（食品科学专业论文）发酵木糖产酒精高温酵母菌株构建的研究.pdf

摘要 本文主要对发酵木糖的酵母工程菌的构建进行了研究，并对获得的理想融合菌株进行了发酵条 件的优化研究，为纤维素类生物质的全面利用打下了菌种方面的基础。通过对大量菌株的筛选，得到 了高温酿酒酵母g 4 7 0 该菌株在4 5 能良好生长，并能较好地发酵葡萄糖，但不能发酵木糖。当底物 浓度为1 0 葡萄糖时，4 1 。c 和4 5 下发酵，发酵液中酒精终浓度为分别为3 9 ( w w ) 和2 ，o ( w w ) ， 转化率分别为7 5 和3 9 。 本研究以高温下发酵葡萄糖的酿酒酵母g 4 7 和木糖发酵菌株休哈塔假丝酵母1 7 6 6 作为出发菌 株，通过单倍体诱导生成及分离，得到g 4 7 - 1 2 ( a ) 和1 7 6 6 1 1 5 ( a ) 等9 株单倍体菌株。单一营养缺陷 型为稳定可靠的遗传选择标志，通过u v 和d e s 诱变对所挑选出的g 4 7 - 2 ( a ) 和1 7 6 6 - 4 ( a ) 两株单 倍体进行诱变。通过对突变株的筛选鉴定得到g 4 7 - 2l y s - 。( a ) 和1 7 6 6 - 4u r a 。( a ) 两突变株，实验证 明两突变株为正突变株。本研究以g 4 7 - 2 l y s - j ( a ) 和1 7 6 6 - 4u r a - j ( a ) 作为构建高温木糖发酵菌株的 融台亲株。 通过聚乙二：醇( p e g ) 和电诱导融合等方法，实现了发酵木糖产酒精的休哈塔假丝酵母和高温酿 酒酵母之间的融合。融合子经d n a 含量、细胞体积测定和稳定性能试验证明为稳定的融台子。融合子 p 刀能在4 5 。cf 发酵木糖产酒精，其在4 5 c 发酵木糖所产生的酒精体积百分数为i 6 7 ( v v ) 。与 亲株相比，f - 7 1 的酒精耐受能力也提高了1 4 3 。 通过对融合子发酵培养基优化以及系列发酵条件的研究，使融合子发酵木糖产酒精的终产量提高 到i 9 8 ( v v ) ，转化率为8 i 。 本论文还进行了体外重组构建发酵木糖产酒精的酵母工程菌的初探1 ：作。 关键词术糖，高温，酒精，融合，酵母 t h ec o n s t r u c t i o no f t h e r m o p h i l u sx y l o s ef e r m e n t a t i o n e n g i n e e r i n g y e a s ts t r a i n st op r o d u c ee t h a n o l a b s t r c t c o n s t r u c t i o no fx y l o s ec o f e r m e n t a t i o ny e a s te n g i n e e r i n gs t r a i n sa n dt h eo p t i m a lf e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n sw e r es t u d i e di nt h i sr e s e a r c h t h e s es t u d i e sh a v ei m p o r t a n t m e a n i n g t ot h es t r a i n si nm a k i n g f u l lu s eo fl i g n o c e n u l o s eb i o m a s s s c e r e v i s i a eg 4 7w a s g a i n e db y ag r e a tm o u n to fs c r e e nw o r k t h i s s t r a i nw a sc h a r a c t e r i z e db yg r o w i n ga th i g ht e m p e r a t u r e ( 4 5 1 2 ) a n dc a nf e r m e n tg l u c o s ew e l la tt h i s t e m p e r a t u r e w i t ht h es a m es u b s t r a t es u g a rc o n c e n t r a t i o no f1 0 ，t h ef i n a le t h a n o lc o n c e n t r a t i o no ft h e b r o t hi s3 9 ( w w ) a n d2 0 ( w w 、w h e nf e r m e n t i n ga t4 1 a n d4 5 cs e p a r a t e l y t h e i rt r a n s f o r mr a t e a r e7 5 a n d 3 9 c o r r e s p o n d i n g l y s c e r e v i s i a eg 4 7a n dc a n d i d as h e h a t e a1 7 6 6w h i c hc a l lp r o d u c ee t h a n o lb yx y l o s e - f e r m e n t i n g w e r eu s e da st h ep a r e n t ss t r a i n s n i n eh a l p o l i d sw e r eg o tt h r o u g hh a l p l o i di n d u c i n gf o r m a t i o na n d s e p a r a t i o n t h ea u x o t r o p h i cm u t t sw i t ho n l yo n es e l e e t a b l em a r k e rw e r es t a b l ea n dd e p e n d a b l e s o b o t ho fg 4 7 - 2 ( a ) a n d1 7 6 6 - 4 ( a ) w e r ei n d u c e db yd e sa n du vi nt h i sr e s e a r c h i tw a sp r o v e dt h a t a u x o t r o p h i c m u t a n t s6 埠7 2l y s 。( a ) a n d1 7 6 6 - 4u r a 。( a ) w h i c hu s e da s p a r e n t s t r a i n sw e r e p o s i t i v em u t a n t s w eg o ti d e a lf u s a n t sb e t w e e ns c e r e v i s i a ea n dc a n d i d as h e h a t e a t h r o u g hi n t e r - g e n e r i c p r o t o p l a s tf u s i o ni n d u c e db yp e g a n de l e c t r o p o r a t i o n f u s a n t sw e r et e s t i f i e dt ob es t a b l eb yi t sd n a c o n t e n t t h ev o l u m eo fc e l la n dt h es t a b l e e x p e r i m e n t f u s a n t f - 7 lc a n p r o d u c e e t h a n o l b y x y l o s e - f e r m e n t i n ga t4 5 ( 2a n dt h ef i n a le t h a n o lc o n c e n t r a t i o no fb r o t hw a s1 6 7 ( v v ) c o m p a r e dw i t h p a r e n t ss t r a i n s t h ee t h a n o lt o l e r a n c ea b i l i t yo f f u s a n t sw e r e i m p r o v e db y1 4 3 t h eo p t i m a lf e r m e n t a t i o nm e d i u m c o m p o s i t i o na n df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sa b o u t t h ef u s a n t sw e r e s t u d i e d a n dt h ef i n a le t h a n o lp r o d u c t i v i t yt h r o u g hx y l o s e f e r m e n t i n gw i t ho u rf u s a n t sw a s1 9 8 ( v v ) i t st r a n s f o r mr a t ew a s8 1 t h ec o n s t r u c t i o no f x y l o s e f e r m e n t i n gy e a s t sb yg e n er e c o m b i n a n t w a ss t u d i e db r i e f l ya l s o k e y w o r d s ：x y l o s e ，h i g ht e m p e r a t u r e ，e t h a n o l ，p r o t o p l a s tf u s i o n ，y e a s t s 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名叶 时间： 卵毕年占月，彦日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。可以采n 影f - i 、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 导师签名： 钟糊 时间：加年6 月i g 同 时间：”牛年月 第一章绪论 随着世界人口的迅猛增长以及世界经济的发展、生活水平的提高、能源危机、环境问题以及 粮食短缺问题日益困扰着整个世界。寻求新的可再生清洁能源，缓解环境危机和粮食危机则显得 越发重要。 7 0 年代的石油危机引起了世界各国对未来能源短缺问题的普遍关注。近年来，汽车燃油中助 燃剂甲基叔丁基醚( m t b e ) 被确认为对水资源有严重的污染和对人类有极其危害的副作用。为 了缓解环境危机，人们将目光转向了可再生燃料酒精。乙醇能在自然界中产生，同时能被植 物和动物在生理上所接收，同时是有效的汽油增烷剂和增氧剂。酒精作为燃料具有其它燃料无可 比拟的优点。首先，酒精氢含量高。其燃烧产物仅为二氧化碳和水，而二氧化碳能进入自然界的 碳循环，为燃料酒精的产生提供一种价格低廉的原料纤维素类物质。因此，燃料乙醇的使用 将从根本上解决温室效应的根源。其次，酒精作为一种可再生的清洁能源是石油等化石能源的首 选的替代品。 生产酒精的传统原料有糖蜜、淀粉等粮食原料。人口增长和粮食危机的潜伏，使人们转为以 纤维素类生物质生产燃料酒精。生物技术的发展为以纤维素原料生产燃料酒精铺展了技术的平 台，生产成本和能耗也会大幅度降低。 木质纤维素是地球上最丰富、最廉价的可再生资源。植物每年通过光合作用能产生1 5 5 0 多 亿吨纤维素类物质，其中纤维素和半纤维素总量为8 5 0 亿吨。而每年用于工业过程或者燃烧的纤 维素类物质仅占2 左右，还有很大部分未被利用【2 】。如果将每年光合作用生成的纤维素量的十 分之一转化为能源，就能满足全球的能量需求。 在二战开始和战后的一段时间里，以植物纤维为原料生产酒精在美国、前苏联和欧洲曾经形 成了一个较大的产业。近十年米以纤维素为原料生产燃料乙醇已经成为世界科学家们的研究热 点。 1 1 燃料酒精的发展及研究现状 1 1 1世界燃料酒精的发展概况 在2 0 世纪7 0 年代石油危机的刺激下，各国出于战略考虑，纷纷开始了可替代石油的新燃料 的研究。燃料酒精作为生物燃料的重点，在美国，巴西，澳大利亚等国得到了长足的发展。研究 表明，酒精作为内燃机的燃料与汽油相比有不少优势，是一种高效燃料。酒精便于储存、输送， 并完全与现有的加油站设施相容，而且在减少环境污染方面还有极大的优势。 在巴西，酒精燃料占整个整个汽车燃料市场的5 2 左右。而目前酒精在美国占有汽油市场的 1 5 。3 。酒精作为一种新兴的、无污染、可雨生的清洁能源，具有良好的发展前景。目前在国际 上关于“木质纤维材料制燃料酒精”的技术正方兴未艾，其中主要原因是因为酒精作为汽车燃料 的前景看好。 酒精燃料迅速发展的另一原因是世界能源结构调整的需要。据专家估计，除非发现新的油田 世界现有石油开采至二三十年代将会枯竭。此外，为了减少经济发展对原油进口的依赖，美国投 入大量的资金开发从植物纤维素原料经生物转化生产酒精的技术，并取的了一定的成绩。与2 0 世纪7 0 年代相比，当今美国经济增长对依赖原油的程度仅是7 0 年代的5 0 。专家预计，未来 1 0 年内由植物纤维素原料生产大量的酒精将用于燃料等市场。 其次，发展燃料酒精是环境保护的需要。燃料酒精是替代汽油燃料减少城市日趋严重的空气 污染的一种有效的清洁燃料。i i 前美国增氧剂甲基叔丁基醚( m t b e ) 的禁用促进了燃料酒精的发 展。乙醇生产原料能在自然界中产生，同时能被植物和动物在生理上所接收，同时是有效的汽油 增烷剂和增氧剂。因此，乙醇作为增烷剂和增氧剂正在取代m t b e ，需求量增大。生物乙醇从可再 生植物来，利用了通过光合作用转化了的二氧化碳和储存于植物中的太阳能，从而具有降低温室 效应的巨大潜能由于新技术的应用提高了生产燃料乙醇的生产效率和生产能力，使酒精成为一 种新的燃料，能以更高的比例与汽油混用。而大量使用酒精含量高的汽油，如e 8 5 和e 9 5 ，将会 极大的消除石油这个使地球变暖的根源。酒精作为动力燃料同时也可以加入到柴油中。 1 1 2我国燃料酒精的发展概况 我国生产酒精的原料为甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜、玉米、木薯、红薯干等。酒精的主要用途为 配制白酒、医药用等。从9 0 年代中期开始，我国酒精生产能力就已经开始过剩。酒精价格受甘 蔗、玉米等的生产和市场供求关系影响较大。一方面，由于近年粮食生产的丰收以及消费者喝酒 习惯由白酒转向果酒而导致酒精生产市场疲软。但是，另一方面，形式也在悄然发生着有利于燃 料酒精发展的变化。首先，由于经济的发展，生活水平的提高以及汽车关税的大幅度下降，我国 的汽车消费浪潮逐渐到来，由此汽车燃料的需求将大幅度提高。另一方面。我国既是石油生产大 国同时也是石油消费大国。从1 9 9 3 年起，我国已经成为石油净进口国。从此，石油价格受到国 际市场的直接影响。国内柴油、汽油价格的上升以及燃油税的征收，这些都有利于燃料酒精在中 国的发展。 其次，在我国环境保护日益受到重视。汽油、柴油作为汽车的燃料都有一个很大的缺点，那 就是对环境污染很大。为了实现可持续性发展，就需要大力发展可再生的清洁能源。另一方面石 油作为一种稀缺性、不可再生的资源，终有一天会被耗尽，而替代石油的最好途径就是发展新型 可再生清洁能源。燃料酒精作为一种较好的清洁能源，将会使酒精行业迎来新的发展机遇。 2 0 0 0 年以来，根据国务院领导的指示，国家计委会同国务院有关部门，单位和试点地区就推 ，“使用乙醇汽油开展了大量细致的工作，使我国推广使用车用汽油乙醇_ 作取得了很人的进展。 目前我国推广使用车_ j 乙醇工作取得了阶段性成果。 1 2 纤维素类物质生产燃料酒精的研究概况 生产乙醇的方法分为化学合成和微生物发酵法。化学合成法主要有间接水合“3 和直接水合 法”1 。发酵法是乙醇，尤其是燃料乙醇主要的生产方法。发酵法生产乙醇的原料主要有三类：糖 类，淀粉类和木质纤维素类。一些糖类物质可直接发酵生产乙醇，而淀粉类和木质纤维素类物质 则必须先经水解产生单糖后才能被微生物转化产生乙醇。由于世界潜伏的粮食危机，以植物纤维 为原料生产燃料酒精成为燃料酒精生产的突破口。 小质纤维素类物质是世界上存在的最广泛的可再生资源。地球上每年光合作用产物高达1 5 0 0 亿吨，其中绝大部分为木质纤维素类物质。仅我国每年农林纤维素类废弃物就有近1 0 亿吨。如 果能利用生物工程等技术手段，将其中一部分转化为燃料乙醇，即有望对能源不足的难题作出巨 大贡献。 1 2 1 木质纤维素类物质的分布和组成 植物原料主要含有三大成分：纤维素、半纤维素和木质素。纤维素是高等植物细胞壁的主要 成分占植物干重的4 5 5 0 ，是由葡萄糖构成的线性高分子。纤维素分子聚集成结晶状态的纤 维束存在于植物细胞壁，使得在很多条件。卜纤维素的化学反应速度很慢。半纤维索是一种异源多 聚糖t 其单体组分包括葡萄糖、甘露糖、半乳糖、术糖、阿拉伯糖和少量鼠李糖、葡萄糖醛酸、 甲基葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸。其结构带有支链，是非结晶的，分子量也远低于纤维素，所以具 有较高的反应活性。占植物干重的2 0 3 5 。半纤维素相对容易水解。而且，不同来源的木质纤 维素类物质的各种组分不尽相同，其水解液中的糖分组成以及形成的抑止性物质也各不相同。但 总的说来，木糖是半纤维素组成中含量晟多的糖分。木质素是一种芳香族的高分子化合物，占植 物干重的1 5 3 0 ，其在植物中的作用是将纤维索以及纤维细胞粘在一起，草类植物中的木质素 含量较低，相对半纤维素含量较高”l 。 表1 - 1不同木质纤维素类物质的组成。1 。 t a b l e1 1t h ec o m p o s i t i o no fv a r i o u $ b jo m a s so fiig n o m e ii u i o s e 1 2 2以植物纤维素为原料生产酒精的技术难题 3 中圈农业大学硕士学位论文 第一章绪论 以植物纤维素类废料生产酒精是最具有挑战性的课题。目前，用纤维素类废料生产酒精的 关键问题是纤维素原料的预处理和高效的发酵工艺。酶法水解的关键是纤维素酶的成本。2 0 0 1 年 美国i o g e n 公司在纤维素酶的开发上有了较大的突破，建立了世界最大的纤维素处理装置。该装 置的应用使得燃料酒精的生产成本可以和以谷物淀粉为原料生产酒精的成本相竞争”1 。如果进一 步改善工艺，降低成本，将使乙醇成为替代性的环保燃料。 利用秸秆等农作物发酵制备酒精的另一个关键问题是如何利用植物纤维原料中的戊糖( 约占 2 0 3 0 ) ”1 。2 0 世纪8 0 年代以前人们认为木糖( 戊糖) 不能被酵母发酵，直到1 9 8 0 年w a n g 等“ 提出木糖可以被一些微生物发酵生成酒精后，国际上掀起了一股木糖酒精发酵菌株的研究热潮， 迄今已发现1 0 0 多种微生物可代谢木糖生成酒精，包括细菌、丝状真菌和酵母“。其中酵母菌发 酵木糖能力最强，目前人们研究晟多的最具有工业应用前景的发酵木糖产乙醇的微生物有三种酵 母菌即嗜鞣管囊酵母( p a c h y s o l e nt a n n o p h i l u s ) 、树干毕赤酵母( p i c h i as t i p i t i s ) 和休哈塔 假丝酵母( c a n d i d as h e h a t a e ) 。但是这些菌株的酒精耐受能力差，发酵过程中控氧条件严格， 同时也只能在常温条件下进行发酵，这就影响其工业应用。 1 2 3 发酵木糖生产酒精的研究概况 随着能源需求量的加大，燃料酒精的生产越来越受到人们的重视。传统酒精由淀粉质原料发 酵得到。利用成本更低的木质纤维素生产燃料酒精，不仅能减轻纤维素类废料对环境的污染，同 时能缓解人类的粮食危机。因此，以纤维素废料作为燃料酒精的生产原料成为重要的研究方向。 富含纤维素和半纤维素的植物原料是最有潜力的酒精生产原料。在植物纤维素中，纤维素、半纤 维素以及术质素的含量比为4 ：3 ：3 ，天然半纤维素如术聚糖水解产物的8 5 9 0 是木糖“。充分 利用纤维素原料中的木糖发酵生产酒精，能使纤维素原料的酒精发酵的产量在原有的基础上增加 2 5 “。因此，发酵本糖产酒精是决定植物纤维资源生产酒精经济可行的关键因素。本课题通过 对构建高温f 共发酵木糖和葡萄糖的酵母工程菌的研究，为纤维素的充分利用打下了菌种方面的 基础。 1微生物发酵木糖生产酒精的代谢机理 术糖的异构化是微生物木糖代谢的最初的生化反应。在大多数细菌( 如ec o l i 和b a c i l l u s 等) 中，木糖首先在水糖异构酶( x y l o s e i s o m e r a s e ) 作用下，转化为木酮糖。然后在术酮糖激 酶( k i n a s e ) 的作用下转变成磷酸木酮糖，继而进入磷酸戊糖循环代谢成为酒精“。在酵母菌中， 需经过两步氧化还原反应将木糖转化为木酮糖。首先在依赖于n a d ( p ) h 的术糖还原酶( x y l o s e r e d u c t a s e ，x r ，e c l 1 1 2 1 ) 的作用下将术糖转化为木糖醇；然后依赖丁n a d + 的木糖醇脱氢( x y l i t o l d e h v d r o g e n a s e ，x d h ，e c1 1 1 9 ) 的作用将木糖醇转化为水酮糖。木酮糖经木酮糖激酶 ( x y l u l o k i n a s e ，e c2 7 1 1 7 ) 作用磷酸化后进入磷酸戊糖循环( t h e p e n t o s ep h o s p h a t ep a t h w a y ， p p p 途径) ，经过系列的生物化学反应生成乙醇“。酵母的戊糖发酵是在兼性厌氧条件下进行，其 总反应式为“： 3c 出1 0 0 j - 5c 2 h s o h + 5c 嘎 4 酵母木糖代谢的途径比葡萄糖代谢的途径复杂得多。在代谢过程中部分术糖转化为其他副产 物。因此，酵母木糖代谢产酒精的理论得率为0 4 6 克酒精克木糖“”，低于葡萄糖酒精发酵的理 论得率0 5 1 克酒精克葡萄糖。 木糖代谢通过磷酸戊糖支路与葡萄糖代谢相联系。具体代谢途径见图1 - 1 。 小糖还原酶催化木糖到木糖醇的反应，是酵母中木糖代谢的第一步，通常木糖还原酶是n a d p h 特异性的。但是树干毕赤酵母( p s t i p i t i s ) 中的木糖还原酶却有显著的以n a d h 为辅助因子的木糖 还原酶活力“。n a d h 的活性对于木糖代谢是至关重要的，因为木糖代谢的第二步的关键酶木糖醇 脱氧酶是m a d p h 专一性的，如果木糖还原酶也是n a d p h 专一性的，除非存在其它方式再生n a d ， 否则就会出现辅助因子的不平衡“。木糖还原酶是诱导酶，受到培养基中木糖的诱导。术糖代 谢的第二步就是将木糖醇氧化成木酮糖，n a d + 依赖型的水糖醇脱氢酶催化这一反应。木糖醇脱氢 酶也属于诱导酶，d 一木糖和l 一阿拉伯糖对木糖醇脱氢酶都有诱导作用。但是木糖醇对该酶并没 用诱导作用。术糖代谢中的第三关键酶是木酮糖激酶( x k s ) ，由x k s l 基因编码。该酶将小酮糖 转化生成5 一磷酸木酮糖，然后5 一磷酸木酮糖再与磷酸戊糖支路中的氧化型步骤生成的5 一磷酸 核糖一起经过磷酸戊糖途径中的非氧化部分生成6 一磷酸果糖和3 一磷酸甘油醛，然后进入糖酵 解代谢，进而生成乙醇等代谢产物。 2 发酵木糖生产酒精的菌种选育 ( 1 ) 自然筛选 木糖一直被认为不能被微生物发酵产酒精。直到1 9 8 0 年w a n g 等人发现木糖可被一些微生物 发酵产生酒精”“。至今，人们发现能发酵木糖产生酒精的微生物包括细菌、丝状真菌和酵母菌。 就酵母菌而言，6 个种( 酒香酵母、休哈塔假丝酵母、产朊假丝酵母、嗜鞣管囊酵母、季也蒙毕 赤酵母和树干毕赤酵母) 能产生相对较大量的酒精”“。能发酵术糖的酵母菌大致分为两大类，一 类能在厌氧条件f 发酵木糖产生酒精如嗜鞣管囊酵母。另一类在发酵木糖时需有部分氧存在， 如产朊假丝酵母。这些菌株由于发酵速率慢以及产生大量副产物而不能应用于酒精工业生产。 1 9 8 4 年b u r i n e n b e r g 。”等人发现树干毕赤酵母发酵木糖的能力优于其它酵母， 它能在厌氧条件 f 较快地发酵木糖产生酒精，但其酒精产率较低。 酿酒酵母是工业上生产酒精的优良菌株。但酿酒酵母不能发酵木糖，只能发酵木糖的异构 体一术酮糖。因此，人们通过各种育种技术构建能发酵木糖产生酒精的酵母工程菌。 ( 2 ) 发酵木糖产生酒精的酵母工程菌的构建 采用原生质体融合技术提高酵母菌发酵木糖产酒精的能力是有效的育种方法之。w a n g ，g s 曾经以酿酒酵母和嗜鞣管囊酵母n r r l y - 2 4 6 0 进行原生质体融合，融合子在糖蜜培养基上的酒精 耐受能力较亲株提高1 0 ，但融合子发酵木糖产酒精的能力没有明显提高。“2 s j ol l e l u a n e 等人也 得到嗜鞣管囊酵母与酿酒酵母的融合子，融合子发酵各种糖的能力介于两亲株之间，但不发酵木 糖产酒精“。j h a n n s a n ，e 等通过融合得到休哈塔假丝酵母和树干毕赤酵母的融合子，融合子的 水糖发酵能力比亲株略微提高”。毛华等人获得了树干毕赤酵母和酿酒酵母的融合子。融合子厌 自! ! ! ! ! ! s 目| | ! ! ! ! ! ! ! g | ! ! ! ! ! ! ! 目| 自! ! ! ! ! ! ! 目_ 自! ! ! ! ! ! 目目目_ ；：= ： 氧发酵木糖以及木糖一葡萄糖共发酵能力明显优于亲株1 。 由于基因工程技术的发展，人们开始通过基因工程的方法构建发酵木糖的基因工程菌。 j e f f e r i e s “等将编码丙酮酸脱羧酶和乙醇还原酶的基因克隆到ec o i l 中，构建了发酵木糖产 酒精的基因j _ = 程菌。使细菌发酵木糖的酒精得率提高到0 4 4 克酒精克木糖。运动假单孢菌具有 能发酵高浓度糖和高酒精产率的特性，并且能抗纤维素原料水解液中的抑制性物质，但运动假单 孢菌不能发酵木糖。与细菌的酒精发酵相比，酵母菌具有酒精耐受能力高，副产物少等优点。同 时经酵母菌发酵过的木质纤维素原料能直接用于饲料而不会产生毒性。此外，酵母菌酒精发酵不 易被细菌和病毒污染。为此，有关学者仍致力于发酵木糖产生酒精的酵母工程菌的研究。 w i l h e l n 和h m o r e “等人将细菌的木糖异构酶基因克隆到酿酒酵母中，但转化子表达的木糖 异构酶几乎没有活性。c h a n 。”等将大肠杆菌的木糖异构酶基因克隆到粟酒裂殖酵母中，转化子发 酵木糖产生3 7 的酒精，达理论产值的8 0 。b r u i n e n b e r g 和d e l l w e g 。”等将树干毕赤酵母的 木糖还原酶基因x y l l 和木糖醇脱氢酶基因x y l 2 克隆到酿酒酵母中，转化子能在以木糖为唯一碳 源的培养基上缓慢生长，但所利用的木糖全部被氧化，酒精产率相当低。b j o r nj o h a n s s o n 1 等 将木酮糖激酶基因m ( s 1 克隆已含有x y l l 和x y l 2 基因的酿酒酵母转化子中。使木糖醇的产率降 低，酒精产率明显提高。n a n c y 等通过改变酵母菌的木糖代谢途径通过克隆控制代谢途径的相 关基因，改变碳源的代谢流向，得到酿酒酵母工程菌，既能单独利用木糖和葡萄糖，同时能实现 木糖和葡萄糖的共发酵。其后又通过增加分别表达船、x d h 以及厨基因的拷贝数而得到稳定的 葡萄糖和木糖共发酵的酿酒酵母工程菌株。“。 3 发酵木糖生产酒精的发酵条件研究 ( 1 ) 培养基成分的优化研究 v a nz y l 等在以木糖为唯一碳源的培养基中分别添加葡萄糖和棉子糖为辅助碳源，用带有 x y l l 和x y l 2 基因的重组酿酒酵母菌株h 1 8 5 进行发酵，木糖的利用率与在以木糖为唯一碳源的 培养基上的发酵相比提高了将近三倍。相比而言，以棉子糖作为辅助碳源，木糖利用率又比以葡 萄糖为辅助碳源提高约1 2 ，但木糖醇产率也相应提高。毛华等研究了树干毕赤酵母和酿酒酵母 的融台子的葡萄糖和木糖混合发酵，当葡萄糖和木糖的比为1 ：1 时，酒精产率最高“。木糖发酵 产生酒精与氮源也有一定关系。v a nz y l 等的研究结果表明重组酿酒酵母菌株h 1 8 5 在完全培养基 中比在基本培养基中能更充分地发酵木糖。重组酿酒酵母菌株h 1 8 5 分别在含有8 0 肌木糖的基 本培养基和完全培养基中发酵，完全培养基中木耱消耗速率比基本培养基中小糖消耗速率快两倍 还要多。 ( 2 )培养条件对木糖发酵的影响 i营养因子、p h 值、温度对木糖发酵的影响 培养基的营养网子对木糖发酵有很大的影响。如休哈塔假丝酵母在缺少生物素和硫氨素的条 件f 几乎不发酵木糖产生酒精。树干毕赤酵母对维生素没有特别的要求，但添加维生素和生物素 能显著提高术糖发酵的酒精产率3 ”4 i 。培养基中添加有机氮源能捉高休哈塔假丝酵母木糖发酵的 g l u c o s e h x k l h xk 2 ，g 。 o 。r n o s p n o g l u c o n o 。o 。l a c o t o n e i f l ( 1 t p g l , 6 p 9 2 - 3 - p 一 r 夕k ；l y c e r a t e x 删： m 。： 1 e n 0 2 p y r a v a t e i p y k l m 咖辩牛 l p v r u v a t e a c e t y lc o a k a c s l a c s 2 d a c e t a l d e h y d e n 曲- 肿z a c e t i ca c i de t h a n o l 图卜1酵母中葡萄糖代谢和木糖代谢之间的联系。 f i gi - 1t h ec o r e a t i o no f g l u c o s em e t a b o l i ca n dx y l o s em e t a b o l i ci nt h ey e a s t s 一7 一 酒精得率，添加无机氮源( 如硫酸氨) 能同时提高酒精产率以及产物中酒精与木糖醇的比率。 d u p r e e z l 3 ”6 j 等人报道休哈塔假丝酵母生长的最适p h 值为3 5 4 5 。当p h 值在2 5 6 5 之间变 化时，休哈塔假丝酵母c b s2 7 7 9 和树干毕赤酵母c b s 7 1 2 6 的水糖发酵的酒精产率变化很大。 两者发酵的最佳p h 是在4 5 5 5 之间。树干毕赤酵母5 7 7 3 的发酵p h 值范围较为广泛。 一般来讲酵母菌发酵木糖的最佳温度在3 0 3 2 ，但是最佳的发酵温度与各菌株的性能、底 物浓度均有关。休哈塔假丝酵母c b s 2 7 7 9 和树干毕赤酵母c b s 7 1 2 6 的最佳生欧速率和发酵速率 是在3 0 ( 2 。提高发酵温度，酒精的产率显著降低，木糖醇产率增高。相比而言，嗜鞣管囊酵母发 酵木糖在3 0 3 7 的范围内，随着温度的增加，木糖醇的产率显著降低，而乙醇的产率则几乎没有 影响【3 ”。温度不仅影响木糖发酵的酒精产率同时影响酵母菌株的酒精耐受能力。如休哈塔假丝 酵母c b s 2 7 7 9 和树干毕赤酵母c b s7 1 2 6 在1 1 2 2 的范嗣内酒精耐受能力达到最高”。 i i酒精和底物浓度对发酵木糖的影响 多数情况下，术糖浓度在1 0 0p i e 或者更高时所积累乙醇终浓度达到最高值。然而当木糖 浓度比较低时，乙醇比增长速率最大。木糖浓度达到4 0g l 或稍高时就抑制树干毕赤酵母 c b s 5 7 7 3 的生长，但其乙醇得率却保持稳定，不随底物浓度的升高而降低。菌株的酒精耐受力是 限制纤维素中术糖利用除温度之外的另一关键因素。菌株的酒精耐受力随菌种的不同而不同，同 时受培养温度和碳源的性质的影响。如嗜鞣管囊酵母和棒孢酵母，在以葡萄糖为发酵底物时，两 者的酒精耐受力较发酵木糖时高得多”7 l 。因此，在培养基中添加一定的葡萄糖有利于提高发酵术 糖的菌株的酒精耐受能力。2 。原因可能是葡萄糖的添加可能抑制酵母菌的无氧呼吸，但添加葡 萄糖同样影响到菌株的酒精耐受能力。 i i i 供氧量对木糖发酵的影响 合适的供氧对酵母菌的木糖发酵来讲十分重要3 “。氧的供应不仅影响酒精产生的速度，跟 水糖醇的积累也有关系。通风速度决定了培养基中的碳源在酵母生长和产物积累中的分配。合适 的供氧量能提高木糖发酵的酒精产率同时能降低副产物木糖醇的积累。寻找合适的通气量使得乙 醇产量和菌体量都达到最高，而降低木糖醇的积累，一直是有关学者的研究方向。不同的酵母菌 株的木糖发酵有不同的最佳溶氧量( d o t ) 。当发酵培养基中的d o t 值超过1 时，树干毕赤酵 母就不再产生酒精。休哈塔假丝酵母和嗜鞣管囊酵母产生酒精的最佳d o t 值都明显低于1 。一 般来讲，木糖发酵的最佳d o t 值很低，难以用溶氧电极测出。因此，通过氧传递速率( o x y g e n t r a n s f e rr a t e o t r 值) 来表达木糖发酵中的需氧量。d e l l w e g 。“等人通过在线计算机控制o t r 值 和检测光密度值来控制木糖发酵中的需氧量。当氧的比吸收速率为0 3 m m 0 1 g 。1 h 1 时，酒精产率达 到最大值0 4 4g 幢。就休哈塔假丝酵母而言，当其在以木糖为唯一碳源的培养基上生长时，无氧 状态会导致细胞死亡：而当在修哈塔假丝酵母的培养基中添加一定量的葡萄糖时，无氧状态不会 诱导细胞死亡，同时能提高木糖的转化率”。 1 3本课题的研究意义和内容 1 3 1 本课题研究意义 随着西方国家工业化进程的加深和一些发展中国家工业化经济的快速发展和崛起，石油和 天然气等化石燃料不断消耗殆尽。石油等不可再生资源面临着枯竭的危险。另外，全球石油资源 分布比较集中，包括美国、加拿大、中国等在内的许多国家的石油供给大部分需要从海湾、俄罗 斯等产油国进口。2 0 世纪7 0 年代的两次石油危机的历史教训和近年来石油价格的频繁上涨的现 实告诉我们寻求石油的可替代能源，减少石油进口国经济发展对石油的依赖性是很有必要的。巴 西、美国等国家在2 0 世纪初就开始开发石油资源的替代品。燃料乙醇就是在这一背景下应运而 生的。 我国虽然是世界第五大产油国，但随着我国经济建设的不断深入发展，从1 9 9 3 年起，我国 就成为了石油净进口国。到2 0 1 0 年，我国的石油需求量将有3 0 依赖于进口，经济发展对进口 石油的依赖可想而知。大力发展燃料乙醇的生产已经成为我国十五规划中的一项重要内容。 我国人口众多，可耕地面积少。如果以粮食生产乙醇来满足燃料乙醇市场的需求显然不可 行。另一方面，我国是农业大国，仪我国每年农林纤维素类废弃物就有近1 0 亿吨。如果能以纤 维素类生物质为原料生产燃料乙醇，不仅可以节约粮食，而且对环境保护来讲也是一大贡献。 木糖是纤维素类生物质的水解液中含量仅次于葡萄糖的单糖组分，最多可占到3 1 。因此， 木糖的完全转化生产乙醇是实现木质纤维素有效生物转化生产乙醇的关键。传统的乙醇发酵菌株 是酿酒酵母，该菌株具有许多其它酒精酵母以及细菌无法比拟的优点，而且是普遍认为安全的微 生物”“。酿酒酵母是乙醇发酵的首选菌株。但是野生型的酿酒酵母不能发酵木糖生产乙醇，这给 木质纤维素的生物转化带来了很大的难题。通过研究表明，酿酒酵母虽然不能发酵木糖产生乙醇， 但是它能利用木糖的异构体一木酮糖产生乙醇。这暗示我们可以将其它微生物中术糖到术酮糖的 代谢途径引入到酿酒酵母中就有可能能利用t 小糖产生酒精。 1 3 2 课题研究的内容 经济有效的将木质纤维素原料中的木糖转化为酒精，依赖于纤维素水解原料的成本( 基本 上为纤维素酶的成本) 以及有效的木糖发酵菌株。菌种选育和菌株改良一直是本研究的首要研究 内容，在这方面也有一定的基础和经验。国外对开发能够利用木糖生产乙醇的菌株选育做了很多 工作。现在虽然通过菌株的筛选以及基因工程等手段使酒精产量得到提高，但是纤维素原料的水 解以及发酵术糖生产酒精的工业化仍存在许多挑战性问题。如在纤维素的同步糖化发酵中，酶的 最适温度和酵母菌生长以及发酵的最适温度不一致性，以及酵母菌的酒精耐受能力等严重影响发 酵本糖生产酒精的工业化。本课题针对纤维素酶的最适温度和酵母的发酵温度不一致的问题以及 普通工业酿酒酵母不能同时发酵木糖生产酒精的问题，有目的的构建能在高温下共发酵五、六碳 糖的酵母t 程菌，为利用纤维素类原料生产燃料酒精打下菌种方面的基础。为进一步的菌株改良 工作奠定一定的基础。 因此，本课题拟在以下几个方面展开研究： 1亲株高温酿酒酵母的筛选咀及发酵术糖生产酒精酵母亲株的筛选。 2 融合亲株遗传标志的获得。 3原生质体的制备、融合以及优良融合子的筛选。 4 优良融合子的发酵条件的研究。 构建高温下共发酵五、六碳糖酵母工程菌，首先得确定具有优良目的性能的亲株，并确定亲 株的筛选遗传标志。通过原生质体的制各、融合、融合子的筛选，最后得到性状优良的遗传融 合子，并对其发酵条件进行优化研究。 第二章融合亲株的筛选、单倍体获得及遗传标志的确定 2 1 引言 微生物细胞原生质体融合技术一方面可以利用营养互补体系自大量个体中选出种问、种内、 属间甚至亲缘关系更远的杂种后代，为遗传学的分析和研究提供新的途径：另一方面可以人为 地创造一定的环境，使那些缺乏或难以完成有性及准性生殖的种、属间的细胞进行融合，以获得 不同种、属间甚至亲缘关系更远的工业高产菌种。 1 9 7 6 年，s i p i c z k i 和f e r e n c z y 对酵母原生质体融合获得成功“。随着工业微生物育种的发 展，原生质体融合技术的应用领域越米越多。原生质体融合技术可以在不受结合型限制的条件下 进行微生物的育种工作。而带有遗传标记的单倍体的获得，在微生物原生质体融合技术中又占有 极重要的地位，它可以减少后代的分离，有利于获得稳定的融合子以及简化融合子筛选工作。 原生质体融合前首先必须对亲本进行遗传标记，从而有利于挑选融合子。在融合中，可以采 用营养缺陷型、抗药性、灭活原生质体、荧光染色、形态差异和自然生态标记等方法。其它辅助 方法有d n a 含量的测定、同丁酶电泳、电镜观察等与上述方法一起配合使用。营养缺陷型标记是 一种传统有效而直接的方法。优点是准确可靠，在排除污染的情况下，在基本培养基上长出的菌 落即可初步认为是融合子。但是在诱变中可能损伤控制优良性状的基因而导致优良性状损伤，而 采用性能优良的单一营养缺陷型菌株作为融合亲株能减少优良性状的损伤。 酵母为单细胞型真菌，一般以出芽方式生殖。在通常情况f ，繁殖体为双倍体，但是经过特 定条件的诱导，可以使其产生单倍体孢子并山芽产生单倍体繁殖体。单倍体细胞具有a 型和a 型 两种交配型。两种交配型细胞经其细胞壁上特定的凝聚因子诱导而进行交配，回复为二倍体：同 一交配型细胞之间，则因细胞壁上的凝集冈子的存在而不能进行交配。一般而言，杂交育种运用 了酵母的单烈倍生活周期，将不同基因型和相对的交配型的单倍体细胞经诱导杂交而形成二倍体 细胞，经筛选便可以获得新的遗传性状。 带有遗传标记盼l 生状优良的单倍体是获得稳定优质融合子的前提。诱变( 化学诱变、物理 诱变) 是认为的提高突变频率的有效方法。本章从实验室( 本章研究内容在中国科学院微生物所 酵母遗传与育种实验室完成) 现有菌株种筛选得到高温酿酒酵母钾，。并以高温酿酒酵母g 4 7 和术糖发酵菌株休哈塔假丝酵母1 7 6 6 为融合亲株。对两亲株进行单倍体菌株的分离研究。通过 化学诱变剂d e s ( 硫酸二乙酯) 对高温酵母6 4 7 和1 7 6 6 诱变获得带有稳定遗传标记的亲株。为 后续的原生质体融合做准备。 2 2 材料与方法 2 2 1 实验材料 1 出发菌株 中科院微生物所遗传与育种实验室保存的5 2 4 株酵母菌。修哈塔假丝酵母1 7 6 6 ( 原a t c c 3 4 8 8 7 ) 购于中国食品与发酵工业菌种保藏中心。 2 试剂 ( 1 ) p l l7 0 的磷酸缓冲液( 0 2m ) ( 2 ) 蜗牛酶( s i g m ac o ) 液：用p b s 配制，o 2 2 岫无菌过滤器过滤。 ( 3 )制霉菌素( s i g m ac o ) ：9 5 乙醇溶液配制。 ( 4 ) 0 2m 磷酸缓冲液，p h5 8 。 ( 5 )无菌生理盐水。 ( 6 ) p b s 液：p b 液加0 8m 山梨醇。 ( 7 )硫酸二乙酯：以p b 液配制。 ( 8 ) 0 1 b 一巯基乙醇：9 9 9m lp b 液中加0 1m lb 一巯基乙醇。 ( 9 )生妖因子 脯氨酸谷氨酸苯丙氨酸谷氨酰氨亮氨酸赖氨酸酪氨酸组氨酸 甲硫氨酸色氨酸缬氨酸苏氨酸甘氨酸胱氨酸6 一苄氨基嘌呤 半胱氨酸丙氨酸 ( 1 0 )1 0m g m l 的硫酸铵溶液( 用液体删培养基配制) 3 培养基 y e p x 液体培养基：酵母膏1 0 ，蛋白胨1 0 ，术糖2 o 。 y e p x 固体培养基：在y e p x 液体培养基中加入2 0 琼脂粉。 y e p d 液体培养基：酵母膏1 0 ，蛋白胨1 0 ，葡萄糖2 o 。 y e p d 固体培