（食品科学专业论文）利用木糖高温发酵生产L乳酸优良菌株的筛选及发酵条件的优化.pdf

摘要本文开展了乳酸细菌利用木糖高温发酵生产l 一乳酸的研究。首先在各种适合于乳酸菌生长的自然环境中采集了1 2 6 个样品，然后进行了乳酸菌的筛选试验，优选出2 株l 一乳酸产量较高且遗传性比较稳定的菌株，对该两株菌的种子培养条件及影响l - - 孚l 酸发酵的因素进行了系统的研究，同时对玉米芯l 一乳酸发酵进行了初步的探讨。结果表明，t 1 1 1 和0 7 7 的最佳种子培养条件为：在2 0 0 m l _ = 角瓶中于盛装l o o m l 种子培养基，摇床培养1 6 h ；其最佳发酵培养基组分为( g l ) ：蛋白胨5 0 ，酵母浸粉3 0 ，牛肉膏2 0 ，木糖6 0 0 ，m n s o t 4 h ：00 0 4 ，m g s o 。7 h 。0o 2 ，f e s o 。7 h 。00 0 5 ，k 。h p 0 42 o ：最佳发酵条件为：2 5 0 m l 输液瓶装载1 5 0 m l发酵培养基，接种1 0 ，在4 6 条件下摇床发酵4 8 h ；利用t 1 1 1 和0 7 - 7 进行玉米芯l 一乳酸发酵，其l 一乳酸产量分别为：3 1 3 0 9 l 和3 0 8 8 9 l ，转化率分别为5 2 1 7 和5 1 4 7 。关键词：l 一乳酸；菌种筛选；发酵条件：玉米芯s c r e e n i n gt h eb a c t e r i af e r m e n t i n gx y l o s et ol l a c t i ca c i da th i g ht e m p e r a t u r ea n do p t i m i z i n gc o n d i t i o n so ff e r m e n t a t i o na b s t r a c tt h j sp a p c rd e v e l o p e dt h es t u d yo ni a c t o b a c i l l u st op r o d u c el - l a c t i ca c i du s i n gt l l ex y l o s ea th i g ht e m p e r a t u r e f i r s t ，1 2 6s a m p l e sw e r eg a t h e r e di nt h en a t u r a le n v i r o n m e n ti nw h i c hg r e wt ot h ei a c t o b a c i l l u s t h e nh a dc a r d e do nt h es c r e e n i n ge x p e r i m e n to fl a c t o b a c i l l u s a n d2l a c t o b a c i l l u sw i t hh i g h e ra n ds t e a d i e ro u t p u to fl - l a c t i ca c i dw e r es e l e c t e d ，a n dc u l t u r ec o n d i t i o n so fs e e da n di n f l u e n t i a lf a c t o r so fl - l a c t i ca c i df e r m e n t a t i o nw e r ee x p l o r e d s i m u l t a n e o u s l yp r o d u c i n gl - l a c t i ca c i du s i n gc o r n c o bw a se l e m e n t a r yd i s c u s s e d f i n a l l yi n d i c a t e d ，t h eb e s ts e e dr a i s ec o n d i t i o n so ft 1 1 1a n d0 7 7i s ：1 0 0 r a ls e e dc u l t u r em u d i u mi n2 0 0m lt r i a n g l eb o t t l e ，1 6h o u r si ns h a k eb e d ；i t sb e s tc o m p o n e n tf e r m e n t a t i o nm e d i u mi s ( l ) ：p e p t o n e5 0 ，y e a s te x t r a c t3 0 ，b e e fp a s t e2 0 ，x y l o s e6 0 o ，k 2 h p 0 42 0 ，m n s 0 4 4 h 2 00 0 4 ，m g s 0 4 7 h 2 00 2 0 ，f e s 0 4 7 1 4 2 00 0 5 ；t h eb e s tf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o ni s - 1 5 0 m lf e r m e n t a t i o nm e d i u mi n2 5 0 m lb o t t l e ，v a c c i n a t e s1 0 ，4 8h o u r si ns h a k eb e du n d e r4 6 ：t h eo u t p u to fl - l a c t i ca c i du s i n gt 1 1 - 1a n d0 7 - 7f r o mc o r n c o br e s p e c t i v e l yw e r e3 1 3 0 9 la n d3 0 8 8 9 l ，a n dt h ec o n v e r s i o nr a t er e s p e c t i v e l yw e r e5 2 1 7 a n d5 1 4 7 k e yw o r d ：l l a c t i ca c i d ；s c r e e n i n gf o rb a c t e r i u m ；c o n d i t i o n so ff e r m e n t a t i o n ；c o r n c o bd ir e c t e db y ：p r o f l iz h e n g y i n gv i c op r o f d i a n gd u n p i n ga p piic a n tf o rm a s t e rd e g r e e ：z h a n gxiu f e n g ( f o o ds c i e n c e )( c o l l e g eo f f o o ds c i e n c ea n de n g i n e e r i n g ，i n n e rm o n g o l i a a g r i c u l t u r a lu n i v e r s i t y h u h h o t0 1 0 0 1 8 ，c h i n a )插图和附表清单表1 乳酸异构体的物理性质表2 蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏l 。( 3 3 ) 正交表表3m n 2 + 、m 9 2 、f e 2 + l 9 ( 3 3 ) 正交表表4 发酵方式表5 样品富集结果表6 菌种分离结果表7 初筛结果表8 遗传稳定性试验结果表9 样品0 d 值表1 0 种子培养基装载量对l 一乳酸发酵的影响表1 1 种子培养基装载量与样品0 d 值表表1 2 木糖浓度对l - $ l 酸发酵的影响表1 3 不同木糖浓度转化率表表1 4 蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏正交试验结果( 0 7 - 7 ) 表1 5 蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏正交试验结果( t l l - 1 ) 表1 6 蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏正交试验方差分析表( 0 7 - 7 ) 表1 7 蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏正交试验方差分析表( t 1 1 - 1 ) 表1 8m n 外、m 9 2 + 、f e 2 正交试验结果( 0 7 7 ) 表1 9m n h 、m g 舡、f e 2 正交试验结果( t 1 1 - 1 ) 表2 0m n 2 + 、m 9 2 、f e 2 + 正交试验方差分析表( 0 7 7 ) 表2 lm n 争、m g 舢、f e 2 + 正交试验方差分析表( t l l 一1 )表2 2 接种量对l 一乳酸发酵的影响表2 3 发酵时间对l 一乳酸发酵的影响表2 4 发酵温度对l 一乳酸发酵的影响表2 5 发酵方式对l 一乳酸发酵的影响表2 6 装载量对l - - 孚l 酸发酵的影响表2 7 不同处理还原糖含量表表2 8 玉米芯卜乳酸发酵结果2 9 图l乳酸的两种对映体结构式23 0 图2 同型乳酸发酵途径62坞均加虬毖捣船衢历砑盯约船匏船骝踮腮蚰虬铊l互文龟曩&l吼加u挖nm垢拍埔均加扒毖船孔沥撕盯勰图3 异型乳酸发酵途径7图4 菌种筛选流程图1 5图5t 1 1 - 1 、0 7 - 7 的生长曲线图2 4图6 种子培养基不同装载量0 d 值及l 一乳酸产量图( t l l 一1 ) 2 5图7 种子培养基不同装载量0 d 值及l - - 孚l 酸产量图( 0 7 - 7 ) 2 6图8 木糖浓度与l 一乳酸产量的关系图2 7图9 木糖浓度与转化率关系曲线图2 8图1 0 蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏对l 一乳酸发酵的影响图( 0 7 7 ) 3 1图1 l 蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏对l 一乳酸发酵的影响图( t l l 一1 ) 3 1图1 2m n 2 、m 9 2 、f e 2 + 对l 一乳酸发酵的影响图( 0 7 - 7 ) 3 4图1 3m n 2 + 、m f + 、f e 2 + 对l 一乳酸发酵的影响图( t 1 1 - 1 ) 3 4图1 4 接种量与l 一乳酸产量的关系图3 6图1 5 发酵时间与l 一乳酸产量的关系图3 7图1 6 发酵温度与l 一乳酸产量的关系图3 8图1 7 发酵方式与l 一乳酸产量的关系图3 9图1 8 装载量与l 一乳酸产量的关系图4 0图1 9 还原糖浓度随水解时间及磷酸浓度变化图4 1趴驼弘盯强曲们虬心们必蛎们钉，tp l a ( p o l y l a c t i ca c i d )缩略语表e m p ( e m b d e n m e y e r h o f p a r n a sp a r t h w a y )s s f ( s i m u l t a n e o u ss a c c h r i f i c a t i o na n df e r m e n t a t i o n )f b c( f e d - b a t c hc u lt u r e )聚乳酸糖酵解途径同步糖化发酵半连续发酵n a d p h ( r e d u c e dn i c o t i n a m i d ea d e n i n ed i n u c l e o t i d )还原型烟酰腺嘌呤二核苷酸n a d +( n i c o t i n a m i d ea d e n i n ed i n u c l e o t i d e )i t m p( h e x o s em o n o p h o s p h a t ep a t h w a y )l 一酶d l - 酶t c a 循环( t r i c a r b o x y l i ca c i dc i r c u l a t i o n )i s p rd n s 法烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸己糖途径l 一2 一卤代酸脱卤酶d l 一2 一卤代酸脱卤酶三羧酸循环原位产物分离3 ，5 - - - - - 硝基水杨酸比色法内蒙古农业大学硕士学位论文11引言乳酸是广泛存在于人、动物、植物和微生物等生物体中的有机酸，是食品工业中重要的酸味剂和防腐剂，也是医药、印刷、印染、制革工业的重要化工原料之一。其分子结构中含有一个不对称碳原子，因此具有旋光性，按其构型可分为d ( 一) 一乳酸、l ( + ) 一乳酸和d l - 孚l 酸三种n “。人体只含有l 一乳酸脱氢酶，只能代谢利用l 一乳酸，过多食用d - - 孚l 酸或d l - - 孚l 酸会导致人体代谢功能的紊乱，危害人体健康啪。因此，从健康角度考虑，用l 一乳酸代替目前在食品和医药工业中普遍使用的d 一乳酸或d l - 孚l 酸已是必然趋势。尤其是近几年，聚乳酸( p l a ) 被广泛应用于生物可降解塑料、绿色包装材料、胶囊包衣、生物植片、手术缝合线等的生产中，这都给l 一乳酸的发展带来了巨大的促进作用。乳酸的生产方法主要有化学合成法、酶法和发酵法三种。化学合成法生产的产品是外消旋乳酸，即d l 一乳酸，由于化学合成法所用原料是乙醛和剧毒物氢氰酸，所以尽管美国食品和药物管理局已将化学合成法生产的乳酸列为安全产品，但发达国家还是不能放心使用合成法制得的乳酸0 1 。同时，由于用于化学合成生产乳酸的原料主要来自于石油的裂解，在资源日益紧张的今天，利用合成法生产乳酸受到了大大的限制；酶法虽然可以得到l 一乳酸，但生产工艺比较复杂，应用到工业上还有待于研究；发酵法生产乳酸可以通过菌种和培养条件的选择获得l 一乳酸，而且其原料来源广泛、产品光学纯度高，因此成为目前l 一乳酸生产的重要方法，。目前我国乳酸生产主要以葡萄糖和淀粉等为原料，不仅消耗大量的粮食资源，而且使乳酸成本居高不下，大大限制了乳酸的应用，尤其是限制了聚乳酸在环保领域的应用“。所以，利用植物纤维原料发酵生产乳酸，不仅可以缓解粮食的紧张局势，而且可以大大降低乳酸的生产成本。植物纤维原料是人类可利用的最丰富的天然可再生资源。我国农副产品和野生植物资源丰富，据估计，农业植物纤维废料的年产量约11 7 8 0 万吨，其中稻壳3 3 8 6 万吨，麦杆6 5 0 0 万吨，玉米芯1 2 5 0 万吨，甘蔗渣4 0 5 万吨，棉籽壳2 0 0 万吨，向日葵壳2 7 万吨，油菜壳1 2 5 万吨“”“。这些资源大多未能得到有效利用。在我国的一些玉米、小麦和水稻产地，每年夏秋季节秸秆被大量焚烧，不仅造成了巨大的资源浪费，同时，滚滚浓烟及排放的大量有害气体造成了严重的环境污染，甚至影响了飞机的正常飞行。人类赖以生存的环境正在不断恶化，如何有效地将植物纤维原料转化为能源或其它工业产品有着极其深远的意义。植物纤维原料作为自然界最主要的碳水化合物储存物，包含纤维素、半纤维素和木质素三部分。半纤维素可以在半纤维素酶系或酸的作用下产生以木糖为主的还原性戊糖类，进而可以在乳酸菌的作用下转化生成乳酸m ：。在农业植物纤维原料的水解产物中，木糖含量较高，而且分布比较稳定。虽然许2利用木糖高温发酵生产l - * l 酸优良菌株的筛选及发酵条件的优化多微生物可以代谢木糖，但存在着木糖发酵速度慢，产物产率较低等问题，因此，筛选优良的木糖发酵菌株对利用农业植物纤维原料发酵生产乳酸有着重要的意义。1 1 乳酸的结构和性质乳酸( l a c t i ca c i d ) ，又名2 一羟基丙酸( 2 - h y d r o x y p r o p a n o i c a c i d ) ，分子式为c h 。c h ( o h ) c o o h ，相对分子量为9 0 0 8 。乳酸是一种天然的有机酸，广泛存在于自然界中。乳酸分子中含有2 个不对称碳原子，因此具有旋光性。l 一乳酸为左旋，但l - * l 酸盐或酯却是右旋，当d ( 一) - * l 酸和l ( + ) - * l 酸等比例混合时，即成为消旋的d l - 乳酸睁。乳酸的两种对映体结构式见图1 。l影c 0 0 1 l一：m i r r o rt i 0 0 c - - k 0 1 1c l l jj ，、i | 4图1乳酸的两种对映体结构式d l - 】l a c t i ca c i d乳酸的两种对映体及外消旋型乳酸的物理性质见表1 。表1乳酸异构体的物理性质m 1l - * l 酸是一种强的有机酸，能与水以任意比互溶，但不易结晶，易溶于乙醇、乙醚、丙酮，不溶于氯仿、苯、汽油以及二硫化碳等有机溶剂。6 0 浓度以上的乳酸具有很强的吸湿性。纯净的无水乳酸是白色的晶状固体，相对密度约为1 2 0 6 ( 2 5 ) ，内蒙古农业大学硕士学位论文3熔点为1 6 8 。c ，沸点为1 2 2 。在6 7 - - 一1 3 3 p a 的真空条件下反复分馏，可得纯品乳酸结晶n ”。乳酸可以参与多种反应，如氧化反应、还原反应、酯化反应、缩合反应等。由于l 一乳酸分子内含有羟基和羧基，所以具有自动酯化的能力，乳酸浓度越大自动酯化的能力越强。l 一乳酸可分为工业级、食品级和药典级。工业级乳酸是乳酸含量为5 0 9 0 的溶液，具有吸湿性，食品级乳酸的乳酸含量在8 0 以上，药典级乳酸的乳酸含量为8 5 9 0 。1 。2 乳酸的应用乳酸是世界上公认的三大有机酸之一，是重要的生物化工产品，它在酿造、医药、食品、卷烟、皮革、印染、化工等领域有着广泛的应用“”。1 2 1食品工业由于乳酸对人体无毒无副作用，且易于消化吸收，可直接参与体内代谢，能促进消化，抑制肠道内有害细菌，且酸性柔和稳定，有助于保护食品的口味，因此乳酸及其衍生物已逐渐取代其它有机酸，作为酸味剂、杀菌剂、乳化剂、保鲜剂等广泛应用于食品工业。在罐头、酱菜、饮料生产中加入l 一乳酸可以替代对人体健康有毒害作用的苯甲酸钠；在啤酒酿造过程中，加入乳酸能促进糖化完全，调节p h 值，促进酵母菌发育，抑制杂菌感染，防止酒混浊，且乳酸酸性温和，具有良好的食用安全性，能改善酒的风味，提高啤酒品级，延长保质期。在美国禁止使用磷酸调节p h 值，而全部改用乳酸嘲；在调味品如酱油、醋、咸菜、色拉中乳酸用作防腐保鲜和调味剂，使酸味自然；在蛋糕、面包、肉制品、果冻、奶酪、果酱、冰淇淋、腌制品等食品中，用乳酸来调节p h值，起到抑菌效果，可延长保质期；在面包、糕饼的生产过程中，加入乳酸可以使面包、糕饼松软可口；乳酸是世界各国普遍使用的酸味剂瞳”，目前世界上的乳酸有2 3用作酸味剂，主要用于乳酸饮料、糕点、清凉饮料、果酱、罐头、糖果、酒类中，能起到改善食品风味、防腐、护色、改良粘度和使抗氧化剂增效的作用。乳酸酸味柔和爽快，能使食品具有微酸性，又不掩盖水果和蔬菜的天然风味和芳香，既有酸化又具防腐作用，所以乳酸常用于保持腌制蔬菜和果类的天然风味及芳香；在肉类保鲜中，乳酸能提高肉禽类加工品卫生标准；在食用香料中，乳酸多用作黄油、乳酪、牛奶等乳制品香精的组分陋。另外，l 一乳酸和d 一乳酸在机体内的代谢途径不同i 人体只含有l 一乳酸脱氢酶，只能代谢利用l 一乳酸，过多食用d 一乳酸或d l - 孚l 酸就会导致人体代谢功能的紊乱，危害人体健康，特别是婴幼儿，由于部分脏器发育不全，不能够代谢4利用木糖高温发酵生产l 一乳酸优良菌株的筛选及发酵条件的优化利用d 一乳酸，d 一乳酸在体内的积累可能会引起急性尿酸值升高。从健康角度考虑，欧共体要求在乳婴的强化牛奶和婴幼儿断奶食品中只允许使用l 一乳酸和l 一乳酸盐。1 2 2 生产可生物降解材料一聚乳酸的主要原料塑料废弃物已成为威胁全球环境的主要因素之一，为解决塑料废弃物对环境造成的污染问题，许多国家已经开始研究、生产和使用可降解塑料扭”。由于l ( + ) 一乳酸是生物可降解塑料一聚乳酸的原料而备受关注。以l 一乳酸为单体经化学合成的生物工程材料聚l 一乳酸是一类高分子材料，无毒、无刺激性，它易被自然界中的各种微生物或动植物体内的酶分解，最终形成二氧化碳和水，不污染环境，因而被认为是最有前途的可生物降解高分子材料，聚乳酸有望在不久的将来代替聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯等各种不可降解的塑料，以消除“白色污染 所造成的环境危机防。生物可降解塑料各国已有很多专利。美国嘉吉和陶化学公司的合资企业c d p ，2 0 0 1年完成聚乳酸6 0 0 0 吨中试，2 0 0 2 年开始建设年产1 4 万吨产品的项目，现已形成生产能力。c d p 已将聚乳酸用于生产矿泉水瓶。美国c o l l e - g e f a r m 糖果公司开始采用c d p 的p l a作环境友好包装材料，用聚乳酸包装的糖果透明性、扭结性、印刷性均良好，且阻隔性好，能保持糖果的香气。本岛津、三井、油墨公司都拥有5 0 0 1 0 0 0 t a 装置，并均，计划扩建。德国e m s i n v e n t a - - f i s c h e r 公司在德国东部建一家年产3 0 0 0 吨的聚乳酸示范工厂，用于食品包装袋和包装盒，计划扩建至2 5 万吨，下一步计划建年产1 0 万吨聚乳酸的装置。德国开发了一种聚乳酸镀金属膜，具有高阻隔性，适用于包装各种含有香气的奶油、干酪及高油食品，氧透过率仅为未涂金属的1 1 2 ，高于镀金属玻璃纸。1 2 3 医药行业在医药工业中，乳酸可直接配制成药类或使用乳酸盐作为消毒剂。乳酸除了可以直接用作消毒剂外，还可以制成乳酸钠，配成输液，治疗酸中毒及高钾血症。乳酸具有亲水性，能溶解蛋白质、角质和许多难溶药物，且对病变组织腐蚀作用相当敏感，能增加药物吸收量，防止副作用，可用于治疗喉头结核、白喉、狼疮等病。此外，用乳酸可制取红霉素糖衣，在收敛性杀菌方面用于含漱剂、涂布剂、注入剂、洗净剂等。l ( + ) 一乳酸钙、l ( + ) 一乳酸亚铁、l ( + ) 一乳酸锌都是补充金属元素的良好药品啪“。医疗器材方面，由于聚乳酸材料具有独特的生物兼容性、生物降解性和良好的物理化学性能，在人体内能被人体代谢，且不引起变态反应，有相当的机械强度和耐久性，可经受各种消毒处理，及具有良好的加工性能，无毒副作用等，因此，聚乳酸材料正在丁f 发应用于生物医学领域的产品，如用于生产缓释胶囊制剂，从而使血液循环中药物浓度相对降低，大大提高疗效，降低副作用。聚乳酸还可以用于生产手术缝合线，可随伤l 】的愈合而被机体分解吸收，不需要拆线，特别适合机体深部组织的缝合，内蒙古农业大学硕士学位论文5可减少病人的痛苦，促进病人提前康复。此外，聚乳酸在制作人造骨折内固定物( 代替金属固定物，免除二次手术) 、生物植片、u 型钉、伤口夹、组织修复材料、医用外套、个人卫生用品等方面也有着广泛的应用哪州。1 2 4 化妆品行业乳酸是皮肤固有天然性保湿因子的一部分，乳酸及乳酸钠被广泛用于许多护肤品的滋润剂，乳酸作为保湿剂，用于各种洗浴用品中，如沐浴露、肥皂和润肤蜜中；乳酸盐可作为新一代皮肤增白剂，与其它皮肤增白剂结合使用会产生协同效果；乳酸是一种十分重要的羟基酸，。在配制清洁霜、嫩肤霜、浴液时，用于p h 值调节，对改善皮肤组织结构，消除皱纹、色斑，治疗皮肤干燥、痤疮等有显著疗效。因此，乳酸在化妆品配方中已倍受青睐一，。1 2 5 农业由发酵获得的粗乳酸铵溶液，可以直接作为青贮料添加剂。另外，l 一乳酸还可以用做植物生长活力剂和水产用生菌剂等。聚l 一乳酸可用于生产缓释农药，延长农药的作用时间，对农作物和土壤无毒副作用，并提高农药的使用效果t 删。1 2 6 其它应用在卷烟业中用乳酸能去除烟草中的杂质，清除苦辣味，提高烟草档次；在制革业中，用4 0 的乳酸能除去革鞣皮中的石灰，用乳酸脱灰后的皮革比用其它酸脱灰质量好，因此，高级皮革必须用乳酸进行脱灰处理；在毛纺工业中，乳酸可用于染料的预铬媒染，以降低羊毛的铬盐含量和防止纤维氧化；在丝绸和人造丝的后处理中，用乳酸作p h 调节剂，可起到增艳和固色作用；此外，乳酸铜可用于电镀业汹，。1 3 乳酸的生产方法1 3 1 化学合成法由化学合成法生产乳酸，最常用的是乳腈法和丙烯腈法，其中，最具有现实意义的是乳腈法。w il c e n u s 于1 8 6 3 年用乙醛和氰化氢反应制得乳腈，然后再水解生成乳酸，之后，美国m o n s a n t o 公司按此工艺进行了乳酸的工业化生产。目前世界上较大的乳酸生产企业，如美国的m o n s a n t o 乎l 酸厂和日本武藏野化学公司均采用这种方法。乳酸的其它一些可行的化学合成法包括糖的碱性催化水解、丙烯乙二醇氧化、乙二醇的硝酸氧化等n ，。1 3 2 酶法6利用木糖高温发酵生产l 一乳酸优良菌株的筛选及发酵条件的优化日本东京大学的本崎等人研究了用1 ，2 一氯丙酸酶法生产乳酸，他们分别从恶臭假单孢菌( p s e p u t i d e ) 和假单孢菌细胞中提取纯化l 一2 一卤代酸脱卤酶( 简称为l 一酶) 和d l 一2 一卤代酸脱卤酶( 简称为d l 一酶) ，作用于底物d l - 2 - 氯丙酸，即可制得l 一乳酸或d 一乳酸。l 一酶催化l - 2 - 卤代酸脱卤，而d e - 酶既可以催化l - 2 - 卤代酸脱卤，又可以催化d 一2 一卤代酸脱卤，在催化时可发生构型的转化；h u m m e l 等，研究了用丙酮酸酶法生产乳酸，他们从d 一乳酸脱氢酶活力最高的混乱乳杆菌( l a c a o r r f z r s e s ) d s m 2 d1 9 6 菌体中得到d 一乳酸脱氢酶，以无旋光性的丙酮酸为底物得至0d 一孚l 酸m 1 。1 3 3 发酵法发酵法生产乳酸的历史悠久，因其法生产的乳酸食用安全，在世界范围内被广泛采用。自1 8 8 1 年a v e r y 首e , j 孚l 酸生产后，乳酸发酵已成为较重要的工业。1 9 8 2 年全世界乳酸产量为2 4 - - 一2 8 k t ，其中5 0 左右是由发酵法生产的。发酵法生产乳酸是以还原糖、牛乳等为原料，接种微生物，经发酵而生成乳酸。乳酸菌一般不能直接利用淀粉质原料，需先经水解转化为还原糖，再由乳酸菌发酵生成乳酸，或加入糖化酶进行边糖化边发酵乳酸的“双边发酵”。其他的微生物，如根霉等，可以直接利用淀粉、糊精等碳水化合物发酵生产乳酸。按发酵过程中产物生成情况不同，将乳酸发酵分为四个类型，它们各自具有不同的发酵机理阻“，。1 3 3 1同型乳酸发酵同型乳酸发酵是微生物以葡萄糖为底物通过e m p 途径降解为丙酮酸，丙酮酸在乳酸脱氢酶的催化下还原为乳酸，其发酵途径见图2 。e m p 途径乳酸脱氢酶c 6 h 1 2 0 6 2 c h 3 c o c o o h 2 c h 3 c h o h c o o h + 2 a t p2 ( a d p + p i )n a d h + h图2 同型乳酸发酵途径在同型乳酸发酵过程中，乳酸是唯一的代谢产物，微生物利用l m o l 葡萄糖可以生成2 m o l s l 酸，理论转化率为1 0 0 。但由于发酵过程中微生物有其他生理活动存在，实际转化率不可能达1 0 0 ，一般认为转化率在8 0 以上者即视为同型乳酸发酵。1 3 3 2 异型乳酸发酵异型乳酸发酵是微生物利用h m p 途径，分解葡萄糖为5 一磷酸核酮糖，再经差向异内蒙古农业大学硕士学位论文7构酶作用转化为5 一磷酸木酮糖，然后经磷酸酮解酶催化裂解，生成3 一磷酸甘油醛和乙酰磷酸。磷酸酮解酶是异型乳酸发酵的关键酶。乙酰磷酸进一步还原为乙醇，同时放出磷酸。而5 一磷酸甘油醛经e n t 途径转化为乳酸。异型乳酸发酵产物除乳酸外还有乙醇、二氧化碳和a t p ，其发酵途径见图3 。葡萄糖叫6 磷酸葡萄糖蔷酸木酮糖弋3 一磷酸甘油醛磷酸酮解酶j 乙酰磷酸乙醇上乳酸+ 一丙酮酸图3 异型乳酸发酵途径其总反应式为：c 。h 1 2 0 。+ a d p + p i c h 3 c h o h o o o h + c h 3 c h 2 0 h + c 0 2 + a t p在异型乳酸发酵过程中，i m o l 葡萄糖生成i m o l - 孚l 酸，转化率为5 0 。1 3 3 3 双歧发酵双歧发酵总反应式为：2 c h 。：0 6 2 c h 。c h c o o h + 3 c h 。c o o h在此发酵途径中，i m o l 葡萄糖产生l m o l 孚 , 酸，转化率为5 0 。1 3 3 4 混合酸发酵混合酸发酵是同型乳酸发酵在特殊情况( 如葡萄糖浓度受到限制、p h 升高或温度降低) 下发生的一种乳酸发酵机制。葡萄糖经e m p 途径生成丙酮酸，但丙酮酸的代谢途径发生了改变，除了生成乳酸外，还生成了甲酸等副产物。传统意义上的乳酸发酵类型是针对乳酸菌而言的，是在厌氧或兼性厌氧条件下合成乳酸。而根霉作为好氧菌，其乳酸发酵具有独特的代谢途径。它是经e m p 途径生成丙酮酸，然后少部分丙酮酸进入t c a 循环，而大部分丙酮酸在乳酸脱氢酶、丙酮酸脱羧酶和丙酮酸羧化酶的催化下分别生成乳酸、乙醇、苹果酸和富马酸等。根霉的乳酸发酵理论转化率为7 5 t ”。据产物形成情况，该发酵也属于混合酸发酵类型。1 3 3 5 细菌乳酸发酵和根霉乳酸发酵的比较用于工业生产乳酸的细菌主要有以下四个属中的四十余种，乳杆菌属( l a c t 一o b a c t i l l u s ) 、链球菌属( s t r e p t o c o c c u s ) 、明串珠菌属( l e u c o n o s t o c ) 、足球菌属( p e a l y 。c 。c c u 5 ) 。也有用嗜热脂肪芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌生产l - 乳酸的报道。根霉4，8利用木糖高温发酵生产l 一乳酸优良菌株的筛选及发酵条件的优化属中常用的菌种主要有米根霉( r h i o r y z a e j 、行走根霉( 肋j s t o l o n i f e r ) 、小麦曲根霉( r h i r it i c i ) 和美丽根霉( 肋i e l e g a n s ) 。细菌与根霉相比，利用细菌发酵生产l 一乳酸具有明显的优势：细菌发酵的理论转化率为1 0 0 ；在实际工业生产中可达到9 0 以上，而根霉发酵的理论转化率仅为7 5 ；根霉发酵属于好氧发酵，发酵过程中需要良好的通风搅拌，能耗大，而细菌发酵属于厌氧发酵，发酵过程中不需通风搅拌，可大大降低能耗；细菌发酵无副产物，而根霉发酵有较多副产物，增加了发酵过程控制的难度，同时也增加了乳酸提取和精制的难度；在发酵工艺方面，根霉发酵生产乳酸主要采用气升式反应器和固定化方法，而细菌乳酸发酵可以和产物提取相耦合，采用原位分离技术在发酵过程中进行产物提取，减少了工艺流程咖。所以，目前利用细菌来厌氧发酵生产l 一乳酸成为生产乳酸的主要方法。1 4 乳酸发酵工艺研究进展1 4 1 分批式发酵法分批式发酵是从原料处理开始，经配料、灭菌( 或不灭菌) 、接种、发酵、提取、最后洗罐，再重复上述流程的操作。这种方法技术要求低，工艺操作相对简单，但发酵周期较长，设备利用率不高。且由于发酵受产物抑制，使产率处于较低的水平恤1 。t 4 2 糖化发酵并行式并行发酵是在一个反应容器中同时进行几个反应，通常是将酶解糖化过程与发酵过程结合起来进行，称作s s f 工艺( s i m u l t a n e o u ss a c c h r i f i c a t i o na n df e r m e n t a t i o n ) 。并行发酵操作简单，可克服产物抑制，充分利用设备，缩短发酵周期。1 4 3 半连续发酵半连续发酵又称补料分批培养( f e d b a t c hc u l t u r e ，简称f b c ) ，是在分批培养过程中间歇或连续的补加一种或多种成分的新鲜培养基的培养方法。此方法可以解除产物抑制、底物抑制和分解产物阻遏，可避免因一次投料过多对细胞生长造成的影响。1 4 4 连续发酵连续发酵又称恒浊、恒化连续培养，是指连续或定时以一定速度流加新鲜培，养基，同时以同二速度等量排出发酵液，从而使培养物在近似恒定状态下继续不断生长、发酵。内蒙古农业大学硕士学位论文9其特点是在整个发酵过程中发酵罐内各种条件始终维持在稳定状态。微生物在近似恒定的状态下生长，有效地延长了对数生长期。在乳酸发酵过程中，还能有效地解除终产物对发酵的抑制作用，提高发酵产率；其缺点是培养时间长，菌种容易变异和污染杂菌。”。1 4 5 固定化细胞及高密度培养发酵与传统发酵相比，利用固定化微生物反应器具有小型：高效、细胞负荷高、生物催化剂可以反复使用、高产量和转化率高，易于产物分离，从而实现工艺过程的自动化、连续化，降低生产成本等优点。细胞固定化技术可以提高细胞浓度，从而可以提高生产率，细胞被限制或固定在特定的载体中，保留了高的生物活性，连续操作中不用清洗细胞，使细胞的固定化更为有效m ”。同时，通过固定化培养，能及时的更新培养液和移走发酵产物，可以为菌体生长和产物合成提供一个优化环境。1 4 6 原位分离( 1s p r ) 乳酸耦合发酵原位产物分离是指将生产细胞的代谢产物快速移去的方法，它和发酵耦合，则为原位产物分离发酵。在发酵过程中通过耦合溶剂萃取、吸附( 离子交换树脂、活性碳、高分子树脂层等) 、膜分离( 渗析膜、电渗析膜、中空纤维滤膜、反渗透膜等) 等分离操作系统，从生产细胞附近移走产物，降低乳酸的抑制作用一。i s p r 技术克服了传统发酵工艺中的产物抑制、生产成本高和碳酸钙对环境污染等缺点，是今后乳酸工业的发展方向。1 5 乳酸生产现状及存在的主要问题1 5 1 生产现状目前世界上乳酸的总生产能力约为2 5 0 0 0 0 t a ，产量约为1 3 0 0 0 0 t a ，主要生产地区为美国、西欧和日本等，近8 0 的生产厂家采用发酵法进行生产。世界最大的乳酸生产企业是荷兰的p u r a c 公司，生产能力为8 0 0 0 0 t a ，实际产量约为7 0 0 0 0 t a ，全部采用发酵法生产“”。美国有2 个乳酸生产厂，它们是美国最大的发酵生产商a d m 公司和荷兰p u r a c 与美国c a r g i l l 公司的合营公司，生产能力分别为3 1 0 0 0 t a 和3 4 0 0 0 t a ，产品全部为l 一乳酸。日本乳酸生产厂家有武藏野化学公司和大赛珞化学公司，生产能力分别为8 0 0 0 t a和6 0 0 0 t a ，均采用合成法生产d l - $ l 酸，。我国乳酸工业尚处于发展中，目前有生产厂家7 0 多家，主要有河南省会郸生物工1 0利用木糖高温发酵生产l 一乳酸优良菌株的筛选及发酵条件的优化程公司、江西省南昌武藏野生物工程公司、湖北孝感亚风乳酸集团、盐城华德生物工程公司、山西乐达生化有限公司等。现有生产能力大约为2 5 0 0 0 t a ，实际产量约为1 5 0 0 0 t a ，9 0 的产品是d l 一乳酸。生产规模、酸产率、产品质量等与国际水平相比仍有较大差距，特别是l 一乳酸的研究与开发还很不够“。1 5 2 乳酸生产中存在的主要问题首先，乳酸生产的转化率比较低。目前工业上多数是利用根霉发酵生产乳酸，而根霉发酵生产乳酸理论上的转化率仅为7 5 。其次，乳酸的生产成本比较高。利用根霉好氧发酵生产乳酸，因需要良好的通风搅拌而消耗很多的能量，使生产成本增加，而细菌发酵法生产乳酸虽然能耗比较小，生产成本低于根霉发酵，但其生产原料主要为葡萄糖和淀粉等，使其生产成本依旧居高不下，限制了l 一乳酸的应用，尤其是限制了作为降解塑料在环保领域的应用。再次，乳酸的生产纯度比较低。目前用于生产乳酸的乳酸杆菌的发酵温度与产d 型和d l 型的德氏乳酸杆菌的发酵温度接近，因此在发酵时非常容易混入产d 型和d l 型乳酸的德氏乳酸杆菌，从而导致发酵产生的l 一乳酸的纯度降低，难以满足聚乳酸作为生物可降解塑料的替代品所需要的比较高的纯度。1 6 发酵法生产乳酸的研究现状及未来展望1 6 1研究现状随着人们对细菌发酵生产乳酸优点的认识，国内外对细菌发酵生产乳酸的研究越来越多。k a r i nh o f v e n d a h h ”等人采用乳酸乳球菌发酵1 0 6h 产l 一乳酸1 0 0g l ；用德氏乳杆菌发酵l o o h 产l 一乳酸9 5 9 l 。z h a n g “8 ，等研究了食淀粉乳杆菌n r r l b 4 5 4 2 直接从淀粉发酵生产l 一乳酸的条件，淀粉的起始浓度为1 2 0 9 l ，从液化淀粉出发，可在2 0 h 生产出浓度为9 6 2 9 l 的乳酸。d a n n e r 阳，采用嗜热脂肪芽孢杆菌i f a 6 h 和i f a 9 在以葡萄糖为碳源，6 5 分批培养发酵生产l 一乳酸，转化率分别为6 0 5 8 4 o 和9 8 7 。h u j a n - e ne 刘等对干酪乳杆菌n r r l b - 4 4 1 产l 一乳酸进行优化，在1 6 0 9 l 葡萄糖时，最高乳酸浓度达到1 1 8 6 9 l 。徐子钧利用紫外线、亚硝基肌、d e s 等理化因子对从自然界筛选到的乳酸菌进行复合诱变，再用高浓乳酸钙平板、纯乳酸平板、琥珀酸平板筛选得到一株高产l 一乳酸的正向突变菌株m 7 ，平均发酵产量为9 0g l ，比原菌株产量提高3 0 ，对糖的转化率为8 8 9 。乐晓洁蛳，等利用紫外线诱变方法，对出发菌株干酪乳杆菌y b q l 一l 进行诱变处理，筛选得到一株正向突变株y b q h2 - 1 4 ，其l - $ l 酸产量达到9 3 9 l ，对糖转化率达到7 7 5 ，比出发菌株产酸提高4 8 5 。路福平牌，等人可使凝结芽孢杆菌7 2 h 产乳酸量达6 7 8g ，l ，其中l 一乳酸占9 6 以上。郑艳等以初筛得到的株干酪乳杆菌鼠李糖亚种突变株r 2 为出发菌株，经紫外线、硫酸二乙酯、复合诱变处内蒙古农业大学硕士学位论文1 1理，筛选出一株产乳酸较高的突变株z y ，l 一乳酸含量达9 3 9 。以正交试验为基础对发酵培养基进行优化，l - - 孚l 酸产量达4 7 8 5 9 l ，对糖的转化率达9 6 3 。刘勇军泓等将出发菌株离子注入诱变并经耐高糖高酸的选育和驯化后，得到一株目的菌株l b l 一l ，其最终l 一乳酸产量达到7 0 9 l 。i s h i z a k i ) 等研究了用e n v i r o nm i c r o b i o l 菌利用透析法由木糖发酵生产l 4 l 酸，初始木糖浓度为5 1 2 9 l 时，产乳酸4 7 9 l 。t a n i g u c h i 泓3等研究了利用e n t e r o e o c c u sc a s s e l i f l a v u s 由木糖发酵生产乳酸，初始木糖浓度为5 0 o g l 时，产乳酸3 8 9 l ，光学纯度为9 6 。i y e rc , 研究t - & 杆菌的戊糖发酵生产乳酸的特点，揭示了干酪乳杆菌鼠李亚种a t c c1 0 8 6 3 的一个新特性，即它能象发酵葡萄糖一样发酵木糖，起初4 8 h 木糖不消耗，7 2 h 后开始逐渐消耗木糖并产生乳酸，至1 4 4 h发酵结束，乳酸的转化率为0 8 9 g 。1 6 2 未来展望由于乳酸用途广泛且有不断扩大之势，乳酸衍生物开发力度逐年加大，近年来世界乳酸需求增加很快，目前，全世界的乳酸产量约为1 2 5 万t a ，预期至! j j 2 0 l o 年，产量可突破1 0 0 万吨，将由精细化学品一跃而成为大宗日用化学品。随着食品、制酒、日用、香料、医药的发展和人民生活水平的提高，各国都已将乳酸产业作为重点工业项目。2 l 世纪世界各国环保意识越来越强，随着环保要求不断提高，作为安全自然的高沸点溶剂、医药合成原料及生物降解塑料的原料，世界乳酸的需求量将稳步增长。目前国际乳酸市场已进入高质量、高价格、高需求的时代。在国内，随着乳酸及其衍生物应用领域的不断扩大和消费量的增加，乳酸的需求量也不断增加。尤其是使用乳酸作为p h 调节剂的啤酒发展迅速，每年需乳酸3 万吨以上。另外，食品工业发展对食品添加剂需求量也越来越大。由于国外消费者对合成法生成的乳酸及其衍生物产生排斥，有的国家已规定合成法生产的乳酸不允许应用于食品工业，而我国拥有发酵法生产所需的充足原料，且所生产产品的价格相对较低，因此，我国生产的乳酸及其盐类、酯类日益受到外商的青睐，我国乳酸工业发展前景十分广阔。尽管前景看好，但我国乳酸工业还存在许多问题，今后我国乳酸工业应大力加强乳酸衍生产品的开发与生产，扩大规模，降低生产成本，提高产品质量，以满足日益增长的国内外市场的需求。1 7 本研究课题的内容鉴于目前l 一乳酸生产中存在的转化率较低、生产成本较高和生产纯度比较低的问题，本论文进行了以下内容的研究：利用木糖高温发酵生产l 一乳酸的乳酸菌的筛选；筛选出来的菌株的发酵条件的优化；以玉米芯为主的农业废弃物发酵生产l 一乳酸的初步探讨。1 2利用木糖高温发酵生产l - 乳酸优良菌株的筛选及发酵条件的优化2 材料与方法2 1材料2 1 1样品来源本试验从各种适合于乳酸菌生长的自然环境中采集了1 2 6 个样品，其中包括各种蔬菜水果3 0 个，北京植物园土样4 7 个，重庆土样4 个，中国农科院土样2 9 个，海南土样1 2 个，大兴安岭土样4 个。玉米芯：海南玉米香甜一号2 1 2 主要试剂和仪器2 1 2 1主要试剂试剂名称试剂规格乙二胺四乙酸二钠分析纯3 ，5 一二硝基水杨酸化学纯苯酚分析纯叠氮钠化学纯d 一木糖分析纯l 一乳酸分析纯葡萄糖分析纯2 1 2 2 主要仪器仪器名称紫外可见分光光度计测氧仪隔水式培养箱( 5 2 )高性能无菌试验台摇床高速冷冻离心机隔水式培养箱型号w f z 8 0 0 - d 3 ac y - 3g n p - 9 0 8 0 型d l c j - 1 n 型s d f 8 8h 1 6 5 0 rg n p 一9 0 8 0 型生产厂家北京化工厂军事医学科学院药材供应站北京化学试剂公司浙江东阳医药化工厂北京化学试剂公司北京化学试剂公司北京化学试剂公司生产单位北京第二光学仪器厂上海华光仪器表厂上海精宏试验设备有限公司哈尔滨市东联电子技术开发有限公司北京分公司上海精宏试验设备有限公司湘仪离心机仪器有限公司上海精宏试验设备有限公司2 1 3 培养基2 1 3 1富集培养基蛋白胨5 o g ，牛肉膏2 0 9 ，酵母浸粉3 o g ，n a c l3 o g ，k 2 h p o 。2 o g ，小糖6 0 0 9 ，l 一乳酸钙1 5 o g ，0 4 溴甲酚紫2 m l ，蒸馏水1 0 0 0 m l ，p h 7 5 ，1 1 5 。c 灭菌2 0 分钟内蒙古农业大学硕士学位论文1 32 1 3 2 斜面培养基蛋白胨5 o g ，酵母浸粉2 0 9 ，牛肉膏1 o g ，n a c l3 0 9 ，i ( h ：p 0 42 o g ，k z h p o t2 0 9 ，木糖2 0 o g ，琼脂1 2 o g ，蒸馏水1 0 0 0 m l ，p h 6 5 ，1 1 5 。c 灭菌2 0 分钟2 1 3 3 分离培养基蛋白胨5 o g ，牛肉膏2 o g ，酵母浸粉3 o g ，k 2 h p o 。2 o g ，木糖6 0 o g ，l 一乳酸钙1 5 0 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l ，p h7 5 ，11 5 。c 灭菌2 0 m i n ，倒平板前加入1 的1 2 1 灭菌3 0 m i n 的c a c o 。2 1 3 4