（食品科学专业论文）分泌涩柿单宁酶的微生物筛选及其酶特性的研究.pdf

分泌涩柿单宁酶的微生物筛选及其酶特性的研究 栾丽杰 摘要柿( d i o s p y r o s k a k il f ) 是一种营养成分丰富的水果。含有糖类、人体 必须的氨基酸、多种微量元素、维生素、有机酸、黄酮类等。我国柿资源丰富， 栽培面积达2 9 3 8 公顷，年总产量为3 4 6 9 4 千吨，占世界总产量的7 0 以上。我 国生产的柿约有8 0 是涩柿，脱涩后柿果在加工过程中或加工后出现的返涩现象， 至今在生产实践中仍没有科学、有效的解决方法，严重制约了涩柿加工的工业化 生产和产业化发展。传统的脱涩方法涩柿脱涩后并非单宁物质消失，只是因为单 宁溶解度降低，与口腔中蛋白质的结合能力降低，人感觉不到涩味。本论文以解 决涩柿返涩问题为出发点，寻找可以分泌单宁酶的微生物，分解涩柿单宁，从根 本上解决涩柿返涩问题。这对推动柿产业发展、增加柿果的附加值，提高经济效 益有重要的实践指导意义。 本文从创造模拟环境入手，以涩柿作为微生物生长的微环境，让微生物自然 生长，利用平板划线法分离微生物，获得纯种菌株。通过菌株在溴酚兰培养基中 的变色情况、c o d 去除率以及菌株对单宁耐受力，筛选出目标菌株。通过对菌落 形态观察和水浸片的观察，初步鉴定目标菌株为黑曲霉( 彳n i g e r ) 。 对目标菌株的原生质体进行紫外诱变，测定诱变菌株产酶能力及传代稳定性， 筛选出试验菌株。通过单因素试验和l ( 3 ”) 正交试验，研究了培养时间、温度、 初始p h 值、葡萄糖浓度、接种量、涩柿单宁含量、容器装液量等因素，确定该诱 变菌株产酶的最优工艺参数。最后对黑曲霉单宁酶的特性进行探讨。研究结果如 下： ( 1 ) 2 8 ，1 6 0 r r a i n 摇床中，黑曲霉恒温培养7 2 h 可获得较大生物量和最高 产酶能力。 ( 2 ) 1 6 0 r m i n 摇床中恒温培养7 2 h ，黑曲霉产酶的适宜温度为2 8 3 2 ，其 中3 0 时黑曲霉所产单宁酶活力最高为1 4 2 9 u m l 。 ( 3 ) 3 0 ，1 6 0 r r a i n 摇床中恒温培养7 2 h ，黑曲霉产单宁酶的适宜涩柿单宁 浓度为2 5 。涩柿单宁浓度为4 时，可获得最大酶活1 5 6 7 u m l 。 ( 4 ) 3 0 ，1 6 0 r m i n 摇床中恒温培养7 2 h ，黑曲霉生在p h 值为5 7 的条件 下生长较好，其所分泌单宁酶活力较高，p h 值为5 时，黑曲霉生物量最大，为 3 5 6 8 m g ：p h 值为6 时，单宁酶活力最高，为1 6 0 3 u m l 。 ( 5 ) 3 0 ，1 6 0 r m i n 摇床中恒温培养7 2 h ，发酵液中葡萄糖浓度为0 5 1 0 时，黑曲霉发酵产单宁酶能力较高，葡萄糖浓度为0 8 黑曲霉产酶能力最高。 ( 6 ) 3 0 ，1 6 0 r r a i n 摇床中恒温培养7 2 h ，接种量为1 5 2 5 时，黑曲霉 所产酶能力较高；接种量为2 时，黑曲霉产酶能力最高。 ( 7 ) 3 0 1 2 ，1 6 0 r m i n 摇床中恒温培养7 2 h ，2 5 0 m l 容量瓶中装液量为4 0 6 0 m l 适宜黑曲霉发酵产生单宁酶，装液量为5 0 m l 时黑曲霉所分泌单宁酶活力最高。 ( 8 ) 正交试验得出，各因素及其交互作用对试验指标影响的主一次顺序为： 培养时间，培养温度，发酵液量，单宁含量，葡萄糖含量，发酵液初始p h 值，接 种量f 黑曲霉发酵产单宁酶最优组合为培养时间7 2 h ，培养温度2 8 ，发酵液量 4 0 m l ，涩柿单宁含量3 ，葡萄糖含量0 8 ，发酵液初始p h 值7 0 ，接种量2 5 。 ( 9 ) 动力学研究表明，以p g 为底物时，米氏方程k m = 0 5 9 5 m m o l l ，v m = 0 3 6 3 m o f l m i n 。 ( 1 0 ) 黑曲霉单宁酶催化分解涩柿单宁的适宜p h 值范围为4 o 6 0 ，最适p h 值为5 o ；单宁酶在p h 值为5 7 的体系中活性较为稳定。 ( 1 1 ) 单宁酶作用的适宜温度为5 0 6 0 ，最适反应温度为5 5 ；单宁酶活 性稳定的温度范围为6 0 。 ( 1 2 ) k + 、m n 2 + 对单宁酶活力无抑制作用，c a ”影响较小，m 9 2 + 可使单宁酶 活力降低，c u 2 + 、z l l 2 + 、f c “、a i ”，c 0 2 + 对单宁酶均有显著抑制作用。 关键词：涩柿单宁黑曲霉单宁酶 n t h es e l e c to ft h em i c r o b ee x c r e t i n gt a n n a s ea n d t h es t u d yo ft h et a n n a s ep r o p e r t yp r o d u c e db yi t l u a nl i j i 8 a b s t r a c tt h ep e r s i m m o ni saf r u i tt h a ti sr i c hi nn u t r i t i o u sc o m p o n e n ta n dc o n t a i n s m a n yk i n d so fp h y s i o l o g i c a l l ya c t i v ef a c t o ra n df o o dv a l o ei sv e r yh i g h i tc o n t a i n s s u g a r p r o t e i n ，n e c e s s a r ya m i n oa c i do fh u m a nb o d y , a n dv a r i o u sm i c r o e l e m e n t s ， v i t a m i n ，o r g a n i ca c i d s ，f l a v o n e se t c t h ep e r s i m m o nr e s o u r c e si no u rc o u n t r yi sv e r y r i c h , t h ep l a n t a t i o na r e ao fc h i n e s ep e r s i m m o nh a si n c r e a s e dm o r et h a n2 9 3 8h a , w i t h a na n n u a lo u t p u to f3 4 7m i l l i o nt a c c o u n t i n gf o ro v e r7 0 o ft h et o t a lw o r l do u t p u t i n o u rc o u n t r y , a p p r o x i m a t e l yo v e r8 0 o fp e r s i m m o n sa r et h ea s t r i n g e n tp e r s i m m o n s 。t h e p e r s i m m o nf r u i t t h a ti s n t a s t r i n g e n tw i l la p p e a r st h ep h e n o m e n o nt h a t i tr e t u r n s a s t r i n g e n ta f t e rt h ep r o c e s s i n gp r o c e s so ri nt h ep r o c e s s i n g u n t i ln o w i td o e sn o th a v e t h ee f f e c t i v em e t h o dt os o l v et h ep r o b l e mi nt h ep r o d u c i n gp r a c t i c ea n di th a ss e r i o u s l y r e s t r i c t e dt h ed e v e l o p m e n to fi n d u s t r i a l i z a t i o ni np e r s i m m o np r o c e s s i n g t h et r a d i t i o nw a y st h a tr e m o v ea s t r i n g e n c yo fa s t r i n g e n tp e r s i m m o nd o e s n tm a k e t h et a n n i nv a n i s h e d ，o n l yb e c a u s et h es o l u b i l i t yo ft a n n i nr e d u c e s ，a n dt h ec o m b i n i n g a b i l i t yo ft h et a n n i nw i t ht h ep r o t e i ni nt h eo r a lr e d u c e s ，t h e nt h ep e r s o nc a n tf e e lt h e a s t r i n g e n c y 1 t h a st h e i m p o r t a n tp r a c t i c e i n s t r u c t i o n s i g n i f i c a n c e t o i m p e l s t h e d e v e l o p m e n to fp e r s i m m o ni n d u s t r ya n di n c r e a s et h ep e r s i m m o nf r u i t s a t t a c h m e n t v a l u e ，e n h a n c e st h ee c o n o m i ce f f i c i e n c y t h i sp a p c rm a d et h ea s t r i n g e n tp e r s i m m o na st h em i c r oe n v i r o n m e n t ，l e tt h e m i c r o o r g a n i s mg r o wn a t u r a l l y , s c o r i n gt h el o n g - b a s eo nt h ec u l t u r em e d i u mp l a t et o s e p a r a t et h em i c r o o r g a n i s m ，o b t a i n i n gt h ep u r e b r e ds t r a i n b yt h ec u l t u r em e d i u mw h i c h c o n t a i n sb r o m o p h e n o lb l u ea n dm a k i n gu s eo fc o dt a k i n go f fr a t ea sai n d e xt o m e a s u r et h e a b i l i t y o fam i c r o o r g a n i s m s e c r e t i n gt a n n a s e ，f o u r s t r a i n sw e r e o b t a i n e d n e nt o l e r a n c et ot h et a n n i nw a ss t u d i e s i no r d e rt os e l e c t et h eb a c t e r i a ls t r a i n b e i n ga b l et ob e a rh i g ht a n n i nc o n c e n t r a t i o na n dt op r o d u c i n gm o r et a n n a s e a f t e r i d e n t i f y e d , i tw a sp r o v e dt h a tt h es t r a i ni s a s p e r g i l l u sn i g e r p r e p a r i n gt h ep r o t o p l a s to ft h et a r g e tb a c t e r i a ls t r a i n , t h a tw a sd e a l e dw i t h u l t r a v i o l e tl i g h t c h o o s i n gf o u rm u t a t i n gs t r a i n st h a tt h et a n n a s ep r o d u c e db yt h e mh a s h i g h e ra c t i v i t yt h a nt h eo r i g i n a l s t r a i n a n dt h em u t a t i n gs t r a i n sw e r ep r o v e dt h a t i s u b s t r a i n sh a di n h e r i t a n c es t a b i l i t y t h es t r a i nw a ss e l e c t e dt h a tc a np r o d u c et a u n a s e w h o s e a c t i v i t yw a s3 5 6 h i g l l e rt h a nt h o s eo fo r i g i n a ls t r a i n s t h ea n i g e rw a sc u l t i v a t e di nf l a s ko nr o t a r ys h a k e r , a n dt h ef e r m e n t a t i o n t e c h n o l o g i c a lp a r a m e t e rt ot h ep r o d u c ee n z y m ew a ss t u d i e d i tc o n c l u d e dc u l t i v a t v i n g t i m e ，t h et e m p e r a t u r e ，i n i t i a lp h ，g l u c o t h i c k n e s s ，i n o c u l a t i n ga m o u n t s ，t a n n i n c o n c e n t r a t i o na n dv o l u m eo f t h ef e r m e n t a t i o nl i q u i d a d o p t i n g1 - 2 7 ( 3 ”) o r t h o g o n a l i t ye x p e r i m e n td e s i g n ，t h ea b o v es e v e nf a c t o r sw e r e o p t i m i z e d p r o p e r t i e so ft a n n a s es e c r e t e db y a s p e r g i l l u sn i g e rw a ss t u d i e s ，t h ek i n a n d t h ev mv a l u ei nm i c h a e l i s m e n t e np a r a m e t e r st h r o u g ht h ec u r v eo fl i n e w e a r - b u r kw a s a s c e r t a i n e d ，t h eo p t i m u mp ha n dt e m p e r a t u r e ，t h es t a b i l i t yo ft a n n a s e t op ha n d t e r n p c r a t u r e ，a sw e l la st h ei m p a c to fi o n so nt h et a n n a s e t h er e s u l t sa sf o l l o w s ： ( 1 ) i ti sf o r7 2h o u r st h a ta s p e r g i l l u sn i g e rc a l lo b t a i nb i g g e rb i o m a s sa n dt h e m a x i m a le n z y m e a c t i v i t yi ns h a k i n gf l a s k ( 1 6 0 r m i n ) ( 2 ) w i t hs h a k i n g ( 1 6 0 r m i n ) f o r7 2 h i ti s2 8 3 2 t h a ti sa v a i l a b l ef o ra s p e r g i l l u s n i g e rt op r o d u c tt a n n a s e a t3 0 t h et a n n a s ea c t i v i t yi st h eh i g h e s t ，1 4 2 9 u m l ( 3 ) w i t hs h a k i n g ( 1 6 0 r m i n ) a t3 0 f o r7 2 h ，t h eo p t i m a lt a n n i nc o n c e n t r a t i o ni s 2 - 5 w h e nt a n n i nt h i c k n e s si s4 i tm a y g a i nm a x i m a le n z y m ea c t i v i t y ：1 5 6 7u m l ( 4 ) w i t hs h a k i n g ( 1 6 0 r m i n ) a t3 0 ( 2f o r7 2 h ，w h e np hi s5 - 7 ，a s p e r g i l l u sn i g e r g r o w sw e l la n de n z y m ev i g o ri sh i g h e r w h e np hi s5 ，t h eb i o m a s si sb i g g e s t , 3 5 6 8 m g ； w h e np hi s6 ，t h ee n z y m ev i g o ri sh i g h e s t ，1 6 0 - 3 u m l ( 5 ) w i t hs h a k i n g ( 1 6 0 r m i n ) a t3 0 cf o r7 2 h ，g i u c o s ec o n c e n t r a t i o nr a n g ef r o m0 5 t o1 0 ，t h e a n i g e rc a np r o d u c em o r et a n n a s e w h e nt h e u c o s ec o n c e n t r a t i o ni s0 8 e n z y m ev i g o ri sh i g h e s t ( 6 ) w i t hs h a k i n g ( 1 6 0 r r a i n ) a t3 0 cf o r7 2 h ，t h eo p t i m a li n o c u l a t i n ga m o u n ti s 1 5 一2 5 w h i l ei ti s2 t h ee n z y m ev i g o ri sh i g h e s t ( 7 ) w i t hs h a k i n g ( 1 6 0 r m i n ) a t3 0 cf o r7 2 h ，a d d i n g4 0 6 0 m lf e r m e n t a t i o n l i q u i dt o2 5 0 m lf l a s kc a no b t a i nh i g h e rt a n n a s ea c t i v i t y , w h e ni t i s5 0 m lt h ee n z y m e v i g o ri sh i g h e s t ( 8 ) t h r o u g l lt h eo r t h o g o n a le x p e r i m e n t ，w em a yc o n c l u d et h a tt h eo r d e rf r o mp r i o r f a c t o rt oi n f e r i o rf a c t o r si st h et i m e ，t h et e m p e r a t u r et h ev o l u m e ，t a n n i nc o n c e n t r a t i o n ， s u g a rt h i c k n e s s ，i n i t i a lp h ，i n o c u l a t i n ga m o u n t t h eo p t i m u ma s s e m b l i n gw a s c u l t u r e t i m e7 2h o u r s ，c u l t u r et e m p e r a t u r e2 8 ，v o l u m eo fc u l t u r em e d i u m4 0 m lt a n n i n c o n c e n t r a t i o n3 ，s u g a rt h i c k n e s s0 8 ，i n i t i a lp h7 o i n o c u l a t i n ga m o u n t2 5 i v ( 9 ) w h e np gs e l e c t e da st h es u b s t r a t e ，t h er e s e a r c ho fd y n a m i c sj n d i c a t et h a tt h e k i n = 0 5 9 5 m m o l l , v m = o 3 6 3 m o l l m i n ( 1 0 ) n eo p t i m a lp hv a l u eo ft a n n a s ei s6 0 i nt h ep hr a n g eo f5 0 7 o ，t h e t a n n a s ea c t i v i t yi ss t a b i l e ( 1 1 ) t h em o s ts u i t a b l er e a c t i o nt e m p e r a t u r ei s5 5 t h et a n n a s ca c t i v i t yr e m a i n s m a j o r i t yw h e nt e m p e r a t u r ei sl o w e rt h a no re q u a l6 0 ( 1 2 ) e f f e c to fm e n t a l i 0 1 1o nt a n n a s ea c t i v i t yi st h a t ：c a 2 + h a sl i t t l ee f f e c to i lt a n n a s e a c t i v f l y ；w h i l ea 1 3 + ，s n 2 * a n dm n 2 + h a v e1 1 0e f f e c to ni t ；c u 2 + 、z l l 2 + 、f c “、3 + ，c d + c o u l di n h i b i t e dt h ee n z y m ea c t i v i t yo b v i o u s l y k e y w o r d s ：a s t r i n g e n tp e r s i m m o n t a n n i n a s p e r g i l l u sn i g e r t a n i l a g e v 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。尽我所知，除文中已经注明引用的内容外，论文中不包含其他个人 已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得陕西师范大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均 已在文中作了明确说明并表示谢意。 作者签名：羹直b 盘日期：兰! 1 2 ：垒兰呈 学位论文使用授权声明 本人同意研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属陕西师范大 学。本人保证毕业离校后，发表本论文或使用本论文成果时署名单位仍为陕西 师范大学。学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其它指定机构送交论文 的电子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进 入学校图书馆、院系资料室被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索；有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。 文献综述 1 柿概述 1 1 柿及柿树概述 柿( d i o s p y r o sk a k l f ) ，柿属柿树科( e b e n a c e a e ) 柿属( d i o s p y r o sk a k il ) 植物。柿原产于我国，广泛生长在我国北方及黄河流域，在我国有3 0 0 0 多年的栽 培历史l l , z l ，礼记中已有柿的记载，柿为灌木或乔木，多数分布在热带或亚热带， 亚洲、欧洲、北美洲等地都有栽培，温带分布甚少。柿品种繁多达2 0 0 多个。以 地区分，可分为南型柿和北型柿两大类。北型柿耐寒耐干、皮薄色浅；南型柿不 耐干旱，皮薄色浓。以果实形状，可分为长柿、圆柿、扁柿、方柿、四棱柿、八 棱柿、盘柿、鸡心柿、牛心柿、瓶柿等。依果实大小，可分为极大( 单果重2 0 0 9 以上) 、大果( 单果重1 5 0 - - 2 0 0 9 ) 、中果( 单果重7 5 1 5 0 9 ) 、小果( 单果重7 5 9 以 下) 。按成熟期分，可分为早熟、中熟、晚熟p j 。根据成熟时果实中可溶性单宁的 含量是否大于o 5 ，分为涩柿和甜柿1 4 】，具体又可分为完全涩柿( p o l l i n a t i o nc o n t a n t a s t r i n g e n t ：p c a ) 、不完全涩柿( p o l l i n a t i o nv a r i a n ta s t r i n g e n t ：p v a ) 、不完全甜柿 ( p o l l i n a t i o nv a r i a n tn o a s t r i n g e n t ：p v n a ) 和完全甜柿( p o l l i n a t i o nc o n t a n t n o a s t d n g c n t ：p c n a ) 。涩柿有磨盘柿、莲花柿、大红袍、绵柿、牛角柿、7 月早、 镜面柿、元宵柿、富平尖柿、扁花柿；甜柿种类有罗田柿、富有。完全甜柿主要 栽培于日本、中国和美国；涩柿主要分布于中国、朝鲜、韩国等地【5 ，6 ”。 我国柿树主要分布于山东、山西、河南、河北和陕西五省，栽培面积占全国 的8 0 - - 9 0 。我国柿资源丰富，其栽培面积和产量均居世界第一，尤其是近年来， 随着国家退耕还林政策的实施，柿树是首选的经济林树种，其种植面积和产量都 在大幅度增加。据2 0 0 5 年e a o 统计，世界柿收获面积3 5 8 4 公顷，总产量2 4 1 8 6 千公吨，其中我国的栽培面积2 9 3 8 公顷，占世界栽培面积的8 l ，总产量为1 7 3 4 7 千公吨，占世界总产量的7 0 以上。近几年我国柿子生产发展较快，2 0 0 3 年，产 柿五大省区为广西、河北、山东、陕西、江西。自1 9 7 5 年以来，台湾柿子发展速 度较快，经济栽培面积逐年增加，柿树成为台湾新兴的重要经济果树之一。 我国柿树品种有8 0 0 多种，原产柿品种几乎都是涩柿，仅在湖北罗田、麻城 为中心的大别山山区有完全甜柿品种一罗田柿的分布。我国著名的柿品种有：( 1 ) 宝华甜柿。湖北省罗田县地方品种，完全甜柿，果实圆形，果顶广平微凹，橙红 色，果大，单果重1 8 0 - 2 5 0 9 ，偶有核。( 2 ) 牛心柿。原产陕西关中西部，果约重 1 8 0 9 ，方心脏型，橙红色，无核。( 3 ) 绵瓤柿。果中等大，单果重约1 3 5 9 ，短圆 锥形，橙红色，肉质绵，汁少，昧甜，偶有核。( 4 ) 磨盘柿。果极大，重2 3 0 9 ， 磨盘形，橙黄色，汁特多，味甜，无核。( 5 ) 胎里红1 8 j 。果实扁圆形，平均单果重 9 7 9 ，味甜，易脱涩。未成熟时外表发绿、果内部发红。( 6 ) 永定红柿。福建省地 方优良品种。( 7 ) 松坪无核柿。果实扁方形，平均单果重1 6 3 9 ，无核。( 8 ) 千岛 无核柿。果实圆锥形，平均单果重1 7 0 9 ，品质上等。( 9 ) 干帽盔柿。果中等大， 平均单果重1 2 0 9 ，心脏形，浅橙红色，髓少，核少，干绵稍甜。( 1 0 ) 小萼子柿。 果中等大，单果约重l o o g ，心脏形，浅橙红色，肉质细腻，纤维少，汁多味甜， 多数无核。( 1 1 ) 甜宝盖柿。果极大，汁极多，肉座形，橙红色，平均单果重2 0 5 9 ， 有核。( 1 2 ) 三代斤柿。果实特大，方锤形，单果约重3 5 0 9 ，最大达5 0 0 9 以上， 无核，风味浓甜，春、夏、秋三季均有开花结果现象。( 1 3 ) 博爱八月黄。果中等 大，约重1 3 0 9 ，扁方形，橙红色。味甜，汁少，多数无核。( 1 4 ) 橘蜜柿。果小， 约重8 0 9 ，扁圆形，橘红色。成花瓣状。果肉有黑斑，味甜，无核。( 1 5 ) 铜盘柿。 果中等大，约重1 3 0 譬，橙红色，萼绿，略成扁圆形，果心有肉球，核少。( 1 6 ) 高 脚方柿。果大，重约2 0 0 9 ，高方形。皮细，果内有肉球，松脆味甜，无核。( 1 7 ) 安溪油柿。果极大，重约2 8 0 9 ，略成扁圆形，橙红色，肉质柔软，细腻，汁多， 味甜，纤维少。( 1 8 ) 恭城水柿。果大，单果约重1 8 0 9 ，扁圆形，橙红色，肉汁致 密，汁多味甜。( 1 9 ) 黑柿。果中等大，单果重约1 3 4 9 ，圆柱形，黑色，蒂下有缢 痕，赘肉呈肉座状，味浓甜。( 加) 富有柿。从日本引入，零星分布于黄河以南。 果中大，重1 3 0 9 ，扁圆形，橙红色，肉质脆，味甜，有紫红色细斑，有核。( 2 1 ) 罗田柿。中国原产，果较小，平均单果重l o o g ，圆扁形，橙红色，果皮租糙，果 肉致密、味甜，有种子4 巧颗，着色后自行脱涩1 9 j 。我国柿品种在各地分布情况见 表1 。 表1 我国柿品种在各地分布情况r i o ) 2 1 2 涩柿主要营养成分和医疗保健功能 柿又名朱果，是一种营养成分丰富，营养价值很高的水果，享有“果中圣品” 的美誉。柿果中含有糖类、蛋白质、人体必须的氨基酸、总胡萝b 素、少量脂肪、 单宁、钙、磷、铁、锌、钾、钠、镁、锰、铜等微量元素及多种维生素、有机酸 和芳香物质等。现代科学对各种柿品种中营养物质的含量测定取平均值，每1 0 0 9 鲜柿果肉中，含糖类1 1 9 ，蛋白质0 7 9 ，脂肪o 1 9 ，膳食纤维1 4 9 ，v a0 1 6 r a g ， 胡萝b 素1 2 0 u g ，v b l 0 0 2 m g ，v b 2 0 0 2 r a g ，v c 3 0 m g ，尼克酸0 0 2 r a g ，v e l 1 2 m g ， c a1 0 m g 。柿果中还含有黄酮类物质，大部分为槲皮素、山萘酚及其苷类【1 l 】另外， 柿果富含果胶，它是一种水溶性的膳食纤维，有良好的润肠通便作用，对于纠正 便秘，保持肠道正常菌群生长等有很好的作用。除柿果外，柿叶中也含有丰富的 营养成分，包括v t 、芦丁、胆碱、黄酮甙、胡萝b 素、各种氨基酸以及锌、铁、 钙等。柿饼外白色的柿霜含有甘露醇、葡萄糖、果糖、蔗糖。柿根中含有强心甙、 皂苷，并含有鞣质等。 中医认为，柿子味甘、涩，性寒，有清热去燥、润肺化痰、止渴生津、健脾、 治痢、止血等功能，可以缓解大便干结、痔疮疼痛或出血、干咳、喉痛、高血压 等症。所以，柿子是慢性支气管炎、高血压、动脉硬化、内外痔疮患者的天然保 健食品。如果用柿叶煎服或冲开水当茶饮，也有促进机体新陈代谢、降低血压、 增加冠状动脉血流量及镇咳化痰的作用。清代著名医学家王世雄在随息居饮食 谱中说：“鲜柿甘寒。养肺胃之阳，益于火燥津枯之体。乾柿甘平。健脾补胃， 润肺涩肠，止血充饥，杀疳、疗痔、治反胃1 1 2 1 。”本草纲目中记载：“柿乃脾 肺血分之果也。其味甘而气甲，性涩而能收，故有健脾、涩肠、治咳、止血之功。” “诸柿食之皆美而益人，味甘、寒、涩，无毒、通耳益气，治肠脾不足，解酒毒； 3 压胃热，止口干，续经脉气。” 现代医学文献报告，柿具有以下功能：( 1 ) 清热滑肠、降压止血的作用。( 2 ) 抗氧化和抗衰老作用。柿中含有大量的多酚类物质，对02 。的清除能力较强，使之 具有较好的抗氧化和抗衰老作用1 1 4 , 1 5 l 。将白鼠的饮食添加柿子粉的试验证明柿子 有显著的抗氧化性效果；将柿果、柿叶采用抗氧化生物技术提取术提取其中抗氧 化成分，提取液喂养白鼠，服用两月白鼠的l o p 、t g 、t c 较空白对照组明显提 高，s o d 明显降低，说明该供试液有一定的清除自由基，抗氧化的作用；高血脂 白鼠血清中t g 、t c 值明显降低，说明该供试液具有一定的降血脂的作用1 1 6 1 。( 3 ) 促进胃肠蠕动，改善肠道功能。柿含有比苹果高一倍的食物纤维和果胶物质，可 增强人体的消化功能。( 4 ) 防止心血管疾病的作用。柿中含有较高的酚醛化合物 和矿物质，这些物质可以增加心脏冠状动脉的血流量，防止动脉粥样化，避免患 上心脏病和中风【1 7 , 1 8 】，在日本，柿子汁用于预防中风1 1 9 l 。( 5 ) 抗菌消炎，解蛇毒， 抗病毒等功效。( 6 ) 对于缺碘性甲状腺肿大有一定的治疗作用。柿子中含有较高 的碘，研究发现1 0 0g 新鲜柿子含碘5 0 r a g ，患甲状腺肿大者常吃柿子有益。另外 新鲜柿果涂在伤口上有止血，镇痛之功效；青柿捣烂可以治疗烧伤、冻伤；柿子 还可以用于治疗咳嗽、吐血、口疮、直肠出血、小便出血、内痔出血、赤痢、热 淋、泄泻等症状| l “。 我国生产的柿约有8 0 以上都是涩柿。涩柿成熟经脱涩处理后，大多用作鲜 食，加工的食品很少，主要是传统作坊式生产的柿饼、柿干和柿醋等。迄今为止， 涩柿加工在国内外均未形成规模化工业化生产，主要由于脱涩后的柿果在加工过 程中或加工后出现返涩现象，对于涩柿返涩问题至今在生产实践中仍没有科学、 有效的解决方法，因此，严重制约了涩柿加工的工业化生产和产业化发展。柿果 可加工成系列产品，如柿饼、柿子脯饯、柿醋、黄酒、白酒、柿子罐头、制粉、 柿子酒、柿子面、柿干、柿酱等。另外，从柿果出发还可制作柿片干、柿酱、柿 汁饮料、果丹皮等。柿无论是鲜食还是加工，都必须进行脱涩处理，否则影响柿 鲜食和加工食品的风味和质量。柿果的涩味是由单宁物质引起。传统的脱涩方法 ( 如乙醇脱涩、温水脱涩、乙烯利( 2 一氯乙基酸) 脱涩、混合脱涩等，不但脱涩时间 长、柿果容易烂、发生褐变和变软，而且还不适于进行大规模的。 2 柿单宁 2 1 单宁及其性质 2 1 1 单宁 单宁( t a n n i n ) 又称为鞣质，广泛存在于植物的叶、壳和果实以及树皮中，属 4 于次级代谢产物。具有收敛性的涩味。b a t e s m i t h 曾将单宁定义为：“单宁是分子 量在5 0 0 3 0 0 0 的能沉淀生物碱、明胶及其它蛋白质的水溶性酚类化合物。”单宁 可与粘膜或唾液中的蛋白质生成沉淀或聚合物，产生口腔组织粗糙褶皱的收敛或 干燥的感觉，单宁还可以与多种金属离子结合生成难溶性物质。单宁具有很大的 横截面，易与蛋白质发生疏水结合，同时还含有许多能转变为醌式结构的苯酚基， 也能与蛋白质发生交联作用，而这些结合产物都会产生涩感。柿果中富含单宁物 质，有极强的收敛性。柿果实中主要的单宁类成分有3 种：没食子酸( g a ) 、没食 子儿茶素( g c ) 和儿茶素( ( + ) 一c ) 。一般认为这3 种化合物的含量与柿的甘涩类型 密切相关，涩品种中g a 含量较高，研究发现成熟时涩柿果内含有没食子酸、没 食子儿茶素和少量的儿茶素；而甜柿中只含有儿茶素i 驯。 2 1 2 单宁的分类 单宁能溶于水、丙酮、甲醇、酒精及酒精与醚的混合物，微溶于乙酸乙酯， 难溶或不溶于乙醚。不溶于氯仿、苯和二硫化碳等有机溶剂中。单宁能与动物胶、 蛋白质、植物生物碱、重金属( 如p b 、c u 、b i 、h g 等) 和碱土金属( c a 、b a 、s r 等1 形成盐而沉淀1 2 1 2 2 2 1 。 单宁是一大类多酚化合物，分子中具有较多的羟基和羧基，其相对分子量一 般在5 0 0 2 0 0 0 0 之间，也有的高达2 8 0 0 0 ( 如红豆草，s a i n f o i n ) ，含有糖苷键、儿 茶素等。 根据单宁的化学结构特征与水解反应，可以把单宁分为水解性单宁( h y d r o - l y z a l a b l et a n n i n s 简称h t ) ，和缩合性单宁( c o n d e n s e dt a n n i n s ，简称c m 。水解 类单宁结构见图1 ，缩合类单宁结构见图2 1 2 4 。随着植物的成熟，单宁逐步由水解 类转为缩合类单宁。 水解类单宁又称桔酸酯类单宁，具有酯式或甙式结构，对蛋白质的沉淀起着 主导作用，它通常以一个单糖为核心，通过酯键与桔酸或与桔酸有生源关系的多 个酚羧酸连接而成，属c 6 c 1 型酚类。水解性单宁一般包括没食子酸单宁( g a l l o t - a n n i n ) 和逆没食子酸单宁( e l l a g i t a n n i n ) ，逆没食子酸单宁又称为鞣花单宁。没 食子酸单宁经酸、碱或酶液水解，可生成葡萄糖和单宁酸；逆没食子酸单宁包含 有单宁酸和一分子与葡萄糖连接成二酯的六羟基联苯酸，六羟基联苯酸经过内酯 化作用，形成逆没食子酸1 2 5 】。水解类单宁与甲醛一盐酸共沸不产生沉淀；与醋酸 铅一醋酸产生沉淀；遇浓硫酸不变色，保持黄色或褐色；遇溴水不产生沉淀。典 型水解类单宁为单宁酸即五桔子单宁。 5 ( n = 1 , 2 , 3 ) 图1 水解单宁结构( 没食子酸单宁) 2 ，3 一顺式 n 图2 缩合单宁结构 2 ，3 一反式 r 缩合单宁又称聚黄烷醇类单宁，是羟基黄烷醇( 包括黄烷醇一3 一醇和黄烷醇一3 ， 4 - 醇) 的聚合物，一般于由黄烷类( f l a v a n ) 化合物衍生得到，具有c 6 c 3 c 6 的结构 特征，分子中的芳香环均以c - c 键相连，在水溶液中不易分解，在强酸中发生聚 合，产生暗红棕色沉淀。习惯上分子量为5 0 0 3 0 0 0 的聚合物称为缩合单宁，分 子量更大的的聚合物称为红粉和酚酸。黄烷醇单体是缩合单宁的前体，缩合单宁 6 进一步可生成红粉和酚酸。由于大部分缩合单宁分解可产生花色素，植物化学家 将这类化合物称为原花色素( p r o a n t h o c y a n i d i n ) 。缩合类单宁( 聚黄烷醇多酚) 分 子内含有邻苯二酚，与三价铁盐反应呈绿色，遇浓硫酸变成红色，与甲醛一盐酸 共沸产生沉淀，与醋酸铅一醋酸一般不产生沉淀，遇溴水产生沉淀。研究表明，缩 合单宁大部分是原花色素的聚合物。大体上，焦桔酚单宁相当于水解单宁，儿茶 酚单宁相当于缩合单宁，水解单宁和缩合单宁的鉴定方法见图3 l 捌。 ，单宁g a l l 。t a 】m i n r水解单宁h y d r o l y z a l a b l et a n n i n s 植物单宁 l 鞣花单宁e l l a g i t a n n i n l 缩合单宁c o n d e n s e dt a n l l i n $ 提取物的薄层色谱 j 三氯化铁 蓝色暗绿色无色 i 茴香醛一硫酸 厂 i 亚硝酸 钠一醋酸 厂 褐色黄色 ji 鞣花单宁桔单宁 醛一硫酸 橙色黄色橙色一橙色 缩合单宁黄酮类缩合单宁缩合单宁 ( 原翠雀定) 化合物( 原花青定)( 原天竺葵定) 图3 缩合单宁和水解单宁的鉴定 2 1 3 单宁的化学性质 ( 1 ) 酶促褐变， 单宁是多酚类物质，为邻位酚羟基，如：邻苯二酚、邻苯三酚。这些多酚化 合物在多酚氧化酶、过氧化物酶等作用下，与空气中的氧发生氧化还原反应，即 发生酶促褐变。柿、香蕉、苹果、梨、桃、草莓等多种水果在加工过程中，果实 破碎后，暴露于空气中都极易发生这种反应，颜色变成红褐色。褐变是果品加工 7 中常发生的现象，严重影响加工品的质量，其反应式见图4 1 删。 台 。 图4 单宁的酶促褐变反应 0 ( 2 ) 单宁与金属离子的络合反应 单宁分子内含有许多邻位酚羟基，作为多基配位体，单宁能与两个或两个以 上的配位原子和中心离子络合，形成环状的螯合物。络合有两种情况：一种是发 生在b 环的邻位羟基，另一种是发生在a 环5 位酚羟基和杂环4 位的碳基上，反 应结构式见图5 。前一种络合方式比较稳定【2 9 j 。单宁遇铁离子变黑色( 水解型单宁 呈微蓝的黑色，缩合型单宁呈发绿的黑色) ，与锡离子长时间共热呈玫瑰色，与p b 2 、 c a 2 + 等结合产生白色沉淀。如f e 2 + 与单宁的络合反应式见图6 1 刈，形成化合物结构 见图7 1