（食品科学专业论文）CMC和大豆多糖对酸性乳饮料中酪蛋白稳定机理的研究.pdf

浙江工商入学硕士学位论文 川i i iiiii i iii iillr rl】 ly 17 2 7 7 5 c m c 和大豆多糖对酸性乳饮料中酪蛋白稳定机理的研究 摘要 酸性条件下酪蛋白沉淀一直是影响酸性乳饮料( a m d s ) 生产和开 发的关键问题，对稳定剂与酪蛋白的相互作用及最终产品稳定性的研 究已成为乳品科学的研究热点。国内对羧甲基纤维素钠( c m c ) 的研究 多限于产品配方及生产工艺的优化，而大豆多糖( s s p s ) 类产品在我国 还不多见，其应用研究少之又少。通过对c m c 、s s p s 稳定酪蛋白机 理及工艺参数对a m d s 稳定性影响的研究，可以为复配稳定剂的开发 及应用提供理论参考，对优化产品生产工艺和保证最终产品稳定性具 有实际指导意义。本论文的主要研究内容及结论如下： 对c m c 酪蛋白复合体系及s s p s 酪蛋白复合体系在酸化过程中 电位滴定、浊度、电位、粒径及荧光强度的研究表明，c m c 、s s p s 与酪蛋白结合的起始p h ( p h c ) 为5 3 o 1 ，结合后体系浊度增加。酪蛋 白的等电点为4 5 3 ，c m c 、s s p s 与酪蛋白结合与体系的p h 有关，是 通过静电吸附作用相互结合的，结合作用发生在酪蛋白沉淀之前， c m c 可以比较快速的吸附地酪蛋白胶粒表面，而s s p s 是逐步吸附的。 通过静电吸附结合的过程是可逆的，当p h 高于酪蛋白等电点时会发 生解吸附作用。静电结合过程中酪蛋白胶粒发生了很大的变化，t r p 残基所处的微环境极性减小。n a + 不会改变结合的p h c 值，但体系粒 径会减小，而c a 2 + 加入后导致c m c 、s s p s 与酪蛋白发生了钙桥作用， 改变了结合的p h c 值，同时体系粒径增加。 l 浙江工商大学硕士学位论文 对酸性条件下体系0 电位和粒径的变化关系，凝乳酶、纤维素酶、 果胶酶、1 , 4 d d 半乳糖苷酶酶解，以及n a + 、c a 2 + 对体系稳定性的 影响研究表明，体系稳定存在一个临界争电位值，c m c 酪蛋白复合 体系的临界( 电位值为2 0 m v ，s s p s 酪蛋白复合体系的临界电位值 为1 5 m v 。1 ( 酪蛋白的亲水巨肽( 1 0 6 1 6 9 ) 对c m c 、s s p s 稳定酪蛋白起 作用，酶解程度越大，c m c 、s s p s 与酪蛋白结合的p h c 值越高，体系 粒径越大。c m c 主要通过静电排斥作用稳定酪蛋白，吸附层的存在 可以增加胶粒间相互作用的能垒；s s p s 对酪蛋白稳定的机理主要是 空间位阻排斥作用，吸附层的静电排斥作用对稳定性亦有贡献。离子 会影响胶粒表面的双电层厚度及带电情况，n a + 对体系稳定性的影响 较c a 2 + 小。另外，酪蛋白胶粒表面的吸附层可以降低凝乳酶对k 酪蛋 白的酶解效率。 研究了不同p h 及c m c 、s s p s 浓度时的体系相状态、水分状态及 稳定状态，结果表明体系的相状态与p h 有极大的相关性，p h 5 2 时 体系由于热力学不相容会发生耗散絮凝沉淀；p h5 2 或5 o 时由于吸附 作用弱，体系会发生相分离；p h 5 2 ，t h ed e p l e t i o nf l o c c u l a t i o no c c u r r e dd u e t ot h e r m o d y n a m i ci n c o m p a t i b i l i t y ；a tp h 5 2o r5 0 ，p h a s e s e p a r a t i o n o c c u r r e db e c a u s eo fw e a ka d s o r p t i o n ；a tp h o , s 2 p k - 酪蛋白，疏水性强弱为p 一 k - c c s l 啦酪蛋白，钙敏 感性大小为啦 a s l p k 酪蛋白1 8 】。 浙江工商大学硕士学位论文 c t s l - c a s e i n ( 8 p ) ： - 一s e r - g l u - s e r p 4 s - - - s e r p 6 4 - l l e - s e r p 6 6 - s e r p 6 7 s e r p 6 s - s e r p 7 5 - - s e r p l1 5 - - - 0 【s 2 c a s e i n ( 11o r1 2 p ) ： 一- s e r p s s e r p g - s e r p l o s e r p l 6 s e r p 5 6 一s e r p 5 7 一s e r p s s - g i u - g l u - s e r p 6 1 - - s e r p l 2 9 - t h r - s e r p i 3 1 - 一s e r p l 4 3 一 d - c a s e i i l ( 5 p ) ： s e r p l 5 - l e u - s e r p i 7 一s e r p t s s e r p l 9 - - s e r p 3 5 _ ：- c a s e i n ( 1p ) ： 一- - s e r p l 4 9 - 一- 图1 1 酪蛋白中磷酸丝氨酸残基位置【毋 f i g 1 1p o s i t i o n so f p h o s p h o s e r i n er e s i d u e si nc a s e i n 9 1 1 1 2 酪蛋白胶粒的模型 在过去的5 0 多年里，酪蛋白胶束的微观结构得到了深入的研究，特别是在 k 酪蛋白被发现和分离之后，但至今都没有得到一致认可的结论。许多学者提出 了各自的模型，主要有核壳模型、内部结构模型和亚单元模型。 ( 1 ) 核壳模型( c o a tc o r em o d e l s ) w a u g h 和n o b e l 提出了第一个酪蛋白核壳模型，该模型认为加入c a ：+ 后带 有磷酸环的a 。或1 3 酪蛋白单体开始形成一定尺寸的核，o 【s 1 与k - 酪蛋白复合物构 成酪蛋白的壳，且k - 酪蛋白单体完全伸展在表面1 0 】。p a y e n s 提出的核壳模型认 为胶体核是由紧密折叠的( 7 , s l - 酪蛋白分子吸附构型松散的d 酪蛋白构成，k - 酪蛋 白覆盖在胶体表面，磷酸钙既存在于胶粒表面，也存在于胶粒内部1 1 】。 p a r 巧和c a r r o l l 提出的核壳模型认为昏酪蛋白位于胶体内部形成0 c s l - ，p - 酪 蛋白的核心点，由酪蛋白磷酸钙( c c p ) 稳定，而胶体表面则是由1 ，p 酪蛋白以 及一些c c p 所构成。p a z i u n 提出的胶体核是以a s 酪蛋白和磷酸钙为骨架，肛酪 蛋白通过疏水相互作用结合的结构模型，核被时、d 和相对高比例的k 酪蛋白 所包围【1 0 , i i 。 ( 2 ) 内部结构模型( i n t e r n a ls t r u c t ur em o d e l s ) 2 浙江工商大学硕：i 二学位论文 r o s e 首次提出了内部结构模型， 酪蛋白单体自聚形成链状聚合物，k 酪蛋 白结合到i f , s 酪蛋白上，同时酪蛋白连接到p 酪蛋白上，形成有限大小的聚合 体，通过c c p 交联形成网状结构。在这网状结构中，p 酪蛋白定向于胶束内部， 而k 酪蛋白定向于胶束外部，且部分k - 酪蛋白被埋在胶束内耐1 1 1 。 g a m i e r 和d u m a s 假定酪蛋白胶束成蛋白聚合物的三维孔式架构，k _ 酪蛋白分 子作“结”，“枝”由吁，p 酪蛋白构成，这个模型没有说明c c p 的作用，仅假定 其结合于酪蛋白架构上】。 ( 3 ) 亚单元模型( s u b u n i tm o d e l s ) m o r r 最早提出了亚单元模型，亚单元由0 【s 1 p ，k _ 酪蛋白单体构成，并通 过疏水相互作用和酪蛋白钙桥保持稳定，这些亚单元由c c p 连接形成胶束结构， 1 ，l ( 酪蛋白包裹在胶束表面【1 0 1 。 s l a t t e r y 和e v a r d 提出了由不同组成亚单元构成胶体粒子的模型，模型中部分 亚单元含有时，b 一酪蛋白，其余除含有i f , s ，3 - 酪蛋白外还含有k - 酪蛋白。富含k - 酪蛋白的亚单元主要分布在胶束的表面，而k 酪蛋白相对匮乏的亚单元则埋在胶 束内部的疏水区域。亚单元的相互交联主要在胶束内部的疏水区域进行，k - 酪蛋 白的亲水部分则暴露在溶剂中，当胶体表面被k - 酪蛋白完全覆盖时则胶体粒子停 止生长，因此认为k - 酪蛋白的含量决定了胶束的大小1 。 s c h m i d t 署l p a y e n s 认为亚单元是通过c c p 连接的，c a 2 + 结合于磷酸酯基团，这 些基团通过c a 9 ( p 0 4 ) 6 簇连接。各亚单元结构的组成不同，酪蛋白的核心是疏水的， 极性区域包裹在外，静酪蛋白位于胶束的表面【】。 最普遍接受的亚单元模型是由w a l s t r a 提出的，模型如图1 2 所示。酪蛋白 胶束由近乎球形的亚单元组成，组成各亚单元的成分不同，直径大小在1 2 1 5 n m 范围内，每个亚单元有2 0 2 5 个酪蛋白分子。亚单元通过蛋白质疏水相互作用结 合，由c c p 接连。亚单元主要有两种类型：一种主要由0 【s ，d 酪蛋白组成，疏 水区域埋在亚胶束内部；另一种由伍r ，静酪蛋白组成，l c 酪蛋白位于胶束外表面， 其亲水性c 端从胶束表面延伸出形成发层结构，通过空间位阻和静电排斥作用 使酪蛋白胶束稳定 1 2 , 1 3 , 1 4 】。 浙江工商大学硕士学位论文 。一 。h 飘 _ _ 曼鬯 图! - 2w a l s t r a 提出的亚单元模型1 1 2 f i g 1 2t h es u b u n i tm o d e lp r o p o s e db yw a l s t r a 1 12 l 然而，许多学者对亚胶束模型持保留意见，提出了其他的模型，其中一种模 型由h o l t 提出，如图1 3 所示，酪蛋白胶束为类似凝胶状的网络结构，钙敏感的 酪蛋白由微晶体结构的c c p 链接，表面覆盖一层1 ( 酪蛋白，其c 端向外伸展形成 发层结构【1 5 ，1 6 】。另一种是由h o m e 提出的双重结合模型，如图l - 4 所示，酪蛋白胶 束中的蛋白通过疏水相互作用和静电排斥作用连接，疏水相互作用是酪蛋白胶束 形成的驱动力，静电排斥作用决定了胶束的聚合程度。a s l 酪蛋白在疏水界面上 形成的是环形链，p 酪蛋白形成的是尾形链，c c p 连接酪蛋白胶束且中和磷酸丝 氨酸残基上的负电荷，导致静电排斥作用减弱，疏水相互作用占优势使得酪蛋白 进一步交联，k 酪蛋白由于没有磷酸丝氨酸簇，因此它只进行疏水性反应且作为 胶束增长的终止剂【1 7 , 1 8 】。这两种模型都保留了亚胶束模型的关键特性，如c c p 的 结合作用，k - 酪蛋白占主导地位的表而覆盖层。 图1 - 3h o l t 提出的酪蛋白胶束模型1 习 f i g 1 3c a s e i nm i c e l l em o d e lp r o p o s e d b y h o l t 1 1 5 i 4 b8 图1 4 酪蛋白胶束的双重结合模型【l 】 f i g 1 4t h ed o u b l ec o m b i n a t i o nm o d e lo f c a s e i nm i c e l l e 1 1j 浙江工商大学硕士学位论文 1 1 3 酪蛋白胶粒的稳定性 1 1 3 1 酪蛋白胶粒的稳定机理 。 厶 图1 - 5 酪蛋白胶粒问相互作用的示意图 f i g 1 5s c h e m a t i cd i a g r a mo f t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nc a s e i nm i e e l l e s 1 1 9 1 酪蛋白胶粒之所以能够在牛乳中稳定存在，是静电排斥作用和空间位阻作用 的共同结梨2 0 ，2 1 1 ，酪蛋白胶粒间的相互作用如图1 5 所示。酪蛋白的表面带有电 荷，使胶粒问存在静电排斥作用，但这并不是使酪蛋白稳定的主要因素。k - 酪蛋 白位于酪蛋白胶粒表面，它的c 端具有亲水性，使胶粒表面带有高度的水化层， 当胶粒相互碰撞时，有弹性的水化层可以阻挡其靠近，但最主要的稳定机制还是 k 酪蛋白的“发层”或称之为“聚电解质刷”所提供的空间位阻效应，即当胶粒 相互碰撞时，在作用区域的伸展于胶粒表面的k 酪蛋白分子将损失构型熵并提供 排斥力，防止酪蛋白胶粒发生聚集1 2 2 , 2 3 】。 中性条件下，静电相互作用主要源于酪蛋白中电离的酸根基团，当两个具有 扩散双电层的酪蛋白胶束接近时，双电层的扩散部分开始重叠，重叠的结果导致 产生排斥，双电层的厚度可以用d e b y e 长度来表示1 2 4 筇1 ： 1 、，c o 孚c , r t 其中d 是真空中的介电常数，r 是相对介电常数，f 是法拉力常数，是溶液的 离子强度，在牛乳中为0 0 8 m 。由此计算出酪蛋白胶束间的d e b y e 长度为l n m ， 因此酪蛋白问的静电排斥力为短程相互作用，排斥作用的自由能可由d e r y a g u i n 浙江工商大学硕士学位论文 方程表示 2 4 , 2 6 】： 型：一2 翮乞甲2 i n ( 1 + e x p ( k h ) ) 。0 - 2 ) kt o7 、 两个酪蛋白胶粒间的空间位阻相互作用可以表示为2 5 2 7 】： 堕竺! 塑： k t一( t 一射刮q 日 ( 1 - 3 ) 酪蛋白间的静电相互作用能远远小于空间位阻作用能，将其忽略不会影响酪 蛋白的稳定性，因此酪蛋白带有电荷所提供的静电相互排斥作用并不是维持酪蛋 白稳定性的主要原因。 1 1 3 2 酪蛋白胶粒的聚沉 酪蛋白是以c c p 络合物以胶粒状态存在于乳中，在酸化过程中其理化性质 会发生变化。p h5 8 5 5 时，争电位降低，酪蛋白胶束倾向于聚梨2 8 - 3 0 ；p h5 5 5 0 时，酪蛋白以一定的顺序发生溶解( 1 c ，d c c s 2 0 【。1 ) ，酪蛋白胶粒中的c c p 溶出【3 1 】： p h 5 0 时，c c p 完全溶解，胶体所带电荷会随着p h 的降低而下降，蛋白质胶 粒间的静电排斥作用减弱，同时k - 酪蛋白链会随着p h 的降低而塌陷，其空问位 阻排斥作用也会降低；当p h 继续降低，酪蛋白间的空间位阻作用迅速减弱，使 范德华吸引力超过了空间排斥作用，酪蛋白胶束发生聚集，乳体系失稳 3 2 , 3 3 l 。 1 2 蛋白质与多糖的相互作用 1 2 1 经典稳定理论d l v o 理论 d l v o 理论是从胶粒间斥力位能与吸力位能相互作用的角度来研究胶体的 稳定与聚沉的。胶粒既存在着吸力位能，也存在着斥力位能，斥力位能和吸力位 能的相对大小决定了物系的总位能，即决定了胶体的稳定性。当粒子间斥力位能 人于吸力位能，并且足以阻止粒子由于布朗运动碰撞而粘结时，胶体处于相对的 6 浙江工商大学硕士学位论文 稳定状态，相反粒子相互靠拢发生聚沉1 3 4 1 。 吸力位能是范德华力性质的，由长程范德华力产生，它不同于分子间的短程 范德华力，这种作用力的长度范围与胶粒的半径不相上下。吸力位能与粒子的半 径( 力、物料常数即h a m a k e r 常数) 成正比，与粒子间的距离( 办) 成反比【3 5 ，3 6 】： 忙甜志+ 由捌n 等五h ) m 4 ， 当粒子问的距离较小时( 2 d ) ，式子( 1 - 4 ) 可简化成匕= 一啬。 斥力位能是由于带点胶粒相互靠拢时扩散层重叠所产生的静电排斥力。当两 个粒子彼此相互靠近时，离子氛发生重叠，在粒子中间的局部粒子浓度与整体粒 子浓度的差值形成了一种渗透压，迫使粒子分离开。当两个带电荷粒子靠近到一 起时，如果离子吸附平衡得到保持，则每个表面电荷保持恒定，和表面电势相互 抵消( 恒定电荷) ，或者是表面电势保持恒定，而表面电荷发生变化至互相补偿( 恒 定电势) 。不同球体在同时恒定电荷与恒定电势条件的相互作用为可表示为【3 7 1 ： 甲：掣l n 1 + e x p ( - 砌) 】 ( 1 - 5 ) 珞a ：一m w ，、。：1 n 1 1 一e x p ( 一砌) 】( 1 - 6 ) 对半径为a 的相同粒子之间的作用力来说，在勋( 德拜常数和粒子半径的乘 积) 大于l o 的范围内是有效的，而对于妇小于3 的条件下，总表达式为： = 2 z t m q s 2e x p ( 一啪 ( 1 - 7 ) 斥力位能和引力位能的线性加合是胶体稳定性d v l o 理论的基础，将引力 位能与斥力位能相加时，就得到了电荷稳定化胶态粒子的典型曲线： 巧= 匕+ ( 1 - 8 ) 曲线的形状就是排斥项的指数衰减和与引力项对距离关系急剧衰减相加合 的结果，如图1 6 所示。这种线性叠加导致曲线上有一个初始最大值，正是这个 在胶体对位能中的初始最大值为带电胶体粒子的稳定性提供了机理，它为胶体的 聚集建立了有效的活化能。当两个粒子靠近到一起时，必须以足够的能量相碰撞 来克服由初始最大值提供的能垒，然而这种胶粒聚集能垒仅仅对一种分散体提供 浙江工商大学硕士学位论文 了动力学稳定性，而热力学驱动力则是趋向聚集和分离3 8 1 。 富 一 擎 塞 。 曼0 芑 e 崔 l硌 、 、 、 踢e 扫 r 、一 + ， v ， ； i d 图1 - 6 两个电荷稳定化体系总相互作用能曲线【3 砷 f i g 1 6t h et o t a li n t e r a c t i o ne n e r g yc u r v eo f t w oc h a r g e s t a b i l i z a t i o ns y s t e m 1 3 8 1 1 2 2 吸附高聚物对胶体的稳定空间稳定理论 提供胶体稳定性的一个重要机制就是空间稳定化作用。粒子被聚合物的致密 层所包覆或吸附，当两个粒子接近时，一旦粒子的表面距离( h ) d x 于层厚度( 国的 两倍，聚合物层将接触，可能出现如图l 一7 所示的两种情形：( a ) 渗透，当表面 接近时两层聚合物逐渐混合，使聚合物链段的局部浓度增加1 倍；( b ) 压缩，层 间聚合物链段的浓度从初始值始逐渐增加，但贯穿两表面间的间隙有同样值3 引。 隧潮 腻鳓 ( a ) 渗透( b ) 压缩 图1 7 空间相互作用原理f 3 田 f i g 1 7t h et h e o r yo fs p a t i a li n t e r a c t i o n l 3 研 在聚合物的良好溶剂中，局部聚合物浓度的增加会带来自由能的损失，这将 引起离子键排斥性的空间相互作用，这种排斥只有当表面距离h 变得小于吸附层 厚度6 的两倍时( h 2 0 3 ，才会被感觉到，当h j 时，它将陡然增加，这时聚合物 8 浙江工商大学硕士学位论文 层的压缩不可避免，这种陡然变化的排斥提供了空间稳定性。两个由聚合物包覆 的、半径为口的粒子之间空间相互作用能的解析式为： v 啦= k b t = 4 翮i - 2 n 菩( 三一z ) ( ，一爿2 m 9 ， 聚合物链的偏摩尔体积为瓦，溶剂分子的摩尔体积为或，相互作用的标度 与粒子覆盖度r 的平方呈正比，可以凸显出高表面覆盖度对有效空间稳定化的重 要性。若要使相互排斥作用k t c p o ，就需要有良好的溶剂，即f l o r y h u g g i n s 参 数触5 【3 引。因此，为达到有效的空间稳定作用，对于吸附的聚合物需要高表面 覆盖率，强吸附，稳定链的良好溶剂以及低自由聚合物浓度。 1 2 3 自由高聚物对胶体的稳定空缺稳定理论 在溶液中添加自由的、不吸附的聚合物会引起胶体粒子间产生空缺相互作 用。基于a s a k u r a o o s a w a ( a o ) 模型，可将粒子视为直径为d 的硬球，聚合物可 以用直径为2 6 的小球表示，如图1 - 8 所示，聚合物线团不会发生相互作用，因 此聚合物溶液的渗透压可以使用v a n th o f f 定律由数浓度r p o l 计算得到： n = 玎耐七b t ( 1 1 0 ) 然而聚合物线团与胶体粒子问确实发生了硬球相互作用，聚合物会被排除在每个 粒子周围厚度为巧的空缺层之外3 8 1 。 图1 8 空缺稳定理论的a s a k u r a - o o s a w a ( a o ) 模型p 8 j f i g 1 8t h ea s a k u r a - o o s a w a ( a 0 ) m o d e lo f v a c a n c i e ss t a b i l i t yt h e o r y l 3 明 当两个粒子靠近到间距小于2 j 时，空缺层部分重叠，聚合物可利用的自由 空间就会增大。由于聚合物渗透压的作用使粒子间产生了有效吸引力，聚合物分 子的大小决定了吸引作用的范围，可以通过改变聚合物浓度控制引力的强度，依 据这个论点可以将空缺势能表示为： 9 浙江工商大学硕士学位论文 = - 1 - i v o ，( d ， 4 0 时，果胶 稳定酪蛋白的性能优于s s p s ，在p h 5 2 时，在c m c 浓度较高的情况下，酸性乳饮料体系因热力学不相容而 发生相分离；p h 5 2 时，c m c 因静电作用在酪蛋白胶粒上发生吸附，酸乳体系 的稳定性可能源于c m c 在酪蛋白表面卜发生吸附产生的空间位阻效应而非静电 排斥作用。另外根据c m c 浓度的不同，吸附在酪蛋白表面的c m c 可使体系稳 定，也可使体系因酪蛋白胶粒问的架桥絮凝而发生失稳。此外，体系中非吸附的 c m c 增加了体系的粘度，降低了酪蛋白胶束的沉降速度，有利于提高a m d s 的 稳定性【5 御。c m c 的结构参数如分予量和取代度、c m c 浓度、p h 及混合温度、 调酸温度、调酸顺序、均质压力对a m d s 的稳定性都有影响。 1 4 本课题的研究意义及内容 1 4 1 研究意义 酸性乳饮料( a m d s ) 在我国有极大的市场，2 0 0 7 年的销售额在2 0 0 亿以上， 且每年保持2 0 的增长速率。由于a m d s 的p h 介于3 8 - 4 2 之间，低于酪蛋白 的等电点，在实际生产中需要加入稳定剂以保护酪蛋白的稳定性。目前普遍使用 的稳定剂有高酯果胶( h m p ) 、水溶性大豆多糖( s s p s ) 、羧甲基纤维素钠( c m c ) 和 海藻酸丙二醇酯( p g a ) 等。欧美国家多用果胶，日本广泛使用s s p s ，而我国大 多用相对便宜的c m c 。迄今为止国外鲜有关于c m c 作为a m d s 稳定剂的研究 报道，而国内对c m c 稳定a m d s 的报道较早。由于价格因素和期望获得更长的 货架期，c m c 是日前国内应用在a m d s 中的主要稳定剂，并且在一段时间内仍 将是我国乳制品企业首选的稳定剂。尽管c m c 作为稳定剂已经被广泛应用，但 对c m c 的研究多限于产品配方和生产工艺，在酸性条件下保护酪蛋白的机理研 究却很少。 s s p s 类产品在日本市场上每年的使用量达到2 5 0 0 吨之多，仅次于第一大使 用量的明胶，几乎在所有的食品领域中都有应用，而作为a m d s 中的稳定剂是 其应用的一大方向，因其具有粘度低，乳化稳定效果好以及更宽的p h 使用范围 等特点，在乳品饮料中具有很广泛的应用前景【5 3 】。而目前s s p s 类产品在我国还 不多见，对其应用的研究及开发更是少之又少。 1 4 浙江工商大学硕士学位论文 a m d s 中酪蛋白与稳定剂之间的相互作用十分复杂，它受诸多因素的影响， 包括稳定剂的类型、分子量、分子构象、电荷分布、蛋白质浓度、体系p h 、离 子强度、温度、均质、热处理等。酪蛋白在酸性条件下的变性沉淀本质上是胶体 稳定性的问题，本课题将通过研究c m c 、s s p s 与酪蛋白之间的相互作用阐明酪 蛋白的稳定机理，同时考察工艺条件对a m d s 稳定性的影响，以此为依据优化 a m o s 工艺参数和条件，为研制产品稳定性好的a m d s 提供理论指导，对优化产 品生产工艺和保证最终产品的稳定性具有实际指导意义，同时探讨建立一套研究 多糖类稳定剂与酪蛋白稳定机理的研究方法，为复配稳定剂的开发及其在a m d s 中的应用提供理论参考。 1 4 2 研究内容 ( 1 ) 研究c m c 酪蛋白复合体系、s s p s 酪蛋白复合体系在酸化过程中电位滴定曲 线、浊度、 电位、粒径、荧光强度的变化，探索c m c 、s s p s 与酪蛋白起 始结合p h 、结合方式以及结合过程中体系微环境的变化。 ( 2 ) 研究酸性条件下体系 电位及粒径的变化关系，并结合凝乳酶、纤维素酶、 果胶酶及l ，4 p d 半乳糖苷酶酶解对体系稳定性的影响，阐明c m c 、s s p s 对酪蛋白的稳定机理。 ( 3 ) 对不同p h 及不同c m c 、s s p s 浓度时体系的相状态及水分状态进行研究， 比较c m c 、s s p s 对酪蛋白的稳定效果。 ( 4 ) 研究调配工艺、调酸工艺及均质工艺条件对a m d s 稳定性的影响。 浙江工商大学硕士学位论文 第2 章c m c 、s s p s 与酪蛋白结合方式的研究 2 1 实验材料、试剂及仪器 2 1 1 实验材料与试剂 脱脂乳 c m c 大豆多糖( s s p s ) 柠檬酸 芘 n a c l c a c h 2 h 2 0 2 1 2 主要仪器与设备 新西兰f o n t e r r a 公司 威恰化- r ( 苏州) 有限公司 日本不二制油股份有限公司 无锡市展望化工试剂有限公司 瑞士f l u k a 公司 上海申翔化学试剂有限公司 生工生物工程( 上海) 有限公司 表2 1 主要仪器与设备 t a b 2 - im a i ni n s t r u m e n t sa n de q u i p m e n t s 仪器( 或设备) 名称 生产商 电子精密天平( a r a 5 2 0 ) 数显恒温磁力搅拌器( 8 5 - 2 ) 自动滴定仪( m p t - 2 ) 精密p h 计( d e l t a3 2 0 】 可见分光光度计( 7 2 2 ) 激光粒度电位仪( n a n oz s ) 荧光分光光度计( f - 7 0 0 0 ) 奥豪斯国际贸易公司 江苏省金坛市江南仪器厂 英国马尔文仪器有限公司 瑞士梅特勒托利多仪器有限公司 上海菁华科技仪器有限公司 英国马尔文仪器有限公司 日本日立公司 2 2 实验方法 2 2 1 乳体系配制 将脱脂乳粉i e , * u 成含2 ( w v ) 蛋白质的复原乳，搅拌待其溶解后，静置一段 时间使其水合：用7 0 * ( 2 的蒸馏水分别溶解稳定剂c m c 和s s p s ，于磁力搅拌器 1 6 浙江工商大学硕士学位论文 上搅拌至完全溶解，静止使其充分水合；将上述复原乳分别与等体积的c m c 、 s s p s 溶液搅拌混合，使最终体系蛋白质含量为1 ( w v ) ，c m c 、s s p s 的最终浓 度为0 2 一0 5 ( w v ) 。 2 2 2 电位滴定法 将2 2 1 配制的体系与蒸馏水以l ：1 0 的比例稀释，用m p t - 2 自动滴定仪连续 滴定0 1 m 柠檬酸使体系p h 从6 8 降到3 6 ，p h 每变化o 1 ：- 0 0 5 时记录所用柠 檬酸的体积，以p h 为横坐标，v 触酸为纵坐标绘制电位滴定曲线。 2 2 3 浊度的测定 将2 2 1 配制的体系用1 0 的柠檬酸溶液调酸，调成p h 范围为3 6 6 8 的乳 体系，间隔为0 2 。每个样品各取3 m l ，蒸馏水稀释至1 0 m l ，用7 2 2 型分光光 度计于6 0 0 r i m 波长下测定吸光度值，以蒸馏水为空白对照。 2 2 4 争电位的测定 按2 2 1 配制的方法，配制一系列不同c m c 、s s p s 浓度( 0 2 - 0 5 ) 的乳体 系，与蒸馏水以1 ：1 0 的比例稀释，用n a n oz s 激光粒度电位仪测定体系的- 电 位，测定温度为2 5 。 2 2 5 粒径的测定 按2 2 1 配制的方法，配制一系列不同c m c 、s s p s 浓度( 0 2 - 0 5 ) 的乳体 系，与蒸馏水以1 ：1 0 的比例稀释，用n a n oz s 激光粒度电位仪测定酸化过程中 体系的粒径变化。向0 5 c m c 酪蛋白及o 5 s s p s 酪蛋白复合体系中分别添加 不同浓度的离子，测定体系的粒径随p h 变化，添加t q a + 浓度为0 1 0 m m ，c a 2 + 浓度为o 5m m 。所用光源最大输出功率1 0 w 的h e n e 激光，检测角为9 0 0 ，检 测波长为6 3 3 n m ，在2 5 c 恒温下测定。 2 2 6 荧光光谱的测定 2 2 6 1 内源荧光光谱测定 1 7 浙江工商人学硕士学位论文 配制一系列不同p h 的乳体系，用蒸馏水稀释1 0 倍后，静置1 小时，在激 发波长k 为2 9 7 n m ，荧光发射和激发狭缝分别为3 0 n m 和1 5 n m ，4 0 0 v 电压的 条件下，测定酪蛋白在2 9 0 4 0 0 n m 范围内的荧光发射光谱。 2 2 6 2 外源荧光光谱测定 以芘为荧光探针，在激发波长k 为3 3 5 n m ，荧光发射和激发狭缝分别为 3 0 n m 和1 5 r i m ，4 0 0 v 电压的条件下，测定芘在3 0 0 6 0 0 n m 范围内的稳态荧光 光谱。 2 3 实验结果与分析 2 3 1 酸化过程中的电位滴定曲线 ，- 、 一 邑 鼍 童 u 三 芦 p h 图2 1 酸化过程中体系的电位滴定曲线 f i g 2 1p o t e n t i o m e t r i ct i t r a t i o nc t l r v eo f s y s t e md u r i n ga c i d i f i c a t i o n 多糖的负电荷基团和蛋白质的正电荷基团之间的相互作用会导致蛋白质离 子基团p k a 值的变化，因此需要滴加更多的酸以使体系达到某一个p h 5 4 1 。通过 比较酪蛋白体系、c m c 酪蛋白复合体系以及s s p s 酪蛋白复合体系滴定曲线的 不同，可以判定c m c 、s s p s 开始吸附到酪蛋白上的起始p h 即p h c 值。图2 1 为酪蛋白体系、0 5 c m c 酪蛋白复合体系及0 5 s s p s 酪蛋白复合体系的电位 滴定曲线，由图可知c m c 、s s p s 与酪蛋白发生相互作用的p h c 为5 3 ：l - 0 1 ，此 1 8 浙江工商大学硕：i ：学位论文 时蛋白质的p k a 值发生了变化，质子由n h 3 + 向c 0 0 基团转移，两者的相互作 用将随着p h 的降低进一步增强。尽管c m c 与s s p s 的分子结构及所带电荷量 不同，但是对p h c 的影响很小。有研究认为两个带相反电荷的物质之间的相互 作用主要是静电吸引作用，也有可能足氢键作用或是疏水相互作用，但是只有在 疏水基团在聚合物骨架上发生类似锚定的作用下，疏水相互作用才可能大于静电 作用而占主导【5 5 1 。另有研究表明多糖和蛋白质的结合与多糖浓度以及蛋白质与 多糖的比例无依赖性【5 们。 2 3 2 酸化过程中浊度的变化 8 磊 七 宝 囊 p h 图2 2 酸化过程中体系的浊度变化 f i g 2 - 2t u r b i d i t yc h a n g e so f s y s t e md u r i n ga c i d i f i c a t i o n 在牛乳中，由于含酪蛋白胶粒及脂肪球，对光的不规则反射使牛乳呈现不透 明的乳白色。脂肪球和酪蛋白胶束对光散射影响比较大，散射强度与乳中蛋白质 和脂肪球直径的关系符合r a y l e i g h 公式( i o c d 6 ，即光散射i 与颗粒直径d 的6 次 方成正比) 【5 7 1 。由于脱脂乳中脂肪含量较少，可以认为引起光散射的主要是酪蛋 白胶束。 浊度表征的是由光散射造成的入射光的衰减，因此可以通过浊度测定来反映 光散射的强度。酸化过程中酪蛋白体系、0 5 c m c 酪蛋白复合体系及0 5 s s p s 酪蛋白复合体系浊度的变化趋势如图2 2 所示，对于酪蛋白体系，在p h5 4 6 8 1 9 浙江工商大学硕士学位论文 范围内，体系浊度随p h 的降低下降较快，这与酸化过程部分a s - 酪蛋白和d 酪 蛋白溶解，c c p 溶出以及酪蛋白胶束内部结构发生变化有关。随着p h 进一步降 低，c c p 完全溶解，酪蛋白胶束倾向于聚集，浊度开始增加，p h 至4 8 时酪蛋 白聚集沉淀。对于c m c 酪蛋白复合体系及s s p s 酪蛋白复合体系，p h 从6 8 降 至5 2 时，体系的浊度始终处于0 0 5 0 2 5 范围内，明显低于相同p h 条件下酪蛋 白体系的浊度，随后p h 降低体系的浊度迅速增加。c m c 酪蛋白复合体系在浊 度达到一定值后变化相对缓慢，而s s p s 酪蛋白复合体系的浊度则随p h 的降低 逐渐增加，由r a y l e i g h 散射理论可以推出体系浊度的增加很大程度上源于体系 中酪蛋白胶粒直径的增加。 2 3 3 酸化过程中体系一电位的变化 ( 电位可以表征体系带电情况，在一定的电场作用下，体系中的带电胶粒会 发生电泳迁移，电泳迁移速率u e 与电位的关系满足h e n r y 方程【5 8 】： i d e ：2 e i o 一( k a ) ( 2 - 1 ) ，7 7 其中s 为分散介质的介电常数， 为胶粒的电动电位，呀为分散介质粘度，为电泳 迁移速率，f ( k a ) 为h e n r y i 蚕l 数。通过酸化过程中体系- 电位的变化可以反映体系 中酪蛋白胶粒与c m c 、s s p s 的相互作用，最终( 电位值的大小可以衡量体系的 稳定性。 不同c m c 和s s p s 浓度下，体系争电位随p h 的变化如图2 3 所示。酪蛋白体系 在酸化过程中- 电位的变化呈“s ”形，p h6 8 5 0 变化区间内， - 电位缓慢且呈 微动荡增加，这与酪蛋白胶束中c c p 的逐渐溶出有关，体系中离子化的蛋白质、 磷酸盐、柠檬酸盐具有一定的缓冲能力，加入的h + 与体系中的离子存在着解离平 衡。p 1 45 0 - - 4 0 范围内，_ 电位迅速增加，在p h4 5 3 时达到酪蛋白等电点，此时一 电位值为0 ，随后- 电位为正值，酪蛋白胶粒带净正电荷。当p h 量 曼 盘 昱 o a u 图2 - 3 酸化过程中体系的( - 电位变化 f i g 2 - 3 5 2 时粒径减小，根据资料报道，通过静电吸附作用形成的复合物是可逆的，当p h 浙江工商大学硕士学位论文 高于蛋白质等电点时，会发生解吸附作用【6 2 1 。m a r o z i e n e 6 3 1 在研究果胶与酪蛋白 相互作用时也得出了类似的结论，认为果胶酪蛋白复合物发生了解吸附。粒径 突变的另一个p h 为6 0 左右，体系粒径不再减小，由于酪蛋白胶束结构在中和过 程中不能还原，因此粒径仍较复原乳粒径( 约2 1 0 n m ) 大。 2 3 6 酸化过程中体系荧光强度的变化 2 3 6 1 酪蛋白内源荧光强度的变化 蛋白质的内源荧光主要与其所含的芳香族氨基酸有关，即与苯丙氨酸( p h e ) 、 酪氨酸( t