（食品科学专业论文）产柚苷酶菌株的选育及柚子汁酶法脱苦工艺的研究.pdf

福建农林大学硕上学位论文 产柚苷酶菌株的选育及柚了汁酶法脱苦t 艺的研究 摘要 柚苷酶是由黑曲霉、米曲霉、青霉等霉菌产生的胞外酶，能分解柚皮苷起到脱 苦作用，在食品加工业上具有良好的应用价值和广阔的市场前景。 在本实验中： 1 利用一种新的柚苷酶产生菌的筛选模型，即以桔皮粉为唯一碳源、氮源的 平板，从堆积腐烂的柚子皮上筛选出一株柚苷酶生产菌株a 1 3 。对该菌株进行摇 瓶发酵其产酶水平达到3 6 5 3 1 u m l 。通过形态特征初步鉴定其为黑曲霉 ( a s p e r g i l l u sn i g e r ) 。 2 以n t g 对出发菌株a 1 3 进行诱变，将诱变后的孢子涂在含纳他霉素最低 致死浓度( 2 o l x g m l ) 的筛选平板上，获得抗药性突变株，结合透明圈和摇瓶复筛， 从1 8 0 个纳他霉素抗性突变株中筛选得到1 株摇瓶发酵产酶达8 7 6 4 3 u m l 的 a 1 3 6 2 号菌株，比出发菌株的产酶能力提高了近2 3 7 ，该菌株经数代培养后产 酶稳定。 3 从单因素水平试验和正交试验结果得出最佳摇瓶发酵条件和最佳培养基配 方。发酵培养基配方：豆渣( 含水3 0 - 4 0 ) 10 0 9 ，脱脂豆饼粉4 0 9 ，鼠李糖o 2 9 ， c a c l 2 1 9 ，z n s 0 4 1 9 ，m g s 0 4 7 h 2 0 5 9 ，k e h p 0 4 l g ，蒸馏水1 0 0 0 m l ；发酵条件为： 培养温度3 0 。c 、初始p h 为5 0 、接种量1 0 、5 0 0 m l 三角瓶装液量为5 0 m l ，在 此条件下发酵9 6 h 时产酶可达1 0 1 7 u m l 。 4 通过对a 1 3 6 2 菌株所产柚苷酶进行酶学性质分析，其酶促反应最适p h 为 4 0 左右，最适温度为6 0 * c ，m g + 、c a 2 + 对柚苷酶有较强的抑制作用，而z n 2 + 对酶 促反应有很强的促进作用。 5 将发酵酶液浓缩至酶活力单位1 0 0 0 0 i u m l ，研究柚汁酶法脱苦工艺，在柚 子原汁p h 状态下，酶解温度为5 0 。c ，酶添加量为8 0 0 0 i u k g ，酶解时间为l h ，果 汁脱苦率达4 6 2 5 ，可获得良好的风味特征。 关键词：柚苷酶：黑曲霉；n t g ；抗药性突变株；液体发酵；酶法脱苦 福建农林大学硕士学位论文产柚苷酶菌株的选育及柚子汁酶法脱苦工艺的研究 s c r e e n i n ga n d m u t a t i o nb r e e d i n go ft h en a r i n g i n a s e p r o d u c i n gs t r a i na n dt h es t u d yo ft h ed e b i t t e r i n g t e c h n o l o g yb yn a r i n g i n a s e a bs t r a c t n a r i n g i n a s ew r i t st h ee x t r a c e l l u l a re n z y m ef r o ma s p e r g i l l u sn i g e r ，a s p e r g i l l u so r y z a e ， p e n i c i l l i u mn o t a t u ma n ds o m eo t h e rf u n g iw h i c hc o u l dh y d r o l y z en a r i n g i nt od e b i r e r i z e i th a d g r e a tp o t e n t i a la p p l i c a t i o ni nf o o dp r o c e s s i n g i no u r w o r k ： 1 an e wm o d e lf o rs c r e e n i n go fn a r i n g i n a s ep r o d u c i n gs t r a i n ，p l a t e sc o n t a i n i n g o r a n g em e a la st h es o l oc a r b o na n dn i t r o g e nr e s o u r c ew e r eu s e d ，a n dan a r i n g i n a s e p r o d u c i n gs t r a i na 1 3w a so b t a i n e d a 13c o u l ds e c r e t e d3 6 5 31u m ln a r i n g i n a s ei n s h a k ef l a s k ，a n di tw a si d e n t i f i e dt ob ea s p e r g i l l u sn i g e r ； 2 a 13w a sm u t a t e dw i t hn t ga n dt h es p o r e sw e r es p r e a do nt h ep l a t e sw h i c h c o n t a i n i n g2 0 i r t g m lt e n n e c e t i n ，t h em i n i m u ml e t h a lc o n c e n t r a t i o n ，t oo b t a i nt h e a n t i d r u g m u t a n t s a f t e rh o l oa n ds h a k ef l a s ks c r e e n i n g ，o n e n a r i n g i n a s e o v e r - p r o d u c i n gs t r a i na - 1 3 6 2w h o s ey i e l dw a s8 7 6 4 3 u m li ns h a k ef l a s k ，2 3 7 h i g h e rt h a to fo r i g i n a ls t r a i n ，a m o n g18 0a n t i - t e n n e c e t i nm u t a n t sw a sg o t ； 3 t h eo p t i m a lm e d i u ma n dl i q u i df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o nw e r ed e t e r m i n e d b y o n e f a c t o re x p e r i m e n t a ld e s i g na n do r t h o g o n a le x p e r i m e n t a ld e s i g n ：b e a n d r e g s ( c o n t a i n i n g3 0 0 旷4 0 w a t e r ) 10 0 9 ，d e g r e a s i n gs o y b e a r lp o w d e r4 0 9 ， r h a n m o s e 0 2 9 ，c a c l 21g ，z n s 0 4lg ，m g s 0 4 7 h 2 0 5 9 ，k 2 h p 0 41g ，d i s t i l l e dw a t e r 1 0 0 0 m l ，c u l t u r e da t3 0 c ，i n i t i a lp h5 0 ，i n o c u l u m e1 0 ，5 0 m lm e d i u mi n5 0 0 m l s h a k ef l a s k ，a n dt h ey i e l dw a s1017 u m la f t e r9 6h r sf e r m e n t a t i o ni nt h i s c o n d i t i o n ； 4 t h ec h a r a c t e r i z a t i o no ft h en a r i n g i n a s es e c r e t e db ya 13 - 6 2w a sp e r f o r m e d ：t h e o p t i m a lp ha n dt e m p e r a t u r eo ft h ee n z y m a t i cr e a c t i o nw a s4 0a n d6 0 cs e p a r a t e l y , m 矿、c a 2 十h a dg r e a ti n h i b i t i o ne f f e c tw h i l ez n 2 + c o u l dp r o m o t et h ee n z y m e ； u 福建农林大学硕士学位论文 产柚苷酶菌株的选育及柚子汁酶法脱苦工艺的研究 5 t h ep r o c e s so fe n z y m a t i cd e b i t t e r i n gw a s o p t i m i z e d ：a tt h ep ho fn a t u r eg r a p e f r u i t j u i c ea n d5 0 。c ，8 0 0 0 i u k ge n z y m e ，a f t e r1h r sr e a c t i o nt h ed e b i t t e f i n gr a t er e a c h e d t o4 6 2 5 ，g o te x c e l l e n tf l a v o u rc h a r a c t e r i s t i c s k e y w o r d s ：n a r i n g i n a s e ；a s p e r g i l l u sn i g e r ；n t g ；a n t i d r u gm u t a n t ；l i q u i df e r m e n t a t i o n ； e n z y m a t i cd e b i t t e r i n g i i i 独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是我个人在导师的指导下，进行的 研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作了答谢 的地方外，论文中不包含其它人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本研究做 出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯他人知 识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名 论文使用授权的说明 & 斌m j 参6 、 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，即： 学校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或 部分内容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。 保密，在年后解密可适用本授权书。 口 不保密，本论文属于不保密。 砂 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名： 指导捌垛笔答辄彩厄 日期： 叩宪爱吞 日期：勿秒6 福建农林大学硕上学位论文产柚苷酶菌株的选育及柚子汁酶法脱苦工艺的研究 第一章引言弟一早ji 苗 1 柚子加工与开发利用现状 1 1 柚子的生长条件、栽培区域概况 柚子，属柑橘类，又名文旦、香抛、雷柚、气柑，俗称团圆果，为芸香科( m t a c e s a e ) 植物常绿果树柚树的成熟果实。柚子的果实大，球形或近于梨形，呈柠檬黄色； 果肉白或红色，隔分成瓣，瓣间易分离，味酸可口。柚子营养价值很高，含有非 常丰富的蛋白质、有机酸、维生素以及钙、磷、镁、钠等人体必需的元素，营养 价值高，果实成熟后香气宜人，深受消费者的青睐，是加工果汁饮料的良好原料【l j 。 同时，柚子还具有健胃、润肺、补血、清肠、利便等功效，可促进伤口愈合，对 败血病等有良好的辅助疗效。中医学也认为，柚子味甘酸、性寒，具有理气化痰、 润肺清肠、补血健脾等功效，能治食少、口淡、消化不良等症，能帮助消化、除 痰止渴、理气散结【2 3 】，可促进伤口愈合，对败血症等有良好的辅助疗效【2 4 】。 我国栽培柚子的历史十分悠久，远在公元前的周秦时代就有种植，夏书禹 贡中曾有“扬州厥包杼柚锡贡”的记载，吕氏春秋亦有“果之美者，云梦之 柚”的记载，说明柚在我国至少已有三千多年的栽培历史【5 1 。在我国柚子的主要产 地为广西、广东、浙江、福建、台湾、四川、陕西等地，我国柚类已有4 0 多个品 种，其中不乏名优品种。除了我国种植外，柚子在东南亚许多国家和地区都有栽 培，美国、古巴、南非、巴西、阿根廷以及日本也是柚子的主要产地。因此，柚 子可算是国际上大众化的果品之一【6 7 】。目前，我国漳州的“文旦柚”、广西的“沙田 柚”、华安的“坪山柚”与泰国的“暹罗柚”一起并称为世界“四大名柚”。 柚子生长适宜温度为摄氏2 3 - 2 9 ，性喜高温及雨水、日照充足的气候，耐 寒力较弱。福建省地处亚热带季风性气候，气候温和，雨量充沛，具有独特的自 然生态环境，十分适宜柚子的种植。2 0 0 7 年福建省柚子总种植面积1 8 0 1 6 万亩， 总产量7 8 6 万多吨，居全国前列。福建省的特产名柚有古田湖滨蜜柚、福鼎四季 柚、平和瑭溪蜜柚、华安坪山蜜柚和仙游渡尾蜜柚等。在福建省，漳州是最大的 柚子产地之一，其中瑁溪蜜柚栽培面积约6 0 万亩，其他传统品种如坪山柚、文旦 柚栽培面积各约3 万亩，渡尾无核蜜柚栽培面积达1 0 万亩，福鼎四季柚栽培面积 约3 5 万亩，葡萄柚也有少量种植，一般每亩可采柚子4 0 0 0 - - - 5 0 0 0 公斤。 福建农林大学硕士学位论文产柚苷酶菌株的选育及柚子汁酶法脱苦工艺的研究 1 2 柚汁加工中的苦味成分 柚汁在长期贮藏和热处理过程中会产生令人难以接受的苦味，而鲜食或取汁 后及时饮用就没有这种苦味，这种经加工后呈现强烈苦味的现象就是人们通常所 说的“后苦味”或“延迟苦味”( d e l a y e db i t t e r n e s s ) 现到8 1 。“后苦味”大大降低了柚 汁的口感，增大了加工生产的难度。 研究发现产生苦味的物质主要来自两方面，其一是柚皮苷( 图1 1 所示) ；其二 是类柠檬苦素【9 小】( 图1 2 所示) 。 图1 1 柚皮苷结构式图1 2 类柠檬苦素结构式 f i g 1 1t h es t r u c t u r eo fn a r i n g i nf i g 1 - 2t h es t r u c t u r eo fl i m o n i n 柚皮苷是一种黄烷酮糖苷类化合物，是存在于柑橘类水果中的主要苦味物质， 由柚皮素7 p d 葡萄糖仅l 鼠李糖构成，分子式为c 2 7 h 3 2 0 1 4 2 h 2 0 ，相对分子质 量为6 1 6 5 8 。它在水中的苦味阈值为2 0m e , l ，在果汁中约为3 0m g l ，易溶于热 乙醇中，在热水和热乙酸中可溶，冷水和冷乙醇中微溶，乙醚、氯仿、苯中不溶。 柚皮苷在柑橘类水果果实组织中的分布不均匀，其中果皮中柚皮苷的含量大约占 全果柚皮苷含量的7 0 ，而在中果皮中含量最高，果汁中含量最低，中果皮中柚 皮苷的含量是果汁的2 6 - 4 0 倍。柚皮苷在柑橘类水果果实中总体含量的由高到低 依次为：白皮层、外果皮、内果皮、种子、果汁，没有成熟的柑橘类水果果实中 的柚皮苷含量最多。此外，柚皮苷含量也因产地、品种、成熟度不同而异【1 2 - t 5 。 另一类化合物是类柠檬苦素( l i m o n o i d s ) ，是一组三萜系衍生物( 图1 2 ) ，是植 物次生代谢的产物，主要存在于芸香科和楝科的多种植物中，迄今已分离出大约 3 0 0 多种类柠檬苦素化合物。类柠檬苦素常以两种形式存在，一种为类柠檬苦素配 基化合物，已分离鉴定出3 7 种；另一种为类柠檬苦素葡萄糖苷化合物( 即配糖体， 又称苷) ，已分离鉴定出2 1 种【1 6 】。具有强烈苦味的类柠檬苦素( l i m o n o i d s ) 中，柠 碱是最重要的苦味源。 2 福建农林大学硕士学位论文产柚苷酶菌株的选育及柚子汁酶法脱苦工艺的研究 蜜柚加工过程中出现明显苦味，这就限制了在食品工业中的广泛应用，使许多 消费者难以接受。柚子制品的苦味、柚子汁浑浊、加热变味等问题严重限制着柚 子加工业的发展，造成了一定的经济损失，这些问题已成为柚子加工研究者们研 究的重点。 2 柚汁脱苦方法研究现状 在柑橘类水果制品中，特别是柑橘类果汁中含有一定的苦味是保持产品特有 风味必不可少的，但苦味过强就会影响产品的质量和销售。柑橘类果汁的脱苦是 柑橘类水果深加工的关键技术。目前柑橘类果汁中苦味物质的脱除方法主要有： 屏蔽脱苦、超临界脱苦、膜分离脱苦、代谢脱苦、吸附脱苦、酶法脱苦、固定化 细胞脱苦、基因工程脱苦等。 2 1 屏蔽法脱苦 蔗糖和环糊精等物质能够减缓柑橘汁中的苦味，添加1 0 的蔗糖可使柠檬苦 素类似物水溶液的苦味阈值增加2 7 m g k g ，使柚皮苷水溶液的苦味阈值增加 4 5 m g k g 。新地奥明( n e o d i o s m i n ) 是与脱氧新橙皮苷结构相似，是有效的柠碱苦 昧抑制剂，它能提高柑桔果汁的柠碱苦味阈值，而且对柚皮苷同样有效，能极大 程度地降低果汁中的柠碱苦味。果汁中加入5 0 - 1 5 0 m g k g 新地奥明，即可降低苦 味，改善果汁风味。 环糊精是由6 个以上的葡萄糖分子通过0 【一1 ，4 糖苷键组成的环状多糖类化合 物，其疏水中心空腔能够结合某些分子，形成包合络合物。环糊精可有效增加苦 味阈值，降低人对苦味的敏感性。环糊精增加柚皮苷和柠碱的缔合度，形成一种 包埋化合物，从而去除柑橘汁中的苦味成分。环糊精添加量因柑橘汁种类不同而 异，一般在o 3 - - 0 5 之间，不超过1 ，以免苦味成分重新析出。据m i t a k i 研 究报道，p 环糊精能具有选择性地包埋柑桔类果汁的柠碱和柚苷，从而降低柑桔果 汁的苦味，而对糖类、v c 及其他营养成分并无太大影响 1 7 】。 徐仲伟等发现0 5 p 环糊精脱除柠碱和柚皮苷的效率分别为4 9 1 和4 7 8 ，比低浓度p 环糊精脱苦效率高，而且p 环糊精对作为橙类品种主要成分的柠 碱包埋作用较大，而糖类、维生素c 和其它营养成分无损失。徐国胜等 1 9 1 研究了 p 一环糊精对柑橘类果汁脱苦工艺的最适参数：果汁温度为4 5 ，作用时间9 0m i n ， p - 环糊精添加量为o 5 9 l o o m l ，柠檬苦素脱苦率为8 6 5 3 ，柚皮苷脱苦率为2 4 1 7 3 福建农林大学硕士学位论文产柚苷酶菌株的选育及柚子汁酶法脱苦工艺的研究 ，v c 损失率为4 6 8 。另外，环糊精本身具有可食用性，因而将它添加到柑橘 汁中是安全的。 添加苦昧抑制剂是目前生产商较实用的一种脱苦方法，但是单一用苦味抑制 剂不能完全脱除苦味，如p 环糊精脱苦法，它的应用局限较大，仅能在一定苦味浓 度范围内实现脱苦，苦味抑制剂如能和其他方法配合使用效果会更好。 2 2 超临界c 0 2 脱苦 k i m a l l 2 0 1 探讨了用超临界c 0 2 流体来脱除柑橘汁中柠碱的条件：在) 7 医, 5 0 2 1 - - - 4 1 m p a ，温度3 0 - - 一6 0 之间处理1h ，柠碱脱除率平均达2 5 ，处理4h 能使柠碱含 量由1 7 5m g l 降至7m g l ，而对果汁中的其他营养成分没有影响。超临界c 0 2 脱苦效果较明显，但需要超临界高压装置，操作较复杂，相对投资较高，高温高 压是否会带来一定程度的营养损失尚需进一步的研究。 2 3 膜技术脱苦 膜分离技术是近几十年发展起来的高新技术，这些年发展尤为迅速。按照分 离原理不同可分为：滤膜和溶解扩散膜两种类型。滤膜分离物质的原理是根据分 子量的大小。溶解扩散膜对物质的分离是根据溶质分子在膜中的溶解性和扩散性， 因此，与滤膜相比，它能将浓度极化现象降至最低，且具有很强的抗污染能力。 杜吉涛等【2 1 】采用截留分子量为5 万、8 万和1 0 万道尔顿的国产中空纤维超滤膜对柚 子汁进行脱苦处理，经l o 万道尔顿超滤膜澄清的柚子汁其苦味得以适度去除。膜 技术脱苦具有分离效率高，操作温度低的特点，目前由于膜性能方面的原因仅在 实验室使用。 2 4 代谢法脱苦 在果实收获后，采用加速苦味物质代谢的方法也能减轻果汁中的苦味。徐仲伟 等 1 8 1 将整果置于2 0 m g k g 的乙烯气体中1 h ，然后于室温下在空气中放置5 天，可 使果汁中柠碱苦味降低4 4 9 ，但此法对柚皮苷脱除的影响很小。这主要是由于 乙烯利的处理能加速柑橘果实内柠碱类的代谢。 2 5 吸附法脱苦 吸附法是利用各种吸附剂吸附苦味物质进行脱苦。吸附剂有多种，包括活性炭、 活化硅酸镁、硅胶、离子交换树脂、木质吸附剂等。各种吸附剂对不同成分的吸 4 福建农林大学硕士学位论文产柚苷酶菌侏的选育及柚子汁酶法脱苦工艺的研究 附能力不同，用聚乙烯毗咯烷酮可从葡萄柚汁中去除柚皮苷和柠碱，醋酸纤维能 吸附柠碱和柚皮苷，硅胶可吸附柠檬苦素。用吸附法脱除柑橘类果汁中的苦味， 主要有三方面的优点：1 处理过程带入到果计中的杂质少。2 处理温度低，可在常 温下进行脱苦。3 处理时间短，设备简单，成本低，可以再生。如活化硅酸镁采用 水冼或加热方法可以使之活化活化后能继续去除柠檬苦素和柚皮苷。 采用苯乙烯树脂和酚醛树脂为主的合成树脂进行接触处理除去苦味物质的结 果表明，合成树脂只选择吸附苦味物质而不吸附果汁成分，可用于柑橘果汁等的 生产之中。利用天然的木质吸附剂处理柑橘果汁可获得良好的脱苦效果，且廉价 易行。这类木质吸附剂有植物的渣、果实或豆科植物的外果壳、树皮等。寻找各 种有效的吸附剂除去柑橘中的苦味一直都是一个研究热点。 早在1 9 5 0 年m c l o l i o c h 使用活性炭从美国脐橙中吸附除去柠檬苦素，经处理后 果汁无苦味，但由于处理后的果汁p h 值上升，引起了一些化学反应，从而使产 品产生出了硫化物的气味 2 2 】。 n 2 0 世纪8 0 年代后期，澳大利亚、阿根廷、希腊、以色列、意大利、日本、 西班牙和美国已在生产上用树脂脱苦【2 3 】。c h a n d l e r 等【2 4 1 人研究凝胶型的醋酸纤维 素酯( c a ) 和醋酸丁酸纤维素酯( c a b ) 作吸附剂，脱除果汁中的柠碱，并已开始 工业应用。c h a n d l e r 及j o h n s c e 2 5 】对2 0 余种商品化树脂进行了筛选研究，结果表明： 吸附树脂x a d 7 可去除果汁中8 8 的柠碱：$ 8 6 1 的吸附效果最佳，能吸附果汁中 1 0 0 的柠碱；而$ 8 6 6 对柠碱更具有选择性，但吸附效果不女n s 8 6 1 。 在国内，利用吸附法去除柑桔汁中苦味物质的研究也有相关报道。万萍等【2 6 】 将带有苦味的柑橘汁经过澄清，用0 3 的活性炭，在室温下脱苦3 0m i n ，再通过离 心或过滤法分离活性炭，可将柑橘汁中的苦味基本脱除。程绍南等 2 7 1 采用国产 h b 8 0 1 吸附树脂( 加入量l o ，搅拌1 0m i n ) 对高橙、柑、柳橙进行脱苦，该树脂对 上述柑橘类果肉原汁的柚皮苷和柠碱的脱除率分别达6 1 6 1 0 0 和8 0 3 9 8 9 ，对全果原汁的脱除率分别达7 1 5 - - 9 0 9 和7 8 9 1 0 0 。但在柑橘汁的 脱苦处理中，若采用h b 8 0 1 吸附树脂，尚需进一步研究防止v c 损耗的措施。 19 9 7 年吴厚玖等【2 8 】人对国内大批树脂进行脱苦研究，筛选出三种国产树脂对 柚皮苷都具有很好的吸附和解吸性能，可用于柚皮苷的回收和纯化，以及柚汁和 葡萄柚汁的脱苦；2 0 0 1 年孙志高等 2 9 1 人研究发现选用的大孔吸附树脂对柠檬苦素 5 福建农林大学硕上学位论文产柚苷酶菌株的选育及柚子汁酶法脱苦工艺的研究 的脱除率均大于7 0 ，对柚皮苷的脱除率均大于8 0 。 吸附脱苦法具有简单易行、处理温度低、处理时间短等特点，但亦存在一些 缺陷，如一些吸附剂会吸附掉果汁中的营养成分，吸附剂易被饱和、阻塞，吸附 剂再生时间长等，今后需不断优化吸附剂的吸附性能及再生性能，以扩大其在规 模化生产中的应用。 2 6 酶法脱苦 虽然有吸附法、屏蔽法、超临界流体萃取脱苦和代谢脱苦法等多种方法可用 于芸香科水果的脱苦，但这些方法都存在脱苦效率不高、操作不方便等缺点。相 关研究表明：蜜柚及其他芸香科水果的主要苦味物质都能被某些微生物分泌的相 应的胞外水解酶水解成无苦味或苦味较弱的其它分子，因而可以利用酶法分解蜜 柚的苦味物质而实现脱苦。微生物酶法脱苦最具潜力，脱苦效率可达9 0 以上，苦 味基本消除【3 0 - 3 2 1 。 酶法脱苦主要是利用不同的酶分别作用于柠碱和柚皮苷，使之生成不含苦味的 物质。脱苦酶按作用对象可分为黄烷酮糖苷类化合物脱苦酶和柠檬苦素( 柠碱) 类 化合物脱苦酶。 作用于柠檬苦素类化合物的脱苦酶主要有柠酸a 环内酯脱氢酶、柠檬苦素环氧 酶、柠檬苦素醇脱氢酶、反式消除酶、乙酰基裂解酶等。利用节杆菌属和不动杆 菌属的去柠檬苦素酶使柠碱酸盐d 环内酯开环产生无苦味的柠碱衍生物的方法， 只是一种权宜之法，因为在果汁天然的酸性环境中( p h 3 0 3 5 ) ，d 环可以重新关 闭。但若使用柠碱酸盐脱氢酶打开d 环，则可以使柠碱酸盐d 一环内酯转化为无苦味 的1 7 脱氢柠碱酸盐a 环内酯，这是一种有效的脱苦方法，但此法还未用于生产， 且对此研究也很少【3 3 】。 作用于黄烷酮糖苷类化合物的脱苦酶主要是柚皮苷酶，它是由叶l 鼠李糖苷酶 和p d 葡萄糖苷酶组成。柚皮苷酶最早是h a l l 于1 9 3 8 年从芹菜种子中分离得到的， 目前国外已有商品柚苷酶供应。柚皮苷在此酶的作用下最终生成没有苦味的桔皮 素和葡萄糖。王鸿飞【3 4 】等利用柚皮苷酶对柑橘类果汁进行了脱苦研究，得出柚皮 苷酶对柑橘类果汁脱苦的适合工艺条件：柚皮苷酶用量为0 5g l 、果汁温度为 6 0 。c 、果汁p h4 、作用时间9 0m i n ，脱苦率达9 0 5 5 。 从目前的发展趋势来看，酶法脱苦具有专一性强，对柑橘果汁风味和营养成 6 福建农林大学硕士学位论文产柚苷酶菌株的选育及柚子汁酶法脱苫工艺的研究 分破坏少、效果好、成本低等特点，是柑橘类果汁脱苦最有潜力和应用价值的方 法 3 5 1 。 3 柚苷酶的研究现状 酶是一类具有生物活性的蛋白质，是一类生物催化剂【3 6 】。酶按分子组成分为 单纯酶和结合酶两大类，单纯酶仅由氨基酸组成，其催化活性取决于蛋白质结构， 结合酶由酶蛋白和辅助因子两部分组成，辅助因子可以是金属离子、有机化合物 或维生素类物质，这两部分对酶的催化活性非常重要，缺一不可。酶普遍存在于 生物界，人们可以采取适当的理化方法将酶从生物组织或细胞以及发酵液中提取 出来，加工成具有一定纯度标准的、具有酶的特性的生化制品，即酶制品。专用 于食品加工的酶制剂称为食品酶制剂。 3 1 柚苷酶的性质及作用机理 柚苷酶糖苷酶的一种，由b 鼠李糖苷酶和p 葡萄糖苷酶组成，能分解柚 皮苷得柚配质、葡萄糖和鼠李糖起到脱苦作用。其脱苦机理为：柚皮苷先经p 鼠 李糖苷酶水解为鼠李糖与普鲁宁( p r o n i n ，无苦味但有涩味) ；后者再由b 葡萄糖苷 酶水解成为全部无苦味、涩味的柚配质。柚苷酶可由黑曲霉、米曲霉、青霉等霉 菌产生。鼠李糖和各种鼠李糖苷均可诱导该酶的产生。葡萄糖对柚苷酶的活性有 抑制作用。 3 2 柚苷酶在柑橘果汁加工中的应用 柚苷酶能分解柚皮苷得柚配质、葡萄糖和鼠李糖起到脱苦作用。 汪钊【3 2 】等发现柚苷酶加酶量1 6 u 1 0 0 p p m 柚皮苷，p h 3 6 4 6 ，5 0 。c 作用2 3 h ，无核橘汁苦味基本消失。 王鸿飞等采用正交试验进行柚皮苷酶对胡柚汁脱苦工艺条件的优化，得出其 最适工艺条件为：柚皮苷酶用量为o 5 9 l ( 酶活力5 6 9 u g ) 、果汁温度为6 0 。c 、果 汁p h 为4 ，作用时间为9 0 m i n 。在优化后的工艺条件下，用柚皮苷酶对柑橘类果 汁进行脱苦具有良好的效果，脱苦率达9 0 5 5 。 赖崇德旧等利用自产柚苷酶对柑橘类果汁进行了脱苦性实验，发现4 0 。c 时其 最适的加酶量为2 8 2 4 u m l ，最适p h 值为3 5 - 4 5 ，最少作用时间6 0 m i n ，脱苦 率可达9 0 以上。 7 福建农林大学硕士学位论文产柚苷酶菌株的选育及柚子汁酶法脱苦工艺的研究 酶法脱苦具有操作简单、脱苦条件温和、脱苦效率高、便于应用等优点，受到 广大柑橘类果汁生产厂家的青睐。 3 3 柚苷酶生产中存在的问题 虽然国内外对利用酶法脱除芸香科水果苦味的相关研究报道较多，也分离筛选 得到了一些柚苷酶的产生菌株，并对用柚苷酶脱除芸香科水果苦味进行了大量研 究，但就整体研究水平而言，国内外对于酶法脱除芸香科水果，尤其是柚汁苦味 的研究还处于基础阶段，对于脱苦酶的生产工艺、酶制剂学、酶动力学的研究还 很缺乏。国外已有商品化的柚苷酶产品，但生产成本及应用成本很高，即使用于含 苦味较弱的橙汁的脱苦其成本已达到1 2 0 0 元吨橙汁，限制了酶法脱苦的实用性。 因此，高产菌株的筛选是当务之急。 4 柚苷酶产生菌的育种技术及现状 4 1 黑曲霉的菌种特征 柚苷酶可由黑曲霉、米曲霉、青霉等霉菌产生，目前国内研究的基本都是黑曲 霉，育种方法均为传统的自然筛选加诱变。由于柚苷酶不是单一酶，因此还没有 基因工程菌方面的研究。 黑曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) 半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，曲霉属 真菌中的一个常见种。黑曲霉菌落有绒毛状、絮状、等。菌落大小依种而异，有 的能扩展到整个固体培养基，有的有一定局限性( 直径1 2 c m 或更小) 。 显微镜下观察，黑曲霉分生孢子梗自基质中伸出，直径1 5 - 2 0 p m ，长约1 3 m m ， 壁厚而光滑。顶部形成球形顶囊，其上全面覆盖一层梗基和一层小梗，小梗上长 有成串褐黑色的球状分生孢子。孢子直径2 5 - 4 o g m 。分生孢子头球状，直径7 0 0 8 0 0 9 m ，褐黑色。菌落蔓延迅速，初为白色，后变成鲜黄色直至黑色厚绒状。背面 无色或中央略带黄褐色。有时在新分离的菌株中能找到白色、圆形、直径约l m m 的菌核。分生孢子头褐黑色放射状，分生孢子梗长短不一。顶囊球形，双层小梗， 分生孢子褐色球形。 4 2 柚苷酶产生菌育种技术的研究 诱变育种是指用物理、化学因素诱导植物的遗传特性发生变异，再从变异群体 中选择符合人们某种要求的单株，进而培育成新的品种或种质的育种方法。它是 8 福建农林大学硕士学位论文 产柚苷酶菌株的选育及柚了汁酶法脱苦工艺的研究 继选择育种和杂交育种之后发展起来的一项现代育种技术。诱发突变的物理因素 主要指某些射线，如仅射线、d 射线、丫射线、x 射线和中子流等；化学诱变剂主 要指某些亚硝酸盐、烷化剂，碱基类似物，抗生素等化学药物。 诱变育种具有速度快、收效大、方法简单等特点，是获得优良菌株的常用手段。 但由于常规的物理、化学等方法随机性较大，所以诱变育种的工作量非常大。定 向诱变和体外诱变【3 8 】等新兴的诱变方法的不断发展和完善，将有望解决常规育种 中存在的问题。 优良菌株的筛选是菌种诱变后的关联步骤，也是决定优良菌株选育效率的关键 步骤。微生物细胞群体经过诱变处理后，突变发生的频率虽比自发突变的频率高 的多，但是在整个细胞的群体中，其频率仍很低，即发生变异的细胞绝对数很低。 d n a 链上突变的发生是随机的，所需要的突变株出现的频率就更低，寻找所需的 突变型犹如“大海捞针 。因此合理的筛选程序与方法在黑曲霉菌种的选育上非常 重要。诱变是随机的，但选择是定向的。诱变后需通过正确、灵敏、快速的筛选 检测方法，从大量未变和负变的群体中把仍然是很少量的正向突变挑选出来，进 行大规模淘汰，以提高筛选效率。因此，在进行菌种选育研究时突破常规的诱变 随机筛选方法，建立抗药性致死突变标志诱变筛选模型，根据柚苷酶产生菌抗性基 因与柚苷酶合成的结构基因和调控基因紧密结合连锁【3 9 】而易发生共突变的原理， 选育高产菌株。本实验通过这种育种途径不仅可以得到高产菌株，而且可以使高频 率获得高产菌株成为可能，为提高柚苷酶产量提供一个方便有效地方法。 4 3 柚苷酶产生菌育种现状 虽然国内外对利用酶法脱除芸香科水果苦味的相关研究报道较多，也分离筛 选得到了一些柚苷酶的产生菌株，并对用柚苷酶脱除芸香科水果苦味进行了大量 研究，但就整体研究水平而言，国内外对于酶法脱除芸香科水果，尤其是柚汁苦 味的研究还处于基础阶段，对于脱苦酶的生产工艺、酶制剂学、酶动力学的研究 还很缺乏。目前国外虽然已有商品化的柚苷酶产品，但生产成本及应用成本很高， 即使用于含苦味较弱的橙汁的脱苦其成本已达至l j l 2 0 0 元屯橙汁，限制了酶法脱苦 的实用性。因此，适合于工业生产的高产菌株的筛选是当务之急。 胡奎等m 】研究设计和试验了1 种新的柚苷酶筛选模型，在堆积过腐坏柑桔的土 壤中分离了多株产柚苷酶菌株。其中s n 0 1 产酶最高，摇瓶产酶达2 9 1 u m l ，初步 9 福建农林大学硕士学位论文产柚昔酶菌株的选育及柚子汁酶法脱苦工艺的研究 鉴定为黑曲霉。经n t g 诱变、筛选，育成菌株s n 9 0 ，其摇瓶产酶可达1 2 8 2 u m l 。 研究发现菌株s n 9 0 的产酶过程需要柚苷诱导并对葡萄糖浓度不敏感，为低分解代 谢物阻遏型突变株，因而该菌株具有较好的工业应用潜力。 赖崇德等3 7 1 设计试验了一种新的柚苷酶产生菌的选育模型，以橘皮粉为唯一 的碳和氮源，通过富集培养的方式从腐烂的橘皮上筛选出一株高产柚苷酶生产菌 株a 1 6 6 。对该菌株进行摇瓶发酵测定酶活力达到9 5 5 6 u m l 。通过对该菌株的形态 特征、培养特征的观察，对照真菌鉴定手册初步判定该菌株为黑曲霉( a s p e r g i l l u s n i g e e r ) 。 汪钊等筛选到黑曲霉产柚苷酶菌株，经优化得到初始最适p h4 0 - - - 5 0 ，最 适无机盐配比：c a c l 2 0 1 ，z n s 0 4 0 1 ，m g s 0 4 7 h 2 0 0 5 ，k z h p 0 4 0 1 ，需 氧量较大，产酶最高峰11 5 h ，自然筛选酶活力达3 2 0 u m l ，d e s 诱变后菌株z g 8 6 酶活力达1 1 2 4 u m l 。他们还进行了该菌株的固体发酵研究，发现较佳的固体发酵 配方为黄豆饼粉1 ：豆渣1 5 2 0 ，培养初始水量控制在5 2 6 5 ，发酵周期从 液体深层发酵法的1 1 5h 缩短至t j 6 0 h 左右，单位发酵培养基产酶量由1 1 2 4 u 增加到 1 3 0 0 0 u ，提高1 0 倍以上，可以省去昂贵的深层发酵设备，酶的提取方便，生产成 本降低，可以工业化生产【4 2 】。 梁新乐等【4 3 】通过筛选得到一株能向胞外分泌柚苷酶的黑曲霉菌株h z g 7 。实 验结果表明：在3 0 ，1 5 0 r m i n ，p h 5 0 的条件下培养1 0 8 h ，菌株分泌的柚苷酶活 力可达到6 3 5 u m l 。利用此酶在4 0 。c ，p h4 0 的条件下对柑桔汁进行脱苦处理，其 柚皮苷含量下降达7 1 以上，苦味基本消失。 卢建明等【卅在沙田柚树林下土壤和沙田柚皮腐烂液中分离了多株产柚苷酶菌 株，其中a 0 9 产酶最高，摇瓶产酶达2 6 3 u m l ，初步确定为黑曲霉。研究发现菌株 a 0 9 的产酶过程需要柚苷诱导，该菌株具有较好的选育潜力。 上述报道中一般用柚皮苷( 通过添加柚皮苷或桔皮粉) 诱导柚苷酶的产生。从理 论上说，用底物诱导酶的生产容易由于底物被分解而失去作用。有文献指出鼠李 糖和鼠李糖苷，即酶的作用产物，也能诱导柚苷酶的产生【4 5 1 ，这可能可以克服使 用柚皮苷的缺点。最好的诱导物应该是底物类似物，但没有发现相关的应用报道。 5 本论文研究的目的和意义 本课题利用一种新的柚苷酶产生菌的筛选模型，即以桔皮粉为唯一碳源、氮源 l o 福建农林大学硕士学位论文产柚昔酶菌株的选育及柚子汁酶法脱苫工艺的研究 的平板，以鼠李糖为产酶诱导剂，从堆积腐烂的柚子皮上筛选出一株柚苷酶生产 菌株。通过对该菌株诱变育种，筛选得到了一株产柚苷酶活力较高的突变菌株。 同时，对产柚苷酶菌株摇瓶发酵条件及柚苷酶动力学进行了系统的研究。开发出 适应柚子汁脱苦的液体柚苷酶制剂，实现柚子汁酶法高效脱苦，突破了柚子深加 工技术瓶颈。 虽然国内外对利用酶法脱除芸香科水果苦味的相关研究报导较多，也分离筛选 得到了一些柚苷酶的产生菌株，并对用柚苷酶脱除芸香科水果苦味进行了大量研 究，但就整体研究水平而言，国内外对于酶法脱除芸香科水果，尤其是蜜柚苦味 的研究还处于基础阶段。培育出适合于工业生产的高产柚苷酶菌株，制备出高产、 高效的酶制剂，对柚苷酶动力学进行系统的研究有助于降低酶的生产成本、提高 酶法脱苦的效果。本课题研究成果将有利于改进柚苷酶菌株筛选模型，为大工作 量的菌种选育提供理论依据。培育出一株新的柚苷酶产生菌株，利用酶法脱苦降 低柚子汁脱苦的成本，提高脱苦效率，更有效的解决柚子汁i j n - v 过程中产生的“后 苦味 ，对福建柚子) j h - r - 业的发展起到重要的促进作用。 福建农林大学硕士学位论文产柚苷酶菌株的选育及柚子汁酶法脱苫工艺的研究 第二章柚苷酶产生菌的分离筛选及鉴定 摘要：本文利用一种新的柚苷酶产生菌的筛选模型，即利用桔皮粉平板筛选方法， 以桔皮粉为唯一的碳、氮源，从堆积腐烂的柚子皮上筛选出一株柚苷酶生产菌株 a 1 3 。对该菌株进行摇瓶发酵测定酶活力达到3 6 5 3 1 u m l 。通过对该菌株的形态 特征、培养特征的观察，对照真菌鉴定手册初步判定该菌株为黑曲霉( a s p e r g i l l u s n i g e o 。 关键词：柚苷酶；透明圈；黑曲霉：液体发酵；菌种鉴定 柚子加工过程中会出现明显苦味，主要是由于苦味的柚皮苷及柠檬苦素的释 放。其中柚皮苷是苦味的主要成分。目前消除柚汁等柑橘制品中苦味的主要方法 有酶法、吸附法及屏蔽法，其中酶法最具潜力。分解柚皮苷的柚苷酶用于橙汁、 桔汁的工业化生产国外早有报道，国内也有相应的研究，但尚未应用于生产，主 要原因是缺乏适合于工业生产的高产柚苷酶菌株。本实验从堆积腐烂的柚子皮上 筛选出一株高产柚苷酶的菌株，为进一步的诱变育种奠定良好的基础。 1 材料与方法 1 1 材料 1 1 1 主要原辅料 柚子：平和珀溪蜜柚，九成熟，色泽光鲜，个体均匀，超市购买。 1 1 2 主要试剂 柚皮苷( n a r i n g i n ) ，含量9 8 ，购于陕西慧科植物开发有限公司； 桔皮粉：粉碎机研磨，过6 0 目筛，购于浙江上虞市万事达麦业有限公司； 脱脂豆饼粉，饲料店购买； 豆渣，自制，含水量3 0 - - 4 0 ； 一缩二乙二醇，c p ； 1 2 福建农林大学硕士学位论文产柚苷酶菌株的选育及柚子汁酶法脱苫工艺的研究 d a v i s 柚苷显色液( d e s ) 1 4 6 ，成分为一缩二乙二醇：l m o l l n a o h = 9 ：1 ；( 它 能与柚皮苷、洋李苷起呈色反应( 黄色) ，而几乎不与水解终产物柚配质起呈色 反应) ； 其他试剂为国产常用a r 级试剂。 1 1 3 培养基的配制 1 1 3 1 斜面培养基( 改进察氏培养基) m g s 0 4 7 h 2 05 9 ，桔皮粉1 0 9 ，k 2 h p 0 45 9 ，k c l5 9 ，f e s 0 4 5 h 2 0o 1 9 ，琼脂 2 0 9 ，四环素片适量，蒸馏水1 0 0 0 m l ，p h 值自然，o 1 m p a 蒸汽灭菌2 0 m i n 。 1 1 3 2 平板筛选培养基 桔皮粉1 0 9 ，在水中煮沸3 0m i n 后用纱布过滤，其余成分同斜面培养基。 1 1 3 3 种子培养基 豆渣( 含水3 0 - - 4 0 ) 1 0 0 9 ，脱脂豆饼粉4 0 9 ，鼠李糖0 2 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l ， 0 1 m p a 蒸汽灭菌2 0 m i n 。 1 1 3 4 产酶摇瓶发酵培养基 成分同种子培养基相同，3 0 0 m l 三角瓶装量3 0 m l 。 1 2 主要仪器 m 7 0 0 微波炉：广东美的微波炉制造有限公司； t g l 1 1 6 c 台式离心机：上海安亭科学仪器厂； s h a c 型恒温振荡器：常州国华电器有限公司： h h 6 数显恒温水浴锅：常州国华电器有限公司； 1 0 1 0 型电热鼓风干燥箱：上海阳光实验有限公司； h q 6 0 型漩涡混合器：北方同正生物技术发展公司； p h s 3 c 型精密p h 计：上海精密科学仪器有限公司； y x q g c z 型电热式蒸汽消毒器：山东章店新华仪器厂； h v - 2 0 0 0 紫外可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司； t d l 5 型低速台式大容量离心机：上海安亭科学仪器厂； h p x 9 0 8 2m e 数显电热培养箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂； p l 2 0 2 s 1 0 0 型精密分析天平：梅特勒一拖利多仪器( 上海) 有限公司。 1 3 福建农林大学硕士学位论文产柚苷酶菌株的选育及柚子汁酶法脱苦工