（食品科学专业论文）家蚕核型多角体病毒FGF的细胞和组织定位研究.pdf

江苏大学硕士学位论文 摘要 成纤维细胞生长因子( f i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r s ，f g f s ) 大都发现于脊椎动 物( 包括人) ，是一种具有广泛生物活性的蛋白分子。已有研究表明，f g f s 对机 体发育、组织的结构与功能的维持、损伤的愈合与修复都有作用，还与肿瘤的发 生和转移等多种病理过程有关。本研究分离纯化了柞蚕多角体病毒( a n t h e r a e a p e r n y in u c l e a r p o l y h e d r i nv i r u s ，a p n p v ) ，并在对该病毒d n a 序列分析时，发现 了一个与人源f d 基因相似的基因。该基因存在于所有已公布的杆状病毒全序列 中，但功能未知。为了解该基因在病毒感染中所起的作用，本文在家蚕一杆状病 毒的模型中对f g 基因进行了初步研究，包括对家蚕核型多角体病毒( b o m b y x m o r i n u c l e a r p o l y h e d r i n v i r u s ，b m n p v ) 的f d 基因进行了克隆、表达和功能的研 究，主要结论如下： 1 克隆了柞蚕多角体病毒a p n p v 中的f d 基因。该基因大小为5 5 8 b p ，其 读码框含有1 8 5 a a ，是一个新基因。该基因已在g e n b a n k 上登录( 登录号为 a y 6 4 1 5 2 7 ) 。 2 克隆和表达了家蚕核型多角体病毒中f d 基因。构建了原核表达载体 p e t 2 8 a - f g f , 通过i p t g 诱导表达后，s d s p a g e 显示在2 7 k d a 左右有一特异条 带，与预测的蛋白质分子量大小一致。该蛋白在大肠杆菌中含量较高并以包涵体 的形式存在，表达产物含有6 个组氨酸残基，用n i n t a 亲和层析柱高效纯化了 表达产物。 3 以绿色荧光蛋白( g r e e nf l u o r e s c e n c ep r o t e i n ，g f p ) 作为融合基因，构建 真核表达载体p c d n a 3 1 - g f p - f g f , 该基因在高等哺乳动物细胞c o s 一7 细胞中表 达，并定位在细胞核内，可能影响c o s 一7 细胞中d n a 复制或基因的转录。 4 杆状病毒表达系统中，f g f 在不同细胞系中表达定位不尽相同。构建重 组转座载体b a c m i d - g f p - f g fd n a ，转染细胞获得重组病毒a c - g p - f g f , 分别感染 t n 5 和s f 9 细胞使f g f 在这两种细胞中过量表达，发现该蛋白定位于细胞膜。 构建重组转移载体p b a c p a k 8 g f p - f d 与线性化的b m p b a c p a k 6d n a 共转染 b m n 细胞，该蛋白定位于b r a n 细胞的细胞核中。f g f 在不同细胞中定位不同， 江苏大学硕士学位论文 表明f g f 分子与细胞间存在识别关系，即来源于亲和病毒的f g f 才能被该细胞 识别，作用于核内。 5 f g f 在蚕体各个器官中的表达具有一定的靶向作用。b m g f p f g f 重组病 毒注射四龄蚕，以b m g f p 病毒作为对照，对蚕感染后不同时期的主要器官进行 观察，通过比较认为蚕体中f g f 作用的靶器官为血液、气管、马氏管、中部及 后部丝腺等，并且f g f 能够维持这些器官的正常生理状态。 定位 关键词：家蚕核型多角体病毒，成纤维细胞生长因子，绿色荧光蛋白，表达 i i 江苏大学硕士学位论文 a b s t r a c t f i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r sw e r ef o u n di nt h ev e r t e b r a t e si n c l u d i n gh u m a nb e i n g s w i t hm u l t i p l eb i o l o g i c a la c t i v i t i e s p o l y h e d r i np a r t i c l e so fa n t h e r a e ap e r n y in u c l e a r p o l y h e d r i nv i r e s ( a p n p v ) w e r ep u r i f i e df r o ml a r v ac o r p s eo fa n t h r a e ap e r 砂f t b u n d e r s t a n dm o r ei n f o r m a t i o n sa b o u tt h eg e n es t r u c t u r e so ft h ev i r u s ，t h eg e n o m i c d n a o f a p n p vw a se x t r a c t e d ，a n dw a sd i g e s t e db yh i n di i ia n ds a li ，r e s p e c t i v e l y t h ef r a g m e n t sa f t e rd i g e s t i o nw e r ei n s e r t e di n t ov e c t o r t h r e eh u n d r e dp o s i t i v ec l o n e s w e r eo b t a i n e da n dw e r es e q u e n c e d t h er e s u l to f h o m o l o g i c a la n a l y s i ss h o w e dt h a ta n o p e nr e a d i n gf r a m ei ss i m i l a rt ot h eh u m a nf i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o rg e n e t h ef g f g e n ew a sf o u n di nt h ea l lo fb a c u l o v i r u s e s f u n c t i o n so ft h e f g f g e n ei nv i r a li n f e c t i o n w i l lb ep r o m o t e d i no r d e rt of i n dt h ef u n c t i o no ft h eg e n ed u r i n gt h ei n f e c t i o no f b a c u l o v i r u s ，t h e f g f g e n eo fb m n p v w a sc l o n e d ，a n dp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o np l a s m i d ， e u k a r y o t i ce x p r e s s i o np l a s m i da n db a c u l o v i m s e se x p r e s s i o np l a s m i dw e r ec o n s t r u c t e d ， a n dt h eg e n ew a se x p r e s s e di nt h e s es y s t e mr e s p e c t i v e l y t h em a i nc o n c l u s i o n sa r ea s f o l l o w e d ： ( 1 ) t h e 俘g e n ef r o ma p n p vw a sc l o n e di n t op u c l 8p l a s m i d t h ec o d i n g r e g i o no ft h i sg e n ec o n s i s t so f5 5 8 b pn u c l e o t i d e s ，a n de n c o d e sap r o t e i nw i t h18 5 a m i n oa c i dr e s i d u e s t h i sg e n e s e q u e n c eh a sb e e ns u b m i t t e dt ot h en c b ig e n b a n k a n dt h ea c c e s s i o nn u m b e ri sa y 6 4l5 2 7 ( 2 ) t h ef g fg e n ef r o mb m n p vw a sc l o n e d t h ep r o k a r y o t i ce x p r e s s i o np l a s m i d p e t 2 8 a - f g f w a sc o n s t r u c t e d t h ep e t 2 8 a - f g f w a st r a n s f o r m e di n t ob l 2 1a n dt h eg e n e w a se x p r e s s e di nt h ef o r m a t i o no fi n c l u s i o nb o d i e si n d u c e db yi p t gt h ee x p r e s s i o n p r o d u c t sw i t ht h ew e i g h to f 2 7 k d af u s e dw i t h6 h i s w e r ep u r i f i e db yn i 2 + - n t a i o ne x c h a n g er e s i n ( 3 ) t h ee u k a r y o t i ce x p r e s s i o np l a s m i dp c d n a 3 1 - g f p - f g w a sc o n s t r u c t e d t h e f g fg e n ep r o d u c t sw e r el o c a t e di nt h en u c l e io ft h ec o s - 7c e l l s i ts h o w e dt h a tt h e p r o t e i nw a sr e l a t e dt or e p l i c a t i o no fd n a o ra f f e c t st r a s c r i p t i o no fg e n e s t 江苏大学硕士学位论文 ( 4 ) t h ee x p r e s s i o np r o d u c t so f t h e f g f g e n eh a v ed i f f e r e n tl o c a t i o ni nd i f f e r e n tc e l l l i n e s t h ep r o t e i nw a se x p r e s s e di nt h ec e l lm e m b r a n eo ft n 5a n ds f 9c e i l s ，b u ti tw a s e x p r e s s e di nt h en u c l e io fb m nc e l l s p e r h a p s i t i sb e c a u s et h a tt h ef g jg e n ew a s c l o n e df r o mb m n p v , a n db m n p vo n l yi n f e c t e db m nc e l l s t h eg e n ei sr e l a t e dt ot h e i n f e c t i o no f v i r u s e s ，a n dt os o m es p e c i f i cc e l l sa sw e l l ( 5 ) i n j e c tt h e 4 t hi n s t a ro fs i l k w o r m sw i t hr e c o m b i n a n tv i r u sb m g f p - f g f , c o m p a r e dw i t hs i l k w o r m sw i t hr e c o m b i n a n tv i r u s eb m - g f rs a m p l e sw e r eo b t a i n e d a tv a r i a n tt i m ep o s ti n j e c t i o n ，t h ep r o t e i ne x p r e s s i o nw a so b s e r v e di nt h ev a r i o u s t i s s u e su n d e raf l u o r e s c e n em i c r o s c o p e t h ef g ff u s e dw i t hg f pw a sc o n g r e g a t e di n t h eb l o o d ，t h e ni nt h et r a c h e a ，t h em a r t e n s i t e ，t h em i d d l ep a r ta n dr e a re n do fs i l k g l a n d w h i l ei nt h es i l k w o r m si n j e c t e dw i t hr e c o m b i n a n tv i r u sb m g f p , g f pw a s r e l e a s e di nt h el a t es t a g e ，a n do n l ya tt h a tt i m eg f pw a se x p r e s s e di nt h et r a c h e a ，t h e m a r t e n s i t e ，t h em i d d l ep a r ta n dr e a re n d o fs i l kg l a n d h e n c e ，b l o o d ，t r a c h e a ， m a r t e n s i t e ，m i d d l ep a r ta n dr e a re n do fs i l kg l a n da r et h et a r g e t so ff g ei tp l a y e d i m p o r t a n tr o l ei nt h en o r m a lf u n c t i o no f t h e s eo r g a n s k e yw o r d s ：b 0 m 匆炒m o r in u c l e a rp o l y h e d r i nv i r u s ，f i b r o b l a s tg r o w t h f a c t o r s ，g r e e nf l u o r e s c e n c ep r o t e i n ，e x p r e s s i o n ，l o c a t i o n 江苏大学硕士学位论文 f g f f g f r g f p 0 r f t n ( t r i c h o p l u s i a n i ) b r m n p v b m b m n n p v g v a p n p v o p m n p v a c m n pv a c n p v s e m n p v l d m n p v h a s n p v s f ( s p o d o p t e r a f r u g i p e r d a ) b e v s h c v m i o e d t a a p s f b s p c r p a g e s d s ( s o d i u md o d e c y ls u l f a t e ) 缩写与符号 i x 成纤维细胞生长因子 成纤维细胞生长因子受体 绿色荧光蛋白 开放阅读框 粉蚊夜蛾 家蚕核型多角体病毒 家蚕 家蚕细胞系 核型多角体病毒 颗粒多角体病毒 柞蚕核型多角体病毒 黄衫毒蛾核型多角体病毒 苜蓿尺蠖核型多角体病毒 甜菜夜蛾核型多角体病毒 舞毒蛾核型多角体病毒 棉铃虫核型多角体病毒 秋粘虫 杆状病毒表达系统 人丙肝病毒 感染复制率 乙二胺四乙酸 过硫酸铵 胎牛血清 聚合酶链式反应 聚丙烯酰胺凝胶电泳 十二烷基硫酸钠 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权江苏大学可以将本学位论文的全部 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存和汇编本学位论文。 保密口 本学位论文属于，在年我解密后适用本授权书。 不保密团 学位论文作者签名：j 亲志吞 皇笳年月j j 7 日 指导教师签名：号美 j 茸廿f 年f 月r 尸日 独创性申明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容以外，本 论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过得作品成果。对本 文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：昧丢彦 日期：刎年1月，9 日 江苏大学硕士学位论文 第1 章绪论 1 1 成纤维细胞生长因子( f g f ) 的研究进展 成纤维细胞生长因子( f i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r s ，f g f s ) 是一类通过与细胞 膜特异性受体结合来调节细胞生长的蛋白分子。f g f s 最早是从牛的垂体组织中 分离纯化得到的，它作为一种促有丝分裂原，能够促进n i h 3 t 3 细胞的生长，因 此命名为成纤维细胞生长因子【1 。后来发现，f g f s 的作用远远不止这些，而且 并不是所有的f g f s 都有促进纤维细胞分裂的作用。f g f s 的作用广泛，对机体 发育、组织功能与结构的维持、损伤的愈合与修复都有作用，还与肿瘤的发生和 转移等多种病理过程有关1 2 , 3 。f g f s 还作用于不同类型的细胞，包括内、外及中 胚层来源的细胞，对它们的迁移、形态、功能及增殖产生影响【4 ，5 1 。从发现第一 个f g f 至今，在脊椎动物中已有2 3 种f g f 和四种f g f 受体被鉴定出来，并按 发现先后次序以数值对它们命名，即f g f 。1 f g f 2 3 ，f g f r l f g f r 4 ，f g f 家 族的原型是f g f i ( a f g f ) 和f g f 2 ( b f g f l 。 1 1 1 何基因的组成 磨。基因编码部分的序列大小有5 k b 以下也有10 0 k b 以上，一般都含有3 个 外显子，其中外显子1 含有起始的蛋氨酸，但是许多f g f 基因( 如彤2 和危似) 具有以c u g 起始密码子开始的57 转录序列【6 ，7 1 。在唐厂家族的许多成员中，外 显子l 被分成了2 到4 个可选择性剪切的编码区( 在f g f - 8 中被分成1 a 一1 d ) 。在这 些唐伸，只是在编码区1 a 中含有一个简单的起始密码子( a t g ) 。这种基因的 组成在人和小鼠等生物体中是很保守的，但对其功能性的序列却了解的甚少。在 f g f - 2 中，基因共长3 8 k b ，共有3 个外显子，其闻被二个大的内含子所分隔。唐似 的转录产物共有四种大小分别为1 2 k b 、2 2 k b 、3 7 k b 和7 0 k b ，主要表达的是3 7 k b 和7 ，0 k b ，f g - 2 基因的转录受其5 u t r 序列调控，但转录长度主要由产物中 3 7 u t r 的长短决定膳j 。 大多数f g f 基因分布于整个基因组中。在人类中已经发现的2 3 种龙，基因， 除了危f 1 5 、f g ) c - 1 6 以外，其余的2 1 种都已在染色体上定位9 3 叭，见表1 1 。多数 江苏大学硕士学位论文 人源唐r 基因在基因组中是成簇出现的。膨3 、店f 4 和危，：9 都定位于染色体 l l q l 3 ，相互之间间隔4 0 k b 和l o k b 。f g f - 6 和店阳3 位于染色体1 2 p 1 3 上5 5 k b 之 内，膨7 和唐卢2 d 在染色体8 p 2 1 一p 2 2 。这些基因的定位表明危r 基因在进化过 程中是通过基因和染色体的复制与置换而产生的。 表1 1 人源j 可基因在染色体上的定位 g e n el o c a t i o n 蔚l5 q 3 1 膨24 q 2 6 2 7 膨3 1 1 a 1 3 膨41 l q l 3 3 膨5 4 q 2 1 膨61 2 p 1 3 掰71 5 q 1 5 - 2 1 1 f g f - s 1 0 q 2 4 t a b 1 1c h r o m o s o m a ll o c a l i z a t i o no f f g f i nh u m a n g e n el o c a t i o n 膨91 3 q ll - q 1 2 f d - l o5 p 1 2 - p 1 3 符i i 1 7 p 1 3 1 好1 23 q 3 4 蒋1 3 x q 2 6 斛1 4 1 3 q 3 4 孵1 5 静j 6 g e n el o c a t i o n 妤”8 p 2 1 魍1 1 85 q 3 4 f g f - 1 91 l q l 3 1 向q 08 p 2 1 3 - p 2 2 f g f - 2 11 9 q 3 1 - q t e r 舒2 2 1 9 p 1 3 3 纾2 31 2 p 1 3 3 1 , i 2f g f s 的分子结构特征 目前发现的2 3 种f g f s ，是2 3 种独立的基因产物，脊椎动物中f g f s 的分 子量从1 7 k d a 到3 4 k d a ，但其结构上又拥有共同的保守性序列，蛋白质级结构 分析结果表明2 3 种f g f s 的同源性在3 0 7 0 之间；所有f g f s 具有一个含有 保守氨基酸残基和保守的结构折叠的核心序列，大多数含有2 8 个高度保守的和 6 个完全相同的氨基酸残基 3 l 】。高度保守的氨基酸残基中有1 0 个氨基酸是和f g f 受体( f g f r ) 相互作用的 3 2 1 。对f g f 1 和f g f 一2 的结构研究认为，在其保守的中 心区域是1 2 个反向平行的1 3 片层组成的三角锥形结构d 3 掣1 。f g f 2 中两个0 片 层( b1 0 和b1 2 ) 含有许多碱性的氨基酸残基，从而形成了最基本的肝素结合 位点。而受体的结合位点与肝素的结合位点完全不同。f g f 2 与f g f r 2 的胞外域 9 2 作用位点位于三角锥结构中的bl 、bi 02 转角、b3 84 环、b9 、01 0 o1 1 环、b1 2 ；与1 9 3 的作用位点位于b4 b5 和n 端的5 9 位氨基酸残基( 见 图1 1 ) p s l 。 江苏大学硕士学位论文 图1 1f g f - 2 的三级结构图 f i g ，1 1t h r e e d i m e n s i o n a ls t r u c t u r eo f f g f - 2 1 1 3f g f 受体( f g f r ) 到目前为止，在哺乳动物中共发现了四个f g f 受体基因，这些基因均编码 一种跨膜蛋白。这四种基因通过不同的交替拼接，结果形成了若干种拼接变异型， 分别位于细胞外、跨膜部分、胞内近膜区和胞内结构区( 酪氨酸激酶区) ，为配体 的特异性结合提供了受体的分子基础【3 6 j ”。f g f r 含有3 个免疫球蛋白样的结构 域，分别为i gi ，i g i i 和i g l i i ，在i gi 和i g h 之间有一短序列，称为酸性盒区 ( a c i d i cb o xd o m a i n ) ，核心序列为8 个连续酸性残基( 见图1 2 ) 。四种f g f 受 体的i g i i 和i g l i i 的氨基酸高度同源，而且高度保守。i g i i 和i g i i i 之间的序列也高 度保守，而通过交替拼接形成的i gi 保守性差。因此m e c k e e h a n 和k a n 认为i g i i 、i g l i i 及其它们之间的连接顺序构成了f g f 的结合位点，而i gi 在f g f r 活 性中只是起到某些辅助作用f 3 8 1 。 f i 号肚 免疰球置白功t 抠j 雌 免疫球置白功t 2 区 免盔球蛋白功j 2 匡i 跨眍 图1 2f g f r 结构示意图 f i g 1 2s t m c m r ef e a m r eo f f g f r 3 一；辜门丘 江苏大学硕士学位论文 凰1 1f g f - 2 的三级结构图 f i g 】1t h r e e - d i m e n s i o n a ls t r u c t u r eo f f g f - 2 1 1 3f g f 受体( f g f r ) 到目前为止，在哺乳动物中共发现了四个f g f 受体基因，这些基因均编码 一种跨膜蛋白。这四种基因通过不同的交替拼接，结果形成了若干种拼接变异型， 分别位于细胞外、跨膜部分、胞内近膜区和胞内结构区( 酪氨酸激酶区) ，为配体 的特异性结合提供了受体的分子基础 3 6 , 3 7 】。f g f r 含有3 个免疫球蛋白样的结构 域，分别为i gi ，i g i i 和i g l i i ，在i gi 和i g l l 之间有一短序列，称为酸性盒区 ( a c i d i cb o xd o m a i n ) ，核心序列为8 个连续酸性残基( 见图1 2 ) 。四种f g f 受 体的i g i i 和i g i i l 的氨基酸高度同源，而且高度保守。i g i i 和i g f f i d l f 司的序列也高 度保守，而通过交替拼接形成的ki 保守性差。因此m e c k e e h a n 和k a r l 认为i g i i 、i g l i i 及其它们之间的连接顺序构成了f g f 的结合位点，而i gi 在f g f r 活 性巾只是起到某些辅助作用”。 性中只是起到某些辅助作用”1 。 * ；k i 蛴i 自自t 娃i 一 一免疰球耆自功 区i i 一竞硅球量白功能区“= 一目盟b 酩蜘硅出蘸i 一骼氧譬强隆 图1 2f g f r 结构示意图 f i gi 2s r u c t u r ef e a t u r eo f f g f r 3 一；车00 江苏大学硕士学位论文 1 1 4f g f 的功能 f g f 家族的2 3 个成员几乎在所有的组织器官中表达，但是其表达模式和时 间不尽相同。虽然每种f g f 具有特定的表达位点，但是它们又倾向于有相同的 表达模式。许多f g f s 在胚胎发育过程中表达( 例如f g f 3 ，一4 ，8 ，一1 5 ，一1 7 和- 1 9 ) ，而有些则在胚胎和成熟器官中表达( 例如f g f 12 ，一5 7 ，一9 1 4 ， 1 6 ，一1 8 和。2 一2 3 ) 3 9 1 。f g f 的表达模式表明它们在发育过程中具有重要的作 用。 1 1 4 1f g f 促进伤口愈合及组织修复 首先发现的是f g f 1 和f g f 。2 在许多愈合的伤口部位表达1 4 0 。在进行外源 表达时，它们在许多动物模型中都促进了伤口的愈合。因此，可以认为它们是伤 口修复的重要调控子。缺少f g f 一2 的大鼠，在皮肤受伤后，上皮再生成和胶原 蛋白的沉积降低h ，这充分证实了f g f 2 在伤口修复中起重要作用。f g f 家族 的其它成员也是组织修复的重要调控子。例如，缺少f g f 6 的大鼠在受伤后， 骨骼肌肉的再生受到了严重的影响，表现出肌管退化和纤维化 4 2 1 。此外，通过 f g f r 2 的剪切体( f g f r 2 一i i i b ) 发挥作用的f g f s ，是上皮形态发生、修复和细 胞保护的主要调控子【4 鲋。 1 1 4 2f g f 促使肢体发育 肢体发育的起始阶段，体壁间充质增殖逐渐变厚，之后变厚的间充质诱导其 外表皮j j nj g n 局2 - - 个称为顶表皮嵴( a p i c a le p i d e r m a lr i d g e ，a e r ) 的特异结构。 a e r 其后的区域称为进展区( p r o g r e s sz o n e ) ，a e r 提供的信号刺激进展区的细 胞增殖，促使肢体发育。o l w i n 等人在a e r 中分离出了f g f 2m r n a 和f g f 一2 蛋白质，并初步证实在肢芽发育中起重要作用| 4 4 1 。n i s w a n d e r 等在a e r 中分离 出了f g f 一4 蛋白，该蛋自刺激a e r 下方间充质增殖【4 卯。f g f - 4 通过两种方式对 肢体发育起作用。一种是直接刺激进展区的细胞增殖。一种是间接使后部的间充 质发生模式信号。 1 1 4 3f g f 刺激骨髂的形成 f g f s 可刺激骨生成细胞增殖和毛细血管的生成。通过f g f r - 3 传递信号的 f g f 存楣女程度上影响了骨骼的延伸。c o l v i n 和d e n g 通过基因靶向，已经获 4 江苏大学硕士学位论文 得了缺失f g f r - 3 的大鼠，并报道了这些突变体具有相同的骨骼不正常的特征 4 6 , 4 7 1 。当突变体在其骨骼形成开始或骨骼继续发育过程中不受干扰时，骨骼的不 正常化会因骨骼过分生长而产生。在正常动物中，f g f r 3 在增殖区的活化减缓 了软骨细胞的分化，以此减缓了软骨细胞离开增殖区及承受细胞肥大的速率。在 活体实验中，f g f - 2 可促进骨骼长入多孔羟基磷灰石，使脱矿骨基质植入后新形 成的骨骼量明显增加。植入f g f - 2 可促使大鼠颅骨缺损出现骨愈合。 1 1 4 4f g f 促进神经系统的发育 原位杂交和免疫细胞化学证实中枢神经系统发育有f g f s 的表达，f g f 1 、 ，2 、_ 4 、5 、8 在中枢神经系统中的表达随着时间及区域变化而有所不同【4 8 1 。发 育早期f g f s 在胎脑内进行增殖或神经发生的区域内表达，在成年脑内的神经发 生区内f g f s 得到持续表达，这些均表明f g f s 在调节神经前体细胞增殖中发挥 重要作用。其中f g f 1 和f g f 2 似乎起着更重要的作用。在啮齿类动物胚胎e 1 0 期和成年阶段海马齿状回颗粒层及前脑侧脑室下区均可检测到f g f 2 ( b f g f ) ， 在e 1 1 期胚胎鼠和成年鼠齿状回颗粒层也可检测到f g f i ( a f g f ) 4 9 1 。 1 1 4 5f g f 和癌症相关 到目前为止，在已知的f g f 家族成员中至少有四种癌基因产物，即 f g f 一3 ( i n t - 2 ) 、f g f - 4 ( 1 a s t 1 ) 、f g f 一5 和f g f 6 。f g f 3 是原癌基因i n t 一2 的产物， i n t 一2 的m r n a 在乳腺肿瘤病毒( m m - t v ) 诱发的肿瘤中增多，这可能是病毒螯 合到与i n t 一2 邻近的部位，促进m t 一2 的表达。现有研究表明i r a - 2 过度表达可以 促进小鼠乳腺肿瘤的发生【5 0 】；f g f 一4 是从胃癌和k a p o s i 肉瘤中发现分离出来的， 它对成纤维细胞和上皮细胞具有很强的有丝分裂促进作用鲥1 ；f g f 5 是在肿瘤细 胞d n a 转染的n i h 3 t 3 细胞培养液中分离得到的一种癌基因产物，它可以促进 上皮细胞的有丝分裂，并且可以与肝素结合5 2 ：f g f 6 是在用h s t 1 基因的序列 搜索一个小鼠的e d n a 文库以寻找同源性序列时发现的，因此又叫h s t 2 。将 f g f ，6 基因导入n i h 一3 t 3 成纤维细胞可促进其恶性转化，这种转化能力有赖于 产物的信号肽序y ) j t 5 3 】。 江苏大学硕士学位论文 1 2 杆状病毒的分子生物学研究 杆状病毒( b a c u l o v i r u s ) 是一类单分子双链闭合环状d n a 病毒，基因组大 小为8 8 1 6 0 k b ，因病毒粒子呈杆状而得名【5 4 1 ，其宿主域仅限于非脊椎动物。虽 然从蛛形纲( 螨类) 与甲壳纲类中也分离出了少数几种杆状病毒 5 5 , 5 6 l ，但绝大都 数杆状病毒是感染昆虫的。迄今报道有6 0 0 种以上的昆虫，包括鳞翅目、膜翅目、 双翅目、鞘翅目与毛翅目等七个目。近年来对于杆袄病毒分子生物学研究取得了 很大进展，特别是杆状病毒被用作表达外源基因的载体以来，对其分子生物学的 研究更加引人注目。 1 2 1 杆状病毒分类 在分类学上，根据国际病毒分类委员会( i c t v ) 第五次报告f 5 刀中将杆状病 毒分为两个亚科：包涵体杆状病毒亚科( e u b a c u l o v i r i n a e ) 与非包涵体杆状病毒 亚科( n u d i b a c u l o v i r i n a e ) 。1 9 9 5 年出版的i c t v 第六次报告中将杆状病毒科设为 两个属，即核型多角体病毒属( n u c l e o p o l y h e d r o v i r u s ，n p v ) 和颗粒体病毒属 ( g r a n u l o v i m s ，g v ) 。根据囊膜内核衣体的多少将n p v 分为单粒包埋型多角体 病毒( s n p v s ) 和多粒包埋型多角体病毒( m n p v s ) 。前者的代表种为家蚕核型 多角体病毒( b m n p v ) ，后者的代表种为苜蓿尺蠖核型多角体病毒( a c m n p v ) 。 颗粒体病毒( g v ) 属与n p v 属最大的区别是包涵体呈椭圆形的颗粒，大小亦比 多角体小的多，只含一个间或2 个杆状病毒粒子，该属的代表种为印度谷螟颗粒 体病毒( p i g v ) 。 1 2 2 杆状病毒基因研究概况 a y r e 等人于1 9 9 4 年第一次公布了a c n p v 的全基因组序列，揭开了病毒基 因组解析的序幕【58 1 。迄今已有2 1 种杆状病毒的基因组全序列得到了解析1 5 8 7 4 1 ， 见表1 2 。 杆状病毒的开放阅读框( o p e nr e a d i n gf r a m e ，o r f ) 大约有1 5 0 个左右，有 6 0 多个基因得到鉴定，其中有些基因的编码产物作为病毒体的结构组分，有些 则参与病毒d n a 的复制和转录调控，还有些基因参与宿主代谢，有利于病毒的 增殖，已知基因归纳如下： ( 1 ) 病毒结构蛋白基因，包括多角体蛋白基因p o 胁) ，p l o 基因，多角体被 江苏大学硕士学位论文 膜p p 3 4 基因，d n a 结构蛋白基因( p6 9 ) ，衣壳蛋白基因p 3 9 和p 8 7 ，囊膜蛋白 基因g p 6 4 等； ( 2 ) 病毒d n a 复制基因和病毒表达调控基因，包括病毒d n a 解旋酶基因 ( d n a h e l ) ，d n a 聚合酶基因( d n a p 0 1 ) ，l e f - 萨1 1 ，i e 一0 ，i e 一，i e 一2 ，p 3 5 ，l a p ， p e 3 8 等； ( 3 ) 与宿主细胞相互作用的基因，包括蜕皮甾类的尿苷二磷酸葡糖基转移 酶基因( e g t ) ，抗细胞凋亡作用的p 3 5 基因、i a p 基因，与细胞凋亡引发有关的 p 9 4 基因，与感染虫体液化相关的c h i t 基因、v c a t h 基因等。 ( 4 ) 酶蛋白基因，包括蛋白激酶础j 基因，蛋白酪氨酸，丝氨酸磷酸酶基因 ( p t p ) ，超氧化歧化酶s o d 基因，碱性核酸外切酶类蛋白a l k - e x o 基因等。 此外，近几年对杆状病毒的基因组的研究越来越深入，还发现了许多新基因， 但对其编码蛋白结构和功能报道甚少，包括形j ，d a 2 6 ，g t a ，h e 6 5 ，f e f 等，有 待于进一步研究。 表1 2 已公布的杆状病毒全长基因序列 t a b 1 2t h eb a e u l o v i r u s e sw i t hf u l ll e n g t hs e q u e n c ep u b l i s h e d 基因库基因长读码g + c 含发表 病毒名称简称 序列号 度( b p ) 框数量( )时间 a u t o g r a p h ac a l i f o r n i c am n p v a c m n p vn c0 0 1 6 2 31 3 3 8 9 41 5 4 4 1 1 9 9 4 b o m b y xm o r im n p v b m n p vn c0 0 1 9 6 21 2 8 4 1 3 1 3 5 4 0 1 9 9 6 o r g y i a p s e u d o t s u g a t em n p v o d m n p vn c0 0 1 8 7 51 3 1 9 9 51 5 25 51 9 9 7 m a m e s t r ac o n f i g u r a t an p vm c n p va f 5 3 9 9 9 91 5 3 6 5 61 6 94 171 9 9 7 l y m a n w i ad i s p a rm n p v l d m n p vn co o l 9 7 31 6 1 0 4 61 6 35 7 51 9 9 8 s p o d o p t e r ae x i g “m n p v s e m n p v n c0 0 2 1 6 9 1 3 5 6 1 11 3 9 4 41 9 9 9 p l u t e l l a x y l o s t e l l ag v p x g vn c0 0 2 5 9 31 0 0 9 9 91 2 04 0 72 0 0 0 x e s t i ac - n i g r u mg vx c g vn c0 0 2 3 3 l1 7 8 7 3 31 8 14 072 0 0 0 p h t h o r i m a e ao p e r c u l e l l ag vp o g va f 4 9 9 5 9 61 1 9 2 1 71 4 33 572 0 0 0 h e l i c o v e r p aa r m i g e r an p v h a n p vn c0 0 3 0 9 41 3 0 7 5 91 3 5 3 8 9 2 0 0 l h e l i c o v e r p aa r m i g e r an p v h a s n p v a f 2 7 1 0 5 9 1 3 1 4 0 31 3 5 3 9 1 2 0 0 1 s p o d o p t e r al i t u r an p v s p l i n p v n c0 0 3 1 0 21 3 9 3 4 21 4 l4 2 72 0 0 1 江苏大学硕士学位论文 e p i p h y a s p o s t v i t t a n an p ve p p o n p vn c0 0 3 0 8 3 1 18 5 8 41 3 64 0 7 2 0 0 l c y d i ap o m o n e l l ag vc p g v n c0 0 2 8 1 61 2 3 5 0 01 4 34 522 0 0 l h e l i c o v e r p a ：p ds i n 西e n p v h z s n p vn c0 0 3 3 4 91 3 0 8 6 91 3 93 9 12 0 0 1 c h o r i s t o n e u r a 矗删跨r a n dm n p v c n d n p vn c0 0 4 7 7 91 2 9 6 0 91 4 55 0 12 0 0 2 c r y p t o p h l e b i ak u c o t v e t ag v c l g vn c0 0 5 0 6 8 1 1 0 9 0 7 1 2 93 2 4 2 0 0 2 a d o x o p h y e so r a n ag r a n u | o v i m s a d o m vn c0 0 5 0 3 89 9 6 5 71 1 93 4 52 0 0 3 a d o x o p h y e sh o n m a in p v a d h o n p vn c0 0 4 6 9 01 1 3 2 2 01 2 53 5 62 0 0 3 r a c h i p l u s i ao hm n p v r o h 脚vn c0 0 4 3 2 31 3 1 5 2 61 5 53 912 0 0 3 1 2 3 杆状病毒表达系统 自8 0 年代初发现杆状病毒核型多角体病毒的多角体蛋白基因( p o l h ) 的强 启动子特性后，s m i t h 等( 1 9 8 3 ) 【7 5 1 首先建立了苜蓿尺蠖核型多角体病毒 ( a u t o g r a p