（轻工技术与工程专业论文）酱油菌种米曲霉的研究及条件优化.pdf

摘要 酱油生产主要是利用米曲霉所产生的丰富的蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、酯酶、果 胶酶等多种酶，分解原料中的多种成分，形成色、香、味独特的产品。菌种米曲霉是酿 造酱油品质优劣的关键。本课题对米曲霉选育及产酶特性等方面进行了较系统的研究和 优化试验，目的优化生产工艺，提高酱油生产效率。主要研究内容和结果如下： 1 首先研究不同来源米曲霉在不同的培养基中的生长形态、速度及其产酶情况，建 立选育优良米曲霉菌株方法。实验表明它是一个有效且具实用价值的菌株筛选方法。 2 研究不同的菌株分泌的各类酶情况，结果表明米曲霉u e 3 3 6 - 2 的产酶能力强于其 它曲霉：米曲霉的总体产酶能力均比黑曲霉强；霉菌都产生较低的果胶酶。黑曲霉产生酸 性蛋白酶及酸性肽酶较多，也分泌相对较多的纤维素酶、果胶酶、糖化酶。 3 研究在不同的p h 条件下成曲的蛋白酶活力分布，结果表明酶活力受p h 影响很大， 不同来源的酶液，其谱图不同，最高峰所对应的p h 范围也不一样。生产过程中，米曲 霉的酶在酱油发酵初期时的中性p h 环境下作用最佳，而在发酵后期低p h 值环境会受 到抑制。 4 研究水分，培养时间及，温度原料的c n 比值对产酶的影响，得最优工艺：培养 基中的水分4 6 ，c n 比值为l ：3 ，最佳培养时间为4 4 小时。米曲霉产中性和碱性蛋 白酶的最佳培养基p h 为7 ，产酸性酶的最适p h 为5 。米曲霉产中性蛋白酶和碱性蛋白 酶的最适温度为3 2 ，产酸性蛋白酶的最适温度为2 8 ( 2 。 5 研究双米曲霉菌种制曲，结果表明米曲霉a s 3 0 4 2 ：米曲霉u e3 3 6 - 2 = h3 的菌 种比例，制作酱油，具有明显的互补优势，酱油的氨基酸态氮比用单一菌种提高1 5 。 6 研究米曲霉和黑曲霉混合菌种发酵，得出酱油还原糖含量明显提高；由于竞争抑 制作用，黑曲霉占总接种量不宜低于5 ，但黑曲霉量高会影响风味，所以接种量不宜 超过2 5 。混合种发酵氨氮最终含量提高约9 6 。 7 对制曲及发酵过程物料量的变化初步研究表明物料的损耗随培养时间的延长而加 大，物料干基重量减少的百分数都在1 1 1 5 之间，灰分基本上没变化，而燃烧值损 失约1 2 1 8 。后发酵工艺过程中，除碳水化合物损失极小部分外，其它基本没变化。 8 研究添加几种酶促剂制曲对提高蛋白酶活力的作用。结果表明酵母精粉及多肽物 质h y y e s t s 0 1 对米曲霉活力的促进作用最为明显，添加2 5 的量，可使酶活分别提高 9 1 和7 6 。花生饼，芝麻麸对酶活力的提高幅度较少，添加超过5 的量，酶活力与 添加量成负相关关系。 关键词：酱油；高盐稀态发酵；米曲霉；蛋白酶活力 a b s t r a c t s o ys a u c em a n u f a c t u r i n gm a i n l yu s ep r o t e a s e , c c l l u l a s e ，a m y l a s e , e s t e r a 船，p e e t a s e p r o d u c e df r o ma s p e r g i l l u so r y z a et od e c o m p o s et h er a wm a t e r i a lt of o r mt h er i c h - c o l o r , f l a v o r f u la n de x t r at a s t ys o ys a l l c e a s p e r g i l l u so r y z a ep l a y sak e yr o l ei ns o y $ a l l c 圮 p r o c e s s i n ga n dt h e 簧托逝o fa s p e r g i l l u so r y z a ea n de n z y m e - p r o d u c i n gp r o p e r t i e sa l e i n v e s t i g a t e di no r d e rt oo p t i m i z et h ep r o c e s s i n gc o n d i t i o n sa n di m p r o v et h ep r o d u c t i o n e f f i c i e n c y i s t u d yo nt h es c r e e n i n gm e t h o do fa s p e r g i l l u so r y z a ef r o md i f f e r e n to r i g i nt h r o u g h o b s e r v i n gg r o w t hc h a r a c t e r i s t i c s ，g r o w i n gs p e e da n dt h ee n z y m ea c t i v i t yo f s t r a i n si nd i f f e r e n t c u l t u r em e d i u m t h er e s u l t ss h o wp r a c t i c a b l em e t h o df o rs o ys a u c e p r o c e s s i n g 2 s t u d yo nt h ee n z y m e sf r o md i f f e r e n tk i n do fs t r a i n ss h o w st h a tt h ep r o t c a s ea c t i v i t yo f u e 3 3 6 - 2i sh i g h e rt h a no t h e r s a s p e r g f f l u so r y z a ep r o d u c e sm o r ee n z y n l et h a na s p e r g i l l u s n i g e ri ng e n e r a l ；a l la s p e r g i l l u sp r o d u c el i t t l ep e e t a s e a s p e r g i l l u sn i g e ra s 3 3 5 0p r o d u c e h i g h e ra c i dp r o t e a s e ，a c i dp e p t i d a s e , c e l l u l a s e ，a m y l a s ea n dp e e t a s et h a n a s p e r g i l l u so r y z a e 3 s t u d yo nt h ed i s t r i b u t i o no fp r o t c a s ea c t i v i t yo f f d i f f e r e n tp i - ir a n g es h o w st h a tp i - i a f f e c t se n z y m ea c t i v i t yv e r ym u c ha n dp r o t c a s ef r o md i f f e r e n ts t r a i n sh a v es p c e t r u m so f t h e m s e l v e sa n dd i f f e r e n to p t i m u mp hr e s p e c t i v e l yw o r k sb e s ti nt h en e u t r a lc o n d i t i o na tt h e b e g i n n i n go f f e r m e n t a t i o na n dw i l lb ei n h i b i t e di na c i dc o n d i t i o nd u r i n gt h el a t e rf e r m e n t a t i o n s t a g e 4 s t u d i e so nt h e 蠡c c 0 鹉s u c ha sc nr a t i o w a t e r , c u l t u r i n gt i m ea n dt e m p e r a t u r e a f f e c t i n gp r o t e a s ep r o d u c t i o ng e tt h eo p t i m u mp r o c e s s i n gc o n d i t i o n sa st h ef o l l o w i n g ：t h e w a t e rc o n t e n to f t h em i x e dr a wm a t e r i a li s4 6 ，t h ec nr a t i oi sl ：3 , t h ec u l t u r i n gt i m ei s4 4 h o u r sa n dt h et e m p e r a t u r ei s3 2 ( 3 t h eo p t i m a lm e d i ap hf o ra s p e r g i l l u so r y z a ep r o d u c i n g n e u t r a la n da l k a l i n ep r o t e a s ei s7 w h i l e5f o rt h ea c i dp r o t e a s e t h eo p t i l i i a lc u l t u r e t e m p e r a t u r ef o ra s p e r g i l l u so r y z a ep r o d u c i n gn e u t r a la n da l k a l i n ep r o t e a s ei s3 2 c ，w h i l e 2 8 cf o r t h ea c i dp r o t e a s e 5 s t u d yo nm i x e dc u l t u r e si n c u b a t i o ns h o w st h a tt h er a t i oa s 3 0 4 2 ：u e 3 3 6 - 2 = 1 ：3g e t s t h eb e s tr e s u l t i ti m p r o v e st h ea m i n oa c i dc o n t e n to fs o ys a u o ea b o u t1 5 t h a no n l yu s i n g a s 3 0 4 2c u l t u r e 6 s t u d yo nt h em i x e dc u l t u r e sa 础0 4 2a n d a s 3 3 5 0 ) f o rk o j i ，s h o w st h a ti tc a ni m p r o v e t h er e d u c i n gs u g a ri ns o ys a u c eo b v i o u s l y ；t h er a t i oo f t h ea s 3 3 5 0s h o u l db eh i g h e rt h a n5 b e c a u s et h ea s p e r g i l l u so r y z a ew o u l dr e s t r a i nt h eg r o w t ho f a s p e r g i l l u sn i g e r , a n da l s oi t s h o u l dn o th i g h e rt h a n2 5 b e c a u s et o om u c ha s 3 3 5 0w o u l d b r i n gb a df l a v o rt os o ys a u t i t h em i x e dk o j i 啪a l s oi m p r o v et h ea a nc o n t e n ta b o u t9 6 7 s t u d yo nt h em a t e r i a lv a r i e t i e so f t h ek o j ic u l t u r ea n ds o y s a u c ef e r m e n t a t i o n rs h o w s t h a ti nk o j ic u l t u r i n gs t a g et h et o t a lm a t e r i a lr e d u c t i o nw o u l di n c r e a s ea l o n gw i t ht h e i n c u b a t i n gt i n l e ；t h em a t t e rr e d u c t i o ni sb e t w e e nl l 1 5 ( o nd r yb a s i s ) ；t h ea s hh a v el i t t l e c h a n g ei ng e n e r a l ；t h eh e a to fc o m b u s t i o nd e c r e a s e sa b o u t1 2 1 8 t h em a t t e rh a sl i t t l e c h a n g ee x c e p tt h ec a r b o h y d r a t er e d u c es l i g h t l yi nt h ef e r m e n t a t i o ns t a g e 8 s t u d yo nt h ee f f e c to fs e v e r a lz y m o e x c i t e r s0 1 1k o j is h o w s t h a ty e a s te x t r a c ta n dt h e p e p t i d eh yy e s t 5 0 1c a rp r o m o t et h ep r o t e a s ea c t i v i t ye v i d e n t l y t h e2 5 a d d i t i o nc a l l i m p r o v et h ea c t i v i t y9 1 a n d7 6 s e p a r a t e l y p e a n u t - p r e s s e dc a k ea n ds e s a m es e e d - p r e s s e d c a k eh a v eal i t t l ei m p r o v e m e n tf o rp r o t e a s ea c t i v i t ya n di th a v en e g a v i v ee f f e c t0 1 1p r o t e a s e a c t i v i t yw h e nt h ea d d i t i 衄m o r et h a n5 k e yw o r d s ：s o ys a u c e ，h i g h - s a l tl i q u i d f e r m e n t a t i o np r o c e s s ，a s p e r g i l l u so r y z a e ， p r o t e a s ea c t i v i t y 华南理工大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本人承担。 作者签名：槲 日期：2 0 0 6 年1 1 月3 0 日 览。 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：研究生 在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属华南理工大学。学校有权保存并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许学位论文被查阅( 除在保密期 内的保密论文外) ；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以允许采用影印、 缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容 相一致。 本学位论文属于： 口保密，在年解密后适用本授权书。 口不保密。 学位论文全文电子版提交后： 口同意在校园网上发布，供校内师生和与学校有共享协议的单位浏 ( 请在以上相应方框内打“4 ”) 作者签名：尊劝叫久 日期：? 彤牟同3 。日 指导教师签名：h 期： 第一章绪论 第一章绪论 1 1 酱油的概述 酱油，是以大豆、小麦及食盐为主要原料，利用米曲霉、酵母菌、乳酸菌等多种微 生物的作用，把原料中复杂的大分子有机物进行分解和重组，酿造而成的一种最传统， 最有代表性的发酵食品，在中国、日本及东南亚一带特别深受人们的欢迎，已成为一种 不可取代的调味品。酱油的发酵已有很长的历史，它的发酵工艺及培养条件己相当成熟， 酱油的生产分为前发酵和后发酵两个阶段。前发酵阶段主要是米曲霉的培植阶段，使原 料的表面长满菌丝及孢子，而米曲霉的菌丝中含有丰富的蛋白分解酶和淀粉分解酶等酶 类，这些酶类在后发酵阶段实现原料中蛋白质及淀粉等物质的分解和转化，再结合酵母 菌、乳酸菌的作用，得以产生一些特殊的香味。其中在前发酵阶段中起主要作用的是米 曲霉及米曲霉中的蛋白酶类。蛋白酶活性的高低是基本的，它对于提高原料的利用率， 保证产品的品质和生产的低成本化极为重要【”。 酱油酿造在制曲及发酵过程中，从空气中落入的酵母菌和细菌也进行繁殖，并分泌 多种酶，作用于底物，例如由酵母菌发酵糖类成酒精、由乳酸菌发酵糖类成乳酸等。发 酵时应用这些微生物在一定的条件下的作用、分解和合成酱油的色、香、味的成分f 2 】。 一般酱油发酵是先把成曲中拌入多量的盐水，使其呈浓稠的半流动状态的混合物，该混 合物称为酱醪。或将成曲拌入少量的盐水，使其呈不流动状态的混合物，该混合物称为 酱醅；然后再把酱醪或酱醅装入缸、桶或池内，保温或不保温，利用微生物所分泌的酶， 将酱醅中的物料分解成我们所需要的新物质的过程。发酵过程实际上是由于微生物的生 理作用所引起的一系列的复杂的生物化学变化过程。微生物培育在酱油酿造中是属前发 酵工序，是极重要的一个关键。培养方法及操作的好坏，均将直接影响酱油的质量与原 料利用率f 2 】。酱油的后发酵方法很多，但基本上可以分为低盐固态发酵及高盐稀醪发酵 两类。 5 0 年代初期，全国绝大多数酱油生产采用我国的传统工艺。那时，除几个大城市的 大厂生产规模较大外，其余绝大多数小厂基本上是作坊式生产。5 0 年代中后期，特别是 1 9 5 8 年大跃进开始，全国推广无盐固态发酵酱油和化学酱油。经过几年的实践后，同行 专家和广大消费者都觉得无盐固态和化学酱油的风味的调味效果太差。6 0 年代中期，开 始摸索替代化学酱油和无盐固态酱油工艺。但当时是高度集中的计划经济，又正值经济 特别困难时期，连温饱都很难解决，我国的许多优特食品几乎绝迹。那时主要是解决有 华南理工大学硕士学位论文 吃的，没有条件解决吃好的。低盐固态酱油生产工艺就是在此历史背景下产生的。低盐 固态酱油的风味和调味效果虽然比传统工艺仍有明显的差距，但比无盐固态酱油的风味 和调味效果要好了许多。6 0 年代中期开始，一些酱油生产厂逐步采用低盐固态工艺生产 酱油。1 9 7 5 年，商业部在青岛召开了第一次全国调味品工作会议。绝大多数与会者认为， 在全国推广低盐固态工艺生产酱油，代替化学酱油和无盐固态酱油是比较符合我国当时 国情的。1 9 7 5 年以后，低盐固态酱油的生产工艺，很快发展成了我国酱油生产的主要工 艺。只有华南地区几个大厂保持着一定规模传统发酵工艺酱油的生产。2 0 多年来，低盐 固态发酵作为我国酱油生产的主要工艺，解决了我国绝大数人吃酱油的问题，功不可没 【3 l 。低盐固态发酵没有经过高温水鳃，具有酱油固有的风味，无水解臭。已为广大消费 者接受，所以到现在仍占有酱油产量的主导地位【4 】。但也应该承认，低盐固态酱油的风 味比高盐稀态酱油确实存在着明显的差距。 低盐固态与高盐稀态发酵工艺的差别是多方面的，概括起来主要有6 方面：第一高 稀发酵法比低固法的熟醪时期要长得多，一般在3 个月以上，而低固法一般在2 0 d 左右； 第二食盐水的浓度不同，高稀法的酱醪中的含盐量一般在1 7 以上，而低固法的酱醪 中的含盐量大致在1 2 以下；第三高稀法的醪为稀态，而低固法的为固态；第四发酵 温度不同，高稀法的熟醪温度较底，为1 5 3 0 ，低固法的熟醅温度较高，一般可达 到4 5 4 8 ；第五熟醪过程中的搅拌方式不同，高稀法由于是液态的( 大型发酵罐) ， 所以可采用空气搅拌方式，而低固法一般采用倒池方式；第六取油的方式不同，高稀法 采用对酱醪的压榨方式，低固法是采用淋油方式。发酵所用原料也是不同的，低盐固态 适用于以脱脂大豆、麸皮为主要原料，高盐稀态则适用于大豆、面粉为主要原料【5 】。所 以就决定了两种工艺生产的酱油在外观、口味、香气等方面也是有很大差别的。 高盐稀态发酵工艺是在我国传统发酵工艺上改进的。同时又吸收消化了日本的许多 先进技术，我国南方酱油厂主要是采用此工艺。发酵周期为3 个月，酱油产品氨基酸态 氮生成率高，约为全氮的6 0 左右，酱油风味好嘲。改革开放以后，随着人民生活的迅 速提高，传统风味酱油销量增长很快，华南地区有些发酵工艺酱油生产厂的年销量十年 内增长数倍。8 0 年代后期以来，在吸收消化了一部分国外先进技术的情况下，国内新建 了几个年产万吨以上高盐稀态生产车间，本公司基本工艺流程图1 1 如下。 2 第一章绪论 大豆+ 除杂润水+ 蒸料风冷 加入面粉 一混合鸳瀚一韶悯一发酵一压榨 混合接种制曲制醪发酵 压榨 沉淀过滤调配灭菌成品 图1 1 高盐稀态酱油制作流程图 f i g 1 1t h ef l o wc h a t o f s o y $ f 1 u o ep r o c e s s i n g 首先，优质黄豆经过除尘，除轻杂，除石，磁吸，漂洗等清洁工序后，便进行充分 浸泡吸水，约需浸豆3 小时。若浸豆时间不足，吸水不够充分，会引起蒸豆后豆粒生硬， 豆粒蛋白质变性不充分，既影响制曲质量又影响蛋白酶对蛋白质的分解作用，而蛋白质 的分解不彻底，产生过多的中间产物，导致酱油的澄清困难。 蒸煮工序很讲究，本公司是取用高压旋转蒸煮锅进得蒸豆，蒸煮方式为1 2 1 ，2 0 分钟。若蒸煮时间过长，豆粒过烂，影响下一步的制曲操作，曲会成团结块，使翻曲， 铲曲，松曲工作增加困难，同时豆曲得不到充足的空气，不能尽快带走豆曲在生长过程 中排放出的热量，阻碍豆曲生长，甚至造成烧曲。若蒸豆时间过短，豆粒蛋质变性不 充分，会影响制曲质量及蛋白酶对蛋白质的分解，降低酱油的出品率，同时又会产生过 多的中间产物( 如胨、月示、肽等) ，造成酱油的澄清困难，影响酱油的质量。 制曲工序是酱油制作过程的关键。本公司酱油生产使用的菌种是米曲霉，米曲霉在 生长过程中，产生大量的蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等酶类，这些酶类作用于蛋白质和 碳水化合物，生成氨基酸及葡萄糖等小分子物质，是酱油里的必要营养成分。米曲霉生 长条件要求较高，包括营养、水分、空气、温度及湿度等方面。营养主要是提供充分及 比例合适的氮源( 蛋白质) 及碳源( 糖份) ，我们所用的比使是黄豆：面粉= 7 52 5 。水分则 在不同生长时期所要求的量不同： 孢子发芽期4 8 - 5 2 ， 菌丝生长、繁殖期 5 0 0 0 - 5 2 ， 孢子生长期、成熟期4 8 - 3 0 。 米曲霉是好氧性微生物，没有氧气就不能生长，但不同生长时期，对氧需求量不同， 根据此特点。通过在不同的生长时期，调节鼓风机的大小，输入不同风量： 前期( 孢子发芽期)小风量； 中期( 菌丝生长期、繁殖期)连续小而逐渐至大风量； 后期( 孢子生长、成熟期)大风量逐渐减至中等风量。 华南理工大学硕士学位论文 米曲霉生长过程中温度控制是制曲的难点。温度过低，则米曲霉生长慢，降低生产 效率；温度过高则出现其它杂菌滋生及烧曲现象。本公司采用计算机自动控制系统m m i ( m a nm a c h i n ei n t e r f a c e ) ，控制鼓风，通蒸汽及制冷等系统运作，来调节各个曲房的温 度，具体控制温度过程如下制曲流程图1 2 所示： 3 8 4 0 3 2 3 2 3 3 接入种曲孢子发芽期+ 菌丝生长+ 菌丝大量繁殖 0 小时1 2 一1 6 小时翻第一次曲 3 2 3 3 3 2 3 3 3 3 3 0 +孢子生长+孢子成熟 成曲 1 8 2 2 小时翻第二次曲2 6 3 0 小时铲曲 图l - 2 制曲流程图 f i g 1 - 2 t h ef l o wc h a r to f k o j i8 r o w i n 8 米曲霉生长需要的相对湿度较高，在不同生长期要求不同，具体的控制如下： 前期相对湿度8 8 9 0 ， 中期相对湿度9 8 以上， 后期相对湿度9 8 9 0 。 培养4 4 小时后的成曲，按主料与盐水的比为1 ：2 4 的比例拌入1 8 b e 的盐水，于发 酵缸中天然晒露，发酵约3 个月。在此期间，为使发酵酱醪均匀，发酵速度加快，必须 对酱醅进行循环淋浇。淋浇并不是次数越多越好，经过生产研究，本部制定淋浇操作规 程是在发酵开始时每星期两次再逐渐减至发酵后期每半个月一次。 三个月后，酱醪成熟，便可放出头淋油( u p 头抽，a n 0 8 0 ) ，再加入1 8 波美盐水， 经过一星期后，放出二淋油( 1 i p - 抽a n 0 6 ) 。刚出缸的头抽、二抽很混浊，使之澄清透 明是酱油生产中一个重要工序。本公司按照先清除大部分大个体杂质，再逐步清除小分 子物质，直至酱油完全澄清的思路来设计酱油的过滤路线。首先，从发酵缸出来的头淋 油，二淋油在沉淀缸自然沉降7 天，再取其上清液过板框过滤机，得滤液后经高温短时 灭菌，再过硅藻土过滤机过滤，若对一些严格的酱油品种，还会经过膜过滤。处理后的 头抽及二抽澄清透明，且细菌数极低，符合国家酱油标准要求。 1 2 米曲霉介绍 米曲霉( a s p e r g i l l u so o , z a e ) 是曲霉的一种，由于它与黄曲霉( a s p e r g i l l u s f l a t u s ) 十分相似，所以同属于黄曲霉群。米曲霉菌丛通常为黄绿色，成熟后为黄褐色或绿褐色。 个体形态为：分生孢子头呈放射形，顶囊近球形，直径为4 0 5 0 t t m j j , 梗一般为单层， 大小为( 1 2 1 5 ) l t mx ( 3 5 ) 邮1 ，分生孢子球形或近球形，直径为4 5 7 1 x m ，表面 4 第一章绪论 平滑，少数有莉，分生孢子柄长2 n i m ，近顶囊处直径为1 2 2 5 p m 。米曲霉依靠各种孢 子繁殖，以无性孢子繁殖为主。在适宜条件下，米曲霉可生成大量分生孢子f 1 。 米曲霉酶系复杂，分泌的胞外酶有：蛋白酶，弘淀粉酶、糖化酶、谷氨酰胺酶、果 胶酶、半纤维素酶、纤维素酶等。胞内酶有氧化还原酶等。蛋白酶，小淀粉酶、糖化酶、 谷氨酰胺酶活力的高低与酱油质量及原料利用率的关系密切川。 米曲霉可以利用的碳源是单糖、双糖、多糖、淀粉、有机酸、醇类等。氮源如铵盐、 硝酸盐、尿素、氨基酸、蛋白质、酰胺等都可以利用。p 、k 、m g 、s 、c a 等也是米曲 霉生长所必需的。因为米曲霉分泌的蛋白酶和淀粉酶是诱导酶，在制酱油曲时要求制曲 配料中有较高的蛋白质含量各适当的淀粉含量，以诱导酶的生成。大豆或脱大豆富含蛋 白质，小麦、麸皮含有淀粉，这些家副产品也含有较高的维生素、无机盐等营物质，以 适当的配比混合作制曲原料，能满足米曲霉繁殖和产酶的需要1 7 1 。 米曲霉生长的最适温度是3 2 3 5 ，低于2 8 1 3 或高于4 0 。0 生长缓慢，4 2 以上停 止生长。酶的积累与培养温度和培养时间有关。在一定的温度下，随米曲霉培养时间的 延续，酶活力提高，到某一时间达到高峰，随后活力下降。培养温度低时产酶高峰较迟 到达，当温度在2 5 1 2 以上时，温度越高，蛋白酶、谷氨酰胺酶生成越少，淀粉酶生成越 多。所以，制曲时应控制前期温度3 2 3 5 ，以利于长菌；后期温度为2 8 3 0 ，有 利于蛋白酶、谷氨酰胺酶的生成 7 1 。 米曲霉的生长需要水分，当曲料水分小于4 0 时会影响菌丝的生长，当曲料水分过 高时杂菌容易繁殖。在曲霉生长期，曲料含水4 8 左右为宜，空气相对湿度在9 0 以 上；在曲霉产酶期，水分适当降低，将有利于蛋白酶活力提高。米曲霉生长和产酶的适 宜p h 为6 5 6 8 川。 米曲霉是发氧微生物，当氧气不足时，生长受到抑制。菌体细胞呼吸作用所产生的 二氧化碳，如果过多积聚于曲料中，对米曲霉的生长和产酶不利，所以在制曲时应通入 空气排除二氧化碳，既满足米曲霉的好气要求，又抑制了厌氧菌的繁殖。不过，少量的 二氧化碳的存在，可能对米曲霉产酶有促进作用。 应用于酱油生产的米曲霉菌株应符合如下要求：1 不产生黄曲霉毒素2 蛋白酶、淀 粉酶活力高，有谷氨酰胺酶活力；3 生长快速、培养条件粗放、抗杂菌能力强；4 不产 生异味，制曲酿制的酱油香气好。 常用的米曲霉菌株有：a s s 8 6 3 ：蛋白酶、糖化酶活力强，生长繁殖快，制曲后生 产的酱油香气好。4 鄹9 5 1 ( 沪酿3 0 4 2 ) ：以a s 3 8 6 3 为出发菌株，用紫外线诱变得到。 华南理工大学硕士学位论文 蛋白酶活力比出发菌株高，用于酱油生产蛋白质利用率可达7 5 。生长繁殖快，对杂菌 抵抗力强，制曲时间短。生产的酱油香气好。但该菌株的酸性蛋白酶活力偏低。u e 3 2 8 、 u e 3 3 6 ：以彳鼹舛，为出发菌株，用快中子、c 0 6 0 、紫外线、乙酸磺酸甲烷、氯化锂等诱 变剂处理得到，酶活力是出发菌株的1 7 0 1 8 0 。u e 3 2 8 适用于液体培养，u e 3 3 6 适 用于固体培养，唧粥的蛋白质利用率为7 9 ，但制曲时孢子发芽较慢，制曲时间延 长4 6 小时。渝，8 1 1 ：是从曲室泥土中分离出菌株后经紫外线3 次诱变后得到的 新菌株。孢子发芽率高，菌丝生长快速旺盛、孢子多，适应性强，制曲易管理，酶活力 高。此外，用于酱油制曲的米曲霉还有：9 6 1 ，黝f 一号，w s 2 ，8 6 0 掣”。 本研究使用的米曲霉来源如下： 米曲霉3 0 4 2 ( 简写为a s 3 舛2 ) 一购于中国科学院微生物研究室， 米曲霉3 9 5 1 ( 简写为a s 3 舛j ) 一购于上海酿造研究所， 米曲霉3 3 6 - 2 ( 简写为u e 3 3 6 - 2 ) 购于上海大锦微生物研究所， 黑曲霉3 3 5 0 ( 简写为a s 3 3 5 0 ) 一购于上海酿造研究所。 以上菌种均保藏于李锦记( 新会) 食品有限公司研究发展部。 1 3 立题背景及意义 酱油是我国传统的酿造调味品，在国内已有上千年的生产历史，而做为工业化生产 的历史不是很长。在国外主要的生产国为日本及东南亚地区，其中对发酵机理及整体工 艺设备研究最深入的国家为日本。日本酱油生产技术源于中国，生产历史大约3 5 0 年， 野田是其发源地，近代发展迅猛。如今日本的酱油生产技术日臻完善，自成一家，使传 统的中国酿造酱油技术率先在日本完成工业化进程，代表着当今国际先进的酱油技术水 平。而我国酱油酿造虽有上千年的历史，但由于发展缓慢，行业现状是不容乐观的。根 据国家有关部门统计1 9 9 5 年我国酱油工业商办企业就达9 2 2 家，职工达1 l 万余人，酱 油产量达1 2 2 5 万吨。全行业工业总产值按1 9 9 5 现行价为3 4 6 4 0 万元，利税为1 0 4 9 0 万元，但利润为3 2 7 4 万元，整个商办酱油行业处于亏损状况【6 1 。酱油行业作为调味品 工业的支柱急需寻找新的发展思路，摆脱行业困境，我国酱油工业自解放以来，除六十 年代进行过较大规模的科技攻关投入外，国家一直未组织有计划的国家级重点攻关研 究。六十年代开发出的一系列科技研究成果对酱油工业的重要意思是不言而喻的。其中 包括上海市酿造科学研究所前身上海酿造实验工厂对从福建永春酱曲中分离出来的一 个优良菌株米曲霉a s 3 8 6 3 进行诱变选育出的酱油生产菌沪臃3 0 4 2 以及以沪硬3 0 4 2 6 第一章绪论 纯种培养为标志的低盐固态发酵工艺开发及大面积推广使用嘲。 但是自从六十年代后期米曲霉a s 3 0 4 2 用于酱油酿造到现在已有3 5 年时间，在这 3 5 年间其他工业发酵菌种的选育工作得到长足的发展：如，味精工业自从六十年代选育 的北京棒状杆菌开创了发酵法生产味精的新局面，目前我国味精产量已达6 0 万吨，占全世 界的一半以上。其它工业微生物也由于进行了菌种的选育及其改良，为发酵工艺提供了 人类需要的各种类型的突变菌株，从而使抗生素、酶制剂、氨基酸、有机酸、维生素、 核苷酸、激素、色素、生物碱、不饱和脂肪酸以及其他生物活性物质等产品的产量成倍 甚至成千倍地增长，同时产品的质量也不断提高。因此，工业微生物育种对于提高发酵 工业产品的产量和质量，进一步开发利用微生物资源，增加发酵工业产品的品种，具有 重要的意义【町。 目前，关于提高米曲霉生物活性的研究多是从微生物育种这个角度入手。我们酿造 企业的科技工作者在有关科研单位和关心酿造事业的大专院校老师们长期密切配合下， 酱油生产中以提高米曲霉的蛋白酶活力为主攻方向，曾经分别筛选和诱变出不少新菌种 例如，1 9 5 8 年全国酱油酿造推广应用的术廊零a s 3 8 6 3 ，系从福建永春酱曲中分离出来的 一个优良菌种六十年代后期，上海对此菌进行诱变，选育出了蛋白酶活力高，酶系比较 全的米曲霉护髓3 0 4 2 新菌种。接着各地又以沪露3 0 4 2 为出发菌株，进一步采用不同 诱变剂进行了诱变，就得到了很多新菌株，如无锡诱变出”米膨霉勺6 j ”；广州诱变出” 米曲霉广州”；湖南常德市酱厂诱交出”采膨零w s 2 ”；天津诱变出米考零1 0 8 1 ”；上海 又诱变出适用于液体制曲的”米曲霉2 砖酿u e 3 2 8 及适用于固体制曲的”米曲霉沪酿 u e 3 3 6 和”米曲霉沪臃唧，乒? ；上海王淑珍对诱变菌株a s p o r y z a e u e 3 3 6 采用理化 诱变因子交替累计诱变处理，理化诱变剂有紫外线、钴6 0 ，y 射线、e m s ，然后根据诱 变目标从无定向突变株中筛选出，形态发生变异，总蛋白酶活力比出发菌提高6 5 4 、 糖化酶、液化酶、纤维素酶、果胶酶，也不同程度提高，遗传性状稳定的优秀酱油生产 菌株a s p o r y z a e c j 9 9 0 ；无锡又以a s 9 6 1 为出发菌株，采用诱变及杂交处理，获得了 t 册6 j ? 新菌株【9 】。 虽然前人已经进行了大量的研究工作，但是由于种种原因。现在全国9 0 以上的酱 油酿造企业还是用沪膀3 0 4 2 菌种，而六十年代后期选育3 0 4 2 时是以北方酱油工艺( 低 盐固态发酵工艺) 为基础，其生产条件和所用的原料和南方广东酱油工艺( 高盐稀态发 酵工艺) 差异很大。北方酱油多以豆饼、麸皮为原料酿造酱油，而南方广东酱油以大豆、 小麦为原料酿造酱油。虽然在长期以来术廊零i 2 在南方广东酱油生产中一直有较好 7 华南理工大学硕士学位论文 的表现，但如果以南方广东酱油的生产工艺为基础进行3 0 4 2 的诱变筛选，选育工作的 进展空间应该是比较大的。 米曲霉酶系活性的高低将直接影响到原料的利用率及产品的产率，影响到酱油中可 溶性含氮物的含量，从而也会影响到酱油的品质，因此，掌握米曲霉的生长特性及选育 优良菌种的方法，提高各种酶的活力，从而提高产能和原料利用率是酱油工业的重要工 作。 1 4 国内外的研究状况 有关酱油的各方面的研究，以中国和日本的科研工作者为多。大多数研究者对酱油 的内容主要有以下几个方面。 1 4 1 菌种的选育和改良 传统的酱油酿造方法无论是制曲或发酵都有多种微生物的参与而发挥多酶系的作 用，产品香气醇厚，风味俱佳，但由于发酵周期长，生产工艺落后，原料及设备利用率 低，不能满足市场需要。后来普遍采用的固态无盐和固态低盐发酵工艺虽然能缓解了供 需矛盾，但由于是单菌种制曲作醅发酵，高温分解，酶系单一，产酯生香条件不够，虽 生产周期大大缩短，但质量低，风味差。因此在现代酿造技术的基础上，又提出了多菌 种发酵工艺，即通过其它微生物的发酵作用来提高酱油中主要风味物质的含量，改善低盐 发酵法生产的酱油口味在酱油发酵过程中应用的菌种主要有米曲霉、黑曲霉、酵母及有 益乳酸菌。对米曲霉的研究主要是通过各种诱导提高中性蛋白酶的活力，对于黑曲霉的 研究主要是针对其产酶特性，利用其分泌的酸性蛋白酶、糖化酶及纤维素酶等弥补米曲 霉酶系不足，提高原料利用率，对提高酱油的风味也能起到一定的作用。我国传统的天 然酱醪中含有3 科7 属2 3 个种，其中能赋予酱油良好风味的2 属3 个种，即鲁氏酵母、 易变球拟酵母及埃契氏球拟酵母。其中鲁氏酵母占总数4 5 ，是酱油中主要酵母。鲁氏 酵母在3 0 c 左右条件下能发酵酱醅中葡萄糖产生乙醇、甘油、琥珀酸等物质，有机酸通 过三羧酸循环的氨基化转化，生成对应的氨基酸，鲁氏酵母与嗜盐片球菌联合作用产生 乳酸及乳酸乙酯等物质形成酱油的风味。因而在低盐固态发酵后期人为添加酵母菌进行 后熟发酵可改善酱油的风味u o l 。 1 4 2 生产工艺及设备的优化研究 酱油生产工艺条件的研究主要包括以下几个方面：一是改造大曲生产设备，实现制 曲工艺的自动化。改变了长期以来采用的帘子、竹匾、木盘等简单设备，而采用厚层通 8 第一章绪论 风制曲，缩短了制曲时间，提高了劳动生产率，保证了成曲质量，改善了劳动条件，在 制曲原料的处理上还对大豆、小麦等采取膨化技术。二是采用高盐稀醪发酵法代替传统 的固态发酵法，此工艺采用低温盐水( 约5 ) 拌曲，低温( 约1 0 1 2 ) 发酵，6 0 天后补 加酵母菌，并升温到3 0 c 保温发酵至结束，即进行“前低后高”的温度控制。该法将整个 发酵过程明显地划分为“酶解阶段”和“产香阶段”，有利于酱油风味物质的形成，但该法 前期中f 氐温与高盐，双重作用抑制了大部分的酶活，无疑延长了酶解阶段，这是高盐稀 醪发酵工艺的一个不尽合理之处【i l 】。三是采用淋浇法【1 2 1 ，它是在固稀发酵的基础上采用 回淋工艺，避免了固态发酵中由于温度过高形成焦化层而影响酱油风味，并能充分利用 蛋白酶等酶系，改善酱油的风味。四是改良生产设备，提高生产的自动化程度，实现机 械化大生产。例如在日本己开始研究采用细胞固定化技术应用于酱油的发酵。在蛋白质 及淀粉质原料分解基本结束后进行的酒精发酵就可通过固定化酵母反应器来进行。 1 4 3 产品质量的控制与提高 随着人们对调味品质量要求的提高，研究者们对此进行了大量的工作，主要集中在 以下几个方面： 利用添加天然色素改善酱油的色泽，生产特色酱油，如无色( 或浅色) 酱油、黄 色酱油等 开发新口味的酱油，比如虾味酱油、海鲜酱油等 向固体酱油、粉末酱油发展【2 】 向保健型酱油方向发展，增加酱油的营养。 1 4 4 各种酶制剂在酱油发酵中的应用 国内外一些研究表明，丰富强化酱油大曲的酶系能够提高氨基酸生成率，增加酱油 的产量d 3 1 。用于酱油发酵的酶制剂主要有酸性蛋白酶、糖化酶及纤维素酶。米曲霉产生 的蛋白酶主要是中性蛋白酶，其作用是将蛋白质分解成多肽，而酸性蛋白酶可以将多肽 分解为游离的氨基酸而提高酱油中氨基态氮的含量，提高原料利用率，经济效益比较明 显。纤维素酶制剂用于发酵酱油生产上，强化了原料组织结构的破坏，使蛋白裸露，便 于蛋白酶对蛋白质的分解，提高了酱油得率，加快了发酵速度，增加了酱油中的还原糖 和色度，改善了酱油的风味和质量。 1 5 本课题的来源及主要研究内容 本课题来源于本人所在的公司的实际生产要求及导师指引下而进行的研究。为了改 9 华南理工大学硕七学位论文 善和提高酱油的生产效率，提高原料利用率，本文将研究菌种在不同的培养基中的生长 形态；生长速度及其产酶活力情况来选育优良米曲霉菌种方法；不同的菌株分泌的各类 酶情况；不同的p h 条件下成曲的蛋白酶活力分布；水分及原料的c n 比值对产酶的影 响；双米曲霉菌种制曲发酵；米、黑曲霉混合菌种制曲发酵；米曲霉在制曲和后期晒制 发酵酱油过程中物料量的变化；添加几种酶促剂制曲对提高蛋白酶活力的作用等八个方 面内容，掌握选择合适的米曲霉菌种方法、适宜的培养基及培养方式、产酶特性及确定 最佳产酶条件、选择较好的霉菌组合进行双菌种发酵、掌握初步的霉菌生长过程中的物 料变化情况和提高酶活力的方法。主要研究目标是选育优良菌种，确定最佳培养条件和 优化发酵条件，以提高酱油生产的原料利用率，生产效率和出品率。 1 0 第二章米曲霉生长性状及优良菌株筛选研究 第二章米曲霉生长性状及优良菌株筛选研究 2 1 前言 米曲霉是一种好气性，易培养，产复合酶的菌株1 4 1 。不同的米曲霉菌株，在不同的培 养基中，有不同的生长特性和性状。本实验通过对米曲酶菌种在酪蛋白培养基、试管斜 面培养基、瓶种及生产基料中的生长特点进行综合分析，鉴定米曲霉优劣，筛选出适合 生产的优良菌株。 2 2 材料与方法 2 2 1 主要仪器设备 三角瓶，试管，培养皿，电子天平，接种棒，无菌操作台，高压蒸气灭菌器，恒温 培养箱，显微镜，血球计数板。 2 ，2 2 菌种 米曲霉a s 3 0 4 2