（食品科学专业论文）壳聚糖硫酸酯在合成及对作物病原菌抑制效果的研究.pdf

致 谢 首先感谢我的导师徐伟亮副教授. 从论文 的选题、 实验的具体实施 到最后定稿，导师给予了巨大地支持和悉心地指导，分师那治学严谨、 科学奉献的精神， 将鼓励和鞭策我在新的工作岗位不断前进! 同时， 弟 子也要感谢三年来导师及师母在学习和生活各方面给予的关心和帮助! 感谢浙江大学生物技术研究所陈卫良副教授对本研究的抗菌应用 提供的实验设备和技术指导! 感谢叶孟兆教授、 贾之慎教授和谢荣春, 级实验师对我在实验和学 习卜 无私的指导和帮助1 三年的学习、 科研工作主要是在化学实验室完成的， 在此对浙江大 学理学院化学系和平馆的所有老师表示衷心的感谢! 感谢浙江大学动物科学学院潘炳龙老师、 王昭荣老师、 丁建萍老帅 对我的帮助! 感谢浙江大学理学院华家池校区办公室的阮秀梅老师和俞忠伟老 师对我的帮助! 在资料检索、 实验、 论文写作中得到陈晓军、 李 俊、 朱红丹、 郭琴 和何伟等同学的大力帮助，在此表示深深地感谢! 最后要感谢我的父母， 在我的成长过程中， 他们倾注了大量的心血; 感谢我的妹妹，一直给予我的巨大鼓励和支持。 最后向参加本论文评阅和答辩的全体专家致以坡诚挚的谢意! 浙江大学硕 学位i 里 文献综述部分 1前言 壳聚糖 c h i t o s a n , ( 1 , 4 卜2 - 氨基一 2 一 脱氧一 d - d - 葡聚糖 是由甲壳 素 c h i t i n , ( 1 , 4 ) - 2 一 乙 酞 氨基一 2 - 脱氧一 0 - d - i m 聚糖 经脱乙 酞化反 应 而得的一种多 糖类天然高分子。 甲壳素是无脊椎动物外骨骼和真菌细胞 壁 的 主 要 结 病 成 分 ， 是 地 球 上 含 量 仅 次 于 纤 维 素 的 生 物 聚 合 物 。 它 们 的 结构式如图所示: o , r :- n h c o c f ia c h i t i n ) ，- n h , ( c h i t o s a n ) ，- 0 h ( c e l l u l o s e ) 图一 甲壳素、壳聚糖和纤维素的结构式 f i g u r e 1 s t r u c t u r a l f o r m u l a o f c h i t i n / c h i t o s a n a n d c e l l u l o s e 1 . 1国内外利用甲壳资源的历史及现状 1 8 1 1 年， 为f u n g i n e a 法国人h . b r a c o n n o t 首次从蘑菇中分离出甲壳素， 将其命名 1 8 2 3 年， 法国人a . o d i e r 发现昆虫的甲壳中含有大量的这 利 、 物质， 用希腊 语 改名为c h i t i n , 1 8 5 9 年， 法国 人c . r o u g e t 用 浓k o h 处理甲壳素， 使其脱乙酸化， 得到可溶于有机酸的物质( 陈德智， 1 9 9 6 ) . 1 8 9 4 年， 德国人f . h o p p e - s e y l e r 将该 物质命名为壳 聚糖 ( c h i t o s a n ) . 娜 浙 江 人 学 硕 学 位 论 文 尽管甲 壳素发 现较早， 但大规模的研究开发利用还是1 9 8 0 年以 后的 事情。 1 9 7 7年在美国波士顿召开了第一届国际甲壳素/ 壳聚糖学术会议，1 9 8 2 年在日 本召开了第二届国际会议，此后每两年召开j次国际会议。近二 十几年来，国际上的研究突飞猛进，从最初生产壳聚搪用于一般污水处 理剂转变为生产高附加值具生物活性的新材料和新产品，广泛应用于医 学、医药、食品、化妆品和农业等领域，已获得专利的产品有人造肾膜、 防水衣、液晶、 植物生长调节剂及抗癌药 物等等 ( 刘万顺，1 9 9 7 ) 0 我国从1 9 5 4 年开始研究甲壳素的制备及应用。 1 9 5 8 年国内首先将乙 酸化甲 壳素用于印 染工业。 近十几年来的 研究发展 十分迅速。 1 9 9 6 年1 0 月和1 9 9 9 年4 月， 中国化学会分别在大连和武汉召开了第一届和第二届 甲壳素化学和应用研讨会( 王爱勤， 1 9 9 6 ) , 1 9 9 8 年7 月在浙江玉环召集 了甲壳素专家论坛报告会。我国研制的高科技产品有人造皮肤、创伤愈 合海绵、免拆手术缝合线等等。 我国的甲壳素/ 壳聚糖资源丰富，生产企业遍布沿海各地和四川省， 年总产量达 3 , 0 0 0 - 5 , 0 0 0 吨。 浙江省是甲 壳素生 产大省， 仅以 蟹壳和虾 壳为原料， 每年甲壳素产量近1 , 0 0 0 吨。 1 . 2甲壳素/ 壳聚糖产品的研究进展 目 前， 甲 壳素/ 壳 聚糖产品的开发 研究主 要集中 于以 下几个方面: 降 解壳聚糖以制备低聚壳聚糖及更小分子量的水溶性壳聚搪;化学修饰甲 壳素/ 壳聚糖以制备不同性能和不同用途的甲壳素/ 壳聚糖衍生物;甲壳 素/ 壳聚糖及其衍生物性质和应用的研究 ( 柴平海，1 9 9 9 ) 0 1 . 2 . 1壳聚糖降解 浙 江 大 学 硕 i - 学 位 论 文 甲壳素经脱乙酞化处理后，得到分子量在几十万左右的水不溶性壳 聚糖。 若采用适当方法将壳聚糖降解为均分子量1 0 , 0 0 0 以下的低聚产品， 可使起其水溶性大为改观， 特别是均分子量低于 1 , 5 0 0的低聚壳聚糖产 品，基本全溶于水。 低聚或更小分子量的壳聚糖可用于具有生理功能的保健食品，有降 血脂、降胆固醇、 增强机体免疫力和抵抗疾病的能力; 化妆品的添加剂， 对冻疮和青春痘有特殊疗效;制备抗肿瘤制剂;利用其可被溶菌酶降解 的特性，可应用于溶菌酶活性的临床诊断或医药食品的检验部门;利用 其对植物病原菌的抗菌活性和对植物产生抗菌物质的诱导作用，可用于 天然新型农药等等 ( o u c h i t . ，1 9 9 0 ; m u z z a r e l l i r . a . a . ，1 9 9 6 ; j e o n y o u - j i n . 1 9 9 8 ; r e d d y m . i 3 . ，1 9 9 9 ) 0 1 . 2 . 2甲壳素/ 壳聚糖的衍生化反应 壳聚糖分子中c 2 位的一 n h , . c 3 和c 6 位的一 o h 具有较强的反应活性。 选用适当的反应试剂对它们进行化学修饰 ( 如醚化、酷化、 n 一 衍生化、 接枝共聚与交联等等) ，在甲壳素/ 壳聚糖分子结构中引入各种功能团， 改善甲壳素/ 壳聚糖的物理化学性质，制备出 各种类型的凝胶、 膜、 聚电 解质以及其它水溶性材料，广泛应用于各个领域。下面介绍一些主要的 衍生化反应 ( 蒋挺大，1 9 9 6 ) . ( 1 ) 醚化反应 甲壳素/ 壳聚糖的轻基与烃基化试剂反应生成醚， 如烷基醚、 经烷基 醚和氰乙基醚等等 ( 董炎明，1 9 9 9 ) .( 表一) ( 2 )醋化反应 甲壳素/ 壳聚糖的经基与各种酸和酸的衍生物发生酷化反应， 生成的 酷类分为无机酷和有机醋。 前者包括硫酸醋、 黄原酸酌、 磷酸醋和硝酸 3 浙 江 大 学 硕 1 : 学 位 论 文 酷等，后者包括乙酸醋、苯甲酸酷、长链脂肪酸醋和氰乙醋等。其中壳 聚搪硫酸a el 是肝素类似物，因此壳聚糖硫酸酷化反应是其化学修饰最为 引人注目的领域。 表一 甲壳素/ 壳聚搪的醚化反应 烃基化试剂 硫酸二甲酷 反应条件产物 卤代烷 卤代烷 环氧乙烷/ 2 - 抓乙醇 环氧丙烷 氯节 丙烯睛 丙烯睛 低温甲壳素/ 壳聚糖甲基醚 1 2 - 1 4 甲壳素烷基醚 4 0 c , 4 h r壳聚糖烷基醚 3 3 c , 1 . 5 h r经乙基甲壳素 冰浴， 2 h r经丙基甲壳素/ 壳聚糖 0 - 5 c , l h r : 室温， 2 0 h r节基甲壳素 1 2 - 1 4 1c , 1 8 h r氰乙基甲壳素 室温， 5 h r氰乙基壳聚糖 ( 3 ) n 一 衍生化反应 甲 壳素乙酞氨基上的h ， 一般情况下很稳定， 但在强烈条件下， 能发 生取代反应。壳聚糖氨基是一级氨基，较活泼，能发生许多反应。一些 反应举例如下: a 壳聚糖在中 性介质中与芳香醛或脂肪醛反 应， 形成西佛碱( s c h i f f s b a s e ) : 叨 一 r 初 飞且!we.户 ， ch20 h- 0 , -14 毕0 l n h ， r- c- h 一一一一一一一 wr 8 达选竺上* ctic i 进 这个反应在壳聚糖的研究和应用中是很有用的:一方面，可用于保护 氨基， 进行0 - 取代反应; 0 - 衍生物制备好后， 可以方便地将醛基脱掉。另 一方面，由一些特殊的醛形成的西佛碱 ( 如戊二醛) ，可用于固定化酶。 此外，用硼氢化钠/ 硼氮化钠将西佛碱还原后，可得到一系列很有用的衍 生物。 b .与狡酸醉在高温下发生很猛烈的反应，形成n - 酞化衍生物: r - c i 0 0. . 卜 r - c 0 c! 0 盆 n 一 酞化作用，一是用于壳聚糖氨基的保护，便于进行0 - 衍生化反应; 二是有些n 一 酞化衍生物对有些癌细胞有选择性聚合作用， 有作为抗癌药物 的诱人前景，所以研究者较多。 ( 4 )接枝共聚与交联 接枝共聚物有如下的结构: 一aaa. . . . . .人aaa” 二aa a a” 一。 ,a - 4 , ,e k a . . . . . . a- i bb bb b另 ibb 、， bb bb bb bb 浙 江 人 学 硬 学 位 论 接枝共聚物具有与均聚物a和均聚物 b不同的性质，也兼具有这两 者的一些特性。甲壳素/ 壳聚糖的接枝共聚物是以天然聚合物 ( 多糖链) 为主链，以合成聚合物为侧链的半合成聚合物，它兼具天然聚合物和合 成聚合物的某些性质， 从而可满足特殊的需要。 接枝共聚反应分化学法、 辐射法和机械法。 目 前只报道了甲壳素/ 壳聚糖接枝共聚的化学法和辐射 法。如苯乙 烯在钻6 0的照射下， 室温与甲 壳素/ 壳聚搪反应生成接枝共 聚物; 甲 基丙烯酸甲 酷在同样反应条件下也能与甲 壳素/ 壳聚搪生成接枝 共聚物。用三正丁基硼烷作引发剂，甲基丙烯酸甲酷在甲壳素上接枝， 此反应在水的存在下进行，经水溶剂化的甲壳素与三正丁基硼烷形成络 合物， 产生 游离基， 从而引发接枝反 应 ( 余艺华，1 9 9 7 ) . 甲壳素/ 壳聚糖的轻基与双官能团的醛或酸醉的醛基交联， 产物不溶 解，溶胀也很小，性质很稳定，适用于层析载体或固定化酶载体.交联 主要发生在分子间，但也不排除分子内的交联。常用的交联剂是戊二醛 和乙二醛。室温下进行且反应快速。交联反应既可在水溶液中进行，也 可在非均相介质中 进行，而且在很宽的p h 范围中发生. 、 1 . 2 . 3甲壳素/ 壳聚糖及其衍生物的性质与应用 1 . 2 . 3 . 1甲壳素/ 壳聚搪的物理性质与应用 甲壳素为白色无定型固体，大约2 7 0 分解，几乎不溶于水、 稀酸、 碱、乙醇或其它有机溶剂，可溶于浓敖酸、硫酸、7 8 - 9 7 % 的磷酸及无水 甲 酸。 壳 聚 糖为 阳 离 子 聚 合 物， 大 约1 8 5 分 解， 可 溶 于 有 机酸 和 弱 无 机 酸稀溶液。 因制备工艺条件和需求的不同， 脱乙 酞度由6 0 % 至1 0 0 % 不 等。 脱乙酞度和平均分子量是其两项主要性能指标 ( k a r n i c k i z . s . ，1 9 9 4 ) 0 甲壳素、壳聚糖易成膜。由壳聚糖浇注成的无色透明膜，具有良 好 的柔性、 粘附性、 通透性及一定的抗拉强度. 壳聚糖/ 甲壳素膜可用作音 浙 江 人 学 硕 学 位 论 文 响设备振动膜、双电解质膜、人工肾膜、反渗透膜、超滤膜、渗透蒸发 膜、脱水膜等等。 甲壳素，尤其是壳聚搪分子中的氨基和轻基与许多重金属离子形成 稳定的鳌合物，可作为絮凝剂用于废水处理，食品厂蛋白质回收，溶液 中重金属离子的分离等等 ( d i e t r i c h k . , 1 9 8 5 ; m e y e r s s . p . , 1 9 8 9 ; d i e t r i c h k . ，1 9 9 1 ; m a r t i n g . p . ，1 9 9 5 ; a h m a d f a n j a n b . h . ，1 9 9 5 ) 0 甲壳素/ 壳聚糖具有较好的吸湿性和保湿性， 可作为牙膏、 护肤化妆 品及陶瓷的改性剂、护发及头发生长促进剂 ( 那海秋，1 9 9 7 ;彭长宏， 1 9 9 8 ;黄光斗.1 9 9 8 ;林炎平，1 9 9 8 ) . 1 . 2 . 3 . 2甲壳素 / 壳聚糖的生物活性与 应用 甲壳素可选择性地凝集白 血病的l 1 2 1 0 细胞和e h r l i c h 腹水癌细胞， 巨 对正常的红血球骨髓细胞无影响 ( 姜雪松，1 9 9 6 ) 。壳聚糖能有效地增 强巨噬细胞的吞噬功能和水解酶的活性， 刺激巨 噬细胞产生淋巴因子， 启动免疫系统，同时不增加抗体的产生.甲壳素及其降解产物有促进伤 口愈合，抑制伤口愈合时纤维增生，并促进组织生长的功能，对烧、烫 伤有独特疗效。壳聚塘是极好的伤口敷料，可直接用于伤口，如果用壳 聚搪水溶液和动物胶水溶液的混合物涂于伤口表面形成一层胶，效果更 佳。壳聚搪是碱性天然多糖，具有抗胃酸和抗溃疡的作用，可用于治疗 过敏性皮炎，还能降低肾病患者血清胆固醉、尿素及肌酸水平. 1 . 2 . 3 . 3甲壳素/ 壳聚糖衍生物的性质与应用 酞化壳聚搪可制成多孔微粒用作分子筛或液相色谱载体，分离不同 分子量的葡聚搪或氨基酸;还可制成胶状物用于酶的固定化和凝胶色谱 载体。n 一 甲酞壳聚搪用于人造纤维中，提高纤维对酸性染料的亲和力。 n 一 顺丁烯二酞基壳聚糖与丙烯酞胺共聚物在任何p h 范围都稳定， 在水中 膨胀形成机械性能良 好的凝胶，用这种材料固定的抗体能有效地减少血 浙 江 人 学 硕卜学 位 论 文 浆中肝炎病毒的 抗原值. 6 - 0 - ( 2 - 经甲 基) 甲壳素和 6 - 0 - ( 2 , 2 - 轻乙基) 甲 壳素具很强的吸水性，可用作一次性尿布等强吸水性材料。3 , 4 , 5 一 三甲 氧苯甲酞甲壳素能吸收紫外线，可用于防晒护肤品的添加剂。 1 . 2 . 3 . 4医学应用 甲壳素/ 壳聚搪及其衍生物具有良 好的生物相容性和生物降解性， 降 解产物一般对人体无毒副作用，在体内不积蓄，无免疫原性，因而在医 学领域有广阔的应用前景。 甲壳素/ 壳聚糖制成的人工皮肤吸水性、透气性、组织相容性良 好。 甲壳素制成的吸收型外科手术缝合线， 材料柔软，易打结，机械强度较 高，易被机体吸收，同时不改变皮肤胶原蛋白中经脯氨酸的含量，无炎 症反应，还可用常规方法消毒，增加伤口的抗张强度，加速伤口的愈合 ( c o l i u m b e i c . ， k i f u n e k . ，1 9 8 2 ;刘宪华，1 9 9 0 ; b i a g i n i g . ，1 9 9 1 ; 叶春婷，1 9 9 5 ;苏秀榕，1 9 9 6 ) 0 甲壳素/ 壳聚糖分别溶于适当溶剂， 可制成人工透析膜。 这种膜具有 较高的机械强度，能经受高温消毒， 对溶质 ( 如抓化钠、尿素、维生素 b , _ ) 有较好的通透性，可望应用于人工肾( i b r a h i m m . ，1 9 8 3 ) . 脱乙酞壳聚搪可用于药物缓释颗粒，药物释放完全，在酸性介质中 形成凝胶层且抗酸，防止药物对胃的刺激.甲壳素/ 壳聚糖及其衍生物用 于粉剂、颗粒剂 ( 缓释颗粒) 、片剂 ( 缓释片剂) 、微囊剂的制备，流动 性和润滑性很好。 壳聚糖接枝药物， 使小分子药物大分子化， 具有长 效、 低副作用的 特点。甲壳素/ 壳聚糖用作直接压片药物的稀释剂，比 用微晶 纤维素效果好 ( m i y a z a k i s，1 9 8 1 ;刘向军，1 9 9 1 ; l i y . p . , 1 9 9 1 ; s o n g y . ，1 9 9 2 :u c h e g b u i . f . ，1 9 9 4 ; r a t h k e t . d . ，1 9 9 4 ; k r i s t - m u n d s d o t t i r t . ，1 9 9 5 ; y o s h i n o t . ，1 9 9 6 ;周长忍，1 9 9 7 ; f a n g y . ， 1 9 9 8 ) 0 浙 江 人 学 硕 卜学 位 论 文 甲壳素/ 壳聚糖及其一些衍生物具有优异的透氧性和促进伤口愈合 的特性，为硬、软性接触眼镜提供了理想的材料。 1 . 3与本研究有关的甲壳素/ 壳聚糖及其衍生物研究进展 1 . 3 . 1低分子量壳聚糖的制备研究 壳聚糖的降解方法可分为酶法降解、无机酸降解和氧化降解三种。 酶降解法可特异地、 选择性地切断壳聚糖的0 ( 1 - 4 ) 糖营键， 降解条件温 和，反应过程易于控制，易得到所需分子量范围的壳聚糖产品，但难以 选择合适的酶种。酸降解法是非特异性的降解过程，所得降解产物的分 子量范围很宽， 要得到特定分子量范围且具有较高收率的壳聚糖产品还 是比较困难的:酸解过程引入了强酸，还会造成一定的环境污染。氧化 降解法发展较快，但它采用了多种试剂进行降解反应或降解产物的后处 理，这给产品的分离、纯化增添了困难。相对而言，氧化降解法在制备 分子量 1 0 , 0 0 0 左右的壳聚糖产品时更为有利 ( 金鑫荣，1 9 9 8 ) . 1 . 3 . 2狡烷基甲壳素/ 壳聚糖的制备及应用研究 狡烷基反应是氯代烷酸、 邻苯醛酸或乙 醛酸与甲壳素/ 壳聚糖的经基 或氨基反应，引入梭烷基基团。目前，狡甲基化反应的研究较多，根据 梭甲 基反 应的位置， 产物分别为 0 - 梭甲 基甲壳素( t o k u r a , 1 9 8 3 ) . 0 - 梭甲基壳聚糖( p a r k , 1 9 8 6 ) , n - v甲基壳聚糖和 n , 0 - m u z z a r e l i i , 1 9 8 7 ) 。 上 述产品 中， n - 狡甲 基壳 聚 糖的 制备 方法非常巧妙，壳聚糖的自由氨基与乙醛酸反应产生水溶性的醛亚胺 ( r c h : n r ) .然后用合适还原剂还原此产物. 在均匀条件下， 这种制备 非常容易实现且不需要加热或冷却。产生的n- 狡甲基壳聚糖包含乙 酞 一一一一一一一一一-一-一 浙 江 大 学 硕 学 位 论 基、 狡甲基和自 由氨基。 通过对壳聚糖原料的 选择( 脱乙酞度和分子量) 和乙醛酸用量的控制， 很容易控制三者的比 例。当壳聚糖高度脱乙酞化 时， 反应产物可称为甘氨酸葡聚糖， 因为几乎所有的侧基是甘氨酸残基。 按甲基甲壳素能有效地诱导胞毒巨噬细胞， 具有适宜的溶解度、 生 物降解性和独特的药物动力学性质。 它还能作为稳定剂，与卵磷脂等构 成脂质体型人造红血细胞， 这种人造红血细胞含有人溶血产物，对不同 血浆蛋白和非离子型表面活性剂具有显著的稳定性， 在血浆或血浆填充 剂溶液中有良 好的流动 特性。而常规的 脂质体几乎不能对含水的 球蛋白 ( 如血红蛋白)保持稳定( k i m 同时，分子量( .m w ) 大小对生物活性有影响，具有以下活性关系: m w 2 6 , 0 0 0 m w 1 2 , 0 0 0 肝素( 2 1 , 0 0 0 ) m w 5 4 , 0 0 0 ( h i r a n o s . ，1 9 8 5 ) , 衍生物抗凝血活性据认为是由于高分子某一序列内特异s 0 , 一 所致， 这与 l i n d a h l 等人研究肝素的抗凝构效关系一致.同时b e e t z . t . 合成一段 能够特异结合抗凝血酶a t 一 川的序列，这是一段壳聚搪六糖硫酸酷，其 还原端缺少 c 6位上的s 0 , - ，此序列具有较强的a - x a活性.二十世纪 八十年代后期有人制备梭甲基甲壳素硫酸酷， 体外检测即使浓度较低亦 显示出抑制凝血酶活性，其中s 0 , 一 与狡甲基等摩尔比时抑制活性最强。 二十世纪九十年代， t o k u r a s . 等人 ( 1 9 9 4 )以脱乙酞度 7 0 % 的壳聚糖 经c 2 位的n 一 硫酸化、c 6 位狡甲基化后，产物选择性吸附a t - 1 1 1 ，表现 出最高的抑制凝血酶活性，这与 h i r a n o s . 认为 c 6位硫酸化是主要活 性位点不太一致。而n i s h i m u r a 等人( 1 9 9 8 ) 报道的结果与h i r a n o s . 结 论相符， 都证明c 3 位和n 位硫酸化无抗凝活性， 而c 6 位硫酸化的甲壳 素的抗凝血活性强。 h i r o y u k i k . 等人 ( 1 9 9 3 )发现狡甲基甲壳素硫酸 酚虽然结构类似肝素， 却没有肝素的抗凝活性。 迄今， 虽然各种意见不 一， 但大多数人认为甲壳素， 壳聚搪硫酸化制备的类肝素物质的抗凝血 活性与s 0 , 一 含量密切相关。 壳聚搪硫酸酷还具有抗病毒、 抗肿 瘤的 活性( g a m a s o s a m . a . ， 1 9 9 1 ; m e s h c h e r y a k o v a d . ，1 9 9 3 ) 。 h o r t o n d . 和 j u s t e . k . 的研究( 1 9 7 3 ) 证 明氨基上含有 s o , 的壳聚糖衍生物对白血病病毒具有显著抑制作用。 一一一-一-一-. 浙 江 人 学 硕 学 位 论 s h a r o n v . v . 等人 ( 1 9 9 0 ; 1 9 9 1 ) 发现壳聚糖硫酸酷能抑制哺乳动物病 毒感染，特别是能预防和治疗人类 h i v感染，它竞争性抑制 h i v - i 逆 转入酶，抑制h i v - i 复制的i c 5 0 为7 u g / m l ，随着浓度的增加而降低 h l v - i 蛋白的合成， 同时也能抑制劳舍氏白血病病毒和单纯疙疹病毒i 和1 1 . i s h i h a r a c . 等人 ( 1 9 9 3 ; 1 9 9 5 )证明甲壳素硫酸酷对弗兰德鼠 白血病病毒， 仙台病毒和单纯疙疹病毒有作用， 而狡甲基甲壳素无抗病 毒活性，可见是s o , 一 抑制病毒活性的功能基团. 多搪在医药上作为一类免疫调节剂，具有治疗肿瘤， 肝炎，调血脂 等作用。通过比较壳聚搪硫酸酷和肝素抑制肿瘤作用，m u r a t a j . 和 s a i k i 1 . ( 1 9 9 0 ; 1 9 9 1 ) 详细研究了 其作用机理。 狡甲 基甲 壳素硫酸酷 介导的抑制肿瘤扩散与肝素的作用显著不同， 是由于它干扰癌细胞在微 血管的停滞， 而抑制肿瘤生长。 梭甲基壳聚搪硫酸醋对b .6 - b l . 细胞诱发 的血管生成具有效的抑制转移作用， 显著减少通向肿块的血管数量， 但 不直接影响肿瘤与内皮细胞的存活和生长， 而狡甲基甲壳素及肝素无此 作用。 梭甲基甲壳素硫酸酷抑制肿瘤诱导的血管生成， 切断肿瘤营养源， 从而抑制肿瘤转移，对癌扩散抑制率达 8 0 - 8 5 % ，与肝素不同，它无任 何副反应。h i r o y u k i k . 等人( 1 9 9 3 ) 合成一种粘附细胞的短肤 r g d s ( a r g - g l y - a s p - s e r ) ， 与 狡甲 基甲 壳 素 硫酸酷结 合 增强了 治 疗肿瘤 扩散的作用，该复合物的抑制活性依赖于甲壳素骨架的取代基团，由 s o ,- 与梭甲基协同发挥功效。 梭甲 基甲壳素硫酸酷治疗肿瘤转移机理是 其特异性结合层粘连蛋白 和纤连蛋白， 或者是抑制细胞来源的肝素酶和 i v 型胶原酶，从而抑制肿瘤细胞侵袭重建基底膜和肿瘤诱导的血管生 成，但对肿瘤细胞和内皮细胞无毒性作用。 通常的硫酸化试剂有:氯磺酸/ 毗咬，s o :,/ 毗咙，浓硫酸，s o :,/ s o 和s o :,/ d m f . 硫 酸 化 的 确 定 主 要 以 硫 含 量 为 标 准 ， 其 他 指 标 如 粘 度 ， 红 - 一 一 一 一一 一 一一 一 - 一 一- - - - - 浙 江 大 学 倾 学 位 论 文 外光谱等亦是重要依据. 1 . 3 . 4甲壳素/ 壳聚糖及其衍生物抗菌活性的研究进展 1 . 3 . 4 . 1壳聚糖的抗菌活性及与分子量的关系 有关壳聚糖抗菌活性的各种影响因素的研究论文很多， 但得出的结 论并不一致。 管云林等 ( 1 9 9 7 ) 采用金黄色葡萄球菌作为试验菌株， 发 现随着壳聚搪分子量的降低， 抗菌活性增强。 夏文水等 ( 1 9 9 6 ) 采用大 肠杆菌作为试验菌株. 发现随着壳聚糖分子量的增加， 抑菌效果逐渐下 降.且实验测定分子量为 1 , 5 0 0低聚壳聚糖的抑菌效果最强.k e i s u k e 等 ( 1 9 9 7 ) 的论文报道对于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌， 平均分子量小 于5 , 0 0 0 的壳聚糖不仅没有抗菌作用， 反而能促进细菌生长， 而分子量 约为9 , 3 0 0 的壳聚糖几乎可以完全抑制细菌生长。 y o u s o o k 等 ( 1 9 9 7 ) 报道分子量为4 0 , 0 0 0 的壳聚搪，浓度0 . 5 % 时，对金黄色葡萄球菌和大 肠杆菌的杀灭率为9 0 % ; 分子量为1 8 0 , 0 0 0 的壳聚搪， 浓度5 0 0 p p m 时， 对金黄色葡萄球菌 和大 肠杆菌的杀灭率几乎为1 0 0 % 。郑连英等 ( 2 0 0 0 ) 报道分子量3 0 5 , 0 0 0 以下的范围内， 随壳聚糖浓度的增加， 抗菌作用逐 渐增强，当浓度为 1 . 0 % 时，对革兰氏阳性菌和阴性菌的抗菌率均达到 1 0 0 % 。对革兰氏阳性菌，随壳聚糖分子量的增加，抗菌作用逐渐增强， 其原因主要是分子量越大， 所形成的外层膜越致密， 越能阻止营养物质 进入细菌细胞， 因而抗菌作用更明显。 对革兰氏阴性菌， 随壳聚搪分子 量的减小， 抗菌作用逐渐增强分子量5 , 0 0 0 以 下的壳聚糖的抗菌作用最 强， 其原因主要分子量越小， 越容易进入细胞壁的空隙结构内， 干扰细 胞的新陈代谢，达到杀死细菌的目的。 1 . 3 . 4 . 2壳聚搪衍生物的抗菌活性及与分子量的关系 s u d a r s h a n 等 ( 1 9 9 2 ) 在不同的细菌培养基上， 对从真菌衍生而得 一 - 一 - 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 - 一 一 一 一 一 一 - 一 - - 浙 江 大 学 硕卜学 位 论 文 的水溶性壳聚搪及衍生物进行了 抗菌效果的 研究， 他们发现: 壳聚糖乳 酸t h 和谷氨酸盐1 小时对数周期衰减范围为卜5 ，对格兰氏阴性菌和阳 性菌均有杀菌效果。p a p i n e a u等 ( 1 9 9 1 )的研究报道:0 . 2 m g / m l壳聚 糖乳酸盐抗大肠杆菌最有效，2分钟对数周期衰减为 2 , 1小时对数周 期衰减为 4 ;壳聚糖谷氨酸盐能有效抗酵母菌， 酵母菌在 l m g / m l的壳 聚糖乳酸盐中1 7 分钟，迅速而完全失活。 c u e r o 等( 1 9 9 1 ) 观察到n - 梭甲 基壳聚 糖减少黄曲 霉 和寄生曲霉 产 生黄曲 霉毒索达9 0 % 以上。 m u z z a r e l l i r . a . a . 的研究 ( 1 9 8 8 ) 报道n - 梭甲 基壳聚糖对口 腔细菌尤其是蛀齿细菌特别敏感。陈凌云等 ( 2 0 0 0 ) 报道 n , 0 - 甲 基壳聚糖对金黄色葡萄球菌有较好的抑制作用，对大肠 杆菌的抑菌作用则较差， 随浓度的增大， n , 0 - 梭甲基壳聚搪的抗菌活性 明显增强; _且 抑菌性能与分子量之间的关系十分密切， 随分子量的降低， 抑菌效果显著提高，当分子量大于1 0 0 , 0 0 0 时，受试样品无抑菌功能， 而当分子量小于5 , 0 0 0 时，抑菌活性明显增强。夏文水的研究 ( 1 9 9 6 ) 发现: n , 0 - 甲 基壳聚搪在水溶液中易形成牢固的膜， 不利于细菌和大 部分真菌的生长。 t s u r u g a i k . 等 ( 1 9 9 4 ) 研 究 发 现n , n , n 一 三甲 基 壳 聚 糖季 钱 盐 具 有 抗大肠杆菌和葡萄球菌的 活性。 于义松的 研究 ( 1 9 9 2 ) 报道含 n 一 长链 烷基的壳聚糖季按盐对月饱子菌和大肠杆菌有抗菌作用。h i r a n o s . 发 现( 1 9 8 7 ) 壳聚 搪与碘代甲 烷在三乙 胺中反 应所得到的 季按盐对革兰氏 阳性菌有强抑制作用。k i m 等 ( 1 9 9 7 )由 西佛碱( s c h i f f s b a s e ) 反应 得到多种壳聚糖季钱盐， 发现乙 酸缓冲液中， 浓度为1 0 0 p p m 时， 抗菌 活性顺序为壳聚糖n , n 一 二丁基壳聚搪n , n 一 二丁基壳聚糖- n 一 甲基壳 聚糖 n 一 辛荃- n , n 一 二甲 基壳聚搪 1 0 0 % 1 0 0 % 取代度 9 0 . 9 % 9 0 . 9 % 6 3 . 6 % 6 3 . 6 % d二勺d : bb 采用m a r k - h o u w i n k 方程计算n - v甲 基壳聚糖i 和111 的 粘均分子量 ( m . ) .结果见表三。 4 . 3 . 2 4 . 3 . 2 , 1 n - 甲基壳聚糖的结构分析 红外光谱分析 取代度9 0 % 的n - 狡甲 基壳聚搪i 在1 6 3 0 c m 左右的拨基或狡基谱带 的吸收峰大于 取代度6 3 . 6 % 的n - 梭甲 基壳聚 糖1 1 在1 6 3 0 c m 左右的 拨基 或狡基谱带的吸收峰; n - 狡甲 基壳聚搪在1 6 3 0 c m , 1 5 2 0 c m 和1 2 8 0 c m - 附近的一 n h 吸收峰与壳聚糖相比， 有一定变化，这说明狡甲基反应发生 在氨基上。 一一一一-一-.- 几代尸1.代2况1 资引r口rl畏甘奈钾 儿而r别日rll卜 n 细v e n n i b e n ( a rv朴 图 三 n - 甲 基壳聚糖i 和n 的红外光谱图 f i g u r e 3 i r s p e c t r a o f n - c m - c h i t o s a n i a n d i i wd e n ( - ll 图四 壳聚糖和n - 狡甲 基壳聚糖1 的红外光谱图 f i g u r e 4 i r s p e c t r a o f c h i t o s a n a n d n - c m - c h i t o s a n i 8 5 1 幼，、1 叫叫一 5，。.目.卜. 才勺古6 卜求 . . 一一 ， 一. ， 目 . . . . 一 ，-一 2 口泊 wa r a l a a n b m 卜 肺， ， 郭，侧 图五壳聚搪和n - 甲基壳聚糖i i 的红外光谱图 f i g u r e 5 i r s p e c t r a o f c h i t o s a n a n d n - c m - c h i t o s a n i i 5壳聚糖硫酸酷的制备研究 5 . 1引言 甲 壳素/ 壳聚搪经硫酸酷化后，得到 肝素类似物。 硫酸醋化试剂有 浓硫酸、 氯磺酸/ 毗睫、 s 0 , / 毗咤、 mao , 和s 0 , / d m f 等等， 反应一般是 非均相进行。但壳聚糖可在d m f 中与以偶极离子存在的s 0 , - d m f 复合物 进行均相反应， 该反应条件温和， 无需加热或冷却。甲壳素的硫酸酷化 反应只能在经基上进行， 而壳聚搪的硫酸酷化反应可在轻基和氨基上同 时进行. 本研究采用两种方法合成壳聚糖硫酸酣， 并对产物性质进行了 测定。 浙 江 大 学 硕 学 位 论 文 合成路线一: 浓 h c l s 0 , n - 甲基壳聚糖一一 一 卜n - 梭甲基壳聚糖一一 争n - 狡甲基壳聚糖硫酸醋 m .= 5 6 4 . 7 0 0降解d m f 合成路线二: h a c h o c o o h s 0 , 壳聚努一 一) 壳聚搪一n - c m 一 壳聚搪一 一 - - t n - c m 一 壳聚糖硫酸酷 m .= 4 2 8 . 0 0 0 降解m . = 2 3 , o o o n a b h , m . = 3 0 , 8 8 0 d m f s 0 , 一一 奋壳聚搪硫酸醋 d m f 5 . 2材料和方法 5 . 2 . 1材料 5 . 2 . 1 . 1原料 n - 梭甲 基壳聚搪 ( 自 制) ，m . - 3 0 , 8 8 0 , 5 6 4 , 7 0 0 和8 , 5 1 0 ; 壳聚糖，脱乙酞度为 9 0 . 6 % , m .- 4 2 8 , 0 0 0浙江玉环县澳兴甲壳素 有限公司) ; 壳聚糖， 脱乙酞度为9 0 . 9 % , m .- 2 3 , 0 0 0 ( h a法制得) 。 5 . 2 . 1 . 2试剂 发烟硫酸 5 0 % s 0 :, ) , 醇和丙酮等均为分析纯 5 . 2 . 1 . 3仪器 n , n 一 二甲基甲酞胺、 蒸馏水 ( 自 制) 氢氧化钠、浓盐酸、甲 d x 2 5 型电动搅拌机 ( 杭州仪表电机厂) 循环水式真空泵 ( 河南巩义市英峪豫华仪器厂) 2 k - 8 2 a 型真空千燥箱 ( 上海市实验仪器总厂) 数显电热鼓风干澡箱 ( 上海浦东跃欣科学仪器厂) 2 7 一-. 一一一ir r 王上竺6 a 生*it ie i_ n i c o l e t - 4 7 0 型红外光谱仪 e a l 1 1 0 元素分析仪 ( 意大利c a r l o e r b a 公司) a d v a n c e 2 b 4 0 0 m h z 核磁共振仪 ( 德国b r u k e r公司) 5 . 2 . 2方法 5 . 2 . 2 . 1 s o - d m f 复合液的制备 取一定量的d m f 于三颈瓶中， 冰浴， 搅拌下滴入等体积的发烟硫酸。 配制时，保持s 0 , - d m f 复合液的温度不超过3 0 c . 5 . 2 . 2 . 2壳聚糖硫酸酷的合成 以氧化降解法制备的壳聚糖为原料，磨成粉状后， 使其悬浮于d m f 中 ( w : v = l : 1 0 ) .室温搅拌下滴入过量的 s 0 ,- d m f复合液，壳聚糖逐渐 溶解。再分别反应3 小时、6 小时、9 小时、1 2 小时、1 5 小时和2 0 小 时后，加入适当 浓度的n a o h 溶液，调节反应液p h 至9 - 1 0 ，继续搅拌 0 . 5小时后， 将反应液转入透析袋内，蒸馏水反渗析 4 - 5天后， 4 0 - 5 0 干燥。 5 . 2 . 2 . 3 n - 矮甲 基壳聚糖硫酸醋的合成 分别以n - 梭甲 基壳聚糖a 和b 为原料. n - 梭甲 基壳聚糖a ( m = - 8 , 5 1 0 ) 是由原料壳聚搪经狡甲 基化，浓盐酸降解 1 0 分钟后， 最后精制而得。 n - 竣甲 基壳聚搪b ( m . = 3 0 , 8 8 0 )是由 原料壳聚糖经h 2o , 法氧化降 解， 梭甲基化后，最后精制而得。 n - 梭甲基壳聚搪a( 粉状) 悬浮于 d m f中 ( w : v = 1 : 1 0 ) ， 搅拌下加 入过量的s o :, d m f 复合液， 此时n - 梭甲 基壳聚糖a 立即溶解， 继续搅拌 3 小时后， 加入适当浓度的n a o h 溶液以调节反应液p h 至9 - 1 0 ， 再搅拌 0 . 5 小时后，转入透析袋，用蒸馏水反渗析4 - 5 天后，5 0 千燥。 n - 狡甲基壳聚搪 b( 粉状)悬浮于 d m f中 ( w : v = 1 : 1 0 ) ,搅拌下加 浙 江 人 学 硕 学 位 论 文 片 入过量的s o .,- d m f 复合液， n - 梭甲基壳聚糖b 逐渐溶解， 继续搅拌6 - 1 0 小时后，加入氢氧化钠溶液以 调节反应液p h 至9 - 1 0 ， 再搅拌0 . 5 小时 后，转入透析袋，用蒸馏水反渗析4 - 5 天后，5 0 干燥。 5 . 2 . 2 . 4壳聚糖硫酸酷的性质测定 5 . 2 . 2 . 4 . 1红外光谱测定 将精制的壳聚糖和壳聚糖硫酸醋分别和k b r 压片，以k b r 为参比， 用红外光谱仪测定。 5 . 2 . 2 . 4 . 2硫含量测定 将5 . 2 . 2 . 4 . 1 中测定的壳聚糖硫酸醋， 用硫元素分析仪分别测定它 们的硫含量。 5 . 2 . 2 . 4 . 3元素分析 用元素分析仪分别测定所合成的一系列壳聚搪硫酸酩的c , n和h 的含量。 5 . 2 . 2 . 5 n - 狡甲 基壳聚糖硫酸酷的 性质测定 5 . 2 . 2 . 5 . 1红外光谱测定 将精制的壳聚搪硫酸酷和n - 狡甲 基壳聚糖硫酸酷分别和k b r 压片， 以k b r 为参比，用红外光谱仪测定。 5 . 2 . 2 . 5 . 2硫含量测定 将 5 . 2 . 2 . 5 . 1 中测定的n - 梭甲 基壳聚糖硫酸酷， 用硫元素分析仪 测定其硫含量。 5 . 2 . 2 . 5 . 3 h - n m r 谱测定 将n - 狡甲基壳聚糖硫酸醋溶于d 2 0 中 ( 稍加热) ，用4 0 0 兆赫兹的 核磁共振仪测定h - n m r 谱。 浙 江 大 学 硕 学 位 论 文 5 . 3结果与分析 5 . 3 . 1 5 . 3 . 1 . 壳聚糖硫酸酷合成的结果与分析 i红外光谱分析 大量文献报道:壳聚糖硫酸醋基的 吸收峰在 1 2 5 0 c m 和8 0 0 c m ， 附 近。从合成的6 个壳聚搪硫酸酷样品的红外光谱图中，我们可以看到: 与壳聚糖的红外光谱图比 较，样品 1 在 1 2 5 0 c m 和8 9 0 c m 附近有吸收 峰: 样品2 , 3 , 4 和5 在 1 2 5 0 c m 和8 0 0 c m 附 近有吸收峰:而样品6 在 1 2 5 0 c m ， 附近无吸收峰，只在 8 9 0 c m 附近有一个很小的吸收峰。 8 9 0 c m 附近的吸收峰不是壳聚糖硫酸醋基的吸收峰. 因而， 我们可以初 步判定: 样品1 的硫含量应该较低: 样品2 , 3 , 4 和5 是壳聚糖硫酸醋: 样品6 未接上硫酸酷基， 其原因可能是硫酸酷化反应的时间过长， 壳聚 糖发生了降解反应，而并未进行硫酸酷化反应。 刁泊洲州川 一4丫. 一入1卜一. 川恻1 ，j生u 1走寇认队 八从 w. 月“ 国 吐. 门心 品 ” 图六 壳聚糖及壳聚糖硫酸酷1 的红外光谱图 f i g u r e 6 i r s p e c t r a o f c h i t o s a n ( 0 ) a n d s u l f a t e d c h i t o s a n ( 1 ) 学 位 论 文 浙 江 大 学 硕 一 一一 再 一， 一 匀 勺 少 气 稼 、.、 声了 人 的阳 吞 户川州川尹 协口。 刀/ 沁 - 咚、 70翻 s o 4 o- 味伴. 分 i +,u 以 旧 2 因 目 、 勿 e 勺口 自 . 门( 爵 ” 图七 壳聚搪及壳聚搪硫酸醋2 的红外光谱图 嘴 f i g u r e 7 i r s p e c t r a o f c h i t o s a n ( 0 ) a n d s u l f a t e d c h i t o s a n ( 2 ) 胜自钧 丫公曰 , 0 o - 八州曰日厂 f 认八入 / 、尸 铲厂 产/ / 。朴叭 。内d价刀卜 加洲叨ij六 夕，jjj ， 98,.iv 一健冰 96以时90 卜岁 、 /产 !哪 口叹一0目 口尸洲日月j” 钟、，怪! 明6川目刊1 口 厂卜 /厂 / / 幸 2 口刀 例. v e mm 。 臼 ， ( ， ， ” 86-阵:终侧 图八 壳聚糖及壳聚糖硫酸醋 3 的红外光谱图 f i g u r e 8 i r s p e c t r a o f c h i t o s a n ( 0 ) a n d s u l f a t e d c h i t o s a n ( 3 ) 31 一一一一-一-，. 浙 江 人 学 硕 学 位 论 厂 一到月川浦 灿 nu了盆压 勺才/8豆书 人，、 、叭吩吓85:180: 月、 75) 刃 卜、1多 厂 / 、下哟 、l /丫 / 、/ ， / j肠， : .、 7o的 万 飞 a u.，/ / 80;55= 曰刀1目卜，刊尸 加朽 卜淤11|sere!1护 飞 / 了气， 、 订 厂 2 侧刃 w. -. -让 旧 门健 - 1 ) ，o:万30:.，o0 图九 壳聚糖及壳聚糖硫酸醋4 的红外光谱图 f i g u r e 9 i r s p e c t r a o f c h i t o s a n ( 0 ) a n d s u l f a t e d c h i t