（环境工程专业论文）膜生物反应器中微生物种群结构多样性研究.pdf

中文摘要 本研究针对膜生物反应器( m a r ) 污水处理工艺的特点，利用p c r - d g g e 等 分子生物学方法，研究了小试膜生物反应器中微生物种群结构。在此基础上，对 比了处理不同水质的m b r 中微生物种群结构的区别。 通过细胞裂解直接提取其中的基因组d n a ，以细菌1 6 sr r n a 引物进行v 3 高变异区域p c r 扩增，再将p c r 产物进行变性梯度凝胶电泳分离，获得表征污 泥中微生物群落特征的d n a 指纹图谱。 研究结果表明，采用化学裂j 薛酚氯仿异戊醇抽提试剂盒纯化的方 法可以得到较为完整和纯度较高的基因组d n a 。 污泥中群落结构在接种后4 5 天内就会发生很大的改变。在试验过程中，有 些种群一直保持着较为稳定的优势地位，也有原始种群的消亡和次级种群的强化 和演变。u p g m a 聚类分析将d g g e 图谱自动区分为三个不同的时期，从而说 明污泥内种群结构变化随着处理工艺运行在不同的时期而呈现出一定的规律性。 针对氨氧化菌采用n e s t e dp c r d g g e 技术，氨氧化菌中的某些种属作为预 级优势种属存在于反应器运行的各个时期，与总细菌区相比，氨氧化菌群结构的 调整过程较为缓慢。 不同的膜生物反应器中既存在着共同的微生物种属也有各自特异的种属。相 同的微生物种群在不同的反应器中的优势地位不同，各自特有的微生物群落则是 由于水质的不同经过长期演替而来。 不同的m b r 中，顶级优势地位的氨氧化菌有着相同的种属。说明在m b r 中对氨氮降解起主要作用的细菌群落属性是相同的。进水水质对于氨氯化菌的生 长有着较大的影响。 关键词：膜生物反应器微生物多样性聚合酶链式反应变性梯度凝胶电泳 微生物种群结构 a b s t r a c t i nt h i ss t u d y , a i m i n ge m p h a t i c a l l ya tt h ec h a r a c t e r i s t i co ft h em e m b r a n e b i o l o g i c a l r e a c t o r ( m b r ) w a s t e w a t e rt r e a t m e n tp r o c e s s ，t h em i c r o b i a lc o m m u n i t ys 仃u c t u 】r eo ft h e p r o c e s sw a sr e s e a r c h e dw i t hm o l e c u l a rb i o l o g i c a lm e t h o d ，s u c ha sp o l y m e r a s ec h a i n r e a c t i o n ( p c r ) a n dd e n a t u r i n gg r a d i e n tg e le l e t r o p h o r e s i s ( d g g e ) b a e do l lt h i s ，t h e d i f f e r e n c e so ft h em i c r o b i a lc o m m u n i t ys t r u c t u r eb e t w e e nt h ef o u rm b r st r e a t i n g d i f f e r e n tw a s m w a t e rw a ss t u d i e d t h eg e n o m i cd n ao fm i c r o b i a lc o m m u n i t i e sw a se x t r a c t e dd i r e c t l ya f t e rc e l l l y s i sw i t l lc h e m i c a la g e n t a f t e rt h e16 sr r n ag e n e s ( v 3r e g i o n ) w e r ea m p l i f i e du s i n g t h eu n i v e r s a lp r i m e r s ，t h e s ep c r p r o d u c t sw e r es e p a r a t e db yd g g e t h e nt h ed n a f i n g e rp r i n t i n g so ft h es l u d g e ss a m p l e sw e r et a k e np i c t u r e s ，w h i c hr e p r e s e n tt h e e h a r e c t e r s t i co ft h em i c r o b i a lc o m m u n i t ys t r u c t u r eo ft h ed i f f e r e n ts l u d g es a m p l e s 耽er e s u l t ss h o wt h a tt h eh i g nq u a l i t yg e n o m i cd n ac a nb eo b t a i n e dw i t ht h e m e t h o do fc h e m i c a l1 y s i s _ - 1 喇ss a t u r a t ep h e n o l ( p h e n o l ：c h l o r o f o r m ：i s o a m y la l c o h o l = 2 5 ：2 4 ：1 ) e x t r a c 卜掣l r i f i c a t i o no f t h eg e n o m i cd n a p u r i f yk i t n ec h a n g ew a sg r e a t l yt a k e np l a c eo nt l l e4 血- 5 血d a ya f t e rs l u d g ew a si n o c u l a t e d i nt h el a b - s c a l em b r i nt h ep r o c e s so fe x p e r i m e n t ，s o m ek i n d so fp o p u l a t i o n sh a v e b e e ns t a b l yp o s s e s s i n gh i g hp r e p o n d e r a n td e g r e e s ，a sw e l la st h e p r i m a r yc o m m u n i t i e s d i e do u t ，a n dt h es e c o n dm i c r o b i a lc o m m u n i t i e si n c r e a s e d c l u s t e ra n a l y s i so fd g g e b yu p g m ad i v i d e dt h et o t a lt i m eo fe x p e r i m e n ti n t ot h r e ep e r i o d s ，t h i sr e s u l t s s h o w e dt h a tt h ed y n a m i cc h a n g e so fm i c r o b i a lc o m m u n i t yc o n s t r u c u r ew e r e r e s p o n s i b l et od i f f e r e n tp e r i o dd u r i n gt h eo p e r t a t i o no fm b r n e s t e dp c ro f1 6 sr d n af r a g m e n t ss p e c i f i ct oa m m o n i a - o x i d i z i n gb a c t e r i a ( a o b ) a n dd g g ew e r e u s e d t o e x p l o r e t h es u c c e s s i o na n ds h i f t so ft h e a m m o n i a o x i d i z i n gc o m m u n i t y s o m ek i n do fd o m i n a n tp o p u l a t i o ni na o b h a v eb e e n e x i s t i n gi nt h ec o m m u n i t ys t r u c t u r ed u r i n gt h ee x p e r i m e n to fl a b - s c a l em b r s p e e d o fs h i f to f a o bc o m m u n i t yw a ss l o w e rt h a no ft o t a lb a c t e r i a lc o m m u n i t y i nt h ep r o f i l eo fd g g e ，t h e r ee x i s ts o m ec o m m o nb a n d sa n da l s os p e c i f i cb a n d s t h ec o m m o nb a n d si n d i c a t et h a ts o m em i c r o o r g a n i s m sc o e x i s ti nf o u rm b r s 1 1 1 e s p e c i f i cb a n d ss h o wt h a td i f f e r e n tn m r o w n s p e c i f i cm i c r o o r g a n i s m s f u r t h e r m o r ei n t h ef o u rm b r s ，t h ec o m m o nm i c r o o r g a n i s m sh a v et h ed i f f e r e n tp r e p o n d e r a n td e g r e e s t h es p e c i f i cm i c r o o r g a n i s m sw e r eg r a d u a l l yb e c o m et ot h ep r e d o m i n a n tc o m m u n i t i e s a f t e ra1 0 n gp e r i o do fc u l t i v a t i o na n da c c l i m a t i z a t i o nb e c a u s eo ft h ed i f f e r e n ti n l e t q u a l i t y i tw a st h es a m ec l i m a xc o m m u n i t i so fa o be x i s t e di na l lm b r st h a tp l a y e da l l i m p o r t a n tr o l ei nt h er e m o v a lo fa m m o n i an i t r o g e n t h ei n l e tq u a l i t yh a dt h em a j o r e f f e c to nt h eg r o w t ho f a o b k e yw o r d s ：m e m b r a n eb i o r e a c t o r , m i c r o b i a ld i v e r s i t y , p c r , d g g e ， m i c r o b i a lc o m m u n i t yc o n s t r u c t u r e 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得盘鲞盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名： 签字日期：加77 年月矿日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解叁奎盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授杈墨鲞蕉堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位做作者签名：砍吠 签字日期：力护7 年月夕日 导师签名： 扣锐 签字醐：却年石月i g 日 第一章绪论 1 1 课题研究的背景、意义 第一章绪论 膜生物反应器( m b r ) 是一种集膜过滤和生物处理于一体的高效污水生物 处理技术，近年来得到迅速发展和广泛应用。同常规好氧生物处理法相比具有污 泥浓度高，污泥龄长、容积负荷高、出水水质好及占地面积小等优点【l 捌，这使 其在城市、生活和工业污水的净化和处理等领域得到了广泛的应用。 许多研究表明m b r 工艺中9 0 以上的被去除污染物是由活性污泥去除的p j ， 同时污泥特征与膜污染紧密相关 4 , 5 1 ，这说明污泥特征很大程度上决定了最终的 出水水质和膜分离性能。正因如此，有关污泥特征的研究逐渐成为m b r 研究领 域的一个热点。 但是，国内外对m b r 内污泥混合液特性的研究大多还只是从监测其各种理 化性质( 如污泥沉降性、e p s 、t o c 、蛋白质、多糖、腐殖质等含量、污泥颗粒 粒径分布等) 入手并结合一定的仪器观察( 如s e m 、e d x 等) ，从而推断出在 反应器运行过程中出现的各种现象的原因 6 - s 。而在污水处理过程中微生物群落 的作用和生态学特性一直没有得到深入的研究。只有了解微生物群落多样性和动 态性等信息，才能提高对处理系统的控制能力。因此，对于反应器内活性污泥中 微生物种群结构的研究可以从根本上找出影响其结构与功能的主要因素及其内 在关系。对优化m b r 系统运行、提高废水处理效果、延缓膜污染等都具有十分 重要的实际应用价值和理论探索意义。 传统的环境工程微生物的分析方法和培养技术能在纯培养的条件下分离取 得单一的菌株。但是由于环境微生物的可培养性差，通过传统方法培养鉴定出的 微生物只占环境微生物总数的0 1 1 0 ，而且培养分离周期一般较长、工作 量大，因此，传统的培养技术不适用于m b r 中微生物群体组成和结构的分析【9 】。 基于d n a 指纹技术的分子生物学研究手段，例如限制性片段长度多态性分 析( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，r f l p ) 、随机扩增多态性d n a 分析( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ，r a p d ) 等逐步被引入到环境微生物学 研究中，已经将环境微生物领域研究带入一个革命性的新时代【1 0 】。聚合酶链式 反应一变性梯度凝胶电泳( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n d e n a t u r i n gg r a d i e n tg e l 第一章绪论 e l e e t r o p h o r e s i s ，p c r - d g g e ) 技术【1 1 1 直接利用d n a 及r n a 的微生物遗传特性 进行表征，不但避免了传统上耗时的菌种分离，更可进而鉴定出无法利用传统方 法分离出来的菌种，并且可以对一些条带进行测序对比出其种群。这一技术所分 析出的微生物群落多样性使研究者能够快速、准确地鉴定各种环境中的微生物个 体，并进行复杂微生物群落结构演替规律、微生物种群动态性、重要基因定位及 表达的评价分析。在实际工程实践中，可根据由此技术所测得的不同环境中的微 生物种群结构和优势菌群特性来调节工艺参数，可提高污水处理效果的稳定性及 提供最大的处理效率。目前，将分子生物学技术应用于环境领域的研究已成为国 内外研究的热点。 1 2 国内外研究现状与发展动态 1 2 1 分子生物学技术在环境微生物中的应用 自1 8 8 2 年首次进行向污水中鼓入空气的试验后，微生物污水处理技术就作 为一种独立的工艺方法在污水处理领域中占有重要地位d 2 。微生物污水处理技 术是利用微生物自身的代谢作用来氧化分解有机污染物，从而达到净化污水的目 的【”1 4 】。随着人们对污水处理要求的逐渐提高如高效的脱氮除磷效果、低污泥产 量、低能耗等，促使研究者对该体系中微生物的复杂群体结构与系统运转工艺之 间的关系产生了浓厚的兴趣。 传统的环境工程微生物的分析测定方法有：显微镜微生物形态观察、选择性 培养计数、纯种分离和生理生化鉴定等。然而，传统的方法不能满足微生物原位 识别及形态学研究的需要，并且在多样性和动力学研究方面还存在着严重的局限 性：培养过程复杂耗时：只能反映显微镜条件下极少部分( 小于1 0 ) 的菌 落数【1 5 】；选择性培养基计数等定量方法的不准确性。因此，使得先进对于污 水处理工艺中微生物与处理效果之间的关系性研究仍处于“黑匣子”阶段。 近年发展起来的分子生物学技术很好地解决了这一问题，该技术利用微生物 遗传演变时遗传讯息1 6 sr d n a 的保守性和差异性来进行微生物细菌种类的鉴定 和定量分析。如此一来，各种处理工艺中微生物种类、数量与处理效率间的模式 关系便可加以建立。 美国加州大学伯克利分校和美国能源部联合基因组研究所的研究者采集了 一个废弃的矿井深处酸性水池表面粉红色生物膜的微生物基因组1 1 6 】。在缺乏氧 气和光照的环境，滋生着特殊的自养微生物，从空气中固定碳和氮，同时分解矿 石获得能量。这些微生物的活动造成有害重金属离子的释放。给环境带来严重的 2 第一章绪论 问题。而这些微生物都是难以培养的，因此研究者选用了“群落基因组学”的方 法，从生物膜中直接分离d n a ，并进行了基因组测序。他们一共测定了 7 6 2 m b p d n a 序列，拼成了5 个不同的基因组，其中有4 个来自以前从不知道的 微生物。通过基因功能的分析，研究者还发现了这些微生物间的分工，成功构建 了这个微生物群落的代谢网络，找到了各种专门功能的基因：属钩端螺旋体属第 2 组的细菌固定碳原子，产生生物膜，以保护微生物，并使之漂浮在水面：属钩 端螺旋体属第3 组的细菌既能够固定碳，也畿固定氮：所有的细菌可能都参与了 铁的释放。 美国替代能源研究所的著名基因组学家v e n t e r 等人【1 7 】从大西洋百慕大 s a r g a s s o 海域的海水中过滤收集细菌，用鸟枪法进行基因组的分析，一共获得了 1 g b p 非重复序列。这些序列可以组装成若干个不同的微生物，包括一种属 b u r k h o l e r i a 的细菌、两种与s h e w a n e l l ao n e i d e n s i s 相近但不同的细菌、一种海洋 古生菌、若干株p r o c h l o r o c o c c u s ，以及约1 0 个巨大质粒。从中发现了近8 0 0 种 不同的细菌紫红质蛋白光受体，涵盖超过1 3 个科的细菌。有许多序列与已知的 毫无同源性，7 个亚科的微生物是第1 次被发现，充分展示了海洋微生物丰富的 多样性。 以上两篇文献是基因组生物学研究的新的重要里程碑，不仅有助于人们认识 各种微生物群落的结构及其功能，也可以认识这些微生物在代谢水平上的相互作 用。事实上，微生物基因组学的研究近年来已经提出了所谓“宏基因组学” ( m e t a g e n o m i c s ) 的概念。既然环境中的微生物绝大多数都是不可培养的，仅仅研 究单个可培养的微生物是远远不够的，研究这些不可培养微生物基因组的途径就 是从群落中总的微生物d n a 出发，进行基因组分析、功能基因克隆和研究【1 8 】。 利用现代基因组技术进行自然或人工环境的微生物群落的研究成为热门方向。来 源于环境中未培养微生物的功能基因甚至是基因组学研究拓宽了微生物群落的 研究领域。 目前，国外该技术在活性污泥、生物膜种群和数量分析上的研究和应用已有 大量报道，而国内关于分子生物学技术在环境工程领域的应用研究在近几年逐渐 兴起，相关报道也在逐渐增多。 1 2 2 研究中用到的主要分子生物学技术 整个分析流程大体为：采集到的活性污泥样品进行预处理后，进行d n a 提取 分离和纯化，进行p c r 扩增以得到大量1 6 sr d n a 分子，扩增的d n a 片段进行变 性梯度凝胶电泳分离，之后还可进行建立16 sr d n a 资料库，d n a 测序及微生物 分类鉴定，核酸探针的设计及微生物的定量分析。 3 第一章绪论 1 2 2 1 活性污泥样品中基因组d n a 的提取与纯化 ( 1 ) 样品的预处理 活性污泥样品通常是泥水混合物的形式，为了在后续试验中细胞能够彻底裂 解，必须对样品进行预处理。可以采用的预处理包括以下几种： 1 ) 高速离心，通常离心速度在8 0 0 0 1 0 0 0 0 9 左右，离心时间5 1 0 m i n ，弃上 清液，将沉淀部分重悬于无菌水【1 9 1 。 2 ) 玻璃珠击打，经过离心后的污泥中加入数粒灭菌玻璃珠( 直径根据需要选 择在0 1 2 m m 之间) ，在漩涡混合器上或人为摇动几分钟，这能够打散活性污泥 的絮凝，便于后面的细胞破碎和裂解【2 0 1 。 3 ) 有机物去除，在进行总d n a 提取之前，向污泥样品中加入非离子活性剂、 丙酮、石油醚等物质并且低速搅拌、离心，使污泥当中的有机物得以去除，以免 影响后续的d n a 提取和p c r 扩增过程【1 9 】。 ( 2 ) d n a 的提取与纯化 d n a 通常与蛋白质及部分r n a 结合成染色体存在，因此分离核酸首先要破 碎细胞，然后采用各种方法将d n a 中的蛋白质、糖类、脂类和盐类等物质去除 以纯化d n a 。在提取过程中，要保证d n a 不被内源或外界污染的d n a s e 降解以 保持d n a 的完整性，并要排除其它分子的污染。 各种方法的提取效率因细胞壁结构、细胞大小、d n a 分子量等而不同。一 般来说，温和的提取方法如超声波、溶菌酶易造成细胞裂解不完全而损失微生物 种类的问题：而较剧烈的提取方法如强烈的玻璃珠击打，又易造成d n a 片段的破 碎。因此，根据所分析活性污泥的特点，反复进行提取方法的检验和修正是极为 必要的。 粗提后得到的d n a 溶液一般纯度较低，且有不同程度的蛋白质、多糖以及 一些盐类污染，达不到进行后续试验操作的要求，因此还要对其进行必要的纯化 操作。常用的方法有有机溶剂抽提、沉淀、梯度离心法、试剂盒纯化法等。 1 2 2 2p c r 反应 ( 1 ) p c r 原理 聚合酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，p c r ) 最早由m u l l i s 于1 9 8 7 年发 明，现已成为实验室常规的操作，并已实现自动化。p c r 技术类似于d n a 的天然 复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。p c r 由变性一 退火一延伸三个基本反应步骤构成：1 ) 模板d n a 的变性：模板d n a 经加热至 9 5 0 c 左右一定时间后，使模板d n a 双链或经p c r 扩增形成的双链d n a 解离， 使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备：。2 ) 模板d n a 与引物 4 第一章绪论 的退火( 复性) ：模板d n a 经加热变性成单链后，温度降至5 5 0 c 左右，引物与模 板d n a 单链的互补序列配对结合：3 ) 引物的延伸：d n a 模板一引物结合物在 t a q d n a 聚合酶的作用下，以d n t p 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与 半保留复制原理，合成一条新的与模板d n a 链互补的半保留复制链。重复循环 变性一退火一延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又 可成为下次循环的模板。每完成叶个循环需2 4 分钟，2 - - 3 小时就能将待扩目 的基因扩增放大几百万倍。到达平台期( p l a t e a u ) 所需循环次数取决于样品中模板 的拷贝。 p c r 的三个反应步骤反复进行，使d n a 扩增量呈指数上升，经2 5 3 0 个循 环后，扩增倍数可达1 0 6 。但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期， 靶序列d n a 片段的增加呈指数形式，随着p c r 产物的逐渐积累，被扩增的d n a 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这是 由于p c r 扩增效率受到d n a 聚合酶的种类和活性及非特异性产物的竞争等各种 因素的影晌。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。 ( 2 ) 影响p c r 反应的主要因素 1 ) 模板核酸的制备模板对p c r 的影响主要有两个方面：模板d n a 的 量模板d n a 的量太多，易于两条模板d n a 单链重新结合，会使扩增反应失败： 模板的纯度一般来说，p c r 对模板纯度的要求不高，但在模板d n a 溶液中， 不能有蛋白质、核酸酶、尿素、十二烷基磺酸钠、e d t a 等影响扩增反应的物质 存在。对于个别成分复杂的环境样品，提取的总d n a 需用专门的纯化试剂盒纯 化后再用于p c r 扩增，或将模板稀释1 0 1 0 0 倍后使用。 2 ) 引物的质量与特异性要扩增模板d n a ，首先要设计两条寡核苷酸引物。 所谓引物，实际上就是两段与待扩增靶d n a 序列互补的寡核苷酸片段，两引物 间距离决定扩增片段的长度，两引物的5 端决定扩增产物的两个5 末端位置。由 此可见，引物是决定p c r 扩增片段长度、位置和结果的关键，引物设计也就更 为重要。进行p c r 反应时，藉由不同的引物，可针对不同微生物分类层级进行 p c r 反应，其p c r 产物可为具有某科、某属或某种微生物特性的d n a 一般引 物含有1 5 3 0 个碱基，碱基组成为g 屺占5 0 6 0 ，主要根据研究目的的不同 而设计。p c r 扩增时，是从引物的3 端开始按照5 _ 3 的方向延伸，因此引物3 端的碱基必须严格与模板碱基互补，而对5 端要求则不如3 端严格，有时候还可 在5 端加上特殊的序列使扩增后产物用于后续的其它试验操作( 如本研究中采用 的p c r d g g e 技术) 。 一般而言，作p c r 引物用的寡核若酸至少应含1 6 个碱基，引物长度愈长， 其p c r 的特异性愈佳，1 8 2 4 个碱基是最具特异性的。根据生物基因组大小，最 5 第一章绪论 短长度在几个碱基范围内变动，最好在特异性允许的范围内寻找安全性。每增加 一个碱基，引物特异性可提高4 倍。为了防止引物内的同源性，应特别注意引物 碱基对间不能互补，尤其是3 t 末端，引物间的互补将导致不想要的引物二聚体的 出现，这将会在引物二聚体产物和天然模板之间产生竞争p c r 状态，从而影响 扩增成功【2 1 , 2 2 1 。 3 ) 酶的质量早在1 9 5 6 年k o m b e r g 等就从大肠杆菌提取液中发现了d n a 聚合酶，并且得到了d n a 聚合酶i 纯品。d n a 聚合酶i 是由分子量为1 0 9 0 0 0 的一条多肽链构成，此酶可被枯草杆菌蛋白酶分解为两个片段，一个片段分子量 为7 6 0 0 0 ，有聚合酶活性，并有3 _ 5 外切酶活力，即k l e n o w 片段 ( k l e n o w f i a g m e n t ) 。另一个片段分子量为3 4 0 0 0 ，具有5 - 3 外切酶活力。用 t a qd n a 聚合酶代替大肠杆菌d n a 聚合酶i 的k l e n o w 片段是使p c r 普及应用 的关键。k l e n o w 片段不能耐受9 5 的双链d n a 变性温度，所以每次循环都要 加入新酶：而t a qd n a 聚合酶可以耐受9 3 一- 9 5 的高温，避免了不断补加多聚 酶的繁琐操作，同时使退火和延伸温度得以提高，减少了非特异性产物和d n a 二级结构对p c r 的干扰，增进了p c r 特异性、产量和敏感度。t a q 酶是从生存 在热泉水中的耐热的水生嗜热菌内分离得到的，可在高i m m ( 7 2 c ) 下催化d n a 合 成，并且在9 5 0 c 下的半寿期为4 0 m i n ，使p c r 反应得以自动化。 其他常用的高温d n a 聚合酶有v e n ld e e pv e n t ，t l i ，p w o ，a f u , u i t m a 等，这 些酶不仅有高的热稳定性，还能扩增大于1 2 k b 的模板d n a ，更主要的是具有校 正功能，因此比t a qd n a 聚合酶具有更高的保真度，尤其是p i l ld n a 聚合酶具 有超强的纠错功能。 、 4 ) p c r 循环条件p c r 最适退火温度最方便、有效的选择方法是进行梯度 p c r ( g r a d i e n tp c 鼬。梯度范围选择在5 0 0 c 7 0 0 c 范围内，一般一次p c r 即可选 择出p c r 的最适退火温度。如果在5 0 0 c - 7 0 c 范围内没有找到最适退火温度， 则应根据涂抹( s m e a r ) 带出现的范围再次选择梯度范围。 1 2 2 3d g g e 技术 由于特定的d n a 序列的微小变化，可以提供含有关键基因的微生物群落关 于结构和多样性的重要信息，所以在研究微生物生态系统时可以采用不同的 d n a 多态性技术。一般这些技术与p c r 结合使用，来分离和检测具有微小差别 的含量很低的特殊d n a 序列，从而在分离和鉴定那些大小相同但核酸序列稍有 差别的d n a 扩增产物方面显示了强大的发展潜力。 ( 1 ) d g g e 的发展与技术原理 d g g e 技术是由f i s c h e r 和l e r m a n 于1 9 7 9 年最先提出的用于检测d n a 突 变的一种电泳技术【2 3 1 。它的分辨精度比琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳更高， 6 第一章绪论 可以检测到一个核苷酸水平的差异。1 9 8 5 年m y e r s 等【2 4 】首次在d g g e 中使用“g c 夹板”和异源双链技术，使该技术日臻完善。1 9 9 3 年m u z y e 瑙等首次将d g g e 技术应用于分子微生物学研究领域，并证实了这种技术在揭示自然界微生物区系 的遗传多样性和种群差异方面具有独特的优越性。由于d g g e 技术避免了分离 纯化培养所造成的分析上的误差，通过指纹图谱直接再现群落结构，目前已经成 为微生物群落遗传多样性和动态性分析的强有力工具【1 l 】。 d n a 分子双螺旋结构是由氢键和碱基的疏水作用共同作用的结果。温度、 有机溶剂和p h 等因素可以使氢键受到破坏，导致双链变性为单链。d g g e 技术 检测核酸序列是通过不同序列的d n a 片段在各自相应的变性剂浓度下变性，发 生空间构型的变化，导致电泳速度的急剧下降，最后在其相应的变性剂梯度位置 停滞，经过染色后可以在凝胶上呈现为分散的条带。该技术可以分辨具有相同或 相近分子量的目的片段序列差异，可以用于检测单一碱基的变化和遗传多样性以 及p c r 扩增d n a 片段的多态性。 ( 2 ) d g g e 技术的关键环节 根据变性剂梯度方向和电泳方向是否一致，d g g e 可分为垂直d g g e 和平 行d g g e 。垂直d g g e ，其变性剂梯度同电场方向垂直，常用的变性剂浓度梯度 范围比较宽。主要用于试验决定分离野生型和突变型的最佳变性剂梯度范围：平 行d g g e , 其变性剂的梯度同电场的方向平行常用的变性剂浓度梯度范围则比 较窄，以便更好的分离d n a 片段。主要用于解链范围明确的d n a 片段的检测。 目前应用在环境微生物样品分析的主要是平行d g g e 。 1 ) 凝胶和变性剂梯度的选择聚丙烯酰胺凝胶浓度的确定取决于基因片段 的大小，片段大小在2 0 0 b p 左右时，可用8 的凝胶，当片段在5 0 0 b p 时，6 的 凝胶是被广泛使用的。d g g e 对大于5 0 0 b p 的核酸序列的分离效果会降低。另外， 采用一定梯度的聚丙烯酰胺凝胶进行分离，可以在一定程度上提高分辨效果，对 于2 0 0 b p 的片段，可以采用6 一1 2 的丙烯酰胺。变性剂的选择是取决于样品 的t m 值，复杂样品t m 差异较大，要分辨较多样品，变性剂梯度范围则较宽。 可以利用垂直变性梯度实验来选择所要研究的d n a 片段的解链性质，确定变性 剂浓度梯度。在一定变性剂浓度梯度范围内，d n a 片段呈现出一条清晰的“s ” 型曲线。变性剂梯度范围应选曲线斜率较大的部分。通常选择水平胶的的变性剂 梯度范围为3 0 ( 相当于t m 范围1 0 0 c 左右) ，对于1 6 sv 3r d n a ，广泛使用的变 性剂梯度范围是3 0 一6 0 ，针对不同的样品需要进行调整。 2 ) 电泳时间的确定 电泳时间往往受样品的片段大小、凝胶浓度、变性剂梯度、电泳时的电压等 因素的影响。因此如果改变了这些参数，电泳时间必须重新优化和调整，有时即 7 第一章绪论 使参数不变但是样品不同，也需要进行优化。m u y z e r 等建议利用时间进程实 验( t i m et r a v e le x p e r i m e n t ) 来确定最佳的电泳时间【2 3 】。具体方法是将待测样品以 恒定的时间间隔在同一块凝胶上电泳，获得样品最大分辨率的时间为最佳电泳时 间。 在优化d g g e 电泳时间时，经常发现各个条带分离的电泳时间往往是不一 致的。随着时间进程延续，低t m 区域条带在较短的时间内分离较好，但是高 t m 区域条带却分离不好。如果延长电泳时间后，高t m 区域条带分离较好，但 是低t m 区域条带分离不好。这是由于随着电泳时间延长，已分离停留的条带还 会迁移，在相应变性剂梯度范围出现条带的堆积，导致分离效果降低。另外，低 t m 区域条带分离较好时，高t m 区域条带已经跑出凝胶。因此随着变性剂梯度 方向增加一个丙烯酰胺凝胶梯度，形成双梯度一变性梯度凝胶电泳( d g d g g e ) 则可以减缓条带的进一步迁移，提高分离效果。 3 ) “g c 夹板”技术 由于d n a 分子中的g 、c 碱基对要比a 、t 碱基对结合得牢固，因此g 、c 含量高的区域具有较高的解链温度。基于这一原理， ”g c 夹板”( o c c l a m p ) 技 术是将一段长度为3 0 一, 5 0 b p 富含g 、c 的d n a 碱基片段附加到双链的一端以形 成一个人工高温解链区。这样，d n a 片段的原有部分就处在低温解链区从而可 以实现更好的分离。应用“g c 夹板”技术可使检出率提高到1 0 0 1 2 5 1 。d g g e 电泳技术中，“g c 夹板”技术的引入方式主要有两种：一种是应用含有“g c 夹板”的特定引物进行p c r 扩增，此方法要使用校对功能的聚合酶( p r o o f r e a d i n g p o l y m e r a s e ) 以防止引入人为突变。另一种是在p c r 反应中加入“g c 夹板”，“g c 夹板”在此反应中充当接头或夹式引物。 ( 3 ) d g g e 技术在环境微生物分子生态学中的应用 d g g e 技术由于可以再现未被培养的微生物信息，从而解决了传统方法的片 面性，在分析环境微生物群落多样性和动态性方面迅速得到了应用。d g g e 技术 已经被广泛用于活性污泥【2 6 ，2 7 1 、生物膜【2 引、土壤2 9 1 、底泥【3 0 1 等环境样品中的微 生物多样性检测、微生物鉴定、微生物变异以及种群演替等方面的研究。d o n n e r 等对动态变化的浮游化变层中的群落结构的演替过程进行了追踪。试验表明纤维 素酶和脂酶的活性变化与不同取样点水样中细菌的1 6 sr d n a 片段p c r 扩增产物 的d g g e 谱图具有高度的一致性【3 l 】。s 锄t e g o e d s 等【3 2 】利用微生物传感器和p c r 一 d g g e 技术相结合，对生物膜形成过程中微生物种群的变化情况进行了分析。 d g g e 谱图中逐渐增加的条带表明，经过定向的生物演替作用，微生物种类在生 物膜中渐渐丰富起来。r o w a n 采用生物滴滤反应器和生物滤池处理同种废水【3 3 】， 运用d g g e 考察了不同反应器中的氨氧化细菌菌群的组成。虽然不同形式反应器 8 第一章绪论 或是同一反应器的不同位置中的氨氧化细菌菌群组成不同，但是主要种群是不依 赖反应器的形式或是在反应器中所处的位置不同而改变的，也正是这些主要种群 在整个处理过程中发挥着重要的作用。l a p a r a 等人用p c r - d g g e 方法，研究了在 处理制药废水的七段生物好氖反应器中的细菌群落稳定性，发现在功能稳定的废 水处理生物反应器中，在正常运行条件下有着稳定的微生物群落结构，并且在进 水水质发生改变的情况下，微生物群落能够随之发生变化，以维持良好的出水水 质【3 4 1 。k a z u y aw a t a n a b e 等人研究了降解苯酚的活性污泥中的细菌群落情况【3 5 1 。 从降解苯酚的活性污泥中提取d n a ，进行p c r 扩增，通过温度梯度凝胶电泳分析 扩增片段后，得到两条主要1 6 sr d n a 条带，其中含有两条主要的大片段多组分 苯酚轻化酶条带，并测定这些条带的核酸序列；同时采用直接平板培养方法、分 批培养富集后平板培养的方法和恒化培养富集后平板培养的方法进行菌种分离， 通过动力学等的分析得到活性污泥中降解苯酚的主要菌种v a l i v o r a xp a r a d o x u s 。 l o g e m a n n 等人用p c r - d g g e f i s h ( 荧光原位杂交) 技术研究无污泥停留的硝化反 应器中的微生物群落情况【36 。，结果表明反应器中主要优势菌群为n e u t r o p h a ，通 过1 6 sr r n a 文库检索到次优势菌群为- p r o t e o b a c t e r i a ，第三优势菌群为 c y t o p h a g a l f l e x i b a c t e r f 。b c a l l i 等人在实验室中分别用升流式厌氧生物滤池、 复合床和u a s b 三种反应器处理相同的高氨氮的垃圾渗滤液，采用d g g e 技术比 较和分析了不同反应器中微生物多样性的异同，结果表明【3 。7 1 ，在长期运行后， 不同反应器内，具有十分相似的微生物多样性：m e t h a n o s a e t a 种茵都是其最主要 的氨氮降解菌。 国内，清华大学杨洋、孙寓娇、左剑恶等人应用p c 艮d g g & f i s h 、r e a l t i m e p c r 等技术研究了厌氧和好氧颗粒污泥中微生物群落多样性，并进行了定量分 析。结果表明，在2 个接种不同污泥的反应器中，经过1 年多的连续运行，二者的 微生物种群结构基本相同：实时p c r 结果表明，厌氧氨氧化细菌占细菌总量的 2 7 2 9 ，好氧氨氧化菌约为5 t 硼。厌氧颗粒污泥中真细菌明显多于古细菌， 但随着厌氧反应器有机负荷的提高，古细菌明显增加，其中产甲烷丝菌也明显增 加；真细菌多分布生长在颗粒污泥的外层，而对环境条件敏感的古细菌多分布生 长在内层，且随着反应器有机负荷的提高，这种层状分布的特点更为明显【3 9 】。在 小试好氧上流式污泥床( a u s b ) 反应器好氧亚硝化颗粒污泥中，氨氧化细菌( a o b ) 主要分布在颗粒污泥表层，亚硝酸盐氧化细菌( n o b ) 多分布在内层， 随反应器 氨氮负荷逐渐提高，颗粒污泥中a o b 的相对含量逐渐升高m 】。浙江大学殷峻等 人对处理含氨废气的生物滤塔中微生物多样性随时间的变化进行了研究，结果显 示，不同时间的相同填料中微生物d g g e 图谱有着明显的差异性，填料中微生物 的多样性都随着反应器运行时间的延长而有所减少，主成分分析( p c a ) 显示对 9 第一章绪论 于堆肥和污泥来说，填料样品之间微生物群落结构相似性较高，而混合填料样品 间的微生物群落结构相似性较低【4 l l 。哈尔滨工业大学邢德峰等人对生物制氢反 应器微生物种群的动态变化及多样性进行监测，结果表明，污泥接种到反应器后 微生物群落中既有原始种群的消亡和增长，也有次级种群的强化和演变。在细菌 竞争和协同作用制约下，种群多样性降低后趋于稳定，形成顶级群落。有些种群 在群落结构中一直存在，是群落建成的原始种群，原始种群与次级种群在代谢过 程中具有协同作用，表现出群落的综合生态特征【4 2 4 3 】。 1 3 生物遗传多样性研究的原理与方法简述 1 3 1 生物多样性的概念 生物多样性是生物及其与环境形成的生态复合体以及与此相关的各种生态 过程的总和。它包括数以百万计的动物、植物、微生物和它们所拥有的基因以及 它们与生存环境形成的复杂的生态系统。因此，生物多样性是一个内涵十分广泛 的重要概念，包括多个层次或水平。其中研究较多意义重大的主要有基因多样性、 物种多样性、生态系统多样性和景观多样性四个层次【删。 遗传多样性是指种内基因的变化，包括种内显著不同的种群间和同一种群内 的遗传变异【4 5 1 ，亦称为基因多样性。种内的多样性是物种以上各水平多样性的 最重要来源。遗传变异、生活史特点、种群动态及其遗传结