（食品科学专业论文）发酵米粉的微生物鉴定和品质改善机理研究.pdf

论文摘要 摘要 米粉是一类重要的淀粉凝胶食品，在我国南方及东南亚地区广为食用。近年来，北方的消费 量也有所增加。利用陈籼米和碎米加工米粉是提高我国粮食利用率和解决陈米积压问题的有效途 径。尤其是发酵米粉，经过发酵工艺后可使米粉获得更好的口感和质地特性，值得深入研究其发 酵改善淀粉凝胶质地特性的机理，以及作用的微生物和种类。 针对以上问题，本文对发酵过程中的主要微生物进行了鉴定，建立了米粉质地评价体系，研 究了发酵对米粉主要成分的影响，采用发酵过程中的主要酶和酸处理大米粉，考察发酵产生的酶 和酸对米粉流变性的影响，研究了纯种发酵和不同粒度发酵对米粉品质的影响，为工业化大生产 提供科学依据。论文的主要内容及结论如下： 1 、对米粉自然发酵过程申的微生物数量随发酵时间的演变进行了跟踪研究，确定发酵过裂中 的优势菌群为乳酸杆菌、乳酸链球菌、酵母菌，发酵米粉的发酵过程为乳酸发酵。对发酵微生物 的酶活特性进行了测定，结果表明这些微生物主要具有类脂酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、b 一 糖醛酸甙酶、b 一岩藻糖甙酶等酶活性。微生物的脂肪酶和蛋白酶能降解米粉中的脂肪和蛋自质， 有利于米粉凝胶的形成。微生物的酶作用，是发酵米粉的品质优于非发酵米粉的原因之一。 2 、乳酸菌产酸导致的高酸性( 低p h 值) 环境使大肠菌群在发酵后期减少到不可检出的水平， 乳酸菌的这种特殊功能保证了食品的安全性。 3 、建立了米粉的感官评价和仪器评价的指标体系与方法。以大量的重复实验为基础，选取 了3 个最重要的感官指标，建立了与其分别对应的仪器指标之间的关系，为正确地评价米粉的质 地奠定了基础。 4 、建立了一种新的考察支链淀粉外长链数量表征的方法，并用以分析发酵过程中支链淀粉 外长链含量的变化。结果表明，支链淀粉的外长链在发酵过程中逐渐增加，能够使米粉更好地形 成凝胶，形成的凝胶也具有更好的凝胶强度；通过二硫键含量的测定，研究了蛋白质对米粉质地 的影响，结果表明蛋白质含量越少，或是二硫键含量越少，对米粉质地的改善有利。此外，由于 大多数脂质与直链淀粉以螺旋结构的形式存在，对米耪的物性影响很大，本文研究了发酵对米粉 中脂肪含量的影响，结果表明发酵使米粉中的脂肪含量减少，有利于米粉凝胶的形成。 5 、发酵的作用土要是微生物产生的酶和酸作用于米粉的效果，本文研究了发酵过程中产生 的酶和酸对米粉流变性的影响，结果表明p h 4 0 和p h 5 0 的乳酸处理可以改善米粉的流变性，使 米粉的弹性和最大破断应变都有所增加，与对照之间存在显著性差异；此外a 一淀粉酶和蛋白酶也 对米粉流变性有一定的改善作用。 6 、用微生物进行纯种发酵和用不同的原料米粒度发酵，结果表明纯种发酵米粉较不发酵米 粉具有更好的流变特性，但是流变性与自然发酵的米粉没有显著的差异。将大米破碎成2 0 舀 6 0 目后再发酵对米粉质地的影响不人，由于纯种发酵的微生物品种单一，实现工业化大生产便于 控制生产参数。粉碎成1 0 0 目的粉末后再发酵同样的时间则会出现发酵过度，可能可以利用这一 点缩短发酵时间。 关键词：发酵米粉。微生物，鉴定，质地，流变性 论文摘要 a b s t r a c t r i c ei sam a i ns t a p l ef o o do fa s i a np e o p l e s i th a sm a n yu n i q u ea t t r i b u t e s ，s u c ha se a s eo fd i g e s t i o n ， b l a n dt a s t e ，a n dh y p o a l l e r g e n i cp r o p e r t i e s u t i l i z a t i o no fi n d i c ar i c et op r o d u c er i c en o o d l e si sv e r y p o p u l a ri nt h es o u t h e a s ta s i ac o u n t r i e s n a t u r a lf e r m e n t a t i o no fw h o l er i c eg r a i n si s at r a d i t i o n a l t e c h n o l o g yu s e dt op r o d u c ef e r m e n t e dr i c en o o d l e sw i t hac h e w y ，h i g h l ya c c e p t a b l em o u t hf e e l ，w h i c h i sv e r yp o p u l a ri nt h es o u t hc h i n aa n dt h a i l a n d h o w e v e lt h ep o t e n t i a lo ft h i sk i n do ft e c h n o l o g yh a s n o tg o tb e e nr e c o g n i s e df u l l ya sy e t t h em e c h a n i s m so ff e r m e n t a t i o na n di t se f f e c t so nt h et h e o l o g i c a l p r o p e r t i e so fr i c en o o d l e sa r en o tc o m p l e t e l yc l e a r t h eg o a lo ft h i sp a p e rw a sf o c u s e do ns e v e r a lk e yp o i n t sa sf o l l o w s ：( 1 ) i d e n t i f i c a t i o no fm a i n m i c r o o r g a n i s m sd u r i n gf e r m e n t a t i o n ，c 2 ) e s t a b l i s hat e x t u r ee v m u a t i o ns y s t e mf o rf r n ，( 3 ) e f f e c to f f e r m e n t a t i o no nm a i nc o m p o n e n t so fr i c e ，( 4 ) e f f e c to fe n z y m e sa n da c i d sp r o d u c e dd u r i n gf e r m e n t a t i o n o nt h et h e o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so ff r n ，( 5 ) e f f e c to fd i f f e r e n tm i c r o o r g a n i s m sa n dr i c eg r a n u l a r i t yo n t h ec h a r a c t e r i s t i e so ff r n 1 t h el a c t o b a c i u u s , s t r e p t o c o c c u s , y e a s t , m o l d , a p ca n dc o l i f o r m d u r i n gf e r m e n t a t i o no ff r nw e r e c o u n t e d a l o n g w i t hf e r m e n t a t i o n p r o c e s s t h e m a i n m i c r o o r g a n i s m w e r e i d e n t i f i e d a s l a c t o b a c i l l u s , s t r e p t o c o c c u sa n dy e a s t t h ee n z y m ea c t i v i t i e so ft h em i c r o o r g a n i s m sw e r ea l s o s t u d i e d a 1 lt h ei s o l a t e s d i s p l a y e de n z y m e a c t i v i t e so f l i p a s e ( c 1 4 ) , t r y s i n a - c h y m o t r y p s i n ，b 羽u c u r o n i d a s e ， j - f u c o s i d a s e a sl o w e rc o n t e n to fp r o t e i na n df a tb e n e f i tt of r n t e x t u r e ，e n z y m ep r o d u c e db ym i c r o o r g a n i s m sm a y b e o n eo ff a c t o r sf o rt e x t u r ei m p r o v e m e n tt of r n 2 l o wp hp r o d u c e db yia bi n h i b i t a n tc o l i f o r mt oac a nn o tb ed e t e c t e dl e v e l w h i c hc o n t n b u t et of 0 0 d s a f e t y 3 at e x t u r ee v a l u a t i o ns y s t e mf o rf r nw a se s t a b l i s h e d b a s e do nal a r g en u m b e ro fs a m p l e so fs e n s o r y e v a l u a t i o na n di n s t r u m e n t a lm e a s u r e m e n t s ，t h r e em o s ti m p o r t a n ts e n s o r ye v a l u a t i o nf n d e x e sw e r e s e l e c t e dt oe s t a b l i s hr e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h e i rc o r r e s p o n d i n gi n s t r u m e n ti n d e x e s t h i ss y s t e mc a nb e u s e df o rr i c en o o d l e se v a l u a t i o n 4 t h ee f f e c to ff e r m e n t a t i o no ns t a r c h p r o t e i na n df a tw a ss t u d i e di nt h i s p a p e r t w om e t h o d sw i t h d i f f e r e n tt h e o r yw e r eu s e dt om e a s u r a t et h ec o n t e n to fa m y l a s e ，a sar e s u l t ，t h ec o n t e n to fe x t e r i o rl o n g c h a i no fa m y l o p e c t i ni n c r e a s e dd u r i n gf e r m e n t a t i o n ，w h i c hm a k et h eg e lo ff r ns t r o n g e r a sp r o t e i n a n dd i s u l f i d eb o n dc a na f f e c tt h ec o o k i n gp r o p e r t i e so fr i c e ，t h ee f f e c t so fc o n t e n t so fd i s u l f i d eb o n do n f r nr b e o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c sw e r ea l s os t u d i e d b e s i d e s ，h e l i c a lo ff a ta n da m y l o s ea l w a y sa f f e c tt h e r h e o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fs t a r c h ，t h ee f f e c to ff e r m e n t a t i o no nf a tc o n t e n tw a ss t u d i e d f e r m e n t a t i o n d e c r e a s e dt h ec o n t e n to ff a tw h i c hb e n e f i tt og e lf o r m i n g 5 p o l i s h e dr i c eg r a i n sw e r et r e a t e dw i t hv a r i o u sa c i d ( 1 a c t i ca c i d ，a c e t i ca c i d ) a n de n z y m e ( a - a m y l a s e ， 1 3 - a m y l a s e ，a m y l o g l u c o s i d a s e ，l i p a s e ，p r o t e i n a s e ) s o l u t i o n s ，w h i c ha r et y p i c a lf e r m e n t a t i o nm e t a b o l i t e s d u r i n gt h ep r o c e s s i n go ff r n ，t oi n v e s t i g a t et h e i re f f e c t so ut h er h e o l o g i c a lc h a r d c t e r i s t i c so fr i c e 1 i 论文摘要 n o o d l e s t h er h e o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c sw e r em e a s u r a t e db yar h e o m e t e t h ee l a s t i c i t ya n dm a x i m u m s t r a i no fr i c en o o d l e st r e a t e dw i t hp h 4 0 ，p u s 0l a c t i ca c i ds o d i u ml a c t a t eb u f f e r ，a - a m y l a s e p r o t e i n a s e w e r ei m p r o v e ds i g n i f i c a n t l y 6 t h ee f f e c to fp u r em i c r o o r g a n i s mf e r m e n t a t i o na n dg r a n u l a r i t yo fr i c ew e r ei n v e s t i g a t e d a sa r e s u l t ，t h ep u r em i c r o o r g a n i s m sf e r m e n t a t i o na n d2 0 - 6 0m e s hw e r en o ts i g n i f i c a n td i f f e r e n tc o m p a r e d w i t hn a t u r a lf e r m e n t a t i o n ，b u tt h ep a r t i c l el o w e rt h a n1 0 0m e s hw a so v e rf e r m e n t e d ，i ts u g g e s t e ds m a l l e r g r a n u l a r i t ym i g h ts a v et i m ef o rf e r m e n t a t i o n t h e s ec o n c l u s i o n sc a nb u i l dt h e o r e t i c a lf o u n d a t i o nf o rf u r t h e rr e s e a r c h ，m o r e o v e r , c a nb eg u i d a n c e f o ri n d u s t r i a l i z a t i o no ff e r m e n t e dr i c en o o d l e s s o m ep r o p o s a l sw e r eg i v e n ，c o n c e r n i n gf u r t h e rs t u d i e s a b o u th o wt oi m p r o v es c i e n t i f i cr e s e a r c ho ff r na n dh o wt om a k ep r o g r e s sf o rm o d e r n i z a t i o no ff r n p r o d u c t i o n k e yw o r d s ：f e r m e n t e d r i c e n o o d l e s ( f r n ) ，m i c r o o r g a n i s m ，i d e n t i f i c a t i o n ，t e x t u r e ，r h e o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c l i t 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与9 - - b i 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：荡岛扬钇 时间：卵多年多月刁日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：毙纭衫 时间：砌年g 月纠日 导师签名：朝食 时间： p 。年月刁同 中国农业大学硕士论文 第一章绪论 1 1 研究目的和意义 第一章绪论 米粉是我国的传统食品。在我国南方及东南亚地区广为食用。米粉具有典型的地方特色，是 稻米生产国的一类重要凝胶食品。按其加工工艺主要分为切粉和榨粉等，见表1 - 1 ( 成明华，2 0 0 0 年) ：按是否发酵分为发酵米粉和非发酵米粉。 表1 - 1 米粉的分类 t a b 1 1 k in t i so fr ic en o o d i e 3 中国是世界上最大的大米生产和消费国，约占世界总产量的3 5 ( 李里特等，2 0 0 1 年) 。我国 的大米主要作为口粮消费，约占总消费量的8 4 6 ，大米加工消费的量仅占6 左右。目前的大 米加工主要有以t - 几大类：( 1 ) 稻米产品，包括一些特色加工米，如水磨米、免淘米、彩色米、 营养米、蒸谷米、胚芽米、发芽糙米、降血糖米等；( 2 ) 大米深加工产品，包括大米淀粉、火米 蛋白、米制糖浆等；( 3 ) 大米制品，如新型大米油炸食品、方便米饭、速煮糙米、米粉丝、米糕 点、米酒、米豆腐等。近年来，由于我国重视大米的加工利用，稻米的增值率正在逐步提高，稻 米产品在国际和国内市场占有一定的份额。随着稻谷新品种的产生，我国的稻米产量也正在逐年 增长。但是大米的加工远远没有跟上增产的步伐，寻找新的加工途径显得尤为重要。 米粉生产基本上对大米进行了彻底的利用，不仅可以用完整的大米进行米粉j j l q - ，火米加工 过程中的碎米也可以用于米粉加工，利用率高，没有资源浪费。在我国，尤其是南方的湖南、湖 北、浙江、江西、广东、一两、云南等省对米粉的需求最非常大，不仅是很受欢迎的早餐，也是 中国农业大学硕士论文第一章绪论 街头巷尾常见的特色小吃。因此，米粉加工是提高大米利用率的有效途径。 稻谷占我国粮食总产量的2 5 左右，是我国粮食工业的支柱产业之一( 周惠民等，2 0 0 2 年) 。 2 0 0 3 年全国的粮食总产量为4 30 6 9 4 万吨，早籼稻的产量为29 4 8 4 万吨，仅湖南省的早籼稻产 量就有6 2 1 3 万吨，占全国早籼稻总产量的2 1 1 ( 韩家增等，2 0 0 4 年) 。早籼米的直链淀粉含 量高，碎米率高，垩白率高，商品外观差，煮成米饭后口感粗糙，食用品质差，近年来作为口粮 消费呈下降趋势。但是早籼米是加工米粉的理想原料，因此，利用早籼米生产米粉，可解决早籼 稻面临的困境，不仅仅对粮食收购与储藏企业摆脱困境，而且对保护农民种粮积极性，推动农村 经济的发展，确保2 1 世纪我国的食品安全也具有重要的意义。 发酵米粉比传统的米粉加工工艺多一个自然发酵过程，起源于湖南省常德市，其流程如图1 - 1 所示。传统经验和科学研究表明：加工米粉的原料米以直链淀粉含量高的品种( 如籼米) 为佳( 成 明华，2 0 0 0 年) 。生产实践经验表明，发酵米粉加工采用陈化半年到1 年的陈米搭配部分新米加 工的米粉品质最好。因此，发酵米粉不仅可以大量消耗食用品质差的早籼稻，也是陈化籼米的最 佳山路。 图卜1 发酵米粉工艺流程 f i g1 1t h ef i o w o h a r to ff e r m e n t e dr i c en o o d i e 8 目前，我国本土的传统食品发展力度还不够，大部分的米粉生产为前店后厂的家庭作坊式， 产品依赖于生产经验，生产条件落后，卫生质量差。就湖南省常德市而言，有上百家的米粉手工 作坊，小型米粉加工厂1 6 家，工厂一般每天加工大米1 3 吨，依当天的订货量而定。2 0 0 3 年， 作为发酵米粉发源地的常德市进行城市规划，许多污染严重的企业要求搬出常德市，各类作坊、 小工厂要求形成规模生产，建立现代化企业。发酵米粉要求在金键米粉置业公司的领导下建立工 业化生产线，原有的米粉生产厂都要清除，这就意味着传统的自然生产环境遭到破坏，原来自然 环境中的微生物资源就会丢失。而发酵米粉实现工业化生产，鉴定和保存其原始的自然发酵菌种 是必不可少的。面临常德市城市规划建设，鉴定和保存原始的微生物这一举措就显得非常紧迫。 2 中国农业大学硕士论文 第一章绪论 自然发酵依赖于自然界温度、气候、水、环境等的变化，任何一个因素的改变都可能使产品 的质量发生改变。对发酵改善米粉食用品质的机理、发酵工艺的实质等都不清楚，产品的质量不 稳定，常常会在实际生产中造成原料和劳动力的浪费。要实现工业化大生产，必须清楚发酵改善 米粉品质的机理以及发酵工艺的实质，才能规范生产参数和控制生产流程。 本课题涉及到以大米原淀粉为原料进行微生物发酵的理论研究，不仅是一种节能安全的提高 陈粮、次粮利用率的新方法，而且为进一步研究其它淀粉质原料的发酵提供参考，具有重大而深 远的意义。 1 2 国内外研究概况 已经有专家学者对国外传统大米发酵食品中的微生物进行过研究。 b e r h a n u 等( 1 9 8 5 年) 从t e f - i n j e r a ( 埃塞俄比亚传统发酵米粥) 中分离得到s t r e p t o c o c c u s f a c c a i l s , l b r e v i s 等。 d a e n g s u b h a 等( 1 9 8 9 年) 从泰国的发酵米粉( k h a n o mj e e n ) 中分离鉴定出b a c i l l u s s u b t i l i s , 且c e r e u sv a r , l a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u m , l c a s e i , s t r e p t o c o c c u sa v i u m , l 1 a c t s 等；u c h i m u r a 等 ( 1 9 9 1 年) 对k h a n o mj e e n 中微生物分布区系进行了研究，米粉的发酵过程中有4 0 6 0 的微 生物为乳酸菌，k h a n o mj e e n 的自然发酵过程为乳酸发酵，其中的主要微生物有js t r e p t c o c c u s l a c t i s , s t h e r m o p h y l u s , p e d i o c o c c u sa c i d i l a c t i c i , l a c i d i l a c i t i c i , l p l a n t a r u m , l r e u t e r 等。 h a l i n 等( 1 9 9 3 年) 从k e n k e y ( 加纳发酵玉米团) 中分离得到l b r e v i s 和l f e r m e n t u m 。 v o g e l 等( 1 9 9 4 年) 和g a n z l e 等( 1 9 9 8 年) 分别从燕麦和大麦制作面包的酸面团中分离出 l a c t p o n t i s , l a c t s a n f r a n c i s c e n s i s 和l a c t f e r m e n t u m ，认为与酵母菌一起作用可咀改善面包的品质， 使其具有较好的弹性和韧劲。 a g a t i 等( 1 9 9 8 年1 从生面团中分离出来可降解淀粉起主要作用乳酸菌为l a c t f e r m e n t u m 菌系， 发酵类型为异型发酵。 h i r o k o 等( 2 0 0 0 年) 对越南的米粉片( r i c e p a p e r ) 中的微生物进行了分离鉴定，其中的主要 革兰氏阳性菌为：s t r e p t c o c c u sl a c t i s , s t h e r m o p h y l u s , p e d i o c o c c u sa c i d i l a c t i c j i l a c i d i l a c i t i c i , l p l a n t a r u m , l m u t e r , b a c i l l u ss u b t i l i s , b c e r e u sv a r , l a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u m , l c a s e s t r e p t o c o c c u s a v i u m , 上1 a c t i s , s t a p h y l o c o c c u sa u r e u sl f e r m e n t u m , s t r e p t o c o c c u sf a c c a i l s , l b r e v i s 等，这些微生物在 谷物类发酵食品中非常常见，但是米粉片生产过程中的微生物数量以及在加工过程中的具体作用 还有待研究。 s a n n i 等( 2 0 0 1 年) 从f u f u ，b u m k u t u ( 尼日利亚的大米传统发酵食品) 等中分离得到 l p l a n t a r u m 和l f e r m e n t u m 等，这些菌株具有高淀粉酶活力，可以降解淀粉为不具有淀粉酶活力 的乳酸菌提供能源物质，也可能对大米制品的流变性有一定的作用。 我国，除了鲁战会( 2 0 0 2 年) 对发酵米粉中的微生物进行了筛选外，还没有人对发酵米粉中 的微生物区系做过全面的研究，了解微生物的种类和主要特性是将其用于生产发酵米粉的前提条 件，这部分研究成果的取得将为工业化纯种发酵或混合菌种发酵提供选择微生物的基础。 3 中国农业大学硕士论文 第一章绪论 国内外对改善米粉质量的方法以及发酵对淀粉的改性作用也有相当的研究： c a r d e n a s 等( 1 9 8 0 年) 的研究表明木薯淀粉由于自然发酵过程涉及到乳酸菌素，发酵对木薯 淀粉改性使其具有更好的膨化特性，能加工得到品质更好的面包类制品，但是这种改善作用的理 化基础尚不明确。 宋云等( 1 9 8 0 年) 研究发现，酸浆法生产绿豆粉丝是乳酸菌产生的淀粉凝集素起到沉淀淀粉 的作用，该凝集素可将淀粉凝集成块状，加速淀粉的沉淀而使之有效地与蛋白等成分分离。其后 再没有更深入的研究。 t o h 等( 1 9 9 6 年) 研究表明，生产米粉时用蒸汽加热大米粉使淀粉部分糊化，加入热水将大 米粉制成面团，挤丝后再用蒸汽将米粉蒸熟，蒸熟的米粉在热水中漂洗，这样制得的米粉有弹性， 口感爽滑，烹煮时溶出率低。 x a v i e r 等( 1 9 9 7 年) 研究表明，发酵使木薯淀粉中的蛋白质含量明显减少，非淀粉多糖的含 量略有增加，淀粉的结晶结构不受发酵的影响，但是木薯淀粉的水溶性有很大改变，糊化粘度降 低，但是糊化温度没有明显的变化。 o v i e d o 等( 1 9 9 8 年) 研究表明，木薯淀粉在发酵过程中会产生多种有机酸，通过扫描电镜 观察淀粉颗粒，发现淀粉表面有许多小洞，这主要是酶作用的结果。为了研究发酵对淀粉的作用， 用酶或酸水解淀粉，淀粉水解后粘度降低，其糊化峰值温度高于对照，意味着酶、酸可以使淀粉 部分降解。 沈辉等( 1 9 9 8 年) 研究了自然发酵对木薯淀粉的改性作用，发现发酵结束后的酸性木薯淀粉 p h3 5 4 0 ，含有0 5 6 0 6 0 ( w w ) 的乳酸，9 3 5 9 8 5 的淀粉，灰分、粗脂肪和粗蛋白 含量都较低，用于制作面包，具有较好的筋力和韧性。但对发酵的作用机埋没有报道。 c h r i s t i a n 等( 2 0 0 0 年) 也报道了自然发酵可以改变木薯淀粉的理化性质，使淀粉膨润能力 增强，可形成质地良好的凝胶，并对发酵的玉米淀粉和木薯淀粉在烘焙过程中的膨胀率进行了对 比。 成明华( 2 0 0 0 年) 较详细地研究了非发酵米粉的生产工艺及对原料米品质的要求并对我国 各地传统的米粉进行了科学整理分类。关于原料米的研究表明，以表观直链淀粉含量商于2 2 的 品种( 如籼米) 为宜。并用陈化半年或一年的早籼稻与部分晚籼稻搭配为佳；在浸泡或发酵工艺 部分，发现温度和浸泡时间是决定米粉质最的两个重要因素，在常温f ，浸泡不充分会导致磨粉 损伤淀粉，使米粉发粘，蒸煮时溶出较大，而淀粉浸泡吸水在常温下主要发生在无定型区，达到 平衡吸水的时间为3 h r ，此时磨粉造成的损伤淀粉很少，因而不会影响米粉的品质；研究发现制 粉方式采用湿磨要优于干磨，在相同粒度下，干磨的淀粉损伤率高，米粉的胶稠度为6 1 3 m m ， 为软胶型，而浸泡充分后湿磨的米粉胶稠度为2 2 2 m m ，为硬胶型，食用晶质更好。 张子飙( 2 0 0 1 年) 通过生物发酵制锝的玉米面粉可以用来制作面条和饺子，使玉米淀粉具有 小麦面粉的功效，但也未见对其机理进行报道。 l n 等( 2 0 0 2 年) 从自然发酵对米粉的理化特性影响的角度研究发酵对整粒大米的理化特性 以及米粉流变性的影响，结果表明，自然发酵对大米中的直链淀粉含量没有显著的影响，蛋白质、 脂肪、灰分含量减少，但是自由脂肪酸的含最增加。发酵米粉有较低的最人破断应力( 5 4 k p a ) 4 中国农业大学硕士论文 第一章绪论 和较高的最大破断应变( 1 0 8 ) ，更好的透明度和咀嚼性。 鲁战会( 2 0 0 2 年) 从直链淀粉和支链淀粉分子结构的角度进行研究，表明支链淀粉和直链淀 粉豹分子结构对凝胶性能具有决定性影响，直链淀粉迅速聚合成与支链淀粉外侧链形成结合点， 然后聚合不断形成连续相网络结构，将支链淀粉的分散相包埋起来，支链淀粉的内链被封闭，包 埋较多的水分，有良好的持水性，对米粉的粘弹性及1 3 感起着主要作用。发酵后淀粉大分子降解， 中等及小分子质量淀粉比例增加，分子质量大小趋于均匀，从而使淀粉分子易于接近聚合而增强 了淀粉凝胶性能。 闵伟红( 2 0 0 3 年) 从直链淀粉和支链淀粉的含量进行研究，表明发酵后直链淀粉的含量增加 4 9 ，是支链淀粉有部分降解和脱枝，使支链淀粉老化减弱，有利于米粉凝胶的保水性，而连续 相的直链含量增加，加强了刚性的凝胶网络，米粉的韧性和拉伸性能提高。蛋白、脂肪和灰分含 量随着发酵的进行而明显减少，而游离脂肪酸的含量呈上升趋势，流变学测定发现，发酵法生产 的米粉相对于对照样品最大破断应力减小而最大应变增加。感官评定结果表明发酵法生产的米粉 柔韧筋道，品质更好。 目前还没有人从微生物发酵产生的酶和酸对米粉流变性影响这一角度进行研究，本文正是从 这一点着手，研究发酵产酶和酸对米粉流变性的影响，以进一步探讨发酵改善米粉品质的机理。 1 3 存在问题 传统发酵米粉是自然发酵的过程，加工工艺完全按照传统的方法进行，目前主要是手工作坊 式的加工，主要的问题总结如下： 1 纯自然的发酵方法，容易滋生杂菌，腐败变昧，造成大量原料和劳动力的浪费。 2 自然发酵的过程没有任何工艺参数可供参考，完全按照操作者的经验进行，使产品的质量不稳 定。 3 发酵中的微生物没有进行过系统的研究，对微生物的特性不了解，难以设定工艺参数和制定工 艺流程。 4 发酵机理尚不明确，实现工业化大生产缺乏有力的科学依据。 1 4 研究内容和目标 针对以上存在的问题，本课题的研究目标为： 1 分离筛选发酵的主要作用菌种，研究主要微生物的酶活性，为进一步研究发酵过程提供基础数 据。 2 建立米粉质地评价体系，找出评价米粉质地的仪器指标，作为后续研究中评价米粉质地的标准。 3 研究发酵对原料大米的三大主要成分一淀粉、蛋白质、脂肪的影响，由此来考察发酵对米粉质 地的影响。 4 研究发酵所产的酶和酸对米粉质地的影响，从微生物产酶和酸的角度研究发酵对米粉品质改善 的机理。 5 利用特性较好的乳酸菌进行纯种发酵，并研究不同的大米粒度发酵对米粉品质的影响，考察纯 5 中国农业大学硕士论文 第一章绪论 种发酵以及不同粒度发酵应用的优势及可行性。 1 5 实验的技术路线 6 中国农业大学硕士论文 第二章发酵微生物的鉴定及菌株酶活性研究 第二章发酵微生物的鉴定及菌株酶活特性研究 2 1 前言 以籼米为原料，经过自然发酵生产的发酵米粉，口感爽滑，有筋道感，品质优于不发酵米粉。 但是，由于目前发酵米粉的生产基本上是手工作坊，生产规模小，产品质量不稳定。要对其进行 大规模生产，实现产业化，工业化纯种发酵或混合菌种发酵是一种可行的方法。因此，先弄清楚 在发酵过程中起作用的微生物以及这些微生物的特性是必要的。 国内对米粉生产相关的微生物报道较少。1 9 8 0 年，北京大学生物系与北京粉丝厂合作对绿豆 粉丝生产的酸浆法进行了研究。研究发现，酸浆法是乳酸菌产生的淀粉凝集素起到沉淀淀粉的作 用，该凝集素可将淀粉凝集成块状，加速淀粉的沉淀而使之有效地与蛋白等成分分离( 宋云等， 1 9 8 0 年) 。其后再没有更深入的研究。秦礼康等( 1 9 9 7 年) 将绿豆粉丝生产的酸浆法应用于马铃 薯淀粉的生产。结果发现淀粉沉淀时间缩短了6 倍，3 0 m i n 内淀粉得率增加3 1 1 ，淀粉白度提 高1 6 6 ，劣质淀粉比例减少1 0 9 。施安辉等( 1 9 9 8 年) 对贵州等地引起米粉腐败的微生物进 行了分离研究，结果表明，引起腐败的微生物主要是芽孢杆菌( 包括枯草芽孢杆菌、醋酸芽孢杆 菌和马铃薯芽孢杆蓖等) ，无芽孢杆菌( 主要是乳酸杆菌和乳酸链球菌) ，酵母菌和霉菌等。2 0 0 2 年，鲁战会等对发酵米粉中的微生物进行了筛选，但尚未进行系统的鉴定。 b e r h a n u 等( 1 9 8 5 年) 从t e f - i n j e r a ( 埃塞俄比亚传统发酵米粥) 中分离得到s t r e p t o c o c c u s f a c c a i l s ，l b r e v i s 等。 d a e n g s u b h a 等( 1 9 8 9 年) 从k h a n o mj e e n 中分离鉴定出b a c i l l u ss u b t i l i s ，b c e r e u sv d r ， l a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u m 。l c a s e i ，s t r e p t o c o c c u s a v i u m ，l 1 a c d s 等。u c h i m u r a 等( 1 9 9 1 年) 对泰 国的发酵米粉( k h a n o mj e e n ) 中微生物分布区系进行了研究，米粉的发酵过程中有4 0 6 0 的 微生物为乳酸菌，k h a n o mj e e n 的自然发酵过程为乳酸发酵，其中的主要微生物有：s t r e p t c o c c u s l a c t i s ，s t h e r m o p h y l u s ，p e d i o c o c c u sa c i d i l a c t i c i ，l a c i d i l a c i t i c i ，l p l a n t a r u m ，上h r e u t e r 等。 h a l i n 等( 1 9 9 3 年) 从k e n k e y ( 加纳发酵玉米团) 中分离得到l b r e v i s 和l f e r m e n t u m 。 h i r o k o 等( 2 0 0 0 年) 对越南米粉片( r i c ep a p e r ) 中的微生物进行了分离鉴定，其中的主要革 兰氏阳性菌为：s t r e p t c o c c u sl a c t i s ，s t h e r m o p h y l u s ，p e d i o c o c c u sa c i d i l a c t i c i ，l a c i d i l a c i t i c i ， l p l a n t a r u m ，l r e u t e r ，b a c i l l u ss u b t i l i s ，b c e r e u sv a r ，l a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u m ，l c a s e i ，s t r e p t o c o c c u s a v i u m ，l 1 a c t i s ，s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ，l f e r m e n t u m ，s t r e p t o c o c c u s 如c c a i 缸，l b r e v i s 等。 s a n n i 等( 2 0 0 1 年) 从f u f u ，b u r u k u t u ( 尼日利亚的大米传统发酵食品) 等中分离得到 l p l a n t a r u m 和l f e r m e n t u m 等，这些菌株具有高淀粉酶活力，可以降解淀粉为不具有淀粉酶活力 的乳酸菌提供能源物质，也可能对大米制品的流变性有一定的作用。 目前国内尚无人对发酵米粉中自然发酵过程中的作用微生物区系和种类进行深入的研究，对 发酵过程中的主导微生物酶活性也未做过深入的研究，因此，本章首先对米粉自然发酵过程中的 乳酸杆菌、乳酸链球菌、酵母菌、霉菌、细菌总数以及大肠菌群的数量随发酵时间的演变进行了 跟踪研究，以了解发酵过程中的微生物生长情况，从而判别优势菌群。在此基础上，对发酵的主 7 中国农业大学硕士论文 第二章发酵微生物的鉴定及菌株酶活性研究 要微生物进行了分离、纯化并用试剂盒对其进行鉴定，对发酵微生物的酶活特性进行了测定，了 解微生物的主要表观特性、种类及其主要的酶学特性，为更好地控制产品品质，科学地设计工艺 流程和实施工业化生产奠定基础，为研究发酵米粉的发酵机理提供前提条件。 2 2 实验材料与设备 2 2 1 实验材料 ( 1 ) 实验菌种：2 0 0 3 年1 0 月6 日湖南常德发酵米粉厂取样，工厂的选择是从常德市1 6 家较大 规模的米粉加工厂随机选取了三家t 厂，用无菌取样杯分别取自来水、原料米、发酵一天、两天、 三天的样品作为菌种来源，并用温湿度计实测车间的温度、湿度，用p h 计测量各发酵阶段样品 的口h 值。样品在低温条件下送至长沙湖南农业大学实验室进行初步的分离筛选和菌群计数，将 初步分离筛选得到的菌株接种于斜面培养基运回北京中国农业大学进行进一步研究。 ( 2 ) 微生物计数材料 大肠菌群快速检验试验片( 3 m t mp e t r i f i l m t mc o l i f o r mp l a t e ) ，细菌总数测试片( 3 m t m p e t r i f i l m t ma e r o b i cp l a t e ) ，b c p 琼脂，虎红琼脂。 ( 3 ) 分离纯化材料 培养基：m r s 肉汤培养基( b e c t o nd i c k n s o n ，u s a ) ；m 1 7 肉汤培养基( b e c t o nd i c k n s o n ，u s a ) ； d r b c 琼脂培养基(