（食品科学专业论文）动物益生芽孢杆菌菌株的筛选及发酵条件优化研究.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包含为获得沈阳农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示了谢意。 研究生签名：i 蟊规 导师签名：冉壤掀 时间：7 年磊峰日时间：一年6 月译日 时间：叩年月垆日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解沈阳农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送 交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文。同意沈阳农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名 导师签名 则也 壕掀 时间：加叼年月绎日 时间：沁节年月膨日 沈阳农业大学硕士学位论文 摘要 益生菌( p r o b i o t i c s ) 是一种能够直接饲喂，并且可以通过改善寄主肠道菌群平衡而对 动物产生有益作用的活的微生物饲料添加剂。近年来由于抗生素的滥用引起的毒性、药 物残留，耐药性，环境污染等问题剧增，给人类的生存和发展造成严重的负面影响。因 此寻找安全、无毒的抗生素替代品显得尤为重要。长期的实践和大量研究表明，作为动 物微生态制剂的一种，芽孢杆菌不仅能抑制动物肠道内的病原菌，还能够产生多种营养 物质，对维持动物机体正常的生理状态和生长繁殖都有重要意义， 本研究根据益生菌筛选的常规方法和芽孢杆菌的判定标准，从健康动物肠道中分离 出6 8 0 株芽孢杆菌进行筛选。经过耐胆酸盐试验结果有7 5 株能够在含0 3 ( w v ) 的牛胆 酸盐培养基中生长，7 5 株芽孢杆菌中有1 6 株能够抑制大肠杆菌，其中有6 株能同时抑 制肠炎沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。对它们再进行耐胆酸盐复筛试验，获得4 株芽孢杆 菌。经过胃液、肠液、产酶试验得到一株具有优良性状的芽孢杆菌b 5 4 4 。该菌株在p h 值为2 0 的模拟胃液中2 h 存活率为2 1 ；4 h 存活率为5 ；在p h 值为3 , 0 、p h 值为4 0 的胃液中能够缓慢生长。在模拟肠液中生长几乎不受抑制。该菌株还具有产淀粉酶、蛋 白酶、木聚糖酶的能力。 通过培养特征、生理生化特征及1 6 s r d n a 序列分析对菌株b 5 4 4 进行菌种鉴定，初 步确定为枯草芽孢杆菌命名为b a c i l l u ss p p 5 4 4 。 经培养条件和培养基优化试验，初步确定此菌株培养条件为：起始p h 值为7 0 7 3 ， 装液量4 0 m l 3 0 0 m l ，种子液培养1 5 h ，接种量5 ( v v ) ，控制培养温度3 7 4 0 。c 。最佳 培养基成分配比为：玉米淀粉1 0 、k h 2 p 0 4 k 2 h p 0 4 0 4 、豆粕粉2 o 、麸皮4 o ， 活菌数可达3 4 7 x 1 0 1 0 e f u m l 。 关键词：芽孢杆菌，益生菌，筛选，培养条件 沈阳农业大学硕士学位论文 a b s t r a c t p r o b i o t i c sa saf u n c t i o n a la d d i t i v e nb cd i r e c t l yf e e da n dh a sn on o x i o u s e f f e c ta n d s i d e - e f f e c to na n i m a l t h e s ey e a r st h ed i s a d v a n t a g e so fa n t i b i o t i c sa r eb e c o m i n gi n c r e a s i n g l y p r o m i n e n t , t h er e s i s t a n c eo fa n t i b i o t i c si sn o ts a t i s f a c t o r yf o rt h ea p p l i c a t i o n , t h er e s i d u eo fi t i sv e r yh a m i f df o rh u m a nh e a l t h t of i n da s a l t ya n dn o n t o x i cr e p l a c e ri ni m p e r a t i v e a f t e r m a n yy e a r sp r a c t i c ea n dr e s e a r c h ，b a c i l l u ss p p i st h eb e n e f i tt ot h eg r o w t ha n dd e v e l o p m e n t o fa n i m a l s b a c i l l u ss p p c a nn o to n l yi n i b i tt h eg r o w t ho fp a t h o g e n i cb a c t e r i a , a l s op r o d u c e n u t r i t i o u ss u b s t a n c e s ，a n di so n eo ft h em o s tp o t e n t i a ls o u l c o so f p m b i o t i c s a c o r r d i n gt od ei s o l a t i o nm e t h o d sa n ds t a n d a r do fp r o b i o t i c s ，6 8 0s t r a i n sa r ei s o l a t e d f l o r at h ei n t e s t i n eo f h e a l t h ya n i m a l s a f t e r b i l es a l tr e s i s t a n c et e s t , 7 5s t r a i n sc o u l db eg r o w t h i nm e d i u mw i t h0 3 ( w v ) b i l es a l t t h e ns t u d yt h ea c t i v i t yo fb a c i l l u si n h i b i t di ne c o i l t h er e s u l ti s1 6s t r a i n sc o u l da g a i n s te c o i l s i xo fw h i c hc a na l s oi n h i b i ts a l m o n e l l a t y h i m u r i u m ，s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s a f t e rt h ee x p e r i m e n tt h e r ew e r ef o u rs a l t - t o l e r a n ts t r a i n s a f t e rf u r t h e rg a s t r i cj u i c e ，i n t e s t i n a lf l u i d , e n z y m ep r o d u c e de x p e r i m e n t ，w i gs e l e c tas t r a i n c a l l e db a c i l l u sb 5 4 4 w i t he x c e l l e n tc h a r a c t e r i s t i c s t h es u r v i v a lr a t eo fb 5 4 4i ng a s t r i cj u i c e a tp h2 0f o r2 hi s2 1 ，s u r v i v a lr a t ew a s5 i ng a s t r i cj u i c ef o r4 h ，t h es t r a i nw a s a b l et o g r o wi ns l o w l yi nt h eg a s t r i cj u i c ea tp h3 0 ，p h4 0 t h es t r a i nw a ss t i l lg r o wi nt h e s i m u l a t e di n t e s t i n a lf l u i d t h es t r a i nh a sa l s op r o d u c ea m y l a s e , p r o t e a s e ，x y l a n a s e 。 w i t ht h ef o l l o w i n ga n a l y s i so fc o l o n ym o r p h o l o g y , p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i s t r y e x p e r i m e n t s ，a n d1 6 s r d n ag e n es e q u e n c ea sw e l l ，t h es t r a i nw a si d e n t i f i e da sb a c i l l u s s p p 5 4 4 c u l t u r ec o n d i t i o na n dm e d i u mw a so p t i m i z e dt h r o u g has e r i e so fc o m p a r a t i v et e s t s t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m a li n i t i a lp hw a s 7 0 - 7 3 ，a d d i n g4 0 m lm e d i u me a c h3 0 0m l f l a s k ，t h es e e dc u l t u r et i m ew a s l 5 h ，i n o c u l a t i o na m o u n t5 ( v v ) ，t h eg r o w t ht e m p e r a t u r ew a s 3 7 | 0 t h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nm e d i u mw a so b t a i n e da sf o n o w s ( ) ：c o r ns t a x c h l k h 2 p 0 4 k 2 h p 0 4 0 4 ，s o y b e a npo w d e r 2 ，b r a n 4 ，t h eh i 曲e s tb i o m a s so b t a i n e di nt h e e x p e r i m e n t sw a s3 4 7 x 1 0 1 0 c f u m l k e y w o r d s ：b a c i l l u ss p p ，p r o b i o t i c s ，i s o l a t i o n , c u l t i v a t i o nc o n d i t i o n 3 沈阳农业大学硕士学位论文 第一章前言 蘧着人们对抗生素认识的不断深入，抗生素得到了大规模的生产和广泛的应用，同 时抗生素所带来的负面影响，引起人们越来越多的关注。科学家们发现滥用抗生素能引 起体内的正常菌群失调、机体产生耐药性；畜产品中的化学药品、抗菌素、激素含量超 标，不仅会导致动物抗病力减弱，畜产品中的药物残留还会威胁人类健康。而且耐药性 可通过耐药因子限因子) 传递给人体中的病原菌，使保健和治疗更趋困难，这将对人类 的生存和发展产生严重的负面影响。因此，寻找一些能够替代抗生素的安全、高效、环 保型饲料添加剂成为畜牧业的持续发展的重要课题。 益生菌也称作微生态制剂，是一种能够直接饲喂的微生物饲料添加剂，即把某些对 动物机体健康有益的微生物直接喂给动物，在消化道内通过竞争性排斥作用，抑制病原 菌，维持肠道微生物区系的平衡。 益生菌以其安全、高效、环保等特点在畜牧业中正发挥着巨大的作用，益生菌无毒 副作用、无耐药性；能抵抗病原体、调整肠道菌群平衡、预防二重感染、提高机体免疫 力、综合抗病力、降低发病率；并能分泌多种酶、提高饲料消化率；能作促生长剂、降 低养殖成本、提高动物产品品质、丰富食品风味、提高瘦肉率；能提高有害物质( 胺、 氨) 的排出，减少臭味、去蝇蛆。随着人民生活水平和消费水平的提高，以及农产品国 际市场竞争力的提升，益生菌必将具有十分广阔的发展空间。 1 1 益生菌的概述 1 1 1 益生菌的定义 益生菌的现代定义最早在1 9 6 5 年( t j l i y t a ) 被阐述为“由一种微生物分泌刺激另一 种微生物生长的物质”。f u l l e r 等( 1 9 9 1 ) 经过大量的研究工作后确定益生菌定义为：能够 促进肠道内菌群生态平衡，对宿主有益生作用的活的微生物制剂，这是目前人们最常用 的定义。1 9 9 4 年，在德 虱h e r b o m 召开的益生菌研讨会又对其进行了修订，定义为：“益 生菌是活菌和( 或死菌) 包括组分和产物的微生物制剂，供口服或者经由其他粘膜途径摄 入，旨在粘膜表面处改善微生物和酶的平衡或刺激特异性和非特异性免疫机制”。 g u a n n e r ( 1 9 9 8 ) 提出了更精练的定义：“当摄入一定量时能对宿主健康有作用的微生物活 体”。经过对益生菌研究的深入，益生菌的含义也逐渐完善，益生菌株也不断增加，益 生菌功能也陆续得到证实和承认。 5 第一章前言 1 1 2 常用的动物益生菌菌株 关于微生态制剂使用的菌种，各国都有不同的规定。1 9 8 9 年美国食品与药物管理局 ( f d a ) 与饲料协会( a a f c o ) 发布了可以直接饲喂动物的安全菌株4 3 种，其中乳酸菌类1 7 株，双歧杆菌类6 株，芽孢杆菌类5 株，拟杆菌类4 株，霉菌类2 株，酵母菌类2 株，球菌 和丙酸菌类7 株。我国农业部1 9 9 9 年公布了1 2 种可以直接饲喂动物的饲料级微生物菌种， 包括干酪乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sc a s e 0 、植物乳杆菌( l a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u m ) 、粪链球菌 ( s t r e p r o c o c c u s f a e c a l i s ) 、乳酸片球菌( p e d i o c o c c u s a c id i l a c t i ) 、乳链球菌( s t r e p t o c o c c u s z a c t i s ) 、嗜酸乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s ) 、枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b a l i s ) 、纳豆芽 孢杆菌( b a c i l l u sn a t t o ) 、啤酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 、产阮假丝酵母( c a n d i d a u a u s ) 、沼泽红假单胞菌( r h o d o p s e u d o m o n as p a l u s t r i s x 姜文侠等，2 0 0 0 ) 。目前常用的益 生菌主要归纳为乳酸杆菌、芽孢杆菌、光合细菌和真菌四大类。养殖生产中应用的微生 态制剂多数是由以上单一或多种菌株复合加工而成。 1 1 3 益生菌的作用机理 益生菌进入动物肠道后，在复杂的微生态环境中与近4 0 0 种正常菌群会合，显现出 栖生、偏生、共生、竞争和吞噬等复杂关系，从而对宿主产生营养、免疫、刺激生长及 生物拮抗等生物作用，来维持动物胃肠道微生态环境的平衡，提高动物生产性能。 益生菌的作用机理主要表现在： 1 1 3 1 生物夺氧 当需氧型益生菌进入消化道后，生长繁殖消耗肠道内大量氧气，通过“生物夺氧”使 需氧型致病菌数量大幅度下降，因而起到了防止动物患病的作用。 1 1 3 2 菌群屏障学说 研究发现，益生菌能够有秩序地定植于消化道粘膜或细胞之间形成生物屏障，这些 屏障可以阻止病原微生物的定植，起着占位、争夺营养、互利共生或拮抗作用，形成保 护屏障，阻止病原菌的侵入，从而对致病菌的定植产生抑制作用。t u o m o l a 等( 1 9 9 9 ) 和 f o r e s f i e r 等( 2 0 0 1 ) 研究发现：乳酸杆菌等可抑制埃希氏大肠杆菌和沙门氏菌等致病菌附着 到肠道细胞上，并通过与病原菌发生竞争性拮抗作用，将其驱出定植位点。 1 1 3 3 微生物代谢学说 有些有益的菌落可产生有益的代谢产物，如产生有机酸，降低肠道p h 值；产生过 氧化氢和天然抗生素类物质，减少肠道内毒性物质的产生，可形成抑制或杀死有害菌的 6 沈阳农业大学硕士学位论文 环境。嗜酸乳杆菌、乳酸杆菌等在动物体内可产生过氧化氢( n u n e z e ta l ，1 9 9 8 ) ，抑制致 病菌的生长繁殖。m a i ao8 ( 2 0 0 1 ) 认为益生菌对沙门氏菌具有很好的抑制性及杀菌效果。 张民等( 2 0 0 2 ) 报道，芽孢杆菌在其生长繁殖过程中能够代谢产生乙酸、丙酸、丁酸等挥 发性酸，这些酸类能够降低动物肠道的p h 值，可有效抑制病原菌的生长，并为乳酸菌 的生长创造有利条件。u r d a c im 等( 2 0 0 4 ) 报道凝结芽孢杆菌在其生长稳定期就能产生抑 菌物质对g + 菌，尤其是对金黄色葡萄球菌、粪链球菌、艰难梭菌有很好的抑制作用。 1 1 3 4 营养作用 目前有营养特性的益生菌主要有芽孢杆菌，其次是双岐杆菌、乳酸杆菌等。其营养 特性具体表现在： ( 1 ) 能够在体能代谢产生多种维生素，如b l 、b 2 、b 6 等b 族维生素和维生素c ， 烟酸和叶酸等为动物提供维生素营养，从而促进动物生产性能的提高。芽孢杆菌类还能 够产生植酸酶，促进动物对植酸磷的利用和对脂肪的消化吸收率。有些微生物如双歧杆 菌，还能通过抑制某些维生索分解菌来保障维生素的供应。 c 2 ) 益生菌可以降低血氨改善肝脏功能。肠道内腐生菌产生的大量吲哚、硫化氢、 胺等代谢产物需在肝脏中由酸解毒，随后以葡萄糖醛酸盐和硫酸盐等形式排除，若不及 时解毒将导致肝功能紊乱和循环系统失常。双岐杆菌在肠道内可吸收利用这些含氮有害 物质，抑制产胺的腐败菌，降低肠道内的p h 值，使氨变为难于吸收的离子型，达到降 低血氨的功效。产生的氨基氧化酶及分解硫化氢的酶类，可将吲哚类氧化成无毒、无害 的物质，从而降低畜禽舍内氨气、硫化氢的浓度和臭味，减少环境污染。 l 1 3 5 免疫调节作用 拥有完整肠道菌群的常规动物比无菌动物有更高的巨噬细胞活性和免疫球蛋白水 平。这是因为肠道内的益生菌如乳酸杆菌具有提高巨噬细胞的活性的能力，从而起到防 止肿瘤生长的作用。多数乳酸杆菌属菌株还能产生一些脂肪酸类物质，致使周围环境的 p h 值降低，使病原菌不能生长( z i e m e rc je ta l ，1 9 9 8 ) 。另外，双岐杆菌也具有良好的 抗菌性并能增强机体免疫功能。h a m i l t o n 等( 2 0 0 2 ) 对一些益生菌进行的研究表明：有些 益生菌能够影响人体免疫系统的应答能力，不同菌体的影响程度也有所不同。而 m a t t i l a s a n d h o l mt 等( 2 0 0 2 ) 也通过试验发现了乳酸杆菌能够增强机体的免疫能力。 张春杨等( 2 0 0 2 ) 研究表明，用产蛋白酶的益生菌制备成微生态制剂饲喂肉鸡，能明 显促进免疫器官的生长发育，提高脾脏、法氏囊、胸腺等免疫器官指数分别可达1 8 4 7 、 7 笙二童萱童 6 4 2 、4 1 4 6 ；也能促进消化道的生长发育，提高消化道重量指数( 消化道重体重x 1 0 0 ) 最高达2 7 5 5 ；能明显提高循环抗体的水平和消化道内容物中蛋白酶的活力；因而能 极显著促进肉用仔鸡的生长发育，料肉比可减少8 9 6 ，大大提高了生产效益。刘克琳 等( 2 0 0 0 ) 采用由益生芽孢杆菌制成的微生物添加剂饲喂鲤鱼，试验组添加1 的生态制 剂，经1 0 0 d 饲喂试验后结果为：试验组较对照组增重1 1 8 ，饲料系数下降o 2 4 ；试 验组免疫器官胸腺、脾脏生长发育较对照组迅速、成熟快；电镜观察免疫器官内t b 淋 巴细胞较对照组成熟快，数量增多，产生抗体增多，免疫功能增强。杨隽等( 2 0 0 0 ) 在小 白鼠试验中发现微生态制剂有一定的抗辐射、抗疲劳、保护肝脏和润肠通便的作用。 1 1 4 微生态制剂的生产工艺 目前微生态制剂的生产工艺主要有两种：固体发酵法和液体发酵法f 郭兴华，2 0 0 2 ) 。 固体发酵法该法是把固体表面培养的菌泥与载体按比例混合经干燥制成的。此法 产量低，劳动强度大，易受杂菌污染，不适于工业化生产，但投资少。 液体发酵法般生产工艺流程为：菌种接种培养一种子罐培养一生产罐培养排 放培养液加入适量载体一干燥一粉碎一过筛一质量检验一益生菌产品。此法适于工业化 生产，便于无菌操作，但投资较大。 无论是固体发醉工艺还是液体发酵工艺，其整体工艺过程都需要在无菌的环境下操 作，每个环节的卫生条件都要求较高。 目前市场上的徽生态制剂的产品形式主要有液体、菌粉和胶囊产品。我国由于受多 种因素的限制，主要以液体产品面市，也有一定的胶囊产品和菌粉。产品的形态对菌体 的存活有很大的影响，人们已研究一些保护方法，如包埋法、微囊化等等，取得了令人 满意的结果。但成本增高，生产过程也复杂。 1 1 5 益生菌的国内外研究现状及应用进展 在国外，益生菌正逐步应用于畜牧生产上，在理论及应用方面都己进行了深入细致 的研究，取得了丰硕的成果。美国、日本、德国、法国、英国、荷兰、丹麦、西班牙等 国家在猪、肉用牛、鸡、兔的饲料，以及犊牛代用乳中亦己普遍使用。比如，日本的微 生态制剂产品使用的菌种就有：枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、东洋芽孢杆菌、酪酸菌、 乳酸杆菌、乳酸球菌。国外微生态制剂的研究多是围绕乳酸杆菌属、枯草芽孢杆菌属及 一些链球菌类进行。在国外最有代表性的产品是由日本学者比嘉照夫研制的e m 微生态 制剂，它是由光合菌、酵母菌和乳酸菌等1 0 个属8 0 多种微生物复合培养成的有效微生 沈阳农业大学硕士学位论文 物群。 我国饲用微生物的研究始于8 0 年代，多以乳酸杆菌、酵母菌研制为主。乳酸菌制 剂中应用较多的是嗜酸乳杆菌、双岐杆菌和粪链球菌等，其中包括乳酸菌发酵饲料、乳 酸菌粉及乳酸菌提取物。该类制剂应用最早，种类最多。但该类制剂因都是厌氧菌，活 菌存活率低。在产品加工和贮运过程中，易受干燥、高温、高压、氧化等不良环境的影 响，导致产品贮存期短，质量不稳定，进而影响饲喂效果。酵母菌类制剂引起可以产香 ， 等特殊风味，能明显增进动物食欲，但其不耐酸、热等特点也限制了其饲喂效果。 1 2 芽孢杆菌类益生菌 1 2 1 芽孢杆菌的概况 由于目前酵母菌、乳酸菌等微生态制剂产品中的活菌含量低，经由胃酸环境到达肠 道活菌数会更低。因此，科学家们将目光投向了能够耐高温、高压的芽孢杆菌。 需氧芽孢杆菌多为非致病菌，以内芽孢的形式零星存在于动物肠道的微生物群落 中。由于芽孢杆菌在不利的生长环境能够形成芽孢，与常用的乳酸菌、肠球菌等益生茵 相比，用芽孢杆菌生产的微生态制剂具有较多的优点。 ( 1 ) 因为该菌在不利环境条件下以芽孢形式存在，所以具有耐高温0 0 0 c ) 、耐酸碱、 耐挤压和耐温度变化等特点，因此在饲料制粒过程及通过酸性胃环境中时能够保持高度 的活性，满足饲料加工的要求。 ( 2 ) 在贮藏过程以芽孢形式存在，处于休眠期，不消耗饲料的营养成分，不影响饲 料品质，使饲料的质量得到保证。 ( 3 ) 芽孢杆菌能够产生多种酶类如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和营养物质如多种氨基 酸和维生素类物质。更重要的是，芽孢进入肠道后，在肠道上部能够迅速复活，复活率 接近l o o 。这是该菌发挥正常作用的前提。 1 2 2 芽孢杆菌在养殖业上的应用 1 2 2 1 在畜禽业上的应用 芽孢杆菌对提高猪的生产性能有良好作用。陈旭东等( 2 0 0 3 ) 1 撕究结果表明，芽孢 杆菌可提高仔猪平均日增重3 5 6 ，平均采食量可提高1 7 5 ，料肉比降低1 3 7 ，腹泻 率降低7 8 9 。i n o o k a 等( 1 9 7 9 ) 用纳豆芽孢杆菌( b a c i l l u sn a t t o ) 饲喂仔鸡，停喂5 天后仍可 从小肠内容物中分离出活菌。据报道，日粮中的芽孢杆菌6 0 - 7 0 可在猪小肠内发芽。 i n o o k a 等( 1 9 8 8 ) 试验结果表明，饲喂芽孢杆菌的试验鸡抗体水平明显增加，脾脏t b 淋巴 9 第一章前言 细胞的比例提高，脾粘连细胞的过氧化氢的产生量减少。s c h e u e r m a n n ( 1 9 9 3 ) 用蜡样芽孢 杆菌饲喂猪，发现氮沉积量显著升高，血氨浓度降低1 3 5 - 2 0 1 ，因此，释放到环境 中的氨减少。v i s e k 等( 1 9 7 8 ) 、s a n t o s o 等( 1 9 9 5 ，1 9 9 9 ) 报道，枯草芽孢杆菌可以减少畜舍 氨气的排放量。蔡一鸣等( 1 9 9 5 ) ，曹国文等( 1 9 9 7 ) 用无毒芽孢杆菌治疗仔猪黄自痢，取 得了较好的治疗效果，仔猪黄痢治愈率分别达9 6 1 8 和9 4 2 9 ，仔猪白痢治愈率分别达 9 6 9 4 和9 4 0 2 。马曙生等( 1 9 9 9 ) 利用e m 制剂发酵饲料培育仔猪，发现仔猪腹泻率下 t 降6 5 6 4 ，死亡率下降6 7 8 ，日增重也显著提高。王士长等( 2 0 0 0 ) 利用喂母猪、灌仔 猪的方法使用e m 制剂，结果使下痢发生率下降3 7 6 4 ，日增重提高8 - 1 3 。 1 2 2 2 在水产养殖业中 在水产养殖业中，芽孢杆菌可以作为益生菌来降解水中富于的有机物，降低氨、氮 浓度，稳定其它各项理化指标，以达到改良水质、维持养殖水体生态平衡的目的( 刘颖 等，2 0 0 4 ) 。目前应用较多的是枯草芽孢杆菌，它可以降低水体中硝酸盐、亚硝酸盐的 含量，在代谢过程中产生一种具有抑制或杀死其它微生物的枯草杆菌素，从而起到改善 水质的作用f 雷爱莹，2 0 0 5 ) ：另外，芽孢杆菌与其它细菌竞争营养并且抑制其快速生长。 1 2 3 芽孢杆菌在其他领域的应用 1 2 3 1 在农业中的应用 首先芽孢杆菌可以用做微生物肥料。自1 9 5 8 年，h i u o 首次从日本土壤中分离到一株 具有高固氮活性的芽孢杆菌固氮菌株后，土壤中新发现的芽孢杆菌固氮菌株越来越多， 国际上承认的固氮能力较高的需氧芽孢杆菌有3 种，即多粘芽孢杆菌、浸麻芽孢杆菌和 固氮芽孢杆菌( s e l d i n le t a l ，1 9 8 4 ) 。此外也有一些巨大芽孢杆菌、球形芽孢杆菌的部分 菌株有一定固氮能力的报道( 龙苏等，2 0 0 0 ) 。这意味着此类菌在自然界氮素供应上起着 重要作用。 其次芽孢杆菌还可以作微生物农药。微生物农药是利用微生物本身或其代谢产物防 治病、虫、杂草的制剂，包括微生物杀虫剂和农用抗生素( 刘秀花，2 0 0 5 ) 。苏云金芽孢 杆菌制荆( 简称b t ) 是目前世界上产量最大的微生物杀虫剂，它克服了传统化学农药的污 染环境、危害人畜、易产生抗性等缺点，具有选择性强、安全、原料简单等优点( 格拉 泽等，2 0 0 2 ) 。我国拥有丰富的微生物资源，从五十年代末就歼始了对b t 作为杀虫剂方面 的研究工作，8 0 年代中期杀虫剂的发展被列入国家科技攻关计划。n 9 0 年代初期，全国 b t 产品的产量和质量丌始大幅度提高。国内外也有许多关于枯草芽孢杆菌对植物病原真 1 0 沈阳农业大学硕士学位论文 菌的抑制作用及防治试验的报道( f e n e i r a e ta l ，1 9 9 1 ) 。若能够深入了解抗真菌蛋白对真 菌病害的抑制机理，并通过基因工程将此类蛋白基因转入相应作物基因组中，可获得新 的抗病品种。 1 2 3 2 在工业中的应用 利用芽孢杆菌发酵获得在工业生产上需要的高活性、高纯度的淀粉酶、蛋白酶的方 法在本世纪3 0 年代就开始应用。蛋白酶可用于制革、丝绸工业、蛋白胨、牛肉膏和加酶 洗涤剂的制造。生产菌以地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和短小芽孢芽杆菌为主，一般地 衣芽孢杆菌和短小芽孢杆菌所生产的蛋白酶组成洗涤剂时去污效果j f f ( g a n e s h e t a l ， 1 9 9 9 ) 。目前用于碱性蛋白酶的生产菌和研究对象主要是枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、 短小芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌仗0 军等，2 0 0 4 ) 。此外，芽孢杆菌还可以产生许多具 有重要应用价值的酶类，如木聚糖酶、b 葡聚糖酶，b 甘露聚糖酶、植酸酶等( 夏剑辉等， 2 0 0 3 ；林小杰等，2 0 0 5 ) ，有些芽孢杆菌可以同时分泌几种酶，筛选这类芽孢杆菌将具 有重要意义和应用潜力。 芽孢杆菌因其能产生独特的酶、抗菌物质及风味成分而广泛地应用于食品工业中。 如芽孢杆菌产生的胆固酵氧化酶降解食品中胆固醇的效率高、作用显著，对食品特性( 如 风味、营养等) 影响小，而被应用在保健食品中( 牛天贵等，2 0 0 1 ) 。枯草芽孢杆菌可以在 食品发酵的过程中产生一些风味和芳香成分，作为食品添加剂起到增香、改善风味等作 用( 绍元龙等，2 0 0 5 ；王月梅等，2 0 0 2 ) 。 随着经济的发展利用微生物来治理环境污染愈发显示其优越性和重要性。巨大芽孢 杆菌可以降解农药杀虫剂( 周军英等，2 0 0 0 ) ；地衣芽孢杆菌可以对猪粪液进行无害化处 理( 杜珍辉，2 0 0 5 ) ；蜡样芽孢杆菌可作为生物吸附剂对重金属污染废水如电镀等工业废 水进行处理( 潘建华等，2 0 0 4 ) 。 1 2 3 3 在医药方面的应用 在医药方面芽孢杆菌也被广泛的应用。目前用于活菌制剂的细菌，主要有乳杆菌、 双岐杆菌、肠球菌、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、棒状杆 菌等。枯草芽孢杆菌活菌制剂作为口服液用于治疗肠炎、支气管炎等多种疾病，也用来 预防和治疗烧伤创面的感染( 齐涵等，1 9 9 7 ) 。芽孢杆菌还可以产生抗生素类物质或者转 化重要成分作为抗菌药物应用于医疗工业中( 谢海平等，2 0 0 3 ；何晨等，2 0 0 5 ) 。 1 2 3 4 在生物学研究中的应用 整= 童堕宣 在芽孢杆菌属中，有许多天然菌株可提供不同的高生物活性的基因。枯草芽孢杆菌、 短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌也可作为基因工程受体菌，仅枯草芽孢杆菌就表达出了近 2 0 0 种原核和真核生物来源的蛋白基因。枯草芽孢杆菌无论是在生产上还是对基因组及 物理图谱的研究都处中心位置。它的研究涉及到各个方面，例如与芽孢形成和萌发有关 的生化和形态学变化的基因的确定、转化和转导过程中遗传交换机制；细胞壁合成与细 胞生长及细胞分裂、中间代谢过程酶的基因定位；感受态等基因的分析与定位等。目前 国际上用作遗传工程的有芽孢宿主菌几乎全部来s p i z i z e n 及其学生建立的枯草芽孢杆 菌1 6 9 菌株转化系统，它同另一种常用大肠杆菌表达系统相比有着独特的优势。它可以 将转入目的基因表达出的产物分泌到细胞体外。这就为基因表达产物的进一步收集、分 离、纯化工作降低了成本和工作量。t h a m t h i a n k u l 等人将地衣芽孢杆菌的几丁质酶基因 通过同源重组的手段转入到苏云金芽孢杆菌中以提高该菌株的杀虫能力f 1 1 l 锄t h i 姐k u l 甜a l ，2 0 0 4 ) a 1 3 影响益生菌使用效果的主要因素 无论作为饲料添加剂还是作为兽药，益生菌和传统的化学药物有着根本的不同。其 能够改善肠道菌群的平衡，对宿主产生良好的健康效应( f u l l e r r ，1 9 8 9 ) 。但是，益生菌 的应用效果也受诸多因素的影响。主要影响因素包括菌种的选择、使用剂量、菌剂的保 质期、剂型等。 1 3 1 菌种的选择 菌种的组合、筛选是益生菌研制过程中的一个重要环节，直接关系到产品质量的优 劣及应用的效果。目前普遍认为益生菌菌株应具备以下条件： ( 1 ) 无毒、无致病性、安全性好 根据来源于自然，回归自然的标准，选择与原宿主、原环境、原微生态系、原微种 群相适应的菌种最理想。传统的益生菌菌种在安全应用上已有很长的历史，大多数菌种 被认为是没有致病可能性的共生微生物体，且绝大部分分离自健康动物体肠道。 ( 在消化道表面定植，能耐受胃酸和胆酸盐 筛选具有优良特性的菌株是制备微生态制剂的基础，优良菌株应具备的基本条件是 能够在宿主动物肠道粘膜细胞粘附、繁殖并发挥对宿主健康有益的作用( c o l l i n sm d ， 1 9 9 9 ) 。动物胃肠道中具有较低的p h 值，高浓度的胆汁液和胆汁盐。后者能通过乳化来 消化脂肪性食物，而细菌的细胞膜是由脂质和脂肪酸构成的，胆汁可直接作用于它t l f j ( d u 沈阳农业大学硕士学位论文 t o i tme ta l ，1 9 9 8 ) 。因此，益生素菌种必须具有很强的耐胆汁特性才能保证其在肠道中 的生存繁殖能力。 ( 3 ) 产生多种有益活性物质 产生抑制病原菌的物质或创造抑制病原菌生长的环境。一般芽孢杆菌产生小环肽类 细菌素或脂肽类物质，从而抑制病原菌的生长( z i e m c r c j ，1 9 9 8 ) 。同时进入肠道内的益 生菌在生长繁殖过程中除产生淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等以帮助动物消化吸收和利用 相应的营养物质外，还能产生维生素、氨基酸、促生长因子等代谢产物。 1 3 2 使用剂量 益生菌的益生作用是通过微生物在动物体内一系列生理活动来实现的，其最终效果 与施加剂量密切相关。试验发现，如果一种细菌在盲肠内容物中的浓度低于1 0 7 c f u m l ， 该菌产生的酶及代谢产物，不足以影响宿主；数量过多，超出肠内附着点或超出优势菌 群所的数量，功效不会增加，反而产生浪费。 1 3 3 饲料加工过程 死菌体及其代谢产物虽有短暂的效果，但如果没有足够的活菌，也不能达到满意的 效果。因此，活菌数量是评价微生态制剂质量的一个重要指标。在制粒与膨化过程中， 高温、高压、蒸气明显影响益生菌的活性。不同的菌种对高温耐受力差异较大，芽孢杆 菌耐受力最强，1 0 0 条件下2 m i n 仅损失5 1 0 ，而在8 0 加热5 m i n ，乳酸杆菌、酵 母菌损失7 0 。8 0 ，9 5 c 条件下2 m i n 损失9 8 - 9 9 。一般制粒8 0 c 1 0 0 c 对芽孢杆菌 影响较小，仅有1 0 一3 0 孢子损失，对乳酸杆菌、酵母菌和粪链球菌等影响较大。 1 4 研究的目的和意义 由于目前随着饲料工业的快速发展，大量人工合成的饲料添加剂如抗生素、促生长 素、驱虫剂、激素、调味剂和改良剂、防腐剂等在饲料中普遍添加。这些添加剂的应用 虽对畜牧业的发展起到了巨大的推动作用，但也带来了一定的负面效应。特别是因抗生 素、激素的大量使用而产生的耐药性和药物残留给人类健康带来了巨大危害。因此，替 代抗生素的安全、高效、环保型饲料添加剂的研究开发是实现畜牧业可持续性发展的重 要课题。现在人们积极寻找一些新的抗生素的替代品，既具有广谱抗菌、功能稳定、促 生长明显、适于生产加工的特点，又不引起抗药性等问题。长期生产实践及大量研究表 明，多数芽孢杆菌对动物的生长繁殖和正常生理状态的维持都有重要意义。芽孢杆菌是 一类好氧微生物，通过生物夺氧，降低氧化还原电势，有利于厌氧微生物的生长，从而 1 3 蔓二兰堕童 保持肠道微生态系统平衡。而且，芽孢杆菌在肠道中能产生多种消化酶和有机酸，提高 饲料的利用率，抑制有害菌的繁殖、保证宿主健康，也为乳酸杆菌等的生长创造有利条 件。所以，芽孢杆菌是一种理想的动物微生态制剂的生产菌种。 尽管目前已有很多益生菌的相关报道，但还是以乳酸菌为多。芽孢杆菌作为益生菌 虽然潜力无穷，但目前的应用却不如乳酸菌制剂广泛。我国芽孢杆菌资源丰富，而且很 多菌株在不同的环境中表现出与常规菌株不同的生物学特性，应用效果有一定的种属特 异性，这为筛选有益生作用的菌株提供了方向，也是本课题开展的一个很重要的出发点。 本课题研究旨在通过科学的试验方法，从大量动物粪便中筛选出对动物消化道不良 环境具有较强耐受能力，能抑制肠道内病原菌并且代谢产生多种消化酶的芽孢杆菌。应 用于动物饲料中可以起到防治动物腹泻、营养促生长的功效。 1 5 研究内容与方法 1 5 1 研究内容 1 5 1 1 筛选优良的芽孢杆菌菌株 首先从健康动物肠道中分离芽孢杆菌。随后通过耐胆酸盐试验、抑菌试验、在人工 模拟胃液、人工模拟肠液中的耐受性试验以及产生消化酶试验等进行综合比较，筛选确 定最佳的益生芽孢杆菌菌株。 1 5 1 2 芽孢杆菌菌株的鉴定 采用培养特征、生理生化特征及1 6 s r d n a 序列分析对筛选出的芽孢杆菌进行菌种 鉴定。 1 5 1 3 目标菌株最佳发酵条件的确定 通过优化培养条件( 温度、起始p h 值、接种量、装液量等) 和优化培养基组成( 碳源、 氮源、无机盐等) 的方法提高发酵液中的活菌数。 沈阳农业大学硕士学位论文 1 5 2 技术路线 劫物粪便样品采剩 盼离、筛选芽孢杆铡 圃耍困 圃 沈阳农业大学硕士学位论文 第二章益生芽孢杆菌菌株的筛选 2 1 前言 菌种的筛选是益生菌研制过程中一个最重要的环节，优良的菌种是保证益生菌发挥 作用的重要前提。作为益生菌的菌种首先要安全，所以从健康动物肠道分离目的菌株是 保证菌株安全的前提，并且一定程度上保证菌株进入肠道后可定植并生长繁殖。其次优 良的菌株应能够抵抗胃液中的酸性环境和十二指肠中的胆汁。同时为保证菌株进入动物 胃肠道后发挥作用，优良的菌株要求有一定的抑菌、营养功能。蔡雁等( 2 0 0 5 ) 从刚宰杀 的健康鸡肠道中分离芽孢杆菌，经过体外抑菌试验、产酶试验筛选获得一株优良的芽孢 秆菌，饲喂小鼠后发现小鼠肠粪便中大肠杆菌数量减少，而乳酸菌数量有所增加；日增 重可提高2 3 3 。江敏等( 2 0 0 6 ) 报道，以蜡样芽孢杆菌为出发菌株经紫外诱变后菌株对 胆酸盐耐受性可从p h 4 8 ，0 0 1 ( w v ) 提高到p h 4 2 ，0 0 4 5 ( w v ) 。 本章试验的目的就是从已有和自己分离得到的6 8 0 株芽孢杆菌中筛选到能够耐酸、 耐胆酸盐、抑制致病菌同时能够产生多种消化酶的芽孢杆菌。 2 2 材料与方法 2 2 1 材料 2 2 1 1 分离样品 试验共采集北京动物园2 2 1 种动物粪便，分别包括食草类动物、食肉类动物、杂食 类动物等。 2 2 1 2 动物病原菌 大肠杆菌假c d 功、肠炎沙门氏菌( s a l m o n e l l at y h i m u r i u m ) 、金黄色葡萄球菌 ( s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ) 2 2 1 3 培养基 ( 1 ) l b 斜面培养基：胰蛋白胨l g ，酵母提取物0 5 9 ，n a c ll g ，蒸馏水1 0 0 m l ，p h 值7 0 彳2 。 ( 2 ) 种子培养基：牛肉膏0 3 9 ，蛋白胨l g ，n a c ll g ，蒸馏水1 0 0 m l ，p r i 值7 0 0 2 。 ( 3 ) 淀粉酶培养基：可溶性淀粉2 9 ，牛肉膏0 3 9 ，蛋白胨l g ，n a c ll g ，台盼兰0 0 2 9 ， 琼脂粉1 5 9 ，蒸馏水1 0 0 m l ，p h 值7 0 7 2 。( 摇瓶发酵培养基不加琼脂) ( 4 ) 蛋白酶培养基：脱脂奶粉5 9 ，琼脂粉1 5 9 ，自来水1 0 0 m l ，p h 值自然。( 摇瓶 发酵培养基不加琼脂1 1 7 第二章益生芽孢杆菌菌株的筛选 ( 5 ) 木聚糖酶培养基；木聚糖l g ，m g s o 7 h 2 0 0 1 9 ，k n 0 3 1 9 ，酵母膏0 3 9 ，n a c l0 5 9 ， k z h p 0 4 0 5 9 ，琼脂粉1 5 9 ，蒸馏水1 0 0 m l ，p h 值7 0 - 7 2 。( 摇瓶发酵培养基不加琼脂) 2 2 1 4 主要化学试剂 胃蛋白酶( 美国s i g m a 公司生产，活性为1 ：1 0 0 0 0 ) 、胰蛋白酶( 日本a l n r e s c o 公 司生产，活性为1 ：2 5 0 ) 、桦木木聚糖( 美国s i g m a 公司生产) ，购自北京拜尔迪生物科 技有限公司；其他使用的培养基材料和化学试剂都分别为国产分析纯试剂和生化试剂， 均购自北京化学试剂公司和北京欣经科试剂有限公司。 2 2 1 5 主要仪器设备 分光光度计u v - 7 5 2上海精密科学仪器厂 电热恒温培养箱湖北黄石医疗仪器厂 恒温水浴锅北京医疗设备厂 显微摄像系统 m o f i cbs e d e s p a n a s o n i e p h s 2 5 型数字式精密p h 计 上海理达仪器厂 h z q q 全温振荡器哈尔滨东联电子设备有限公司 无菌超净工作台哈尔滨东联电子设备有限公司 立式压力蒸汽灭菌器上海博迅设备厂 t g l - 1 6 c 离心机上海安亭科学仪器厂 牛滓杯( 1 0 x 7 8 x 6 m m )