（食品科学专业论文）利用16S+rRNA基因部分序列的聚类分析鉴定乳酸球菌.pdf

摘要 摘要 乳酸菌在白然界分布j h 泛，其中比较有代表性的菌属为乳杆菌属、乳球菌属、片球菌属 和明串珠球菌属。从十壤、水、植物、青贮饲料、废物，以及人和动物的肠道系统中都可以 分离到乳酸菌。很早以前，人们就利用发酵乳酸菌来制作不同风味的食品。在所有乳制品的 加工和制作过程中，乳酸菌的发酵发挥了至关重要的作用。目前，乳酸发酵食品的种类很多 其中包括香肠、腌制品和饮料等。某些野生型的乳酸菌苗株作为益生菌，同时又是细菌素的 生产者在生物技术研究方面前景远大，它们在新兴的功能性食品的发展上有_ ；静在的用途。 本研究的目的，就是利用分析乳酸菌的1 6 sr d n a 的方法来鉴定乳酸球菌。在表型鉴定 的基础上，应_ j 已发表的乳球菌的1 6 sr d n a 序列，利用p r i m e r p r e m i e r5 软件设计一对引物。 具体的试验方法包括：细菌基因组d n a 的提取，p c r 扩增及产物的纯化，与载体的克隆， 测序，以及相似性分析。 利用这对引物可扩增出一段6 3 4 b p 长度的片段。该片段经过电泳后回收，再与p m d l 8 - t 载体连接，转化入人肠杆菌j m l 0 9 中。在含有氨苄青霉素抗性的l b 琼脂平板上筛选目】性重 组子。提取出重组质粒，并使用限制性内切酶h i n d i 和e e o ri 切割，得到两条线性片段， 比瘦分别为2 6 3 5 b p 和6 9 1 b p 。将含有阳性重组子的菌体进行测序，所得结果分别与g e n b a n k 上发表的同属的代表菌株的1 6 sr d n a 序列比较，得到相似性百分比，则可判定菌株的归属。 从牛乳和青贮饲料中分离到9 株乳球菌，依据伯杰氏系统细菌学手册的标准和描述，9 株乳球菌都鉴定到了属的水平，其中有6 株乳酸菌鉴定到种的水平，该6 株菌均为乳酸乳球 菌( l a c t o c o c c u sl a c t i s ) 。其余3 株中有2 株片球菌( p e d i o c o c c u s ) 和1 株肠球菌( e n t e r o c o c c u s ) ， 这3 株乳球菌根据本研究的结果还无法确定其种的归属。通过本试验可得到以f 结论，利用 分析乳酸菌的1 6 sr d n a 的方法来鉴定乳酸球菌的可行性较好，准确性较高。 关键词乳球菌；1 6 sr d n a ：聚类分析：鉴定 东北农业大学t 学顶士学位论文 u s i n gap a r to f16 sr d n as e q u e n c ea n dc l u s t e ra n a l y s i st o d i f f e r e n t i a t el a c t i ca c i dc o c c i a b s t r a c t l a c t i ca c i db a c t e r i aa r ew i d e l yd i s t r i b u t e di nt h en a t u r e t h eg e n u sl a c t o b a c i l l u s ，l a c t o c o c c u s p e d i o c o c c u sa n dl e u c o n o s t o ca r ei n c l u d e db e i n gr e p r e s e n t a t i v e si n t h i sg r o u p t h e yc o u l db e i s o l a t e df r o ms o i l s ，w a t e r s ，p l a n t s ，s i l a g e s ，w a s t ep r o d u c t s ，a n da l s of r o mt h ei n t e s t i n a lt r a c to f a n i m a l sa n dh u m a n s t h el a c t i ca c i df e r m e n t a t i o n ，w h i c ht h e s eb a c t e r i ap e r f o r mh a sl o n gb e e n k n o w na n da p p l i e db yt h eh u m a n sf o rm a k i n gd i f f e r e n tf o o d s t u f f s i tp l a y sa ne s s e n t i a lr o l ei nt h e p r o d u c t i o no fa l ld a i r yp r o d u c t sa n di si n v o l v e di nt h ep r o d u c t i o no fm a n yo t h e rf o o d s s a u s a g e s ， p i c k l e s ，a n dd r i n k se t c t h ew i l ds t r a i n s ，i nb i o t e e h n o l o g i c a la s p e c ta r ep e r s p e c t i v ea sb a c t e r i o c i n p r o d u c e ra n dp r o b i o t i c s t h e yh a v eap o t e n t i a l u s ef o rt h ee s t a b l i s h i n go fn e w , t h es o - c a l l e d “f u n c t i o n a lf o o d s ” t h ea i m o ft h i s s t u d y i st h ei d e n t i f i c a t i o no fl a c t i c a c i dc o c c i b yc l u s t e ra n a l y s i s d i f f e r e n t i a t i n gap a no f1 6 sr d n as e q u e n c e t h e1 6 sr r n ag e n eo f 9s t r a i n sw e r ea m p l i f i e di n v i t r ow i t ht h ep r i m e r sd e s i g n e du s i n gp r i m e rp r e m i e r5b yt h er e p o r t e dl a c t i ca c i dc o c c i16 sr r n a s e q u e n c e t h en o v e l m e t h o d si n c l u d e ：g e n o m i cd n a sp r e p a r a t i o n ，p c r a m p l i f i c a t i o na n d p u r i f i c a t i o no fp r o d u c t ，c l o n i n go fp c rp r o d u c t sw i t hp m d l 8 - tv e c t e r , s e q u e n c i n g ，a n dc l u s t e r a n a l y s i s a6 3 4 b pf r a g m e n tw a sa m p l i f i e db yt h ea b o v ep r i m e r s t h ea m p l i f i e dp r o d u c tw a sp u r i f i e d a f t e re l e c t r o p h o r e s i s t h e nt h ep u r i f i c a t i o no fp r o d u c tw a sl i g a t e di n t oc o r r e s p o n d i n g l yr e s t r i c t e d p m d l 8 - tv e c t o r a n dt h er e c o m b i n a t i o nw a st r a n s f o r m e di ne c o l ij m l 0 9 f o ri d e n t i f i c a t i o nt h e p l a s m i dw a sc u tw i t hh i n d l l ia n de c o ri t h ec u tp r o d u c t sw e r e2 6 3 5 b pa n d6 9 1 b p t oi d e n t i f y t h es t r a i n ，t h e1 6 sr d n as e q u e n c ew a sc o m p a r e dw i t ht y p es t r a i n so ft h es a m eg e n u s t h er e s u l t c a nb ea b t a i n e da c c o r d i n gt ot h eh o m o l o g y 9s t r a i n so fl a c t i c a c i dc o c c iw e r ei s o l a t e df r o mm i l ka n ds i l a g e s a l lt h e9s t r a i n sw e r e i d e n t i f i e di ng e n u s ，a n d6s t r a i n sw e r ei d e n t i f i e di ns p e c i e sa c c o r d i n gt ot h ec r i t e r i aa n dd e s c r i p t i o n o fb e r g e y sm a n u a lo fs y s t e m a t i cb a c t e r i o l o g y , w h i c hi n c l o u dl a c t o c o c c u sl a c t i s ( 6s t r a i n s ) ， e n t e r o c o c c u s ( 1s t r a i n s ) ，p e d i o c o c c u s ( 2s t r a i n s ) t h e s e3s t r a i n s ，e n l e r o c o c c u s ( 】s t r a i n s ) a n d p e d i o c o c c u s ( 2s t r a i n s ) w e r en o td e t e r m i n e di ns p e c i e sb a s e do na n a l y z i n gt h ep a r to fi6 sr d n a s e q u e n c ed a t a t h ec o n c l u s i o ni st h a tt h i sm e t h o di sag o o do n et od i f f e r e n t i a t el a c t i ca c i dc o c c i k e yw o r d s l a c t i ca c i dc o c c i ；16 sr d n a ；c l u s t e ra n a l y s i s ；i d e n t i f i c a t i o n m a s t e r a t ec a n d i d a t e ：f ux i a o y a n m a j o r ：f o o ds c i e n c e s u p e r v i s o r ：p r o f h u og u i c h e n g 乳酸菌在自然界广泛存在，从人、畜、禽肠道到许多食品、物鼎及少数临床样品中都可 分离到乳酸菌。由丁i 绝大多数乳酸苗对人、畜健康的有益特性及其在国比经济中的重要作用， 而受到了国内外微生物学工作者的重视。近年来，乳酸菌的应用发展很快如乳酸发酵食品、 药晶、饲料等层出不穷。其生物学的研究也逐步深入，随着微生物学的发展，乳酸菌的应用 将更加1 泛对人、畜健康有益作t 【| ；j 的机理将日益清楚乳酸菌将成为人类生活和国民经济 中的重要微生物类群。 近1 0 多年来，随着分子生物学理论和技术的迅速发展，特别是作为生物技术里程碑的聚 合酶链反应( p c r ) 技术的出现及核酸测序技术的不断完善，产生了许多新的细凶分类方法， 如：质粒图谱、限制性片段长度多态性分析、脉冲场凝胶电泳、p c r 指纹图、r d n a 指纹图、 1 6 sr r n a 序列分析等。它仃j 主要是对细菌染色体进行直接的d n a 分析或对染色体外的d n a 片段进行分析，从遗传进化的角度去认识细菌，从分子水平进行分类与鉴定，使细菌的分类 越来越科学和精确，特别是1 6 sr r n a 序列分析方法的出现使得细菌的进化过程可以通过试验 研究来证实。这是细菌分类历史上的一次革命，必将使人们对生物进化及与其它相关学科关 系的认识更加深入。 1 1 文献综述 乳酸菌是在j 二业上有重要意义的一类微生物，在轻一 、食品、医药及饲料工业等许多行 业都具有广泛的应用。从越来越多的相关领域的研究也可以反映出乳酸菌的重要性。最初的 研究主要集中在乳酸菌分类学、微生物学、生物化学、基因以及分子生物学等方面，目前主 要研究乳酸菌在技术工艺特性以及在促进健康和临床方面的应用。最近几年在这些领域的 研究都取得了很大的进展。而且很多国家的政府和企业已经意识到了乳酸菌的经济意义。欧 盟委员会和些商业机构已经对乳酸目的长期研究和利用进行了资金投入。 1 1 1 乳酸菌的定义 乳酸细菌是一类能利用可发酵糖，产生大量乳酸的细菌通称，这个名称就细菌分类学而 言实属一非正式，非规范的名称。 根据伯杰氏细菌鉴定手册，乳酸菌定义如下： ( 1 ) 细胞为革兰氏阳性： ( 2 ) 细胞形态为杆菌或球菌； ( 3 ) 过氧化氢酶为阴性； ( 4 ) 消耗的葡萄糖5 0 以上产生乳酸； ( 5 ) 不形成内生孢子； ( 6 )无运动性。( 金世琳1 9 9 8 ) 这类细菌在自然界分布广泛在工业、农业和医药等与人类密切相关的重要领域应用价 值很高。此外这类菌中有些细菌又是人畜的致病菌，因此受n a i l 极大的重视。可是在乳酸 东北农业人掌工学顾l j 学位论义 菌范围界限的划分和包括哪些细菌属种的认识方面却有鞍人的差异。通常按传统的观念理解， 这类细菌的范围较狭窄，包括的细菌属种也较少。如按乳酸细菌名称的由来及其定义，在全 面了解细菌分类学研究近年来己报道的细菌属种及其主要特征的基础上，经分析比较整理出 符合这类菌定义的细菌，就可列山乳酸细菌的有关属并划分出乳酸细菌的范围。由此也可 看出乳酸细菌分类研究的进程，说明发展至今乳酸细菌涉及的属和种相当多，范用也宪，并 在不断扩大。 自古以来，乳酸菌对食品营养、储藏、感观和人类食品保健及动物饲料等方面起着重要 作用，近几十年从不同学科证实，它不仅是二r = 业用菌，而且也是人体和动物不可缺少的有益 微生物，因此现在乳酸菌的研究从过去的乳球菌和乳杆菌逐渐扩展到双歧杆菌和其它乳酸菌。 1 1 2 本研究所涉及领域及存在问题 乳酸菌包括1 0 多个属，1 0 0 多个种，内容非常丰富。从遗传物质上讲，除了正常的染色 体d n a 外，还有不同类型的转座子( t r a n s p o s o n ) ，如：t n 9 1 6 t n 9 1 7 ，t n 9 1 9 ，t n 9 2 5 ，t n 5 2 7 6 等和插入序列成分( i se l e m e n t ) ，以及质粒，r n a 等。这类质粒数量火，功能多，有的携带 编码正常代谢所需要的基因，如蛋白酶基因，糖类( 乳糖，蔗糖等) 分解酶基因，利用柠檬 酸的酶基因：有的携带编码次生代谢产物的基因，如细菌素( b a c t e d o c i n ) 基因：有的编码 接合转移基因，抗药基因，抗重金属基冈，产硫化氢基因抗噬菌体基因，对外源d n a 限 制和修饰的基因；还有大量尚未查明功能的隐蔽性质粒。d n a 序列分析显示，这些隐蔽性质 粒同源性极高，它们的复制子能在革兰氏阳性菌中复制，这一特性为该类质粒在基因工程研 究中的应用提供了理论依据。 随着分子生物学技术的不断发展，通过细菌基因类似度的分析来判断细菌的种属，越来 越受到人们的重视，单独利用传统的表形分类，已经不能准确地表明细菌间的遗传关系。细 菌的分类鉴定亦从传统的表型分类进入到各种基冈型分类水平，如( g + c ) m 0 1 ，d n a 杂 交，r d n a 指纹图，质粒图谱和1 6 sr d n a 序列分析等。 细胞的核糖体r n a ( r r n a ) 可将遗传信息得以表达，转泽成蛋白质因此可以想象这 些分子具有作为种系发生的指示所必不可少的性质。在相当睦的进化过程中，r r n a 分子的 功能几乎保持恒定，而且其分子排列顺序有些部位变化非常缓慢，以致保留了古老祖先的一 些序列，这就是说，从这种排列顺序可以探测出种系发生上的深远关系。而且r r n a 在细胞 中含量大，个典型的细菌含有1 0 0 0 0 - - 2 0 0 0 0 个核糖体易于提取，可以获得足够的使用量 供研究比较之用。 细菌的r r n a 有三种类型：2 3 s 、1 6 s 和5 s rr n a ，它们分别含有约2 9 0 0 ，1 5 4 0 和1 2 0 个核营酸。5 sr r n a 虽然容易分析，但由于核营酸少，没有足够的遗传信息用于分类研究。 而2 3 sr r n a 含有的核苷酸数儿乎是1 6 s r r n a 的两倍分析较困难。1 6 sr r n a 的分子量适 中，作为研究对象晟理想。 r r n a 存在于所有细菌中，r r n a 基因由保守区和可变区组成，在细菌中高度保守。r r n a 基因包含5 端到3 端的若干种成分，分别是1 6 sr d n a 、间区、2 3 sr d n a 、间区和5 sr d n a 。 目前看来，1 6 sr r n a 基因技术住细菌鉴定中的应用，主要受到以b - j r , 个方面因素的限制： 2 0 f 音 ( 1 ) 需要较高的代价，1 6 sr r n a 基因技术需要较昂贵的仪器设备和药品配套，对实验人员 要求有较好的分子生物学基础；( 2 ) 1 6 sr r n a 基因技术本身在操作过程中，存在些缺陷， 如有可能发生基因丢失的情况，从细菌样品中抽提的d n a 的质量是成功的一个关键步骤，提 取效率的低下或样品中其他物质的干扰，都会使实验结果发生偏差。( 3 ) 1 6 sr r n a 基冈技 术在混合样晶鉴定中所面临的最大的洄题是，我们虽然可以获知样品中微生物存在的信息， 却无法得到我们所检测的微生物菌株，这为后面在生产实际中应_ j 带米困难，这也是1 6 s r r n a 基冈技术不如传统的微生物分离培养方法的地方。虽然存在种种不足，但这并不妨碍1 6 s r r n a 基因技术在细菌鉴定领域中成为一种新的十分有 j 的技术手段，因为它毕竟能够使我们 对在食品中存在的微生物信息有一个全面而细致的了解。而且随着分子生物学技术的进一步 发展，有的问题也是有可能得到解决j 勺，如我们通过1 6 sr r n a 基冈技术鉴定了在食品中存在 的某些微生物种类它们具有一些特殊的功能基因，可以考虑到将该基因分离山来，并克隆 到其他微生物中，这样就可以解决我们得不到微生物菌株的问题。 因为1 6 sr r n a 基囚具有高度保守性的特点，决定了它在实际应用中易存在污染造成假 阳性的缺点。环境中的细菌无处不在，所以，当1 6 sr r n a 基冈运用于临床标本检测时，如何 控制细菌污染( 包括标本采集及p c r 操作过程中各个环岢) 是亟待解决的关键性问题。反应 体系中试荆的污染经常发生，特别是t a qd n a 聚合酶产于细菌，故经常带有r d n a 模板，得 出假阳性结果。但要避免这一问题_ 并不凼难，am e i e r 等( 1 9 9 3 年) 在扩增前加入8 甲氧补骨 酯素，它不干扰引物的复性和t a q 酶的活性且对热稳定，扩增后在打开e p 管前用 乏波紫 外线照射，它激活8 一甲氧补骨酯素，但不损害d n a ，活化的补骨酯素形成环丁烷加在被扩增 的d n a 的嘧啶残基上，从而阻止了t a q 酶对扩增子的再次扩增。pr a d s t r o m 等( 1 9 9 4 年) 和dg o l d e n b e r g e r 等( 1 9 9 5 年) 将未加模板d n a 的反应混合物在紫外线透射仪下照射，均 可以破坏非特异性模板。n mc a r r o l l 等( 1 9 9 9 年) 在p c r 扩增前将权蒸水、缓冲液、m g c l 2 和t a q 酶混合后，用1 o u 的s a u 3 ai 在3 7 c 作用3 0 m i n ，然后9 5 c 灭活，可将t a q 酶中污染 的d n a 去除。此外，只要在各个环节均严格无菌操作，选择恰当的扩增循环次数，d n a 提 取、扩增和产物分析采取隔离措施，以及尽量使用一次性耗材，每次试验均设立阴性和刚性 对照等，就可提高诊断的正确性和可靠性。 1 1 3 理论依据 聚合酶链反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) ：简称p c r ，是体外酶促合成、扩增特定d n a 片段的一种方法。其原理是：在存在d n a 模板、引物、d n t p 、适当缓冲液( m g ”) 的反应 混合物中，在热稳定d n a 聚合酶的催化f ，对一对寡核苷酸引物所界定的d n a 片段进行扩 增。这种扩增是通过模板d n a 、引物之间的变性，退火( 复性) ，延伸等三步反应为一周期 ( c y c l e ) 。循环进行，使日标d n a 片段得以扩增。由于每一周期所产生的d n a 片段均能成 为下一次循环的模板，故p c r 产物以指数方式增加，经3 0 个周期后，特定d n a 片段的数 量在理论上可增加1 0 7 倍。 核糖体：是由核糖体r n a ( r r n a ) 和蛋白质组成的大分子结构。它们在细胞质中大量 存在，以信使r n a 为模板合成蛋白质。核糖体由具有特定大小的大小基组成t 它们的沉 东北农业人学工学硕士学位论文 降系数不同。原核生物核糖体沉降系数为7 0 s ，由5 0 s 和3 0 s 瓶基组成。它们包括二种r r n a ， 2 3 s 、1 6 s 和5 s 。其中1 6 sr r n a 的结构见图1 1 ( 焦振泉，1 9 9 8 ) 。 5 v 】v 2v 3v 4v 5 v 6v 7v 8v 9v l o 3 s 4 0 h p 9 7 0 b pi s 4 0 b o - 可受匿( v a r t a b l er e g i n a vi z o )v 1 6 1 1 0 6 b p v3 4 j 争5 0 0 t 带 v5 7 3 妒7 5 4 b p v7 9 9 p1 0 4 s b p v g ：1 2 4 0 - 1 二9 3 b p c 了协定区( c o n s 伯1 1 tr e 9 0 a ) v 2 ：1 2 1 、1 4 0 b p v 串5 8 p6 7 1 b p v 6 ：8 2 9 8 5 7 b p v 咎u 1 8 1 1 6 d b p v 1o = 1 4 1 p1 4 9 2 6 p 幽1 11 6 sr r n a 结构 f i g 1 - 1d i a g r a mo f1 6 sr r n ag e n es t r u c t u r e 从图i - 1 可见，细菌的1 6 sr r n a 包括1 0 个可变区和1 1 个恒定区。因此，测定1 6 sr d n a 部分序列即可达到对分离物的分子鉴定的目的( 胛g r a y 。t 9 8 4 ) 。 传统的细菌系统分类的主要依据是形态特征和生理性状，采取的主要方法是对细菌进行 纯培养分离，然后从形态学、生理生化反应特征以及免疫学特性加以鉴定。本世纪6 0 年代束 分子遗传学和分子生物学技术的迅速发展使细菌分类学进入了分子生物学时代，许多新技术 和方法在细菌分类学中得到广泛应用。6 0 年代末c rw o e s e 开始采用寡核苷酸编目法对生 物进行分类，他通过比较各类生物细胞的核糖体r n a 特征序列，认为1 6 sr r n a 及其类似的 r r n a 基因序列作为生物系统发育指标最为合适( 洪义国，2 0 0 2 ) 。 对微生物的1 6 sr r n a 进行测序分析时最好进行全长测序，尤其是所测序列将要用于探针 设计和新物种确定时( 张彤等，2 0 0 3 ) 。另外，采用正反向引物对所测定的序列进行重复验 证可以确保序列的准确性。但由丁目前测序费用还比较高昂，因此许多研究者也采用测1 6 s r d n a 部分序列的方法进行微生物多样性分析和平行样品比较。研究表明，4 0 0 - 6 0 0 碱基的 序列足以对环境中微生物的多样性和种群分类进行初步的估计( y s e k i g u c h i 等，1 9 9 8 ) ，但 这样短的序列通常不能用_ 丁新物种鉴定和探针设计。 有了微生物1 6 sr r n a 序列，不论是全长还是部分，都可以提交至o g e n b a n k 采用b l a s t 程 序与已知序列进行相似性分析。g e n b a n k 将按照与测得序列的相似性高低列出已知序列名单、 相似性程度以及这些序列相对应的微生物种类，但更为精确的微生物分类还取决丁系统发育 分析( p h y l o g e n e t i ca n a l y s i s ) 。系统发育分析，就是根据能反映微生物亲缘关系的生物大分 子( 如1 6 sr r n a 、a t p 酶基因) 的序列厨源性，计算不同物种之间的遗传距离。然后采用聚 类分析等方法，将微生物进行分类，并将结果用系统发育树( p h y l o g e n e t i cb e e ) 表示。计算 菌属、菌种之间的遗传距离可以采用不同方法，如j u k e s c a n t o r 方法。在计算遗传距离之后， 构建进化树时有许多种方法，其中以n e i g h b o rj o i n 法最为常用。在进行系统发育树分析时常 用剑的一些软件包括m e g a2 1 ( sk u m a r ，】9 9 3 ) 和a r b ( os t r u n k 1 9 9 7 ) 。 日i 占 1 6 sr r n a 基冈( r d n a ) 是细菌染色体上编码r r n a 相对应的d n a 序列，它集保守性与变 异性于一身，是目前应用最，“的分子微生物学检测的靶基冈。首先编码1 6 sr r n a 的基冈与细 菌染色体上大多数基因相比有高度的保守性( m wg r a y ，1 9 8 4 ) 。r r n a 基冈比整个基冈组进 化得要慢，且保守。这表现在其碱基组成、碱基序列、高级结构及功能等不同层次上，例如， 尽管在序列上有较多差异，真细菌与古细菌的1 6 sr r n a 上与核蛋白结合的位点处的二级结构 仍很相似，现有细菌的r d n a 均由其祖先代一代传下来，虽然在k 期的进化过程中有较大变 化，但其祖先的某些痕迹仍留在其核酸序列中。这种痕迹为细菌的系统进化研究提供了可能。 因此，有人将r r n a 称为细菌的“化石”。这一“化石”的存在，为细菌亲缘关系和系统进化 研究提供了方便。其次，1 6 sr r n a 基因的保守性义是相对的，在保守区之间存在着9 个或1 0 个变异区( v v 。) ，不同科、属、种间都有不同程度的筹异。因此，将1 6 sr r n a 基因的保 守性和特异性结合起来应用，是其在微生物分子诊断中的主要策略。 1 6 sr r n a 基因片段的分析方法土要包括以下3 种：一是将p c r 产物克隆到质粒载体上进 行测序，与1 6 sr r n a 数据库中的序列进行比较，确定其在进化树中的位置，从而鉴定样本中 可能存在的微生物种类，该方法获得的信息最全面，但在样品成分复杂的情况f 需要大量的 测序工作。二是通过1 6 sr r n a 种属特异眭的探针- 与p c r 产物杂交以获得微生物组成信息。此 外，探针也可以直接与样品进行原侮杂交检测，通过原僚杂交不仅可以测定微生物的形态特 征和丰度，而且能够分析它们的空间分布，该方法简单快速，主要应用f 快速检测，但可能 山现假阳性或假阴性结果。三是对p c r 产物进行限制性片段长度多态性( r e s t r i c t i o nf r a g m e n t l e n g t hp o l y m o r p h i s m s ，r f l p ) 分析，通过观察酶切电泳图谱、数值分析，确定微生物基因 的核糖体型，再同核糖体库中的数据进行比较分析样品中微生物组成或不同微生物的种属关 系。1 6 sr r n a 基冈技术，同样在微生物多样性的分析中得到广泛应用。如将该技术与a r d r a ( a m p l i f i e dr d n ar e s t r i c t i o na n a l y s i s ) 技术结合，依据原核生物r d n a 的保守性，将扩增的 r d n a 进行酶切，然后通过酶切图谱来分析菌问的多样性，该法无需将试样分纯，简便、高效， 是一种很有发展前途的方法c mv a n e e c h o u t t e 等，1 9 9 2 ；sw e i d n e r 等，1 9 9 6 ) 。 目前国际上有许多核酸数据库能够检索核糖体核酸序列，些软什可用于序列对比分析 和构建进化树，如c l u s t a l w 和t r e ev i e w 软件。此外一些研究机构还建立了专门用于核糖体 序列分析的数据库，其中最著名的是美国密歇根州立大学的r d p ( r i b o s o m a ld a t a b a s e p r o j e c t 1 i ) 库，该数据j 车目前包括9 7 0 0 多个小亚基单位r r n a 序列，用户可以通过匿名f t p ( t i p c t b e m s i l e d u ) 和w w w 网( h t t p ：c m e m s u e d u r d p ) 使用这些数据和软件，其中w w w 网提供的 主要服务包括：核糖体探针检测；用户委托序列在r n a 分类系统中的人致位置分析：筛选 可能的嵌合r r n a 序列；自动序列对准比较：提供未知序列在系统发育进化树中的位置以及 r f l p 结果分析等多种功能。此外，欧洲还有一些核糖体数据库，如比利时安特甲普( a n t w e r p ) 人学建立的数据库提供6 0 0 0 多种小亚基单位序列( v a nd e p e e r y ，1 9 9 7 ) ，其网址为：h t t p ：r m a u i a a c b e s u 。德国幕尼黑技术人学的a r b ( a r b o r t r e e p r o j e c t ) 数据库提供自动序列对准比 较二级结构检测和进化树构建等程序。 东北农业丈学t 学醐【学位论丈 1 1 4 国内外研究进展 随着分子生物学技术的不断发展，p c r 技术的日益完善，单独利用传统的表型分类和生 理生化鉴定已经不能够准确的表明细菌间的遗传关系，所以通过对细菌基冈类似度的分析来 判断细菌的种属，就越来越受到人们的重视。细菌的1 6 sr r n a 基冈具有高度的保守性，不 同科、属、种间细菌| 6 sr r n a 基因的同源性可达9 7 以上( dj o n a s 笛，1 9 9 5 ) 。 现在国际上对乳酸菌的研究土要集中在以下诸方面：( 1 ) 遗传方面：从d n a 序列到应 用的可能性和复杂性乳酸乳球菌i l l 4 0 3 完糕基因组的低丰余序列，乳酸菌第二类内含子及 其在结合转移中的表达。乳酸菌从食物中获得的抗生素抗性乳酸菌胞壁蛋白酶的多域性， 乳蛋白编码的生物活性肽和蛋白裂解活性及营养功能特性，乳酸菌细胞壁的合成及其功能， 乳酸菌细菌素的膜插入和孔形成机理，乳酸乳球菌产生胞外多耱从遗传 ：程到改善流变特性， 发酵剂的遗传和应用，细胞表面的蛋白层和多糖，遗传元件和遗传研究的i 具，生理学：( 2 ) 免疫方面：乳酸菌的免疫调节功能，肠道微生物菌群和免疫活性细胞的互相作蹦乳酸菌对 噬菌体的防御系统，噬菌体抗性在乳酸菌中的应用噬菌体和噬菌体抗性；( 3 ) 代谢方面： 乳酸菌的肽酶和氨基酸代谢细菌硫代谢与干酪的成熟，细菌素和食品腐败，蛋白酶水解 肽酶水解和脂酶水解；( 4 ) 应用方面：乳酸球菌细菌素的开发应_ i ，把蛋白质锚定在乳酸苗 的细胞壁上，益生菌的生物学特性及临床实验菌株的检出年【i 鉴定方法，益生菌帛l 健康等。 与大肠杆菌、枯草杆菌和酵母菌相比，国内外对乳酸菌遗传学和基因工程的研究起步较 晚。在国内，乳酸菌的分类始丁i5 0 年代末6 0 年代初。对遗传学和生理生化的研究也主要是 在8 0 年代中期才开始。在应用方面，近1 0 年来发展很快，不论是乳酸发酵，食品发酵，还 是人和动物用的益生素都取得了很大的成绩，但是存在的问题也很多。在国外。乳酸球菌的 研究早于乳酸杆菌。1 9 8 4 年召开第一次国际乳酸菌会议时主要内存是乳酸球菌基囚的传递 和基因表达，当时对乳酸杆菌的遗传背景知之甚少，对双歧杆菌更是一无所知。在近l o 年的 时间里，由于乳杆菌和双歧杆菌的生物学特性及其独特的生理功能，引起有关科学家的关注， 人们逐渐重视了对这两种菌的研究，而且进展相当迅速。对乳杆菌的遗传调控、质粒结构、 复制模型、载体构建、宿主改造、转化手段、整台方式、质粒和外源基因的稳定性等都做了 深入的研究，也克隆了一些人们j 感兴趣的基因。目前，乳酸球菌的基因表达系统已较完善， 并克隆了许多外源基因。 1 1 4 11 6 sr r n a d n a 分子生物技术的基本方法 以1 6 sr r n a d n a 为基础的分子生物学技术已成为鉴定微生物普遍接受的方法( m w a g n e r 等，1 9 9 3 ：tz h a n g 等，2 0 0 0 ) ，该技术主要利用不同微生物在1 6 sr r n a 及其基因 ( r d n a ) 序列上的差异来进行微生物种类的鉴定和定量分析。该技术已经受到“泛芙注，试 验的基本路线也比较明确，各种通用引物早己公开发表，并且许多关毽试验试剂已经形成试 剂盒投放市场。 目前，已有多种可以用于细菌1 6 sr d n a 文库( p fk e m p 2 0 0 4 ) 建立的试剂盒上市，如 p g e m 2 t 克隆试剂盒( a cd a r b y 等，2 0 0 1 ) 和t a 克隆试剂盒( tz h a n g 等，2 0 0 l ；h hf a n g 等，2 0 0 2 ) 。建立文库之后的r 作是获取质粒中的1 6 sr d n a 序列通常采用全细胞p c r 扩 6 0 l 占 增( ys e k i g u c h i 等，1 9 9 8 ) 或质粒提取方法( tz h a n g 等，2 0 0 1 ：h hf a n g 等，2 0 0 2 ) 。 国内外目前比较通用的儿种1 6 sr r n ap c r 扩增引物见表i 1 ( gw i l l i a m 等1 9 9 1 ：r g e l s o m i n o ，2 0 0 4 ) 。 表1 - 1 目前比较通川的几种1 6 sr d n a 基 g p c r 扩增引物 t a b i - ls u m m a r yo f p r i m e r sf o r t h ep c r a m p l i f i c a l i o no f e u b a c t e r a l1 6 sr d n a 1 6 sr r n a d n a 分子生物技术的基本方法见图1 - 2 。 图1 2 以1 6 sr d n a r n a 为基础的微生物分子生态技术 f i g 1 2 t h em o l e c u l a re c o l o g i c a lt e c h n i q u eb a s e do n1 6 sr d n a r n a 1 1 4 216 sr r n a 在乳酸菌鉴定方面的研究进展 近年来ty a m a m o t o 等( 1 9 9 2 年) 设计和合成出人肠道区系中常见的般歧杆菌属5 个种 ( 两歧般歧杆菌、青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌和长双歧杆菌) 的特异性的寡 核苷酸探针，它们具有】6 , - q 9 个碱基比变，并与这5 个种的1 6 sr r n a 的序列互补。用天然 高分子量的r n a 制备物作为靶子，这些寡核苷酸探针对丁二人肠道中这些种的菌株具有高度 的种特异性，结果表明用此法检测这5 个种的1 6 sr r n a 序列能取得所期望的结果，并且整 7 东北农业人学丁学硕 ：学位论史 个试验过程从获得纯细胞物后只需6 小时可完成。 pk a u f m a n n 等( 1 9 9 7 年) j j i1 6 sr r n a 探针杂交技术和p c r 技术定量鉴定了分离臼食 物中的3 0 株硬歧杆菌。1 9 9 7 年，dm o r a 笛利用套式p c r 方法扩增1 6 sr r n a 序列和一段 d 乳酸脱氢酶基冈，对乳酸片球菌( p e d i o c o c c u sa c i d i l a c t i c i ) 和戊糖片球菌( p e d i o c o c c u s p e m o s a c e u s ) 进行了鉴定。后来，p p a r 。 a 等( 1 9 9 8 年) 义利用1 6 sr t 对, l a 基冈序列分析技术 从败血症患者术后感染区域成功的分离出干酪乳杆菌。1 9 9 8 年，fb e r t h i e r 等利_ l 】1 6 s 2 3 s r r n a 间区序列快速鉴定了两组( 共3 2 株) 亲缘关系较近的乳杆菌。1 9 9 8 年，tm a t s u k i 等 利用1 6 sr r n a 序列分析快速鉴定了人肠道中的4 6 株双歧杆菌。1 9 9 8 年，rp a t e l 等应用1 6 s r r n a 序列分析将株鸡肠球菌鉴定到种。1 9 9 9 年，g w t a n n o e k 等利用1 6 s 2 3 sr r n a 间区 序列的比较分析分别对分离臼胃肠道、青贮饲料和酸奶中的4 0 株乳杆菌进行了鉴定。2 0 0 0 年，m jk u l l e n 等利用细菌1 6 sr r n a 的包括可变区v i 和v 2 的5 0 0 b pk 度片段序列快速准确 的从人肠道混合物中鉴定山嗜酸乳杆菌。在2 0 0 0 年，黄锡全等对一株明串球菌的1 6 sr r n a 基因序列进行分析，并与其它2 1 株乳酸菌1 6 sr r n a 基因序列进行了同源性比较，与柠檬色 明串珠菌的同源性为9 9 ，认为该菌株是一株柠檬色明串球菌。2 0 0 0 年，mm a n z a n o 等利_ 【 ；| 温度梯度凝胶l 邑泳的方法分析1 6 sr r n a 对分离白食物中的利斯特氏菌进行了鉴定。 2 0 0 t 年，h jm o n s c e i n 等利用温度梯度凝胶电泳和p c r 扩增1 6 sr r n a 的v 6 医( 可变区) 片段的方法对1 6 株肠球菌进行了鉴定，2 0 0 1 年。沈永才等利用1 6 sr r n a 的p c r 法鉴定了 8 株般歧杆菌，井用1 6 sr r n a 荧光定量p c r 法对积歧杆菌进行了定量检测。2 0 0 2 年，am a n e r o 等对利用1 6 sr r n a 探针杂交的方法鉴定肠球菌属细菌进行综述。2 0 0 2 年。yw o o p a 打i c k c 等通过1 6sr r n a 序列分析的方法，从一位菌血症胆囊炎患者体内检测到了唾液乳杆菌的存 在。2 0 0 3 年ys e l o 等对1 6 sr r n a 序列特定长度片段进行分析，对人体粪便样品中嗜酸乳 杆菌( l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s ) 的分布情况进行了检测。2 0 0 3 年，j rb y u n 等利用分 斤1 6 s r r n a 和2 3 sr r n a 间区序列的力法对一株鼠李糖乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sr h a m n o s u sa t c c 5 3 1 0 3 ) 进行了鉴定，并与干酪乳杆菌( 三c a s e d 、嗜酸乳杆菌( a c i d o p h i l u s ) 和瑞氏乳杆 菌( lh e l v e t i c u s ) 的1 6 sr r n a 和2 3 sr r n a 间区片段进行了比较。2 0 0 3 年，j a n gj c 等利用 p c r - r f l p ( 限制性片段长度多态性) 方法扩增出1 6 sr d n a 序列的9 7 6 b p 长度片段，从韩国 传统泡菜中的明串珠菌进行了鉴定。2 0 0 3 年，c nr a c h m a n 等对使用神特异性纂核营酸引物 扩增1 6 s - 2 3 sr d n a 的方法鉴定食品乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sa l i m e n t a r i u s ) 和香肠乳杆菌 ( l a c t o b a c i l l u s f a u c i m i n i s ) 进行了检测，证明该引物对上述两种凶的鉴定特异性较高。2 0 0 3