和交叉多糖的水 溶性高聚物，在制备固体、液体、半固体以及控释制剂中起着关键的作用( g u o 等，1 9 9 8 ) 。果聚糖可以各种方式应用于药物制剂中，果聚糖的黏度随其d p 和 分支程度的不同而异，其中分支程度与果糖侧链的数量有关，通常，低分子量和 分支少的果聚糖黏度低可作为一种快速释放剂型的药片胶黏剂；中等和高黏度的 果聚糖可作为控释剂型中的基质，中等分子量的果聚糖还可作为血液扩张剂的替 代品( m a r o o n 等，1 9 5 5 ) 。 0 2 4 3 农业应用 i m a m 和a d b - a l l a h 早在1 9 7 4 年就将酶法合成的果聚糖开发成了一种土壤 调节剂来改进不同种子的萌发状况。由于果聚糖代谢与植物碳素分配、源库关系 调节和抗逆性等有密切关系，近年来已经吸引了许多植物生理学家、生化学家和 农学家的兴趣。果聚糖的积累增强植物抗低温胁迫作用已被广泛证实( s u z u k i 等，1 9 8 8 ) 。将果聚糖引入植物，可以增强它们在温度带的农学行为和自然保存 能力( v i j n 和s m e e k e n s ，1 9 9 9 ) 。v a nd e rm e e r 等( 1 9 9 6 ) 将枯草芽孢杆菌的 果糖基转移酶基因导入非果聚糖积累型的植物马铃薯中，转基因植株的叶片和小 块茎内均有相当量的果聚糖积累，从而改变了马铃薯植株原有的碳分配模式。表 达来自于运动发酵单胞菌的左聚糖蔗糖基因的转基因烟草，对干旱和寒冷的耐受 能力有明显地增强( p a r k 等，1 9 9 9 ) 。积累果聚糖的转基因植物已经被认为可 以作动物的一种新的营养饲料( b i g g s 和h a n c o c k ，2 0 0 1 ) 。 o 2 4 4 食品应用 随着众多学者对果聚糖的研究和开发，近来又提出了许多关于果聚糖的应 用，尤其是在食品方面的应用( h a n ，1 9 9 0 ) 。果聚糖可作为增稠剂、稳定剂、 乳化剂、赋形剂、色素和香精的载体( c a l a z a n s 等，1 9 9 7 ) 。果聚糖及其部分 c e l l u l o m o n a ss pg j t 0 7 产果聚糖的研究 水解产物还是一种改善肠道微生态环境的益生源，可供双歧杆菌和乳杆菌属等的 肠道细菌发酵( g i b s o n 等，1 9 9 5 ；m a r x 等，2 0 0 0 ) ，而不能被产气荚膜梭菌、 大肠杆菌和金黄色葡萄球菌所利用( k a n g 等，2 0 0 0 ) ，从而有效的增殖双歧杆 菌，而双歧杆菌产生的有机酸又可抑制肠道内沙门氏菌等腐败菌的生长，从而改 善肠道环境。一般情况下低聚合度果聚糖不易被消化，可防止产生龋齿和增胖等； 高聚合度果聚糖具优越的物理化学性能( 黏度、触变性、弹性等) ，可以代替脂 肪，用于制作营养食品和非食物原料( f u c h s ，1 9 9 3 ) 。此外，果聚糖因高甜度 和低热值性而成为食用甜昧剂和低热值性食品原料，研究还发现人体摄入果聚糖 后不增加血糖水平，且能降低血清胆固醇和甘油三酯含量，是糖尿病、高血压患 者和减肥用的良好食品和甜味剂( r o b e r f r o i d ，1 9 9 3 ) 。果聚糖还是纯果糖和2 1 3 一d 呋喃果糖二酐( d f a ) 的上好来源。因此果聚糖可用于开发保健食品或营养品。 0 2 5 果聚糖的研究展望 目前，国外对果聚糖的研究及开发利用进展得很快，在果聚糖的生产( 发酵 生产和体外酶法合成) 、代谢途径及其调控、生物活性等方面做了大量的工作。 由于果聚糖具有抗肿瘤、抗病毒、降胆固醇、降血脂、抗辐射、抗氧化等多方面 的生物活性，果聚糖的研制已成为一个热点。 果聚糖由于供应量有限，致使其实际商业应用受到限制。因此，降低果聚糖 生产成本，提高产量，增加供应量，是果聚糖研究的重点。对于在技术上的应用， 高分子量和低分支度的果聚糖可能是所需要的，但目前对微生物果聚糖及其寡聚 体的糖结构分析研究较少，为了最大程度地利用水溶性果聚糖的多功能性，需要 对其性质有更深入的认识。因此，对于果聚糖来说，还需要进一步加强研究和开 发的深度和广度，使其商业应用早日成为现实。 c e l l u l o m o n a ss pg j t 0 7 产果聚糖的研究 参考文献 1 陈恰天然多糖的研究概况鹾鼢学技杠乒药功臂缓2 0 0 0 ，2 ( 6 ) ：5 2 5 9 2 成善汉，谢从华，柳俊高等植物果聚糖研究进展稽物学遵撼2 0 0 2 ，1 9 0 ) ：2 8 0 - 2 8 9 3 焦彦朝，梁宗琦虫草生物活性物质研究概况劳班农j 蜊喾1 9 9 0 ，3 ：5 3 5 8 4 金城糖生物学破解基因组功能的必由之路手厚影学魔砑兑生魔学堀2 0 0 1 ， 1 8 ( 1 ) ：6 6 - 7 5 5 魏培莲微生物胞外多糖研究进展撕正群越学结学蕊2 0 0 2 ，1 4 ( 2 ) ：2 8 - 1 2 6 张力田碳水化合物化学北京：轻工业出版社，1 9 8 8 ，